（分析化学专业论文）白砂糖产品中聚丙烯酰胺助剂残留的研究.pdf

白砂糖产品中聚丙烯酰胺助剂残留的研究 摘要 本文综述了食品中丙烯酰胺的研究现状及检测技术，介绍了聚丙烯酰 胺降解研究进展及降解产物的分析，主要就白砂糖中丙烯酰胺样品前处理 和分析测试方法的建立、聚丙烯酰胺的降解以及降解产物的分析进行了以 下的研究： 1 研究了白砂糖中丙烯酰胺固相萃取( s p e ) 的样品前处理方法。对固相 萃取柱的选择、柱容量的确定、洗脱溶剂的选择以及用量、上样方式的优 化等因素进行了系统的研究，为后续的分析测定提供可靠的样品前处理方 法。样品的加标回收率不低于9 0 ，满足了现代分析的要求。 2 结合固相萃取技术，利用n h 2 柱分别建立了白砂糖中丙烯酰胺的 h p l c u v 和i - i p l c m s 触s 新分析方法。与传统的丙烯酰胺分析方法相比， 本方法中蔗糖在丙烯酰胺之后出峰，这大大减少了基质的干扰，因此本方 法适用于高糖样品中丙烯酰胺的检测。在i - i p l c u v 方法中，通过双s p e 柱的富集净化作用，使被测物实现基线分离，满足了实际样品分析的需要； 在h p l c m s m s 方法中，采用电喷雾电离源( e s i + ) ，多反应监测( m r m ) 方式检测，通过m s m s 准确定性，为分析结果的可靠性提供保障。并利用 所建立的分析方法对广西白砂糖产品中的丙烯酰胺残留进行了普查。 3 对制糖工艺过程中可能引起聚丙烯酰胺降解的因素进行了考察，结 果表明在中高温下溶解氧、还原性金属离子和酚类物质对聚丙烯酰胺的降 解有显著的促进作用。 4 结合液液萃取技术，首次利用i - i p l c m s 法对白砂糖中聚丙烯酰胺降 解产物的分析进行了探讨。 关键词：白砂糖聚丙烯酰胺丙烯酰胺高效液相色谱一质谱法固相萃 取 s t u d yo nt h er e s i d u eo fp o l y a c r y l a m i d e i nw h i t eg r a n u l a t e ds u g a r a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，t h ea n a l y t i c a lm e t h o d so fa c r y l a m i d ew e r er e v i e w e d t h e b a s i cd e g r a d a t i o np r i n c i p l ea n dc h a r a c t e r i s t i co f p o l y a c r y l a m i d ew e r ei n t r o d u c e d t h ef o l l o w i n ga s p e c t sw e r ei n v e s t i g a t e d ： 1 t h es a m p l ep r e p a r a t i o nm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa c r y l a m i d ei ns u g a r a v a r i e t yo ff a c t o r st h a te f f e c t e do nt h er e c o v e r yo fa c r y l a m i d ef r o ms u g a r h a v eb e e ni n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n gt h ec h o i c eo fs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) c a r t r i d g e ，t h ea b i l i t yo fc o l u m nc a p a c i t i e s ，e l u t i o ns o l v e n t s ，v o l u m eo fe l u t i o n s o l v e n ta n di n j e c t i o nm o d e t h er e s u l t ss h o w e da ne x c e l l e n tg u i d ef o rt h e f o l l o w i n ga n a l y s i sw a sa c h i e v e d o nt h eb e s tc o n d i t i o n s ，t h ea v e r a g er e c o v e r i e s o fa c r y l a m i d ef r o ms u g a rw e r em o r et h a n9 0 e x c e l l e n tp e r c e n t a g er e c o v e r i e s w e r eo b t a i n e da c c o r d i n gt ot h ep r e s e n tm e t h o d 2 h p l c u va n dh p l c - m s m sm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa c r y l a m i d e i ns u g a rw e r ed e v e l o p e db yu s i n gn h 2c o l u m n c o m p a r e dt oc o n v e n t i o n a l a n a l y t i c a lm e t h o d su s i n gc l sc o l u m n ，s u c r o s eh a sas t r o n g e rr e t e n t i o na n de l u t e d o u ta f t e ra c r y l a m i d ei nc a s eo fs p h e r i s o r bn h 2c o l u m n a sar e s u l t ，i tc a nr e d u c e t h em a t r i xi n t e r f e r e n c eg r e a t l y t h e r e b y , t h en e wm e t h o ds u p p l i e dah e l p f u l u i d e t e r m i n a t i o np r o c e d u r eo fa c r y l a m i d ew i t he l i m i n a t i o no fs u c r o s ei n t e r f e r e n c e e f f e c ta n ds h o w sh i 曲s e n s i t i v i t y ，g o o dl i n e a r i t yo v e raw i d er a n g ea n dg o o d 3 s e v e r a lf a c t o r st h a ti n d u c et h ed e g r a d a t i o no fp o l y a c r y l a m i d eh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a ts o l u b l eo x y g e n ，r e d u c i n gm e t a li o na n d h y d r o x y b e n z e n ec o m p o u n d sc a np r o m o t et h ed e g r a d a t i o no fp o l y a c r y l a m i d e o b v i o u s l yo nh i 曲t e m p e r a t u r e 4 ai - i p l c m sm e t h o df o ra n l y s i so fd e g r a d a t i v ep r o d u c t so fp o l y a c r y l a m i d ei n s u g a rw a sd e v e l o p e db yc o m b i n i n gw i t hl i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o nt e c h n i q u e k e yw o r d s ：s u g a r ；p o l y a c r y l a m i d e ；a c r y l a m i d e ；h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c m s ) ；s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n i v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名 学位论文使用授权说明 掘易月日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 酬口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者塞名：磁斗躲论文作者签名：止父斗沥冶百师签名：始莎月日 j - - 西大尊幽荻士掌位论文白砂糖产品中聚丙烯蜀u 安助剂残留的研究 第一章前言 丙烯酰胺( 蝴) 是一种简单而重要的酰胺类化合物，是合成高分子材料聚丙烯酰胺的 单体。作为一种神经毒性的潜在致癌物，丙烯酰胺容易被人体的消化道、呼吸道、皮肤 等组织吸收，损坏神经、生殖系统，对人体有较大的危害【l 】。 从2 0 0 2 年瑞典国家食品管理局及瑞典斯德哥尔摩大学的研究人员率先在高温油炸 及烘烤的马铃薯和谷物类食品中发现丙烯酰胺以来 2 , 3 1 ，丙烯酰胺的毒理性质、产生机理、 预防措施以及分析检测方法等引起了世界范围内的广泛关注 4 1 。早在1 9 9 4 年，国际癌症 研究机构( m a c ) 就将丙烯酰胺列为可能使人类致癌的物质【5 】，2 0 0 5 年2 月，联合国粮农 组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 联合食品添加剂专家委员会( j e c f a ) 对食品中的丙 烯酰胺进行了系统地危险性评估，讨论了与丙烯酰胺及其他5 种食品污染物有关的潜在 健康危害问题，认为丙烯酰胺导致的最严重毒性作用是致癌1 6 j 。中国卫生部也于2 0 0 5 年4 月发布公告称：高温加工的淀粉类食品中丙烯酰胺含量较高，应尽量避免连续长时 间或高温烹饪淀粉类食品，以减少丙烯酰胺可能导致的健康危害【7 1 。食品中特别是热加 工淀粉类食品中丙烯酰胺的研究已有广泛报道。 聚丙烯酰胺( p a m ) 是丙烯酰胺均聚物和各种共聚物的统称，本身无毒。作为一种重 要的水溶性聚合物，它兼具絮凝性、增稠性、耐剪切性、降阻性、分散性等性能，已经 成为一种高技术含量、高附加值的重要化工产品，在采油、化工、造纸、纺织、制糖、 医药、环保、建材、农业生产等部门和领域已有广泛应用并已渗透到人们的日常生活中， 有“百业助剂 之称嗍。制糖工艺过程中广泛使用聚丙烯酰胺作絮凝剂，在工业品聚丙 烯酰胺中，难免残留有微量的未聚合的丙烯酰胺单体；其次，高分子量的聚丙烯酰胺是 一种比较“娇气 的物质，在高温、高速搅拌、紫外照射、铁锈和铁化合物催化等条件 下容易降解 9 1 ，也可能会降解出微量丙烯酰胺单体以及低聚体而一并残留在白砂糖产品 中。因此，对白砂糖中聚丙烯酰胺助剂残留问题进行前瞻性研究，具有深远意义。 广。园大国幽炙士掌位论文白砂糖产品中聚丙捌 宙u 安助翻残留的研究 1 1 食品中丙烯酰胺研究现状及检测技术 1 1 1 来源，物理化学性质以及毒性 食品中丙烯酰胺主要来源两个途径：一是含高碳水化合物的食品经过煎、烤、炸等 高温烹调后产生含量不等的丙烯酰胺；二是由于聚丙烯酰胺中常常含有微量的丙烯酰胺 单体，在食品加工工艺过程中因使用聚丙烯酰胺作絮凝剂而残留或降解出的微量丙烯酰 胺，如饮用水处理，白砂糖生产加工等。 自从在食品中发现丙烯酰胺以来，许多国家对本地区食品中的丙烯酰胺进行了检测， 然而由于食品种类繁多，目前对丙烯酰胺在食品中的分布仍没有一个系统的结论。根据 瑞典和美国对多种市售食品和实验室模拟烹制的食品的调查，将人们的日常食品中丙烯 酰胺的含量加以总结并列于表1 1 、1 2 中。从表1 1 、1 - 2 可以看出，丙烯酰胺质量分数 在0 3 2 1 2a g k g 之间，它与食品种类和加工方式密切相关。富含碳水化合物的食品，特 别是油炸马铃薯类食品，丙烯酰胺的含量普遍较高，而煮制此类原料却不会产生丙烯酰 胺。由于加工方式的不同或其他因素，同一种食品在不同的餐馆或不同的厂家也存在相 当大的差别。 表1 1 不同食品中丙烯酰胺的质量分数 t a b 1 - 1t h ec o n t e n t so fa c r y l a m i d ei nd i f f e r e n tf o o dp r o d u c t s 注：根据f d a 1 0 1 2 广西大掣啊炙士掌位说曙白砂糖产品中聚丙烯刮u 安助荆残留的研究 表1 - 2 丙烯酰胺在食品中的质量分数 t a b 1 - 2n ec o n t e 鹏0 f 孔搿l 锄i d ei i lf o o d s 注：根据瑞典的测量结果【l l l 作为合成高聚物的重要单体，丙烯酰胺具有良好的溶解性，能溶于水、甲醇，乙腈、 丙酮、乙醇等溶剂，但不溶于非极性溶剂如正己烷和苯。由于分子中有酰胺基和碳碳双 键两个活性反应中心，丙烯酰胺很容易发生水解、加成以及聚合反应，例如它的不饱和 氨基系统非常容易与亲核物质蛋白质中半胱氨酸的巯基发生迈克尔加成反应，从而影响 蛋白质的正常功能而致病【1 2 】。室温下的丙烯酰胺可以稳定存在，但熔融时或暴露在紫外 光下以及与氧化剂接触时可以进行游离型聚合反应，产生高分子聚合物聚丙烯酰胺。此 外，它还可以与丙烯酸、丙烯酸盐等化合物发生共聚反应。 作为一种高毒性物质，丙烯酰胺对人体和动物的毒性已有广泛研究【l ，4 ，1 3 】。它主要通 过消化系统( 高温淀粉类食物的摄入) 、呼吸系统( 主动和被动吸烟) 和皮肤系统( 塑料品、 纺织品和纸张的接触) 进入人体，从而损伤神经系统，增加肿瘤的发病率，影响胚胎发 育等等。它的毒理性质包括急性毒性、生殖发育毒性、神经毒性以及遗传毒性等方面。 急性毒性试验结果表n 1 4 , 1 5 】，大鼠、小鼠和兔的丙烯酰胺经口l d s 0 为1 5 0 1 8 0 m g k g ， 属中等毒性物质。动物试验研究表明，丙烯酰胺主要引起神经毒性【1 6 】。神经毒性作用主 要为周围神经退行性变化和脑中涉及学习、记忆和其他认知功能部位的退行性变化。 c a l l e r n a nc j 【1 7 】报道在大剂量暴露丙烯酰胺的工人中，丙烯酰胺血红蛋白结合物的量与 神经毒性相关，而血浆中丙烯酰胺的浓度与神经毒性症状关系较弱。对生物标志物的检 3 广西大掌硕士掌位论文白砂糖产品中聚丙烯胃u 安助剂残留的研究 测结果显示丙烯酰胺的含量以及曲线下的面积与神经系统的毒性效应高度正相关。孙风 祥等【1 6 】人的研究表明，丙烯酰胺急性中毒后，可使神经细胞产生炎性水肿，最终导致细胞 死亡，产生不可恢复的神经系统损坏，接触一定量的丙烯酰胺可有全身性损伤作用。贺锡 雯等【埔】人利用神经行为、生理、病理、生化和代谢方法，研究了丙烯酰胺及其代谢物环 氧丙酰胺对中枢及外周神经系统的损害在中毒不同阶段中的变化规律及剂量一反应关系， 表明丙烯酰胺是蓄积性神经毒素，可引起中枢和周围神经系统的远端轴突变：丙烯酰胺 影响神经系统的糖代谢，其神经毒性可归因于影响能量代谢和细胞内c a 2 + 的稳态。 丙烯酰胺的生殖毒性目前尚无人群资料可查。动物实验中丙烯酰胺除引起生殖系统 肿瘤，生殖细胞染色体变异外，对精子的形成、受精和对雌性生殖都有影响。丙烯酰胺染 毒的雄性大鼠附属生殖器官，生精管萎缩，精子数量减少，精子活动度降低和畸形率增加， 脱离暴露一段时间之后曲细精管会部分恢复【1 9 1 。s a k a m o t o 等口0 1 对幼鼠以1 5 0 m g k g 染毒 后发现睾丸精子细胞核空泡和细胞肿胀的损伤，此外还见精子细胞和精母细胞的变性： 而支持细胞、l e y d i g 细胞对丙烯酰胺有较强的抵抗力。 肿瘤的发生与基因的改变有密切的关系，丙烯酰胺在体内和体外遗传毒性试验均 表现有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常等现 象。n e u h a u s e r - k l a u s 等【2 l 】证实丙烯酰胺会引起哺乳动物体细胞的点突变。丙烯酰胺的代 谢物环氧丙烯酰胺与d n a 的加合物可以在染毒后的多个器官中检测到瞄】。体内丙烯酰 胺引起的d n a 损伤是一个慢性过程，是通过它的代谢物发挥作用【2 3 1 。丙烯酰胺的代谢物 环氧丙烯酰胺比丙烯酰胺有更强的基因毒性，它们都可以引起d n a 链的断裂，若同时伴 有环原性谷光甘肽的缺乏，则会加重损伤的发生嗍。b u l l 等1 2 5 】人以6 2 5 、1 2 5 、2 5m g ( k g d ) 的丙烯酰胺经口染毒a j d , 鼠，发现丙烯酰胺可诱发小鼠皮肤肿瘤，促进肺腺瘤的发展。 丙烯酰胺对动物的致癌性已经得到了公认。 1 1 2 丙烯酰胺形成机制及防止产生措施 对于不同类型的食品，丙烯酰胺有不同的形成机理。根据已有的研究结果，一般认 为其形成的机制有以下两种可能，如图1 1 。对于热加工高碳水化合物的食品，目前普 遍认为丙烯酰胺的产生是由食品中天门冬酰胺和还原性糖在高温加热过程中通过美拉 删( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 而生成【2 6 ，2 7 】，食品加热到1 2 0 摄氏度以上即可发现丙烯酰胺的 生成，加工方式对丙烯酰胺的产生影响很大，随着温度的升高其含量增加。同时，s t a d l e r l 2 7 】 4 g - 西大掣阿士掌位论文 白砂糖产品中聚丙烯酰胺助剂残留的研究 和v a r o u j a n l 2 8 1 还发现，如果用水合天门冬酰胺代替天门冬酰胺或者是往天门冬酰胺还 原糖无水反应体系加入少量的水，则丙烯酰胺的量会显著提高，是无水反应体系生成量 的三倍多。而对于油脂类食品，f r i e d m a n 2 9 1 提出，油脂在高温加热过程中分解生成甘油 三酸酯和丙三醇，甘油三酸酯的进一步氧化或丙三醇的进一步脱水均可产生小分子物质 丙烯醛，而丙烯醛经由直接氧化反应生成丙烯酸，丙烯酸再与氨水作用，最终生成丙烯 酰胺。 玛p c 侧sl r h - 厂o rr | = f 琏= h 一琏暑嚣 r 孤 t r g l y c e r i d e s l l l x ，t h e s i s2 p hp r 旰厂隅霉u o o 转 n 墁 a 警a 硒基地 图1 - 1 丙烯酰胺可能的形成机理 f i g 1 1p o s s i b l er o u t e so ff o r m a t i o no fa c r y l a m i d e 珏e 2 c h c n 珏 a c r y l a l r d e 此外，食品加工过程中形成的丙烯酰胺有两种来源，一是聚丙烯酰胺商品中本身含 有一定量未聚合的丙烯酰胺单体，二是食品加工过程中各种因素的影响可能使聚丙烯酰 胺高聚物降解析出丙烯酰胺单体0 0 l 。 根据食品中丙烯酰胺的来源和形成机理，减少或避免它的形成主要有以下途径：一 是从食品加工的原料控制丙烯酰胺的形成。通过降低原料中天门冬酰胺和还原糖的含量 或对原料进行预处理，可降低或消除产品中丙烯酰胺的含量。d h i r a j 等1 3 1 】研究发现，用 鹰嘴豆粉糊涂抹在生薯条上，炸薯条成品中丙烯酰胺含量由1 4 9 0p g k g 降至5 8 0 g k g 。 k o n i 等【3 2 1 将马铃薯切片后浸在约6 0 温水中1 5 m i n ，可减少其中的天门冬酰胺和还原 糖，用此制成的炸薯条丙烯酰胺含量比未处理的丙烯酰胺含量减少5 1 0 倍，同时还保 留了原有的烹调效果。 二是从食品加工工艺控制丙烯酰胺的形成。淀粉质的食品如土豆、面包、饼干、麦 广西大掣巧髓士掌位论文白砂糖产品中聚丙烯蜀u 安助宪i 残留的研究 片等这些含碳水化合物食品或低蛋白质的植物性食品当加热到1 2 0 以上往往容易产生 - 丽烯酰胺，而且随着加工温度的升高，丙烯酰胺产生量增加，而1 4 0 - 1 8 0 丙烯酰胺的 i 圭成量最大【3 3 1 。瑞典科学家t a k e k e 3 4 1 的研究结果显示，随着食品加工过程中的温度的升 每，丙烯酰胺在食品中的含量也在升高。在可能产生丙烯酰胺的温度下，加工时间的延长 业会增加其含量，这说明丙烯酰胺的产生需要一定的温度和时间：加工方式也非常重要， 柚炸有利于丙烯酰胺的产生，微波炉加热的食品中丙烯酰胺的含量也比较低，而水煮的 食品中则测不到丙烯酰胺的存在。丙烯酰胺在富含碳水化合物的食品中更容易形成，而 ：在富含蛋白质的食品中丙烯酰胺的含量则很低。 1 1 3 分析方法 1 1 3 1 色谱分析方法 食品中丙烯酰胺的分析检测方法常有气相色谱法( g c ) 、气相色谱一质谱联用法( c o m s ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、高效液相色谱一串联质谱法( l c m s m s ) 等。g c 具有柱 效高、重现性好等优点，但只能用于易挥发、热稳定性好的物质的分析。在分析热不稳 定、强极性和难挥发化合物时往往需要结合衍生( 硅烷化、烷基化、酰基化或甲基化) 等繁琐的前处理过程才能进行分析，操作复杂费时。在丙烯酰胺的分析测定中，g c 和 g c m s 法通常p 研都需将丙烯酰胺溴化加成得到易挥发的弱极性的a ，8 - - - 溴丙酰胺进 行测定，以提高方法灵敏度。但溴化衍生化操作过程繁琐，对技术要求高。同时，溴的高 挥发性对人体和环境容易产生毒害。有文献1 4 报道在一定条件下，a ，p 一二溴丙酰胺在高 温进样口内会分解为更稳定的2 一溴丙烯酰胺，分解过程可能与进样口的活性和温度存在 着定的相关性。从而给分析结果带来很大的不确定性，影响分析结果的重现性和精密 度。沈伟健等【3 9 l 在丙烯酰胺溴化衍生化后通过三乙胺定量反应，转化生成性质更稳定的 2 一溴丙烯酰胺后经由g - c m s 测定，消除了二溴丙酰胺可能热分解的不利影响，平行试 验结果的精密度很好，提高了方法的稳定性。 h p l c 弥补了g c 不宜分析难挥发，热稳定性差的物质的缺陷，一般不需要对样品 进行繁琐的衍生化处理，已是现在有机物分析检测中最常用的分析检测方法之一。质谱 ( m s ) 除了可以提供分子质量信息外，还可以提供结构信息，具有很高的选择性和灵敏度。 l c 和m s 联用可实现高效分离和高灵敏度、富含信息的检测，在痕量残留分析中已发 挥越来越重要的作用。在丙烯酰胺残留测定方面，大多数研究者都利用传统的反相c 1 8 6 广西大曹颊士掌位诞文白砂糖产品中聚丙蚓 雠助荆残留的研究 色谱柱分离 4 0 - 4 6 1 。利用常规的反相色谱分离极性化合物，许多研究者都经历了保留和分 离的问题。化合物要么在柱上没有保留，要么完全吸附在柱子上，从而无法与基质达到 分离效果。由于丙烯酰胺分子极性较强，在一般反相色谱柱上，吸附较弱，其保留时间 短，因此难以选择一个合适的流动相，使丙烯酰胺在柱上有一个合理的保留时间，实现 良好的洗脱分离【4 ，伺。 除常规反相色谱法外，利用离子交换色谱来分离丙烯酰胺亦有报道【4 7 】，作者利用d i o n e x 公司的i o n p a ci c e a s l 柱，结合了离子交换和体积排阻色谱。结果表明与反相色 谱柱相比，它的容量因子大大增加，样品即使未经处理，丙烯酰胺也能与基质实现良好 分离。在此基础之上，c a v a l l i 4 8 】利用离子排阻色谱和质谱联用技术对饮用水中的丙烯酰 胺进行了测定。饮用水直接进样，经微孔柱分离，采用电喷雾四极杆质谱，选择性离子 监测模式测定。与常规反相色谱法相比，离子排阻色谱由于固定相的多种保留机理，使 得丙烯酰胺与潜在干扰物实现分离成为可能。此外，柱的高容量允许大体积进样，从而 提高了方法的灵敏度。s o n j ar i e d i k e r 4 9 1 等发现等度条件下s h o d e xr s p a kd e 6 1 3 聚甲 基丙烯酸酯凝胶柱对丙烯酰胺有良好的保留。 1 1 3 2 样品前处理方法 在样品前处理方面，由于样品背景复杂，一般都需经过提取、净化和富集步骤。常 规的前处理程序如表1 3 。 表1 3 丙烯酰胺样品前处理的一般步骤 t a b 1 - 3t h eg e n e r a le x t r a c t i o na n dc l e a n - u pp r e - t r e a t m e n to fa c r y l a m i d eb e f o r el c m s m s 由于丙烯酰胺良好的水溶性，许多文献报道都采用水来提取样品基质中的丙烯酰胺 柏- 4 2 j 。此外，由于甲醇易于蒸发和浓缩，也被一些作者用作提取溶剂【4 3 4 5 1 。r u f i a n h e n a r e s 等【5 0 l 证实在提取液中加入一定量的n a c l 能避免样品前处理过程中的乳化作用，使 7 , r - 西大掣颐士尊啦论文白砂糖产品中聚丙烯彦明蚤助壳i 残留的研究 丙烯酰胺萃取更彻底，提高回收率。在提取过程中应充分均质、振荡，使丙烯酰胺尽可 能地被萃取，但不可超声，否则会产生乳化或细小的颗粒，净化时颗粒会渗入到固相萃 取柱中，影响柱子的保留能力，降低净化效率。也有作者1 5 l j 用8 0 的热水作提取溶剂， 由于丙烯酰胺在此温度的性质相对稳定，提取过程中未发现异常问题。 在样品前处理过程中，为了提高回收率，通常要向均质化后的样品中加入内标化合 物，以校正整个萃取过程中目标化合物的损失。丙烯酰胺测定过程中经常使用的内标化 合物有：含重氢的丙烯酰胺( d 3 丙烯酰胺) 5 2 , 5 3 、碳同位素标记的丙烯酰胺( 1 3 c 3 丙烯酰 胺) 【柏5 0 1 以及甲基丙烯酰胺【4 1 5 1 】等。此外，脱脂常常也是丙烯酰胺样品前处理的步骤之 一。正己烷、石油醚以及环己烷都是常用的脱脂试剂。对于富含蛋白质的样品，还要进 一步除去样品中的蛋白质，c a r r e zi 和c a r r e zi i 试剂已在相当多的文献中被报道引用p 9 , 4 1 , 5 0 1 。是否需要脱脂或除蛋白质要根据实际样品的情况来确定。 在丙烯酰胺的富集净化过程中，一般都采用固相萃取技术处理。固相萃取技术是一 种集分离、净化和浓缩为一体的样品前处理技术。它采用高效、高选择性的固定相，实 质上是一个柱色谱分离过程，其分离机理、固定相和溶剂的选择与高效液相色谱有许多 相似之处。s p e 技术应用于试样的预处理，其作用主要有：( 1 ) 从试样中除去对分析有干 扰的物质。( 2 ) 富集痕量组分，提高分析灵敏度。( 3 ) 变换试样溶剂，使之与分析方法匹 配。( 4 ) 原位衍生。( 5 ) 试样脱盐。( 6 ) 处理过的样品易于贮藏、运输，便于实验室间进行 质控。在以上诸点之中，分离和富集作用是最主要的。实验时，样品流经柱时待测物在 固液两相间进行分配，达到分配平衡，然后根据待测物的性质分别用选择性溶剂除去杂 质，洗脱出待测物，从而达到分离浓缩的目的。固相萃取技术克服了传统液液萃取技术 的诸多缺点，具有分析速度快、高精密度和回收率、低有机溶剂消耗量、环境污染小、 操作简单、易于自动化等优点，是样品前处理技术的一次飞跃发展，在国内外食品中丙 烯酰胺残留分析检测中已得到广泛的应用。w a t e r s 公司的o a s i sh l b 柱由于其良好的 亲水亲脂性能，目前在丙烯酰胺的净化中得到了最广泛的应用 4 0 , 4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 1 。此外，c 1 8 柱 4 2 ，5 4 1 、o a s i sm a x ( m i x e d m o d ea n i o ne x c h a n g e ) 5 5 】、o a s i sm c x ( m i x e d m o d ec a t i o ne x c h a n g e ) 【4 9 ，5 0 1 以及一些混合模式的柱子如i s o l u t em u l t i m o d e 柱【5 6 】也有相关报道。 8 广西大学喊士掌位论文 白砂糖产品中聚丙烯酰胺助荆残留的研究 1 2 聚丙烯酰胺降解研究进展 1 2 1 物理化学性质和降解方式 p a m 是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和各种共聚物的统称，本身无毒。由于其吸 附架桥作用优于无机混凝剂，具有投剂量少、絮体密实、沉降速度快，并容易自液体中 分离等优点，现已广泛应用于水处理、石油、造纸、纺织和制糖等工业，有“百业助剂” 之称i s 。p a m 产品有阴离子、阳离子和非离子等类型，如制糖工业常用阴离子型p a m 作絮凝剂，而污水处理中常用阳离子型p a m 作絮凝剂。p a m 具有良好的水溶性，但不 溶于大多数有机溶剂。采用甲醇、丙酮等沉淀剂可使p a m 从溶液中析出，这是提纯商 品p a m 的常用方法。4 1 ( 体积) 的甲醇水溶液是p a m 的0 溶剂网。 高分子量的p a m 是一种比较“娇气一的物质，在高温、高速搅拌、紫外照射、铁 锈和铁化合物催化等条件下容易降解 9 1 。近年来，人们对p a m 降解的研究主要可以分 为以下几个方面：化学降解 5 8 , 5 9 ) 、生物降解唧，6 1 1 、热降解【明以及机械降解6 3 1 。这些降解 主要是通过激发产生自由基引起连锁氧化反应，从而造成聚合物主链断裂和分子量降 低，水溶液粘度损失【5 a l 。在对p a m 的稳定性研究【5 8 1 发现，p a m 在水溶液中同时发生 两种化学降解反应：水解反应，引起侧基结构的变化，由酰胺基转变为羧基；氧化反应， 引起主链的断裂，使聚合物分子量减少。氧化降解反应具有自由基连锁反应的特征，过 氧化物、还原性有机杂质以及过渡金属离子等起着活化剂作用，产生活性自由基碎片， 促进聚合物氧化降解。聚合物中的过氧化物以及产生的羰基化合物是引发聚合物氧化降 解和光降解的主要成因。由于降解作用，主链断裂分子量大幅降低，产生大量的低聚物， 低聚物的进一步降解会产生丙烯酰胺单体【3 0 州。 1 2 2 降解产物的分析测定 1 2 2 1 粘度法 高分子化合物的分子量一般是用粘度法来测定。粘度是度量流体粘性大小的物理 量。它的实质是反映溶液内摩擦力的大小，亦称为内摩擦系数。p a m 溶液是很粘稠的。 分子量越高的p a m 的溶液粘度越大。这是因为p a m 大分子是长而细的链状体，在溶 液中运动的阻力随着分子量的增加而增大。许多高分子化合物的分子量是用粘度法测 定，p a m 也是如此。高分子物质的溶液的粘度与它的分子量之间有一定的数学关系， 9 广西大攀硕士掌位论文 白砂糖产品中聚丙烯彦明蜜助剂残留的研究 在一定条件下测出它的溶液的粘度，就可以根据这种数学关系推算出它的分子量，称为 “粘均分子量【9 】。p a m 溶液的特征粘度n 】与其分子量m 之间有如下的指数函数关系 【5 羽： n 】= k i v i p a m 溶液粘度的测定一般采用乌氏粘度计，国标g b1 2 0 0 5 1 8 9 提供了p a m 特性 粘数的两种测定方法：一点法适用于特性粘数的一般测定；稀释法适用于特性粘数的精 确测定。 1 2 2 1 低聚体的分析 g c 和g c m s 法测定降解产物中的低聚体有一定数量的报道。朱麟勇等【5 8 】对p a m 聚合物进行热氧化降解后，产物中的低聚物经二氯甲烷萃取分离后，用g c m s 测定， 发现主要组分除含有双键、环氧和羰基的聚丙烯酰胺碎片以外，大量产物属于一般丙烯 酰胺低聚体的衍生物。詹亚力等【6 5 】以k 2 s 2 0 s 和k 2 s 2 0 s f e s 0 4 为诱发剂，以运动粘度 为指标研究了p a m 氧化降解的最佳工艺条件。降解后的有机组成经c - c m s 分析，发现 二氯甲烷萃取物中主要是丙烯酰胺低聚体及其衍生物，其中含1 6 个碳的酰胺和1 8 个碳 的烯酰胺相对含量分别达到2 和1 5 ，部分产物的结构中含有双键、环氧和羰基等基 团。a l e x a n d e rk r o n i m u s 等【刚认为p a m 溶液的高粘性以及对微粒的高吸附能力阻碍了 液相色谱在p a m 降解产物中的分析应用。作者采用在线热化学裂解g c m s 法对污水泥 中阳离子型p a m 降解产物进行了分析测定。结果表明在四甲基氢氧化氨的诱导作用下， p a m 降解为戊二酰亚胺相关衍生物的产物。作者同时还在相同热解条件下对阴离子型 p a m 和非离子型p a m 的降解产物进行了测定，发现降解产物与阳离子型p a m 降解产 物相同，但降解产物的含量差别较大。由于降解产物多，色谱分离度小，大量产物的色 谱峰重叠，作者对污水泥进行了萃取净化处理，以减少有机基质的干扰。f r a n kc h e n g y u w a n g t 6 7 】用裂解气相色谱原子发射检测器对聚乙烯乙醇中的p a m 降解产物进行了分析 并结合质谱加以验证。结果表明p a m 主要裂解成单体类、7 二聚体类、三聚体类和四聚 体类物质。作者同时分析了这四类产物的形成机理。但目前尚未发现l c 和l c m s 法测 定降解产物中的低聚体的报道。 l o 白砂糖产品中聚丙烯倒u 垫助剂残留的研究 1 3 本论文研究的目的 制糖过程中广泛使用聚丙烯酰胺作絮凝剂。聚丙烯酰胺商品中本身含有一定量未聚 合的丙烯酰胺单体以及制糖工艺过程中各种因素的影响可能使聚丙烯酰胺高聚物降解 的低聚丙烯酰胺的问题一直未见有报道。本论文的目的是结合固相萃取技术，以h p l c m s 为主要技术手段，研究建立白砂糖产品中丙烯酰胺单体残留的分析检测方法；结合 溶剂萃取技术，研究建立白砂糖产品中低聚聚丙烯酰胺残留的分析方法；利用建立的分 析方法对广西白砂糖产品中丙烯酰胺单体和低聚聚丙烯酰胺进行普查。 广西大掌硕士掌位论文白砂捌| 产品中聚丙捌 彦u 安助蠢归笼留的研究 第二章白砂糖中丙烯酰胺的测定 自从在食品中发现丙烯酰胺以来，许多国家对本地区食品中的丙烯酰胺的测定方法 进行了广泛的研究。目前国际上主要采用气相色谱法( g c ) 、气相色谱一质谱联用法 ( o c m s ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、高效液相色谱一串联质谱法：( l c m s m s ) 等。在丙烯 酰胺的分析测定中，g c 和g c m s 法通常 3 5 - 3 8 i 都需将丙烯酰胺溴化加成得到易挥发的弱 极性的p 一二溴丙酰胺进行测定，以提高方法灵敏度。但溴化衍生化操作过程繁琐复杂， 同时，溴的高挥发性对人体和环境容易产生毒害。高效液相色谱法可以弥补气相色谱法 不宜直接分析难挥发物质的缺陷，是食品中丙烯酰胺检测中最常用的分析检测方法【4 1 2 1 。 白砂糖中丙烯酰胺残留的测定亦有报道，s s c u t i c 6 s 等采用多维液相色谱热喷雾 质谱法对白砂糖中的丙烯酰胺进行了研究。由于糖中天冬酰胺酸和谷氨酸等基质的干 扰，普通的液相色谱方法在白砂糖中丙烯酰胺的测定中并不可行，为此，作者通过2 根 柱子的切换的多维液相色谱实现对干扰物的除去，建立了精制糖中痕量丙烯酰胺单体的 分析测定方法。该法在样品处理时，依次往白砂糖溶液中加入溴化钾，浓氢溴酸和溴水， 放入0 的冰箱过夜，充分溴化后，再加入硫代硫酸钠中和过量的溴，至溶液澄清。用 乙酸乙酯萃取水相中的仅，b 一二溴丙酰胺后进行测定。整个样品处理过程包括溴化衍生 化和液一液萃取步骤，操作繁琐复杂费时，消耗大量的有机溶剂，且回收率低，无法满 足现代分析的要求。j o z e ft c k c l 6 9 1 l 等用毛细管气相色谱一氢火焰离子化检测器建立了白 砂糖中丙烯酰胺的新的分析方法。样品处理亦包括溴化衍生化和液一液萃取步骤，此外 还包括无水硫酸钠脱水和玻璃硅胶柱净化样品提取液等过程，样品处理更为复杂。因此， 建立新型的快速的满足现代分析要求的样品前处理方法和色谱分析方法是开展白砂糖 产品中丙烯酰胺普查的前提。 2 1 测定白砂糖中丙烯酰胺的样品前处理方法的研究 样品前处理技术是痕量分析化学的关键问题之一，样品前处理技术己成为浓缩被测 定的痕量组分，提高分析方法的灵敏度及除去干扰物质的重要手段，在分析化学中起着 极为重要的作用。 目前，用于浓缩和净化食品中丙烯酰胺的方法主要有固相萃取法( s p e ) 【4 2 舶】、化学 1 2 广西大掌硕士学位论文 白砂稠| 产品中聚丙烯舒u 安助剂残留的研究 净化法【4 1 1 、液一液萃取法( l l ) 【6 8 6 9 1 。l l 法有许多不足之处，例如样品中丙烯酰胺需要 经过溴化衍生化处理，步骤复杂繁琐费时；此外还需要大量的有机萃取溶剂，成本高， 环境污染大，样品回收率和精密度不理想。化学净化法的净化作用单一，净化效果不够 理想，只适用于母体背景成分不太复杂的样品，且不能对样品起富集作用，达不到痕量 分析样品前处理的要求。s p e 技术是一种集分离、净化和浓缩富集为一体的样品前处理 技术。它具有分析速度快，较高的精密度和准确度，分析物的高回收率，有机溶剂的低消 耗，减少对环境的污染等优点【7 0 , 7 1 】，是样品前处理技术的一次飞跃发展，在国内外食品 中丙烯酰胺残留分析检测中已得到广泛的应用 4 0 , 4 2 - 4 6 , 4 9 , 5 0 , 5 4 , 5 5 】。 本节以白砂糖产品中丙烯酰胺的回收率为目标，研究了s p e 柱的选择、上样体积、 洗脱溶剂、洗脱溶剂体积和上样方式等因素对样品回收率的影响，并对这些条件进行优 化，为后续的分析测定提供可靠的样品前处理方法。 2 1 1 实验部分 2 1 1 1 仪器与试剂 a g i l e n t1 1 0 0l c m s dt r a ps l 高效液相色谱一质谱联用仪、a g i l c n t 示差折光检测 器( 德国) ；w a t e r s6 0 0 高效液相色谱仪、w a t e r s2 4 8 7 紫外检测器( 美国) ；固相萃取 装置：a g i l e n t 多管真空处理系统，w a t e r so a s i sh l b ( 6c c ，2 0 0m g ) ，w a t e r so a s i sh l b ( 6 c c ，5 0 0r a g ) ，w a t e r so a s i sh l b ( 2 0c c ，lg ) ( 美国) ，a g i l e n ta c c u b o n d l ls c x ( 3c c ，2 0 0 r a g ) ，a g i l e n ta c c u b o n do d s - c l s ( 6c c ，5 0 0r a g ) ，a g i l e n ta c c u b o n do d s - c i s ( 3c c ，2 0 0r a g ) 固相萃取柱( 德国) ； o r g a n o m a t i o nn e v a p 氮吹仪( 美国) ； w a t e r sp r op l u s 超纯水 仪( 美国) ：s a r t o r i u sm e 2 1 5 s 电子分析天平( 德国) 。 甲醇、乙腈、丙酮( 色谱纯，f i s h e r 公司) ：蔗糖标准品( s i g m a 公司) ；丙烯酰胺标准 品( a m r c s c o 公司) 。 其他试剂为分析纯，所有用水均为超纯水。 2 1 1 2 标准溶液的配制 蔗糖标准储备液为0 5 0 0 0g m l 1 准确称取蔗糖标准品2 5 0 0g ，用水溶解并定容在 5 0m l 容量瓶中；丙烯酰胺标准储备液为1 0 0 0m g m l l ：准确称取丙烯酰胺标准品1 0 o o m g ，用甲醇溶解并定容在1 0m l 容量瓶中。标准储备液置于4 冰箱中保存，使用时用 白砂糖产品中聚丙烯宙u 安助荆残留的研究 水稀释成所需浓度。 2 1 1 3 样品溶液的制备 样品的制备：称取1 0 0 0g 白砂糖样品，加5 0 0m l 水，微热溶解。 萃取和净化：样品溶液通过o a s i sh l b 柱净化。o a s i sh l b 固相萃取柱分别用6m l 丙酮、6m l 甲醇和6m l 水预先活化，取2 0 0m l 样品溶液通过已活化好的h l b 柱， 抽真空使其下滴速度为l d 5 s ，除去不被保留的疏水性及中性有机物和部分蔗糖。用2m l 水过柱洗去柱上大部分蔗糖，再用4m l 丙酮溶液洗脱，使其自然下滴( 不可抽真空) 。 洗脱液收集到1 0m l 离心管中，加水o 2 m l ，洗脱液氮吹仪上蒸发至近干，用水定容至 5 0 0 此，待h p