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高效液相色谱在基因突变分析中的应用研究 摘要 基因突变是导致基因型疾病( 如遗传性疾病和肿瘤等) 的重要因素之一，基因突变及多 态性分析在生物遗传学研究中，尤其在基因型疾病诊断及病理研究中起着十分重要的作用。 传统的基因突变及多态性分析方法大都依赖于如平板凝胶电泳及毛细管电泳一激光荧 光等技术，这些方法有些虽然较为成熟，但或因操作繁琐而不适合于大量临床样品分析和大 量人口扫描分析。或由于成本较高而不具有普遍推广意义。代表突变检测手段新进展的变性 高效液相色谱分析( d e n a t u n n gh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，d h p l c ) 技术是探索 人类基因组d n a 序列变异的新方法。该法在接近d n a 融解温度条件下运用离子对反相高 效液相色谱分析技术，通过比较异源双链与同源双链，可以灵敏而准确地发现d n a 变异， 是一种高通量筛选d n a 序列多态性的技术，具有半自动化、快速、检出率高、适合大片段， 等优点，可以明显减少测序工作量，降低成本。尤其适用于旨在发现新突变或新多态性的课 题。目前国内外已有多个实验室和研究中心采用这项技术进行d n a 突变的检测及疾病的相 关性研究。但分析工作是在专利化仪器( w a v e t md n a 片段分析系统) 上进行的。 高效液相色谱仪是一种广泛使用的仪器，高效液相色谱技术也已广泛应用于蛋白质、核 酸以及其他生物活性小分子的分离和纯化。目前，反相高效液相色谱法被公认为是检测核苷、 碱基的较理想的方法之一。如果能在普通高效液相色谱仪上开展单核苷酸多态性及基因突变 的检测分析，无疑对进一步降低成本和该方法的普及应用具有重要意义。 在本论文的工作中，我们在普通高效液相色谱仪上，选用与心脑血管疾病、糖尿病、新 生儿出生缺陷疾病( 如神经管缺陷) 、先天性心脏病等有关的m t h f r c 6 7 7 t 基因，通过优 化色谱条件成功地进行了突变和多态性分析，为基因突变和多态性分析提供了一种具有推广 意义的新方法： 1 在不变温状态下，分析中x 1 7 4 h a e l l i d i g e s td n am a r k e r ，通过考察该d n a 所含11 个 片段的分离情况，特别是仅相差1 0 个碱基对的2 7 1 b p 和2 8 1 b p 两个片段的分离情况优化 h p l c 的色谱分离条件，并验证i r r p h p l c 系统分析检测d n a 片段的能力。实验结果显 示：离子对反相高效液相色谱法分析基因组d n a 具有操作简便、灵敏度高、重现性好、检 测d n a 片段大小范围较宽的特点。 2 运用变性高效液相色谱技术( , d h p l c ) 在普通高效液相色谱仪进行m t h f rc 6 7 7 t 基 因突变扫描的技术探索，提供了一种运用高效液相色谱仪进行基因突变和多态性分析的新方 法。通过实验优化了在普通高效液相色谱仪上进行的，适用于扫描s n p s 的具有普遍适用意 义的色谱条件。d n t p 、p c r 引物与被检测的p c r 产物峰完全分离：纯合子和杂合子样本能 有效区分，建立起在普通高效液相色谱仪上进行m t h f r c 6 7 7 t 基因突变及未知s n p s 扫描 的变性高效液相色谱方法，该方法具有检出效率高、操作简便、谱图易于确认、经济等特点。 3 首次采用全血直接进行p c r 扩增，然后进行d h p l c 扫描分析，以检测是否存在m t h f r c 6 7 7 t 基因突变。实验结果显示；采用d h p l c 技术分析全血p c r 产物，成功地检测出样 本中的杂合子。避免了冗长的血液中提取d n a 的过程，大大减化操作步骤，缩短样本分析 时间，具有临床应用价值。 4 首次采用高效液相色谱法( h p l c ) 分析m s p c r 产物，建立起检测已知核酸序列突 变位点的h p l c m e p c r 分析新方法。该方法灵敏度高、特异性好，是一种快速简便地检 测已知突变的方法，为临床应用奠定了基础。 关键词 高效液相色谱；变性高效液相色谱；聚合酶链反应；m s - p c r ：基因突变和单核 苷酸多态性分析 i i h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y f o rd e t e c t i o no f p o l y m o r p h i s m s a n dm u t a t i o n i nh u m a ng e n o m e a b s t r a c t r a p i dd e v e l o p m e n t si nd n at e c h n o l o g y ，s u c hu sd n ar e s t r i c t i o na n a l y s i s ，p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( p c r ) ，a n dt h ed e t e c t i o no fm u t a t i o n sa n dp o l y m o r p h i s m si nt h ef i e l d so f g e n e t i ca n d m e d i c a lr e s e a r c ha n dc l i n i c a ld i a g n o s i so fi n h e r i t e dd i s e a s e ，h a v ec r e a t e dt h e u r g e n tn e e df o rf a s t a l i a l y r i c a lm e t h o d st oc h a r a c t e r i z em i n u t ea m o u n t so fd o u b l e s t r a n d e dd n a m o l e c u l e ss e v e r a l m e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e dt os c a nf o rp o l y m o r p h i s m sa n dm u t a t i o n so fd n a f r a g m e n t st o a c c o m m o d a t et h i sn e e d d e n a t u r i n gh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( d h p l c ) i sa r e l a t i v e l yn e wm e t h o df o rt h ed e t e c t i o no fh e t e r o z y g o t ed n a s e q u e n c ev a r i a t i o n ，w h i c hi sb u s e d o nt h es e p a r a t i o no f h o m o a n dh e t e r o d u p l e xs p e c i e s b yi o n - p a i rr e v e r s e d - p h a s eh i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( i r - r p - h p l c ) u n d e r p a r t i a l l yd e n a t u r i n g c o n d i t i o n s r e s u l t i n g i n c h a r a c t e r i s t i cp e a k p a t t e r n sb o t hf o rh o m o z y g o u sa n d h e m r o z y g o u ss a m p l e s i nt h i st h e s i s ，w ee x p l o r e dt h e a b i l i t yo f i r - r p - h p l c a to p t i m u mc o n d i t i o n st or e s 0 1 v ed n a f r a g m e n t sa n dp c r p r o d u c t st h em a i nc o n t r i b u t i o n sa l ea sf o l l o w s ： 1d n a f r a g m e n t sa n dp c rp r o d u c t sa r es e p a r a t e db ym e a n so fi o n - p a i rr e v e r s e d p h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o r g a p h yo nac o l u m np a c k e dw i t h3 5 9 i nw i d ep o r ea l k y l a t e ds i l i c m a t r i x o p t i m u mr e s o l u t i o nw a so b t a i n e db yu s i n ga na e e t r o n i t r i l eg r a d i e n ti n0 1 m o l 几t e a a a n dac o l a n mt e m p e r a t u r eo f3 0 c t h i sa l o w e dt h es e p a r a t i o no fd n a f r a g m e n t sd i f f e r i n gi n c h a i n l e n g t ha n dp c rp r o d u c t sc o u l db ea n a l y z e dd i r e c t l yw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 2 ad h p l cm e t h o di su s e dt od e t e c tt h ec 6 7 7 tm u t a t i o no ft h em e t h y l e n e t e t r a h y d i o f o l a t e i i i r e d u c t a s eg e n e ( m t h f rc 6 7 7 t g e n e ) ，w h i c hi sr e l a t e dt or i s kf a c t o r sf o rt h r o m b o e m b o l i cd i s e a s e t h ed h p l c1 2 i nc o n d i t i o n sf o rt h em t h f rc 6 7 7 ti so p t i m i z e d ，a n dt h ek n o w nm t h f rc 6 7 7 t m u t a t i o ni d e n t i f i e db yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) h a sa l s ob e e nd e t e c t e du n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o nt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h i sn e w a p p r o a c hi s as e n s i t i v ea n da c c u r a t ea n d e c o n o m i c a lt e c h n i q u ef o rs c r e e n i n gs e q u e n c ev a r i a t i o ni nh u m a n g e n o m e 3t h ep e rd i r e c ta m p l i f i c a t i o no fw h o l eb l o o d s a m p l e si sa c c o m p l i s h e da n dt h ep e r p r o d u c t s a r ed e t e c t e db yd h p l cf o rt h ef i r s tt i m e t h er e s u l t ss h o wt h i sm e t h o dh a s g r e a tp o t e n t i a lv a l u e i nc l i n i c a lr e s e a r c ha n d a p p l i c a t i o n 4 t h ed e t e c t i o n o f m u t a g e n i c a l l ys e p a r a t e da l l e l e - s p e c i f i cp o l y m e r a s e - c h a i n r e a c t i o n ( m s p c r ) p r o d u c t sh a sa l s ob e e ns t u d i e db yh p l cf o rt h ef t r s tt i m et od e t e r m i n et h em t h f rc 6 7 7 t m u t a t i o n as i m p l ea n ds p e c i f i ca n dc o s t e f f e c t i v e n e s sm e t h o dh a s b e e ne s t a b l i s h e df o rt l l e a n a l y s i so f m s - p e rp r o d u c t sf o rd i a g n o s t i cg e n e t i ca n di i i h e r i t e dd i s e a s e s k e y w o r d s h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；d e n a t u r i n gh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ； p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ；m u t a t i o n sa n dp o l y m o r p h i s m sa n a l y s i s 附件四 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：雨阿 日期：。一弓年7 月争日 附件五 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：商加 指导教师签堡! j 垂毛= 7 2 n 日期：阳口j 年7 月争日 日期：户一7 月7 日 上海交通大学学位论文答辩决议书 p 所在学科 复【司饥了 申请者 i ，( 吝i k l 丫( 专业) 论文题目 畜j i 淑孑乜毛矗：蔫i 目乏妻翱吓乎内乏 习矗于宅 答辩日 | j j 炒7 牛 地点 1 成至蔼 醇淳数、至 答辩委员会成员 姓名单位职 称签名 受是蔓( 司卉t 弓仳i i 。钕百蠡共艘 宅令车 ， 、j一 二 数才y甓艺事1 扫灰 儿2 - 7 co 他，毛七文也艺j 饥le 彩力 锄彬晷 融蚴支厕芒，i 了仇、1p 乙万壹我廓 酋f 科支、怠芒f1 r 比2 ( 力e 己 可支 茜话l 评语和决议： 鼬肴一卜附纪人类颦圳组整体捌序的笈雕，探索些蚓鲥d n “序列变异的 任务变得1 分迫剀。寝胜尚通鼍技术以大规j 高教地检剥单棱苷酸多态性或突变足目前肇h 组计划的前沿弹题之。而竹统 的分析a 泣擞n 裂m 或城水出贵，而空性扁敲锻树也许址近儿午发艟起柬的靛剃性i 突变的新技术，爿已竹商品化帕利仪器。 本沦史在谰研喇内外人最桐芙- ：c ：献的基础h 选抒柱曾遥高就被州色谱t 进 单定监分析f 1 为研究诽题对在生命科学止其 盐临床艋田饴断中建讧低成本、可推广怕新h 挂，鼎啊1 分重竖意义。 沦史自先祚好岫高教液舯1 也嘴i ：运川离子对反年h 也谱技术对h x l 7 4 ，h a d l l d i g e s td n a 的i 】十片段进 丁分离条件曲探 索证实了该技术分析蚺l n 绀d n a 的能山；随后建巾了姐l l 艇网氢已酸j 丕原酶纂博【突变和多志性分析的变性_ f i i 敬泄十h 包4 疗法 j f ：口提将仝咖p c rj “物阿接m 川丁蹙性矗拙 f | f 七h 包卅丹析街剑了较弹姆的结粜。另外，迁计法将多靶p c r 技术与h p l c 救 术结鞋胜丁l 三知i 突变f 向检测冉沾。以1 ：结粜花l 床单协愀 商睁断方| f | j n nj 泛晌心nj 1 宵浆。 木醣史的琏避新颖研究思路年【空转议汁卉磨、数据瑚寓、结粜一脊：硷爻条理诗楚、f s 写艇旭。表明论文作舌u 经n 备 扎蛮的胖淹礁1 l ：| ：和桐戈的业知诅! h 蔷了独0 从啦科学研究f 门证好幕厩_ f 【i 能力。论文答辩过程中。表达清晰能准确蔷坪 叠提的脚翘， 绵i 符辩委员会鼓认为作者的t 作已纶达l 坝1 学他的要求柴通过作右的论义等辩，建议授下砸 ：学位， 表决结果： 支量一敬遍乏 铲e 答辩委员会主臂j 狮 ( 签名) 第一章绪论 随着二十一世纪人类基因组整体测序计划的发展，探索基因组d n a 序列变异的任务变得十分 迫切。d n a 序列变异绝大多数是单核苷酸的改变，大规模的单核苷酸变异检测无论对于含有大量 外显子的单个基因，还是引起多因子疾病的多个基因，都是巨大的技术挑战。发展高通量技术以 大规模高效地检测单核苷酸多态性或突变，是目前基因组计划的前沿课题之一【lj 。到目前为止， 人类基因组作图的遗传标记已经历三代变化：( 一) 限制性酶切片段长度多态。陛( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ，( 二) 短串联重复序列( s h o r t t a n d e mr e p e a t ，s t r ) ，( 三) 多态性标 记- 单核苷酸的多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) ”。由此可见遗传图谱的制作日趋 精密。如果能确定这些在d n a 链上间隔不大的特殊标记的确切位置，将有助于发现人类主要疾 病如哮喘、糖屎病、动脉粥样硬化、精神分裂症和癌症等的相关基因f s 。因此，突变和多态性的检 测变得日趋重要。 1 1 基因突变及单核苷酸多态性 基因是d n a ( 有时r n a ) 分子上具有遗传学效应的核苷酸顺序，存在于细胞核的染色体内。 真核生物的体细胞里每条染色体都有其另一条同源染色体，即染色体是成对存在的，所以体细胞 是二倍体( d i p l o i d ) 细胞，二倍体细胞每一个基因也是成对存在的，每一对基因分别位于来自双 亲的染色体的同一位置上，称为一对等位基因( a l l e l e ) 。当一个生物体带有一对完全相同的等位 基因时，则该生物体就该基因而言是纯合的( h o m o e y g o u s ) ，称为纯合子( h o m o z y g o t e ) ：反之， 如果一对等位基因不相同，则该生物体是杂合的( h e t e r o c y g o u s ) ，称为杂合子( h e t e r o z y g o t e ) 。 d n a 是由许多脱氧单核苷酸组成的线形双螺旋大分子，其基本组成为碱基、脱氧核糖和磷酸， 带有负电荷的戊糖磷酸骨架在分子的外侧，碱基则平面堆积于螺旋的内部。形成碱基间配对连接 的氢键是非常弱的键，由于互补链之间有着众多的碱基对，所以在生物条件下从来不会自发地分 开。但如果在高温下d n a 分子的氢键就会遭到破坏，于是双螺旋结构解离成两条互补链，这一 过程称为变性( d e n a t u r a t i o n ) 。变性后的互补链再回到正常条件下，又会重新连接成双螺旋结构， 这一过程称为复性( r e n a t u r a t i o n ) 。 1 1 1 基因突变 人类和各种生物细胞的遗传信息是相对稳定的，但在一定内、外环境因素的影响下，遗传物 质可能会发生变化。这种变化及其所引起的表型( 用于描述突变对有机体的影响) 改变称为基因 突变( m u t a t i o n ) ，它是一种遗传状态，d n a 分子内的突变经常影响它所编码的信息，基因突变是 生物界中存在的普遍现象。事实上，正是数百万年来d n a 内积累的变化使得一个物种的遗传物 质区别于其他物种。突变也产生一些较小的变化，使得同一物种的个体之间有所区别。少数情况 下，突变能给生物带来某种好处，然而，大部分突变是有害的，人类数以干计的遗传性疾病即是 由突变造成的。在人的一生中，发生于体内细胞韵突变可能导致多种疾病。最明显的就是癌症卜“。 1 1 1 1 基因突变的诱因 基因突变是基因组d n a 分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变，并引起个体表 型的改变。引起突变的因素广泛存在于机体内外的环境中，主要有以下三种： 物理因素如紫外线、电离辐射( 如x 线) 等： 化学因素如羟胺、烷化剂、亚硝酸盐和碱基类似物等： 生物因素如麻疹、风疹等的病毒及真菌、细菌产生的毒素( 如黄曲霉素) 等。 1 1 1 2 基因突变的分类 基因突变有多种分类方法，按照突变生成的过程分为自发突变和诱发突变。在自然条件下， 不管是由于自然界中突变剂的作用，还是由于偶然的复制错误而发生的突变都称为自发突变 ( s p o n t a n e o u s m u t a t i o n ) ，自发突变的频率较低，基因的每一核苷酸突变率平均为l o l o 。1 0 。相 反，如果使用突变剂处理生物体而产生的突变称为诱发突变( i n d u c e dm u t a t i o n ) 。诱发突变的频率 比自然突变的频率高得多( 千倍以上) ，而现在可以在离体条件下进行定向突变( 定向诱变) 。 按照突变发生的细胞种类不同分为生殖细胞突变和体细胞突变。基因突变发生在生殖细胞中， 称为生殖细胞突变( g e n e r a t i v em u t a t i o n ) 。此突变基因可通过有性生殖遗传给后代，并存在于子代 的每个细胞。基因突变发生在体细胞中，称为体细胞突变( s o m a t i cm u m t i o n ) 。对于有性生殖的生 物来说，这种基因突变不会传递给子代，但可传递给由突变细胞分裂所形成的各代子细胞，在细 胞中形成突变细胞群，它可能成为病变甚至癌变的基础。除基因组d n a 突变外，2 0 世纪8 0 年代 以来，对体细胞中线粒体d n a ( m t d n h ) 的深入研究，已经发现体细胞m t d n a 突变可累及脑、心脏、 2 骨骼肌、肾脏和内分泌等多种器官和组织，造成人类多种疾病，而且体细胞m t d n a 突变可随年龄 增加，并与人类衰老及老年退化性疾病的发生相关。 按照d n a 碱基序列改变情况不同，可将基因突变分为：点突变、碱基插入突变和碱基缺失 突变。点突变( p o i n tm u t a t i o n ) 是指d n a 分子中单个碱基的改变，主要是碱基替换( b a s e s u b s t i t u t i o n ) ，碱基替换又可分为： 转换( t r a n s i t i o n ) 即嘌岭被嘌呤取代或嘧啶被嘧啶取代的变化； 颠换( t r a n s v e r s i o n ) 即嘌呤被嘧啶取代或嘧啶被嘌呤取代的变化，如图1 1 所示。 a g i i t c 转换 _ 颠换 a ：腺嘌呤( a d e n i n e ) g ：鸟嘌呤( g u a n i n e ) c ：胞嘧啶( 毋 t o s i n e ) t ：胸腺嘧啶( t h y m i d i n e ) 囤卜l 转换和颠换 f i g 1 - it r a n s i t i o na n dt r a n s v e r s i o n 碱基插入突变( b a s ei n s e r t i o n ) 是指基因组d n a 链中插入1 个或多个碱基对，这种突变可以 引起其后d n a 序列的阅读框改变。 碱基缺失突变( b a s ed e l e t i o n ) 是指基因d n a 链中1 个乃至小片段的碱基对发生丢失所致的 突变，这种突变也可引起其后d n a 序列的阅读框的改变。 1 1 2 单核苷酸多态性 突变通常是指那些可以或可能影响基因表达水平或基因功能的d n a 序列的变化。但是人群 中还存在一种d n a 序列多态性( p o l y m o r p h i s m ) ，即在进化过程中已经在人群中积累起来的d n a 序列变化。在正常条件下这种变化不会严重影响基因的功能状态和基因携带者的生存和生育能力。 绝大多数的d n a 多态性属于两种基因型状态并存的单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) ，它是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列的多态 性，b pd n a 序列中单个核苷酸的差别。s n p s 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变 异可能是转换( cht ，在其互补链上则为gh a ) ，也可能是颠换 ( c h a ，g t ，c 十g ，a t ) 。转换的发生率总是明显高于其他几种变异，具有转换型变 异的s n p 约占2 3 1 7 j 。转换的几率之所以高，可能是因为c p g 二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基 因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因组d n a 中，任何碱基均有可能发生变异，据估计在人类基因组3 0 亿对碱基中每千个 核苷酸就有一个以上的s n f s ，因此，整个入类基因组中共有3 0 0 万以上的s n p s ，它是人类可遗 传变异中最常见的一种，与限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， r f l p ) 和短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 比较，s n p s 更丰富地存在于基因组中。s n p s 既有可能在基因序列内，也有可能在基因序列外的非编码序列上。总的说来，位于编码区内的 s n p s ( e o d i n gs n p sc s n p s ) i ；p 较少( 约有2 0 万个) ，但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义。 由于每个s n p s 位点通常仅含一对等位基因即双等位基因( b i a l l e l i c ) ，故在基因组筛查s n p s 往往 只需要十的分析”j ，而不用分析片段的长度，这就为发展自动筛查s n p s 的技术提供了方便。 1 1 3s n p s 的应用 1 1 3 1s n p s 作图 如前所述，s n p s 在同一位点上较少的多态性和在基因组中的丰宦性，使之适合于被自动化大 规模扫描，成为继s t r 之后最被推崇的作图标记。 s n p s 用作遗传标记具有以下优点： ( 1 ) s n p s 在人群中是二等经基匾性的，在任何人群中其等位基圆频率都可估计出来。 ( 2 ) 它在基因中的分布较微卫星广泛得多。 ( 3 ) 与r f l p 和s t r 相比，s n p s 是高度稳定的，尤其是处于编码区的s n p s ( c s n p s ) ，而前 者的赢突变率容易； 起对人群的速传分析出现固滩。 ( 4 ) 部分位于基因内部的s n p s 可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它 们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。 ( 5 易于进行自动化分析，缩短了研究对阉。 1 1 3 2s n p s 在疾病相关基因研究与药物设计中的应用 s n p s 之所以引起几乎整个生命科学领域的重视，不仅因为它是一种理想的作图标记，更在于 它可以成为研究基因组多态性和识别、定位疾病相关基因的一种新工具。s n p s 被认为是一种能稳 定遗传的早期突变，与疾病有着稳定的相关性。多数研究者认为。如果能确定这些在d n a 避上 间隔不大的特殊标记的确切位置，将有助于发现人类主要疾病的相关基因，如哮喘、糖尿病、动 脉粥样硬化、精神分裂症和癌症等的主基因。此外，存在于编码区及其紧邻上下游序列中的 4 s n p s ，可以改变基因的表达水平和表达产物的功能。如人类编码m u 鸦片受体序列上的a 1 1 8 g s n i p 可使受体对b e a t 内啡肽的亲和力提高3 0 0 倍以上 9 又如c y p 2 d 6 基因被认为与2 0 的处方药在 体内的代谢过程相关【”】，已定位在这个基因上的多个多态位点将为针对特殊人群制定合理的服药 剂量提供依据。这类s n p s 直接关系到人类对疾病的易感性，对环境园子及药物的反应。随着遗 传变异研究与药物基因组学的结合，根据特定个体的多态性来设计药物将成为可能。因此筛查并 理解这些s n p s ，将会给疾病的诊断、防治带来革命性的进步。 此外s n p s 还能够在身份鉴定、群体进化研究等方面提供强有力的工具。所以s n p s 的研究 倍受关注，特别是对未知s n p s 的筛查己越来越显示出重要性。 1 1 4 基因突变及多态性的检测方法 随着二十一世纪人类基因组整体测序的发展，在基因研究、分子诊断和癌研究等领域，突变 和多态性的检测变得曰趋重要。目前人类基因组计划产生大量的遗传学信息，分子遗传学家正致 力于研究新发现的基因突变情况及基因多态性与人类疾病的相关性，以进一步了解人类遗传多样 性和疾病发生发展的分子机理。因此，发展高精度的快速自动化分子遗传学检测系统显得尤为重 要。 理想的突变检测方法应具有如下特征：可检片段长达上千个碱基、具有1 0 0 的检测效率、 无假阳性或假阴性结果、操作流程简单、无需复杂的仪器设施、不涉及有毒害试剂、耗时少且花 费低，能够鉴别出固有突变并获得很好的一致性结果。但至今为止还没有找到一种具有上述全部 优点的方法，因此往往需要根据所测突变是已知还是未知、突变的性质、基因的大小和结构、所 需的检测灵敏度及可能获得的样品等等加以选择作出最佳组合，用不同的方法来完成突变及多态 性的检测。 1 。1 4 1 单链构象多杰性分析 单链构象多态性( s i n g l e - s t r a n de o n f o m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 分析是基于单链d n a 分子 具有不同的构象。当d n a 链上单个碱基发生变化时，往往会引起其构象的差异，这种差异将造 成野生型( 正常) 和突变型单链d n a 电泳迁移率不同，从而可用于d n a 中单个碱基的替换、微 小的缺失或插入的检测，s s c p 分析方法的优点是简单易行、仪器要求很低，既能用于未知突变 的扫描又能用于已知突变的检测，是一种应用较广泛的基因突变分析方法。 毛细管电泳一s s c p 分析已成为一种基因突变检测新方法，并己应用于p 5 3 抑瘤基因1 3 致瘤基因、m t h r f 基因、c b s 基因、f a c t o t v 基因【1 6 - 18 1 、h e f 基因【l 9 - 2 0 】及l d l 受体基因弘2 ” 突变分析。但是s s c p 的差异灵敏度很低，并不能检测到所有的d n a 突变。一般认为s s c p 只能 检测到3 0 一7 0 的突变，且这种方法分析时间长，往往需要几小时和十几小时，很难满足自动 化的需要，难以大规模的开展工作 2 4 】。 1 1 4 2 变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n t g e le l e e 廿o p h o r e s i s ，d g g e ) 是基于未解链的和部分解 链的d n a 在部分失活条件下具有不同的淌度。这种部分失活条件是通过加入变性剂( 如尿素或 甲酰胺) 或升高温度而获得的。该方法要求被分析的d n a 片段含有两个不同的解链温度区，即 高温解链区和低温解链区。当突变存在于低温解链区野生型和突变型d n a 的解链温度不同， 会导致淌度的差异，使突变能被检测；当突变发生在高温解链区，野生型和突变型d n a 的解链 温度差异很小，在这种情况下突变不能被检测。有两种途径可避免突变漏检的可能性：一是将野 生型d n a 样品( 作为控制) 与待分析的样品混合，使潜在的纯合突变样品转化为杂合子样品。 再通过热变性解链和复性过程，纯合突变d n a 与野生型d n a 错配形成异源双链d n a 。异源双 链d n a 的解链温度一般比同源双链d n a 的解链温度低6 左右口“。另一种是在待分析的d n a 片段上加个3 0 - - 6 0 碱基对( b p ) g c 夹子，使待分析d n a 片段变成了低温解链区，而g c 夹 子构成了高温解链区。 d g g e 技术检测片断大于5 0 0 b p ，长度上优于其它方法，无需放射标记，是一种快速易行最 适于常规筛查小片断的突变检测方法。这种方法能获得1 0 0 的可检测度。 1 1 4 3 杂合子分析 杂合子分析( h e t e r o d u p l e xa n a l y s i s ，h e t ) 是基于同源和异源双链d n a 在非失活条件下具有 不同的淌度。将杂合型d n a 或者潜在纯台突变型与野生型( 控制) d n a 混合，经过热变性解链 和复性过程，形成异源双链d n a 。这种方法操作简单，可用于未知突变的扫描和己知突变的检测， 主要缺点在于对单点突变可检测度低口5 1 。 1 1 4 4 化学错配切割法 化学错配切割法( c h e m i c a lm i s m a t c hc l e a v a g e ，c m c ) 是基于异源双链d n a 能够被某些特殊 化学试剂切割。该法首先以羟氨和四氢化锇为化学探针，分别选择性地修饰错配d n a 碱基，然 6 后用吡啶切割修饰后的碱基。这种方法可用于已知突变的检测和未知突变的扫描，能够分析较大 的d n a 片段，可检测度达到1 0 0 ，该方法的映点是使用有毒的化学试剂。 1 1 4 5 限制性长度多态性分析 限制性长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 使用限制性内切酶 识别和酶解特定的d n a 序列，是一种常用的突变检测方法。某些突变往往会产生限制性内切酶 的位点或使酶切位点消失。但在大多数情况下，突变并不改变酶切位点，因此，需要用诱变p c r 技术引入人造酶切位点。毛细管电泳r f l p 分析已应用于癌症、老年痴呆症及心血管疾病的诊断 2 6 - 3 0 。任吉存等将毛细管电泳一激光荧光方法用于m t h f r 基因两种常见突变c 6 7 7 t 和a 1 2 9 8 c 的检测”。由于该方法突变检测的视野较窄，通常只用于检测那些己知的、改变限制性内切酶识 别位点序列的d n a 突变，而不用于搜索未知d n a 突变j 。 1 1 4 6 等位基因特异性扩增反应 等位基因特异性扩增反应( a l l l e l - s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o n ，a s a ) 分析方法是采用两种特定的引 物( 一种与野生型d n a 序列互补，另种与突变型d n a 序列互补) ，分别在两管中扩增各自的 等位基因。当引物与靶基因序列互补时，扩增反应能够进行：反之扩增反应受阻。a s a 是一种检 测已知突变有效的方法。任吉存等根据等位基因特异性扩增原理提出了一种能同时检测m t h f r 基因c 6 7 7 t 突变和f a c t o r v 基因g 1 6 9 1 a 突变的新方法叫”。 1 1 4 7 寡核苷酸探针杂交 寡核苷酸探针杂交( a l l e l es p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n ，a s o h ) 是一种检测己知突变 的传统方法，这种方法主要基于人工合成的低聚核苷酸探针能够杂交于靶基因d n a 的互补序列 中。电泳和非电泳方法可用于杂交产物的检测。最近芯片技术已成功地应用于杂交反应，使杂交 方法获得了突破性进展。使用核菅探针时，杂交反应需要在高浓度盐溶液中进行，在进样前需要 对样品进行脱盐处理。最近一种新型模拟核酸化台物一肽核酸( p n a ) 作为探针已成功地用于杂 交反应m j 。p n a 是一种电中性化台物，在低盐的条件下能迅速地杂交于靶基因上，杂交产物不需 要脱盐，能用毛细管电泳直接检测。毛细管电泳激光荧光法与p n a 探针结合可能成为一种检测 已知突变的高效方法。 7 1 1 4 8 引物扩展( 微序列分析) 引物扩展是基于引物3 端不同的单个碱基扩展反应。在引物3 一端相邻位点处，只有当标记 的单核苷酸与靶基因互补时，引物扩展反应才能进行。初始方法由于使用放射性同位素标记法， 野生型和突变型等位基因扩展反应分别在两管中进行。现行方法采用多色荧光标记法，野生型和 突变型等位基因扩展能够在同一管中进行。引物扩展也是一种检测己知突变的有效方法，它的缺 点是操作麻烦，需要用p c r 方法制备引物扩展所需的模板d t 、a e 2 ”。 1 1 4 9d n a 芯片技术 d n a 芯片技术( d n ac h i p s ) 是近年来新开发的一种d n a 序列变异检测工具，d n a 芯片( d n a c h i p ) 也称为生物芯片( b i o c h i p ) ，d n a - c h i p 代表了分子生物学检测技术的的发展趋势，这种方法 虽初是为快速测序而构思形成的，它将微电子芯片制造技术、杂交荧光显色技术融合在一起，在 1 c m 2 的以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的d n a 纤维“地毯”， 即具有特定碱基序列的探针，用不同荧光化学物质标记的突变型和野生型d n a 单链，注射到嵌 有芯片的载片上，由于d n a 和探针杂交的过程与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据 荧光强弱检测序列找出突变【。目前已有多家公司开展了对芯片的研究，如美国的a f f y m e t r i x 公 司开发出的b r c a l ( 乳癌基因1 号) 芯片、p 5 3 芯片等，而n e n 生命科学公司则在一张玻璃芯 片上集成了多达2 4 0 0 个已知基因。此外，r e s e a r c hg e n e t i c s 公司新近开发了一个集成有1 5 0 0 个 s n p 的d n a 芯片，它涵盖了人类基因组全部2 4 条染色体，所提供的信息量至少等于或优于目前 常用的3 0 0 - - 4 0 0 个微卫星标记的图谱，检测时只需o 5 p g d n a 样品就可进行一次全基因组的扫描 ”“。d n a 芯片的并行分析能力是传统生物学方法所不能比拟的，具有良好的发展前途。但将其 常规地应用于疾病诊断尚需时问，这是因为目前已经了解所有突变异常的基因数量还很有限并 且芯片的制作成本仍然较高，这些因素限制了它的应用。 1 1 4 1 0d n a 序列分析 d n a 序列分析( d n as e q u e n c i n g ，d s ) b p g 接对疾病样品中的目标基因进行d n a 序列分析是 对d n a 突变进行检测的最终方法。通过直接的序列分析检测d n a 突变时，一般易采用p c r 方 法，先获得目标d n a ，然后对p c r 产物进行分析。在许多情况下，直接的d n a 测序是一种低效 率的方法，理想的情况是有一种d n a 突变检测方法，能够先把突变定位在一一个较短的、一次测 8 序反应能够覆盖的d n a 片段内并把含有相同突变的d n a 片段在测序之前就进行归类，然后通 过序列分析明确突变的种类和位置】。 1 1 4