（分析化学专业论文）原子力显微镜用于细胞表面结构与性质的研究以及单碱基错配的检测.pdf

博 ：学位沦文 摘要 生物大分子所构筑的细胞表面( 细胞壁、细胞膜) 是细胞与外界环境间进行 物质和能量交换的屏障，也是一些物理、化学因素作用于细胞的靶点之所在。在 纳米水平上研究细胞表面的基本结构及其受外界环境作用前后的变化，对于认识 细胞表面结构与功能之间的关系，全面评价药效并对药物合成路线提供参考都具 有重要意义。另一方面，单碱基错配的检测对于从分子水平上阐明多种疾病形成 的原因，实现基因水平的治疗都是至关重要的前提条件。发展具有高灵敏度、高 选择性的单碱基错配检测方法势在必行。上述两个研究领域都已经成为生物分析 化学研究的前沿和热点。 本论文以上述科学问题为研究目标，充分利用原子力显微镜( a f m ) 能够在 大气及液下高分辨成像和对微弱相互作用力敏感的优势，表征了不同药物以及脉 冲电场( p e f ) 对细菌细胞壁表面形态和构成的影响，考察了细胞在大气氛和液 下成像的条件，发展了基于力测定并结合发夹型探针的高灵敏、高选择性的单碱 基错配检测方法。主要内容归纳如下： l 、基于a f m 大气氛中成像，研究天然与半合成内酰胺类抗生素对大肠杆菌 形态的影响。选择具有微小分子结构差别的天然( 青霉素) 和半合成( 阿莫西林) 抗生素，分别对大肠杆菌进行作用。利用a f m 大气氛中制样简便、轻敲模式成像 分辨率高、样品损伤性小的优势，对药物的作用效果进行了表征。观察到这两种 药物在细菌表面造成的纳米水平上小孔状损伤的密度和发生位点均存在区别，从 形态学角度解释了阿莫西林比青霉素药效强的原因。作为对照的氧氟沙星未使细 菌表面出现显著的损伤。该结果在纳米水平上证明了不同抗生素的药效，同时也 表明a f m 能够为研究药物分子结构与作用效果的关系提供新的表征手段。 2 、结合a f m 液下成像和力测定两种技术，研究了p e f 对细菌表面结构与构成 的影响。对通过静电吸附固定于基底上的细菌样品，原位施加不同剂量的p e f ， 表征了菌体形态及其与a f m 探针的相互作用力的变化。结果表明随着p e f 剂量的 增加，细菌表面损伤的程度逐渐增大，具体表现为细菌数目的减少、相互作用力 的增大以及力曲线上出现多粘附相互作用特征区。对照实验表明相互作用力的变 化是由于细胞壁外层的肽聚糖分子网络状结构被破坏，从而使内膜中的蛋白组分 暴露所致。该结果在分子水平上证明了p e f 对细菌表面的影响，同时也表明a f m 是研究细胞表面组分变化与外界物化刺激之间相互关系的强有力的工具。 3 、气氛中及生理环境下a f m 细胞成像的实现及条件优化。首先，比较了三 种常用的固定剂对三种细胞在大气氛中成像效果的影响。其中，o 5 的戊二醛具 有对细胞细微结构的最佳保留能力。在此基础上，进一步考察了扫描速度和不同 i i 博上学位论文原子力显微镜用于细胞表面结构与性质的研究及单碱基错配的检测 培养基环境对细胞液下成像的影响并进行了条件优化。贴壁生长的肾系膜细胞和 肾小管上皮细胞均可在培养基中直接进行成像，细胞骨架清晰。该结果为将a f m 成像和力测定及其联用技术应用到细胞水平搭建了一座桥梁。 4 、a f m 力谱分析用于增强发夹型探针的单碱基错配检测能力。我们将探针 与完全互补和一系列含有不同类型单碱基错配的互补序列分别修饰到针尖与基底 上，通过测量探针与完全互补以及错配序列之间的相互作用力，对单碱基错配进 行检测。不同于荧光检测时灵敏度受到碱基错配位置和序列中g c 含量的显著影 响，这种分子水平的相互作用在检测时不受错配碱基类型和位置的影响，均可实 现高灵敏度检测。该方法解决了在利用荧光方法检测单碱基错配时，发夹型探针 存在的序列依赖性问题，大大增强了发夹型探针的错配检测能力。 关键词：原子力显微镜：液下成像；力测定：细胞；抗生素；脉冲电场；发夹型 探针 i i i 博t 学位论文 a bs t r a c t c e l le n v e l o p e ，i n c l u d i n gc e l lw a l la n dc e l lm e m b r a n ei st h ei n t e r f a c eb e t w e e n c e l la n do u t e re n v i r o n m e n tf 0 rm a t e r i a la n de n e r g ye x c h a n g e i ta l s op r o v i d e s p r o t e c t i o no fc e l lo r g a n e l l ea n dt a r g e ts i t e sf r o mc h e m i c a lo rp h y s i c a ls t i m u l a t i o n s t h ei n v e s t i g a t i o no fc e l le n v e l o p ea tt h en a n o m e t e rl e v e li sv e r yi m p o r t a n ti n u n d e r s t a n d i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni t ss t r u c t u r ea n df u n c t i o n 。c o m p r e h e n s i v e l y e v a l u a t i n gt h ed r u ge f f i c a c ya n dp r o v i d i n ge v i d e n c et o w a r dt h ed e v e l o p m e n to f m e d i c i n e s o nt h eo t h e rh a n d ，t h ed e t e c t i o no fs i n g l eb a s em i s m a t c hi sc r i t i c a lt o i l l u m i n a t et h en o s o g e n e s i so fs o m ed i s e a s ea n dr e a l i z et h eg e n et h e r a p y ，w h i c h a p p e a l su st od e v e l o pc o n v e n i e n t ，a c c u r a t ea n ds e n s i t i v ea s s a y s b o t ho f 也ea b o v e t w oi s s u e sa r et h ep r o m i s i n gd i r e c t i o n si nb i o a n a l y t i c a lc h e m i c a lr e s e a r c h ，a n d d e s e r v ed e v o t i o no fa n a l y t i c a lc h e m i s t s i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，u t i l i z i n gt h ea d v a n t a g eo ft h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，i n c l u d i n gt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h es u r f a c et o p o g r a p h ya tt h ea t o m i cl e v e l a n dt h em e a s u r e m e n to fi n t e r m o l e c u l a rf o r c e sa sl o wa s1o - l 上n( p n ) g r a d e ，w e i n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to fd i f f e r e n ta n t i b i o t i c sa n dt h ep u l s e de l e c t r i cf i e l d ( p e f ) o n c e l le n v e l o p e ，e s t a b l i s h e d t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nf b rt h ec e l li m a g i n ga n di m p r o v e d t h ed e t e c t i o na b i l i t yt o w a r dt h es i n g l eb a s em i s m a t c ho nt h eb a s i so ft h eh a i r p i np r o b e t h em a i nr e s e a r c h e so ft h i sd i s s e r t a t i o na r es u n l n l a r i z e da sf o l l o w s ： 1 a f ms t u d yo fd i f 诧r e n te f f e c t so fn a t u r a la n ds e m i s y n t h e t i c l a c t a mo nt h e c e l le n v e l o p eo fe c o z f t h ed i s t i n c te f 托c to fa m o x y c i l l i na n dp e n i c i l l i nh a sb e e n i n v e s t i g a t e du s i n gt a p p i n gm o d ei m a g i n gi na i r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l t h o u g h a m o x y c i l l i na n dp e n i c i l l i nc o u l db o t hi n d u c en a n o p o r o u sd a m a g et ot h ee n v e l o p eo fe c d z i ，t h ed i s t r i b u t i o no ft h ep o f e sw a sd i f 代r e n t ：t h o s ei n d u c e db yp e n i e i l l i nw e f e r a n d o m l yd i s t r i b u t e do nt h ec e l ls u r f a c e ，w h i l et h o s ei n d u c e db ya m o x y c i l l i nw e r ef a r m o r en u m e r o u sa n dm a i n l yo nt h et w oe n d so ft h ec e l l t h e s ef i n d i n g sc o u l de x p l a i n w h yt h ee f 托c to fa m o x y c i l l i ni ss t r o n g e rt h a nt h a to fn a t i v ep e n i c i l l i n o n o x a c i nw a s u s e da sac o n t r o ld u et oi t si n a c t i v em e m b r a n e ，a n dn oc e l lw a ud a m a g e sw e r e o b s e r v e d i th a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a ta f mi sau s e f u lt o o li nd i s c e r n i n ga n d v e r i f y i n ga n t i b i o t i cm e c h a n i s m sa tn a n o m e t e rl e v e la n dc a nb eh e l p f u l t oe x p l a i nt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h e m i c a ls t r u c t u r ea n dt h ef u n c t i o no f a n t i b i o t i c s 2 t h ee f f e c to fp e fo nt h ec e l le n v e l o p ec o m p o n e n t so f 爱9 p f 如，m f 疥sw a s i n v e s t i g a t e db yt h ec o m b i n a t i o no fa f mi m a g i n ga n df o r c em e a s u r e m e n tu n d e rp b s i v 旦圭学位论文原子力显微镜用于细胞表面结构与性质的研究及单碱基错配的检测 t h et o p o g r a p h yo fb a c t e r i aa n di n t e r a c t i o nf o r c eb e t w e e nb a c t e r i a le n v e l o p ea n dt i p w a sp r o b e di n s i t ub e f o r ea n da f t e rd i f f e r e n t d o s a g e so fa p p l i e dp e f t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ei n t r o d u c t i o no fp e fw o u l dd e c r e a s et h ea m o u n to ft h ei m m o b 订i z e d c e l la n di n d u c et h em u l t i u n b i n d i n gf o r c eb e t w e e na f m t i pa n dt h ec e l ls u r f a c e ，b o t h o fw h i c h 、v e r em o r eo b v i o u sw i t ht h ei n c r e a s i n gd o s a g eo fp e f i tw a sd e d u c e dt h a t p e fc o u l di n d u c et h ec o l l a p s eo ft h ep e p t i d o g i y c a nl a y e ra n dt h e nt h ee x p o s u r eo ft h e p l a s m am e m b r a n e ，w h i c hw a sf u r t h e rc o n f i r m e db yt h ee f c to ft h el y s o z y m ea n d h e a to nt h eb a c t e r i a le n v e l o p e t h e 山o v ec o n c l u s i o n s o f f e r e ds t r o n ge v i d e n c ef o rt h e b a c t e r i c i d a lm e c h a n i s mo fp e fa tt h em o l e c u l a rl e v e l ，a n dd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea f m i sa p q w e r f - u lt e c h n i q u et oe x p l a i nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec h e m i c a lc o m p o n e n t c h a n g eo ft h ec e l l u l a re n v e l o p ea n dt h ee x t e r n a ls t i m u l a t i o n 3 c e ui m a g i n gw a sr e a l i z e di na i ra n du n d e rl i q u i d ，a n dt h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d f i r s t ，t h r e ek i n d so fc e l lf i x e dw i t hd i f f e r e n tf i x a t i v e s w e r ei m a g e di na i ra n dt h eq u a l i t i e so fi m a g ew e r ee v a l u a t e di n d i v i d u a l l y a m o n g t h e m ，o 5 g l u t a r a l d e h y d ek e p tt h ef i n es t r u c t u r eo fa l lc e l l s t h e n ，a 1 1t h e s ec e l l s w e r es u c c e s s f u l l yi m a g e du n d e rp h y s i o l o g i c a lm e d i a 。t h ee f 诧c to ft h es c a nr a t ea n d d i f f b r e n tm e d i u mo nc e l li m a g i n gw a si n v e s t i g a t e d b o t hm ca n dn r k c e l lc o u l db e i m a g e dw i t hc l e a rc e l lc y t o s k e l e t o ni nt h ec u l t u r em e d i u ma n dt h ed u r a t i o nw a sa b o u t o n eh o u r t h e s er e s u l t sp a v e dt h ew a yf o rt h ef u r t h e rc e l li n v e s t i g a t i o nb a s e do na f m t e c h n i q u e 4 u s i n gf o r c es p e c t r o s c o p ya n a l y s i st oi m p r o v et h ep r o p e r t i e so ft h eh a i r p i n p r o b e t h es e n s i t i v i t yo fh a i r p i n p r o b e b a s e df r e tn u o r e s c e n c e a n a l y s i sw a s s e q u e n c e - d e p e n d e n ti nd e t e c t i n gs i n g l eb a s em i s m a t c h e sw i t hd i f & r e n tp o s i t i o n sa n d i d e n t i t i e s t h r o u g hm o d i f i e dt i pa n ds u b s t r a t ew i t hh a i r p i np r o b ea n dc o m p l e m e n t a r y s e q u e n c ei n d i v i d u a l l y ， t h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t yo fs i n g l e b a s em i s m a t c hw a s s y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e db yf o r c es p e c t r o s c o p ya n a l y s i s t h eu n e v e nf l u o r e s c e n c e a n a l y s i ss e n s i t i v i t yw a so b v i o u s l yi n f l u e n c e db yt h eg cc o n t e n t sa sw e l la st h e l o c a t i o no ft h em i s m a t c h e db a s e h o w e v e r ，f o r c es p e c t r o s c o p ya n a l y s i sd i s p l a y e da h i g ha n de v e ns e n s i t i v i t yi nd e t e c t i n gd i f f e r e n t l ym i s m a t c h e dt a r g e t s t h i sc o u l db ea n a l t e r n a t i v ea n dn o v e lw a yt om i n i m i z et h es e q u e n c e - d e p e n d e n te f f e c to ft h eh a i r p i n p r o b ea n dt oe n h a n c et h ep r o b ea b i l i t yi nm i s m a t c hd e t e c t i o n k e y w o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ；i m a g i n gu n d e rl i q u i d ；f o r c em e a s u r e m e n t ； c e u ；a n t i b i o l i c s ；p u l s e de l e c r i cf j e l d ；h a i r p i np r o b e v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名： 杨柳日期：z 矽6 孑年弓月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囤。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 协数 日期：年月 日 日期：蜥年夕月即日 博j ：学位论文 第1 章绪论 人们对未知世界探索能力的提高总是与研究手段的不断发展密切相关。作为 人类文明史上最伟大的发明之一，显微镜把更具体，更真实、更有趣的世界展现 在人类的视野里。显微镜的发展史与数学、物理学、材料科学、细胞学和生物学 等多个学科的发展密不可分，经历了漫长的过程。1 6 7 7 年荷兰科学家列文- 虎克 ( a v d nl e e u w e n h o e k ) 首次使用第一代( 光学) 显微镜进行了活细胞观察。在之后 的十八世纪，显微科学发展缓慢，直到十九世纪工业革命开始后，方同其它学科 一起飞速发展起来。人们制造出了没有色差和像差的高质量显微镜以及暗视野显 微镜，并先后观察到细胞核，线粒体，高尔基体以及细胞有丝分裂过程等。二十 世纪光学显微镜推陈出新的同时，出现了具有更高分辨率的第二代显微镜：电子 显微镜( e l e c r o nm i c r o s c o p y ，e m ) 。第一台e m 由德国鲁斯卡( r u s k a ) 等人于1 9 3 3 年设计并制造。按成像原理的不同，e m 可分为透射电子显微镜( t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ，t e m ) 和扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ， s e m ) it e m 虽有很高的分辨率，但它所获得的图像实际上是很薄样品的内部信 息，用于表面微观表征及分析几乎是不可能的。s e m 虽然为表面观察及分析提供 了有力工具，但由于高能电子束对样品有一定穿透深度，所得成像信息也不能准 确反映真实表面状态。 1 9 8 2 年，瑞士科学家b i n n i g 和r o h r e r 及同事共同研制成功了第一台扫描隧 道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p y ，s t m ) 【，由此第三代显微镜一扫描 探针显微镜( s c a n n i n gp r o b i n gm i c r o s c o p y ，s p m ) 诞生了。利用s t m ，人类第一次 观测到了单个原子，同时也掌握了一种前所未有的，能够直接在单原子、单分子 水平上对物质表面性质进行研究的有力工具，从根本上提高了人类对微观世界的 认识水平。不同于前两代显微镜，s p m 属于近场显微镜，打破了远场衍射极限的 限制，它的出现标志着显微学的新时代扫描探针显微学的到来。l9 8 6 年 r u s k a 、b i n n i g 和r o h r e r 共同接受了诺贝尔物理学奖。同年，b i n n i g 等人在s t m 的基础上，成功研制了原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 【2 1 。作 为s p m 家族的重要成员，a f m 通过对相互作用力的监测替代s t m 中对隧道电流 的感应，从而将s t m 最初的研究领域由导体、半导体拓宽到绝缘体，由无机物 质延伸到有机物质，并以其样品制备简单、气氛和液下多种环境的可操作性而备 受人们关注。 上述优点使a f m 具有足够的潜力成为分子生物学、微生物学以及细胞生物 学等众多生命科学研究领域的重要工具。其主要贡献可简要地从三方面概括如下： 原了：力缸微镜用于细胞表面结构与性质的研究及单碱基错配的检测 在形貌表征的基础上，能够在不同环境下提供d n a 、蛋白质、细菌和细胞等不同 尺度范围内生物样品的形态特征；在相互作用分析的基础上，能够在不同尺度上 研究d n a 与d n a 、d n a 与蛋白、蛋白与蛋白以及细胞与细胞之间等多种类型生 物样品之间的相互作用；在纳米操纵的基础上，能够实现对d n a 和蛋白的分子 操纵，也能穿透细胞膜进行细胞内物质的导入和抽取。 本章将对a f m 工作原理、操作模式、技术要点以及该技术的发展做简要介 绍，归纳其在生物分析应用中的优势，并对其在分子生物学和细胞生物学分析中 的应用进行较为详细的介绍。在此基础之上，提出本论文的工作构想。 1 1 原子力显微镜( a f m ) 概述 1 1 1a f m 的构造和基本原理 如图l ，l 所示，a f m 主要是由执行光栅扫描和z 轴定位的压电扫描器、反馈 电子线路、光学反射系统、探针以及计算机控制系统构成。其中，对微弱作用力 极为敏感的探针是a f m 仪器的核心部件。探针通常由一端固定的微悬臂以及微 悬臂另一端上的针尖构成。 图1 1a f m 的构造及工作原理示意图 形貌表征和相互作用力的测定是a f m 最常用也是最重要的两种功能。结合 示意图1 1 ，下面分别将这两种功能完成时的工作原理介绍如下： 形貌表征原理：盔压电扫描管控制下，探针上的针尖在z 轴方向上与样品表 面接近，并在x 轴和y 轴方向对样品表面进行光栅式扫描。由于针尖尖端的原子与 样品表面的原二于之间存在极微弱的相互作用力( 1 0 。1 2 1o 。6n ) ，微悬臂因此发生 相应的弹性形变。通过将激光束照射到微悬臂上，再反射到超灵敏光电检测器，收 集检测器：蚕两象限激光强度差值，可以对该弹性形变进行定量并将其反馈到回路， 2 博j ：学位论文 从而保持针尖与样品之间的作用力恒定，即保持微悬臂的形变量不变。这样针尖 就会随样品表面的起伏上下移动，通过光电探测系统在计算机上便可得到样品表 面形貌的信息。这种工作模式被称为蛳匾力”模式，是使用最广泛的扫描方式。也 可以使用“恒高”模式来获得图像，也就是在水平方向的扫描过程中，不使用反馈 回路，仅保持针尖与样品之间的距离恒定，通过测量微悬臂z 轴方向的形变量来 成像。由于不使用反馈回路，该模式可以采用更高的扫描速度，但是对于表面起 伏比较大的样品不适用，因而通常适用于分子级别成像。 相互作用力测定原理：除了具有高分辨三维成像的功能，a f m 另一个非常突 出的特点便是对分子间相互作用力大小的表征。通过控制扫描管在x 轴和y 轴方向 不加电压，仅在z 轴施加电压，促使微悬臂在该方向发生往复运动，记录一个运 动全程周期内微悬臂的偏折情况，从而获得力曲线。如图1 2 所示：水平坐标轴表 s a m p ，ep o s f c f o n ( z p l ：e z o f a g e ， 图1 2a f m 力曲线及其原理示意图【4 】 示针尖与样品间的位移，垂直坐标轴表示针尖与样品间相互作用力的大小，也就是 微悬臂的偏折程度。力曲线扫描过程中，虚线代表扫描管不断逼近样品，实线代 表扫描管开始远离样品，箭头指示力曲线进行的方向。可以看到：在a 点，样品逐 渐靠近针尖，两者无接触，微悬臂没有发生偏转。当针尖非常接近样品表面时， 由于来自样品的吸引力，针尖可能突然跳跃式地同样品接触( b 点) ，微悬臂发生 正方向偏转，并继续到达最大偏转位置。然后压电管反向收缩，微悬臂正方向偏 转量逐渐减小( c 点) 。直到针尖所受的力与针尖和样品之间的相互作用力平衡以 后，压电管继续反向收缩，微悬臂开始反向偏转。由于针尖同样品表面接触过程 中有可能形成粘附或化学键，当微悬臂继续被提起一段距离后，粘附被打破而针 尖跳离样品表面( d 点) ，样品和微悬臂均归回原位。微悬臂从样品表面跳离时， 微悬臂偏折量的变化( z ) 可以用来计算出粘附力或其他分子间相互作用力( f ) 原子力显微镜用于细胞表面结构与性质的研究及单碱基错配的检测 的大小，即根据微悬臂的弹性系数k 和函数式f = k z ，利用仪器软件可直接计算 出有关相互作用力的大小。基于力测定原理发展起来的力体积成像( f o r c e v o l u m e i m a g i n go rf o r c em a p p i n g ) 模式，是在专用软件控制下对样品选定范围进行逐点力 测定，并以图像中相应像素点的明暗程度表示作用力的大小，从而直观地反映出 样品表面的整体特征，避免了单点力测定的一些局限性。然而，由于力测定位点 的增加，扫描速度受到了一定影响。 1 1 2a f m 的操作模式及技术要点 1 1 2 1a f m 的操作模式 从前面对工作原理的介绍中不难看出，a f m 是利用针尖与样品之间的相互作 用力来表征样品表面的形貌特性。图1 3 曲线表示针尖与样品表面之间相互作用 力和距离的关系：在针尖与样品表面原子相接触的区域内，体现为相互排斥作用， 而在非接触区域内，则为相互吸引作用。根据针尖与样品之间的距离以及相应的 力作用方式，a f m 可分为三种操作模式，其具体内容如下： 搀斥部分 图1 3 针尖与样品表面之间距离及其相互作用力关系【5 】 ( 1 ) 接触式( c o n t a c tm o d e ) 在接触区域内，利用针尖与样品之间原予斥力的变化而产生样品表面形貌。 当针尖进行光栅式扫描时，引起微悬臂偏折的是针尖与样品表面原子之间的范德 华斥力。该模式的特点在于，扫描过程中针尖与样品一直紧密接触，因此成像速 度快，能得到高分辨的样品表面形貌，而且在对细胞或组织等生物样品进行大范 围扫描时，稳定性好，成像不易受灰尘颗粒和样品表面起伏大等因素影响，但样 品与针尖之间的作用力可能导致细微样品的漂移，也可能使针尖受到损伤。 ( 2 ) 非接触式( n o n c o n t a c tm o d e ) 在非接触区域内，通过测量针尖与样品之间原子吸引力的变化而产生样品表 面形貌。成像过程中，在共振频率的驱动下，微悬臂以一定频率进行震动并同时 在样品表面进行光栅式扫描，反馈系统通过该共振频率控制针尖与样品间的距离 4 一 博士学位论文 保持不变，从而获得图像。该模式的特点是扫描过程中针尖与样品始终不接触， 减少了针尖和样品的污染或损伤，适用于软的生物样品成像；但其分辨率低，不 适于样品的液下成像。 ( 3 ) 轻敲式( t a p p i n gm o d e ) 其原理与非接触式模式相似，但针尖与样品的相互作用力同时涉及接触区和 非接触区，通过使加载在微悬臂上的振幅远大于非接触式所采用的振幅，从而保 持针尖与样品表面间断的接触。当针尖没有接触到表面时，微悬臂以一定的大振 幅振动，当针尖接近表面直至轻轻接触表面时，其振幅将因二者间相互作用力而 减小。反馈系统通过控制微悬臂的振幅恒定，从而控制针尖跟随样品表面的起伏 上下移动以获得样品形貌信息。该模式兼具接触模式的高分辨率以及非接触模式 对针尖与样品无损无污染的优点，特别适合生物大分子和细胞样品的成像。但由 于共振频率可能会受液体环境波动影响，该模式的液下成像对系统配置要求较高。 1 1 2 2a p m 的技术要点 ( 1 ) a f m 探针 探针一般由氮化硅等无机材料制备而成，包括一端固定的微悬臂( a ) 和固定在 微悬臂另一端的针尖( b ) ，如图1 4 所示。探针的性能直接决定了a f m 的分辨率， 为了能够准确地反映出样品表面与针尖之间微弱的相互作用力的变化，得到真实 的样品表面形貌，微悬臂的设计通常要求满足下述条件【6 】：使探针具有较低的力 学弹性常数k ，根据f = k z 可知：k 值越小，能检测到的f 越小，即灵敏度越高； 较高的力学共振频率；高的横向刚性，保证针尖与样品表面的摩擦不会使它发生 弯曲；带有能够通过光学、电容或隧道电流检测针尖动态位移的反射面或电极。 图1 4a f m 探针微悬臂a ) 和针尖b ) 的s e m 图【5 l ( 2 ) 基底和成像环境的选择 a f m 基底的选择范围很大，包括金、石墨、二氧化硅、云母片、玻璃片、和 某些生物膜等表面。基底的选择主要考虑其在为研究对象提供纳米级平整的支撑 原子力显微镜用于细胞表面结构与性质的研究及单碱基错配的检测 面的同时，还要具有良好的化学稳定性，便于清洗和修饰，然而对不同的研究对 象选择标准也不尽相同。例如在生物样品的研究中通常使用新解离的云母片，它 非常平整、干净还可进行硅烷化等表面功能修饰，而在细胞样品的研究中，盖玻 片通常用作细胞贴壁培养的基底，因为细胞相对于生物大分子，其体积较大，因 此对基底的平整度要求便可相应降低，然而细胞与基底之间是否有强的粘附则成 为关键。 按照不同实验的要求，a f m 可在气氛或液体环境下对生物样品进行表征与研 究。在气氛中成像时，对制样的要求较低，操作简便，但不利于生物样品维持其 正常的生理状态。在液体中及近生理条件下对生物样品的形态结构进行成像研究， 得到的信息更加真实丰富，但样品的固定比较困难，特别是对生物大分子而言。 配有温度控制箱的a f m 还能够为一些原位实验提供灵活可控的温度环境。 ( 3 ) 生物样品的固定 用a f m 研究生物样品时，样品的固定是一个至关重要的问题，通常应满足 以下要求：尽可能保持生物样品的活性：固定的样品在a f m 扫描过程中不易脱 落，即有较好的重现性。 生物大分子在基底上的固定主要有物理吸附和化学固定。物理吸附是借助静 电引力、范德华引力和氢键等作用将生物样品直接固定在载体表面。例如云母表 面带负电，当其表面用二价阳离子( m g ( a c ) 2 等) 处理，表面就会富集m 9 2 + 离子， 从而吸附带负电的生物大分子。文献中常用的两种化学共价固定方法是醛基法和 巯基法。醛基法通过戊二醛两端的醛基分别与基底和样品的自由氨基反应，将样 品共价结合到基底表面。w a n g 等i7 】就将云母首先进行氨基化处理，再利用戊二醛 处理得到活化的表面，最后用作d n a 成像的载体。巯基法是在金膜表面修饰含 巯基的物质，利用a u s 键形成牢固的共价键将样品共价固定在基底表面。 细胞样品的固定方法是许多研究者关心的重点。目前a f m 中的细胞固定方 法可分为自然干燥法、物理吸附( 粘附) 法和机械捕获法【8 j 。自然干燥固定法是 将一定量的细胞样品滴在基底上，然后在空气中自然晾干，干燥后形成一层平整 连续的膜。这种固定方法非常简单，但是由于细胞在干燥过程中会脱水，因此对 细胞形态等会有一定的影响【9 02 1 。物理吸附( 粘附) 法主要包括多聚赖氨酸静电 吸附法和琼脂糖凝胶固定法【b 15 1 。在生理条件下细胞一般带负电荷，而多聚赖氨 酸带正电荷，因此可以利用多聚赖氨酸与细胞之间的静电吸引作用固定细胞。这 种固定方法操作简单且重复性好，是目前为止使用最多的一种方法。不过，由于 多聚赖氨酸与细胞壁存在一定的相互作用， 因而对细胞结构还是存在一定的影 响。l u 研究小组【1 6 】使用琼脂糖凝胶来固定细胞，并进行了活细胞的a f m 研究。 琼脂糖凝胶层能较牢固地固定细胞，并能提供必要的营养物质以及一个相对湿的 环境。与多聚赖氨酸法相比，这种固定方法能更好地维持细胞的原始状态，不过 6 博士学位论文 操作相对要复杂一些。机械捕获法是指将细胞固定于多孔聚合物膜中，利用聚合 物膜上的微孔来固定细胞，这种方法对细胞样品几乎没有任何损伤，特别适合于 进行细胞活体、动态过程等方面的研究【1 7 捌】。然而，操作过程中对细胞密度，聚 合物膜的孔径大小以及挤压力都有一定的要求。 1 1 3a f m 技术的发展 任何技术和理论都需要在不断应用的过程中发现问题、解决问题，从而得以 发展。a f m 也不例外，自问世以来它被广泛地应用到材料、物理和生物等众多领 域，其功能也因此得到不断地完善和提高。我们分别从探针的加工和修饰、高速 a f m 、与其他技术的联用这三个方面简要介绍近年来a f m 技术的发展情况。 1 1 3 1 探针的加工和修饰 探针是a f m 的核心部件之一，因此a f m 技术的发展受探针制造技术发展的影 响。传统的探针是由硅或氮化硅材料构成的，易于磨损，对l0 0n m 以下的样品可 能出现“卷积效应”，并难以持久地进行可重复的高分辨率成像。碳纳米管，特别 是单壁碳纳米管，具有极小的直径和优异的机械性能，能提供高的分辨率和稳定 的图像，已经被证明是用作针尖的理想材料2 2 彩】。目前制造碳纳米管针尖的方法 主要包括两种：直接将已经制备好的碳纳米管装配到针尖上；在传统针尖末端附 着催化剂，采取化学气相沉积的方法进行定位生长【2 4 五8 1 。阵列针尖技术的出现主 要是针对单一针尖的a f m 在测定过程中可能存在修饰分子多次测量后受损而导 致的测量重复性不理想的问题。g r e e n 等采用掩膜光刻的方法，通过控制光刻参数 来控制针尖的曲率半径，得到了硅阵列针尖【2 9 。0 1 。l i i l e h e i 等则通过一步法得到了 阵列针尖【3 1 1 。同时，这种阵列针尖还被证明具有高通量地同时进行多种相互作用 表征的潜力【3 2 - 3 3 】。碳纳米管针尖和阵列针尖的出现在一定程度上推动了a f m 技术 向前发展。 探针技术的发展不仅在于加工出高性能的针尖，开发具有化学识别能力的 a f m 探针也成为该领域的一个研究热点。探针的功能化一般有两种方法，一种是 通过共价键或静电作用等作用力直接将待修饰分子连接于a f m 针尖；另外一种 是初步修饰的针尖上先连接一个可以自由活动的线状分子( 如聚乙醇，p e g ，6 8n m ) ，再通过该分子来连接待修饰分子【3 4 铂】。需要指出，无论哪种方法，针尖的 初步活化都是决定分子修饰密度和质量的关键。一方面，功能化的探针在a f m 技术发展的初期就被用于探测生物大分子间的相互作用力。e b n e r 等比较了三种 使针尖氨基化修饰抗体分子的途径，不同功能化的针尖对云母基底上修饰的蛋白 单层作用的一系列实验结果表明，a p t e s 氨基化过程能够得到最低的针尖修饰密 度【37 j ：另方面，功能化探针还被用来对样品表面进行扫描，通过其化学灵敏性 原了力显微镜用于细胞表面结构与性质的研究及单碱摹错配的检测 来成像。r a a b 等用修饰有抗体的针尖对抗原覆盖的基底进行扫描，同时得到了抗 原的形貌成像图和亲和成像图【3 8 】。 1 。1 3 2 高速a f m a f m 技术在材料科学和生命科学等领域扮演着越来越重要的角色。然而传统 的a f m 成像速度较慢，通常需要数秒甚至数分钟，限制了对速度量级在毫秒级的 生物大分子运动、生化反应或生化过程的连续观察。因此，a f m 技术欲要赢得更 广阔的应用空间，就必须设法提高扫描速度，发展高速a f m 技术以突破该瓶颈问 题。1 9 9 3 年b u t t 等首次提出了扫描速度限制的问题，之后人们不断尝试提高扫描 速度【3 9 】。1 9 9 4 年到1 9 9 7 年，分别有研究小组通过自行改