（分析化学专业论文）基于离子液体和凝胶膜修饰电极的制备及其应用研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文摘要 基于离子液体和凝胶膜修饰电极的制备及其应用研究 摘要 本论文的研究目的是：通过以血红蛋白( h b ) 为研究对象，探索基于离子 液体和各类凝胶膜修饰电极的制备条件。然后，将成功的固定化实验条件应用于 国内外少有电化学方面研究的氯过氧化物酶( c p o ) 修饰电极的制备，为拓展 c p o 的应用研究提供些经验以及理论研究的基础。 1 t t - b 在离子液体聚合物膜修饰电极上的电化学行为研究 用简单的滴涂法在玻碳电极上制备了离子液体和聚合物薄膜，并用以固定 h b 。实验结果表明：h b 在修饰电极上发生准可逆的直接电子传递，是一个受表 面过程控制的电极反应。h b 的固定化方法简单易行，且较稳定，有望用于制作 安培型传感器。 2 1 i b 在离子液体和硅溶胶凝胶膜修饰电极上的电化学行为研究 利用层层涂布法，将离子液体和硅溶胶凝胶膜修饰到玻碳电极表面。循环 伏安测量结果表明：固定在修饰电极上的h b 能发生直接电子转移，式量电位与 溶液p h 的线性关系表明有一个质子参与电极反应。对不同干燥条件的考察结果 显示，较低的温度和较高的湿度可有效地防止膜的开裂。 3 h b 在离子液体与魔芋水凝胶膜修饰电极上的电化学行为研究 选用了制备过程简单的魔芋水凝胶( k g m ) 代替制备过程相对复杂、且成 膜条件难以控制的硅溶胶凝胶膜。在k g m 和离子液体的共同作用下，h b 与电极 之间可进行直接的准可逆的电子传递反应，表现为受表面控制的、伴随有质子迁 移的反应。对两类离子液体的考察结果显示，亲水型离子液体较之疏水性离子液 体更有利于h b 的直接电子传递。 4 c p o 在离子液体和魔芋水凝胶修饰电极上的电化学行为及其应用探索 c p o 固定于离子液体与k g m 膜修饰电极上，循环伏安测量结果表明：固定 的c p o 与电极之间发生了直接的电子传递，是一个受吸附控制的电极过程。不 同p n 值溶液中的c v 测试表明，c p o 在修饰电极上发生电子传递的同时，也伴 随有质子的转移。 上海师范大学硕士学位论文 摘要 此外，还考察了该修饰电极对0 2 和h 2 0 2 还原反应的电催化性能，初步探讨 了催化反应的机制。利用该修饰电极对溶液中h 2 0 2 的催化电流响应，可进一步 拓展基于c p o 的修饰电极对h 2 0 2 检测的应用。 关键词：离子液体，硅溶胶凝胶，魔芋葡甘聚糖，血红蛋白，氯过氧化物酶，电催化，循环 伏安法，h 2 0 2 检测 上海师范大学硕士学位论文摘要 t h ep r e p a r a t i o na n di t sa p p l i c a t i o no fe l e c t r o d em o d i f i e d w i t hi o n i cl i q u i da n d s o l g e lo rk g m a b s t r a c t n l ep u r p o s eo ft h i st h e s i si st os t u d yag o o di m m o b i l i z et e c h n i q u ef o rb i o l o g y a tf i r s t ，h e m o g l o b i n ( h b ) w a su s e da sas t u d ys y s t e m t h eh bh a sb e e ni m m o b i l i z e d o n t ot h es t n f a c eo fg l a s s yc a r b o n ( g c ) e l e c t r o d ew i t hi o n i cn q u j dp o l y m e ra n d o b t a i n e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw a su s e df o ri m m o b i l i z ec h l o r o p e r o x i d a s e ( c p o ) ， w h i c hh a db e e nt i t t l er e s e a r c h e d t h e s er e s u l t sc o u l dm a k es o m ee x p e r i e n c eo fc p o m o d i f i e de l e c t r o d ep r e p a r a t i o na n dt h e o r e t i c a ls t u d yb a s i co na p p l i c a t i o no fc p o n l et h e s i si n c l u d e st h ef o l l o w i n gp a r t s ： 1 s t u d yo ne l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fh e m o g l o b i n ( h b ) a ti o n i cl i q u i d p o l y m e rm o d i f i e de l e c t r o d e t h ei o n i cl i q u i dp o l y m e rs o l u t i o nw a sd r o p p e do n t ot h eg - ce l e c t r o d es u r f a c e f o ri m m o b i l i z a t i o no fh b n ec y c l i cv o l t a m m e t r ym e a s u r e m e n t ss h o w e dt h a tt h e d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro fh ba tt h ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t hi o n i cl i q u i dp o l y m e rw a s o b s e r v e d , a n di tw a saq u a s i r e v e r s i b l ee l e c t r o c h e m i c a lr e d o xr e a c t i o nc o n t r o l l e db y d i f f u s i o n t h i sw o r kd e v e l o p e da ne a s yw a yf o re n z y m e si m m o b i l i z a t i o na n d f a b r i c a t i o no fa m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r s 2 s t u d yo ne l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fh ba 土i o n i cl i q u i da n ds o l - g e lm o d i f i e d e l e c t r o d e an e wt e c h n i q u eo fh bi m m o b i l i z e dw i t hs o l g e la n di o n i cl i q u i db yl a y e rb y l a y e rc o a t i n g sw a sr e p o r t e d t h ec y c l i cv o l t a m m e t r yr e s u l t ss h o w t h a th b i m m o b i l i z e da tt h em o d i f i e de l e c t r o d ec a nu n d e r g ot h ed i r e c te l e c l z o nw 纽s f e r , t h e f o r m a lp o t e n t i a l 掣) s h i f t e dn e g a t i v e l yw i t ht h es o l u t i o np hi n c r e a s e di nt h er a n g e f r o m4t o9 ml i n e rr e l a t i o n s h i po ft h ee o v e r s u s p hw i t has l o p e5 0 9 5m v p h d e m o n s t r a t e dt h a to n ep r o t o nt r a n s f e ri s c o u p l e dt oe a c he l e c t r o nt r a n s f e ri nt h e e l e c t r o c h e m i c a lr e d o xr e a c t i o no fh b 西ed r y i n gc o n d i t i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el o w e rt e m p e r a t u r ea n dh i g h e rh u m i d i t yc a na v o i dt h e c r a c k i n go fs o l g e lf i l m s m 上海师范大学硕士学位论文 摘要 3 s t u d yo ne l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ff i ba ti o n i cl i q u i da n dk o n j a cg l u c o m a n n a n ( k o m ) m o d i f i e de l e c t r o d e i nt h i sw o r k , t h es o l g e lf i l m si sr e p l a c e d 坶k g mf i l m t h ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f e ro fh bi sc l e a r l yo b s e r v e da tt h ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t hi o n i cl i q u i da n d k g m t h ec y c l i cv o l t a m m e t r yr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dh e m e - p r o t e i n s e x h i b i ts u r f a c e - c o n t r o l l e de l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o rr a t h e rt h a n f r e e l yd i f f u s i n g p r o c e s s ，i na d d i t i o n , t h ep r o m o t i o no fd i f f e r e n t k i n d o fi o n i cl i q u i di nt h e e l e c t r o c h e m i c a lr e d o x r e a c t i o no fh bw a sa l s od i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e h y d r o p h i l i ci o n i cl i q u i dw a s b e t t e rt h a nh y d r o p h o b i ci o n i cl i q u i d 4 s t u d y o ne l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fc p oa ti o n i cl i q u i da n dk o n j a c g l u c o m a n n a n ( k g m ) m o d i f i e de l e c t r o d ea n di t sa p p l i c a t i o n s t h ec h l o r o p e r o x i d a s e ( c p o ) h a v eb e e ni m m o b i l i z e dw i t hk g mf i l ma n di o n i c l i q u i do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h ei m m o b i l i z e d c p ow e r ei n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc p ow a s s u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e do nt h eg c ea n du n d e r g of a s td i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r r e a c t i o n sw i 也t h ef o r m a lp o t e n t i a la t - o - 3va n dt h er e d o xw a sap r o c e s sc o n t r o n e db y s u r f a c ea d s o r p t i o n t h ec y c l i cv o l t a m m o g r a m sm e a s u r e di nv e r i o u sp hs h o w e dt h a t t h ef o r m a lp o t e n t i a l ( e o ) s h i f t e dn e g a t i v e l yw i t ht h es o l u t i o ni n c r e a s e di nt h er a n g e f r o m4t o8 1 1 1 el i n e rr e l a t i o n s h i po ft h ee 0 v e r s u sp hw i t has l o p e4 3m v p h d e m o n s t r a t e dt h a to n ep r o t o nt r a n s f e ri sc o u p l e dt oe a c he l e c t r o nt r a n s f e ri nt h e e l e c t r o c h e m i c a lr e d o xr e a c t i o no fc p o t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fc p o k g m r t n 蚯o n g 屺m o d i f i e de l e c t r o d ef o r e l e c t r o c h e m i c a lr e d u c t i o no f0 2a n di - 1 2 0 2h a v eb e e n i n v e s t i 。g a t e d ，a n d i t s e l e c t r o c a t a l y t i c a lm e c h a n i s m w a sa l s od i s c u s s e db r i e f l y w i t hi n c r e a s i n gt h e c o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 ，t h ec a t h o d i cp e a kc u r r e n to fc p oi n c r e a s e dl i n e a r l y ，w h i c h c a ne x t e n dt h ea p p l i c a t i o no fc p oi nt h eh 2 0 2d e t e c t i o nf i e l d k e y w o r d s ：i o n i cl i q u i d s ，s i l i c o ns o l g e l ，k o n j a cg l u c o m a n n a n , h c m o g l o b i ， c h l o r o p e r o x i d a s e ，e l e c t r o c a t a l y s i s ，c y c l i cv o l t a m m e t r y ，h 2 0 2d e t e c t i o n i v 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：枷柙 日期： 论文使用授权声明 渺p 、5 a 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者躲桐杆翩签名：关姝日期：酣嘭r 咖 上海师范大学硕士学位论文第l 章 第一章绪论 近年来，类似三聚氰胺事件、太湖水质污染等事件的发生，使得生物检测在 环境、医药食品等方面的应用也不断扩大。如何构建灵敏度高、稳定性好且具有 很好选择性的生物传感器已成为一个重要命题。然而在众多的研究内容中，研究 和发展生物活性单元的固定化技术，使用实用且简单的载体材料或固定化技术， 促进生物活性单元在检测中识别作用的发挥，是构建整个传感器的关键，也是传 感器研究和应用价值的基础。 1 1 生物传感器研究进展 生物传感器是- f 3 由多学科互相渗透成长起来的新的研究领域，这种交叉学 科，不论在在理论上还是技术上均有许多问题需要进行深入研究和开发，然而在 实际研究过程中，目前生物酶传感器仍是研究热点。根据酶与电极间电子转移的 机理的不同，可将生物传感器分为三代：第一代生物传感器：采用酶的天然介体 一氧的催化原理设计制作而成；第二代生物传感器：结合媒介体的作用，进行无 试剂测量；第三代生物传感器是指在无媒介体存在的条件下，利用酶与电极间的 直接电子转移制备的酶传感器。这种将酶作为电极结合试剂的概念源于c l a r k 和 l y o n s 1 】提出可以通过检测酶催化反应所消耗的氧来测定葡萄糖的含量。在1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 锘u 备出第一支酶电极，他们采用聚丙烯酞胺膜将葡萄糖氧化酶 ( g l u c o s eo x i d a s e ，d ) 固定于极谱氧电极表面，然后通过检测酶反应的产物 来检测葡萄糖含量【z j 。 近年来，众多研究者致力于提高生物酶传感器中生物活性单元的稳定性和选 择性的研究。首先对于改善传感器的稳定性，主要采用对生物单元具有稳定作用 的介质、固定剂来增加其稳定性。研究表明用合适的凝胶膜作为生物单元的载体 应用于酶电极；可以大大提高生物单元的稳定性。赵广超1 3 等人将血红蛋白 ： ( h e m o g l o b i n , h b ) 以包埋的方式固定于硅溶胶凝胶膜内，结合离子液体对蛋白 质分子直接电子传递的促进作用，将其应用于氧气传感器的研究，发现由于溶胶 凝胶膜和其他导电膜层的存在，有效地防止了离子液体的流失，从而改善了电极 的稳定性；然而为了提高选择性，可以掺入新的活性单元来增加对目标分子的亲 上海师范大学硕士学位论文 第1 章 和力。如对生物酶分子进行化学修饰或在酶电极中加入介体来提高修饰电极的选 择性，这是由于用于修饰的物质或介体大都具有一定的电子运载能力。n i w a 4 等以锇的配合物和聚乙烯基吡啶为媒介体制备成了谷氨酸氧化酶和辣根过氧化 物酶传感器，不但大大改善了该传感器选择性，而且该传感器还具有稳定性好、 响应快、响应电流值大等优点，可归因于电子媒介体的中介作用。p a n 等【5 】以n a 矗o n 作为电极材料将谷氨酸氧化酶固载于的铂电极表面上，制备成对谷氨酸敏感的生 物传感器，在检测中由于n a t i o n 的存在可有效消除来自乙酞氨基酚、尿酸和抗坏 血酸的干扰。 1 2 酶固定化方法 生物酶传感器研究基础和出发点就是要制备具有高活性、高稳定性的生物酶 修饰电极。酶作为一种特殊的蛋白质的，除了在固定化时要保持其构型外活性也 是固定化时特别要考虑的。所以筛选出最佳的固定化实验条件是本研究工作的出 发点和关键性的一步 ， 酶固定化方法有多种，大致可分为以下四类：共价键合法、交联法、吸附法、 以及包埋法等。共价键合法是利用酶分子上的官能团和电极表面上的反应基团之 间形成化学共价键，从而达到酶分子固定化的。然而在共价键合过程中发生的较 为剧烈化学反应对酶的存活不利，另一方面在反应过程中底物与酶反应位点间的 接触受到限制；交联法是用双功能或多功能试剂与酶之间交联的固定方法。由于 交联剂价格的昂贵限制了其在酶固定化方法中的应用；吸附法是利用物理吸附或 离子键等方法，将酶固定在各类载体之上。吸附法操作简单，反应条件温和，但 是由于酶分子于载体之间结合不牢固，可能会导致了玷污反应产物或者生物活性 单元催化活力的丧失等问题；包埋固定化法是把酶固定于聚合物材料的网格或微 胶囊结构中，这样可以防止酶蛋白释放，并且不会阻碍底物与酶分子的接触，在 包埋法中，蛋白质分子生物活性破坏少，而且很少改变酶的高级结构，酶活力回 收率很高，可以应用于许多酶的固定化：目前生物酶传感器的研究中，采用包埋 法固定生物分子仍是研究的主流。 在包埋法可分为微胶囊法、有机凝胶包埋法，溶胶凝胶包埋法。溶胶凝胶 包埋法是物理包埋过程，对酶的尺寸无特殊要求，温和的反应条件和凝胶的非晶 2 上海师范大学硕士学位论文第l 章 态结构都有利于保持酶的结构完整性和表面微观结构的各向同性，另外，由于基 质含有足够的水，生物酶处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性【6 1 。 1 2 1 溶胶凝胶包埋法在生物传感器领域的研究 溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶( s 0 1 ) 、凝胶 ( g e l ) 而固化的方法。自从1 9 9 0 年以色列的b 谢吼等【7 】利用s 0 1 g e l 法成功地将碱 性磷酸酶引入s i 0 2 基质中，s o l g e l 法固定化酶技术的开发进入了一个迅速发展的 阶段【8 1 0 】。目前许多生物酶如血红蛋白酶【3 】、过氧化氢酶【1 1 1 、脂肪酶【1 2 1 、胆固 醇氧化酶【1 3 】、葡萄糖氧化酶【1 乒阚、以及黄嘌呤氧化酶【1 7 】等均能被包埋在s 0 1 g e l 基 质中，并能保持较高的构象完整性、催化活性和热稳定性，所以目前该技术被广 泛应用于各类生物酶传感器领域中。 黄加栋等报道了将多壁纳米碳管修饰铂电极与二氧化硅s o l - g e l 固定化酶 相结合的葡萄糖氧化酶传感器，该传感器对葡萄糖在0 1 5 6m m o l l 范围内呈 线性响应，响应时间为2 0s ，检出限为0 0 5m m o l l ，4 5d 后的响应值仍保持9 0 ， 具有较好的稳定性【1 8 】。董绍俊等利用溶胶凝胶q b s i 0 2 对生物分子具有很好的选择 吸附性，结合纳米a u 颗粒的生物兼容性，电极上构建了第三代辣根过氧化酶传 感器，该电极不但能很好地催化h 2 0 2 的还原，而且响应快、重现性好，并大大 增强了灵敏度【1 9 1 。k u m a r l 2 0 l 研究小组将胆固醇氧化酶( c h o x ) 和辣根过氧化物酶 邮冲) 的混合液夹心于两层s 0 1 g e l 膜中，在选定的试验条件下对c h o x 的响应 时间为5 0 s 、线性范围为2 - - 1 0m m o l l ，检出限0 5m m o f l ，所制备的酶传感器 在4 5 可稳定1 2 周。正是由于这种溶胶凝胶酶溶胶凝胶夹心结构可用于同时 固定多种酶，所以这种技术在传感器领域也受到了广泛的关注。n a d z l a a f o v a 2 1 】等 将h b 和肌红蛋( m y o g l o b i n , m b ) 同时掺杂至u s o l g e l 中，固定于热解石墨电极 上，研制成氧气和过氧化氢传感器。比较了溴代十六烷基三甲胺( c r m a b ) 、 c t m a b 和聚苯乙烯磺酸盐( p s s ) 、c t m a b - - - 种模板制得的膜对氧气和过氧化 氢的催化还原活性的影响。并且得出结论：加入c t m a b 和p s s 的s 0 1 g e l 膜最 稳定。 不可否认s o l g e l 法也存在一些局限性，如实验条件控制严格，制备过程较 为复杂；包埋可能会稍微改变试剂的生物活性等。 3 上海师范大学硕士学位论文第1 章 1 2 2 魔芋葡甘聚糖水凝胶在酶固定化中的应用 魔芋葡甘聚糖( k g m ? 是魔芋( 天南星科多年生草本植物) 块茎的主要成分， 是一种极其丰富的可再生天然高分子资源。k g m 被广泛应用于医药、食品领域 同时k g m 具有优良的粘结性、成膜性、增稠性、乳化性和悬浮性等特点且生 物安全性及降解性能好，在化工、高分子材料、石油、环保等领域也有重要用途 天然的k g m 及其改性产物，已成为国内外研究的热点之一磁2 4 】。 魔芋葡甘聚糖是由1 3 - d 甘露糖与t 3 d 葡萄糖以1 3 1 , 4 键结合起来的链状分子， 具有特定的生物活性【2 5 】；结构式如下所示 2 6 1 ： 阜h ， 0 2 c o n 魔芋葡甘聚糖分子中含有大量羟基、羰基等亲水性基团，它能结合大量水分， 通过氢键、分子偶极、诱导偶极、瞬间偶极等作用力与水分子结合形成难于自由 运动的巨大分子，在水中使魔芋葡甘聚糖溶液成为非牛顿流体f 7 】；其水凝胶呈 网状结构，其中有许多水腔，可为蛋白质提供适宜的微水环境，用它来固定酶有 利于保持其生物活性。与硅溶胶凝胶法相比，魔芋水凝胶制备方法更简单，因 此在生物传感器研究方面具有一定的优势。刘慧宏等幽】人利用魔芋多糖水凝胶 将h b 固定于电极表面制备的舢k g m 膜修饰电极在柑有机混合溶液中能得到 稳定的电化学和电催化响应。郭晓明【2 叨等制备了脱乙酰基魔芋葡甘聚糖( d k g m ) 的溶胶凝胶，将d - k g m 用于葡萄糖氧化酶的固定，制各了相应的葡萄糖传感 器。所制备的传感器灵敏度为2 4 0n a m m o l l ，线性范围为o 1 8m m o l l ，稳 定性好，寿命长。实验结果表明d - k g m 是种可用于生物传感器中酶固定化的 优良材料。 4 上海师范大学硕士学位论文第1 章 1 3 离子液体修饰电极 1 3 1 室温离子液体的发展和简介 室温离子液体，又称离子液体或室温熔融盐，是指在室温或室温附近温度下 呈液态由离子所构成的物质，它是继水和超临界二氧化碳后又一类绿色溶剂体 系。关于室温离子液体的研究，最早可以追溯到1 9 1 4 年报道的第一个在室温下 呈液体的有机盐类硝酸乙基胺 e t n h 3 i n 0 3 】。这种盐类的制备过程也相当简单， 直接将浓硝酸滴加到乙胺溶液中，采用蒸馏方法除去水份，就可以得到液体状态 的硝酸乙基胺盐，其熔点可以低至1 2 。c 3 0 】。 根据离子液体阴离子的不同，可以简单的分为两类，氯铝酸类离子液体和非 氯铝酸类离子液体【3 1 1 。随着在1 9 9 2 年【3 2 】发现了对水和空气稳定且组成固定的 离子液体1 乙基3 甲基咪唑四氟硼酸盐 b m 酮b f 4 后，相关的含有各种不同阴 阳离子的非氯铝酸盐类离子液体被合成出来，对离子液体的研究迅速发展。目前 常见的离子液体，其阳离子主要有季磷盐、烷基吡啶、烷基咪唑季铵盐等，阴离 子有三氟磺酸根、六氟磷酸根、x x ( - - 氟甲基) 硫酰亚胺根、四氟硼酸根等，具体 的阴阳离子结构如下图所示： ：醪耐 r 。 1 一，s 之 i f - 、r ” 阴离子：b f 4 , p f ，c h 3 s 0 3 。，c f 3 s 0 3 ，c 庙 g s o f ，( c f s s o z ) 2 虬( c f s s o z ) s c r , c h s c o o ， c f 3 c o o ，n o r ，h s o f ，s b i - ，f 佃口d ，e t c 与传统的有机溶剂和电解质相比，离子液体具有独特的物理化学性质p 3 3 研： 离子液体的熔点低，液态温度范围宽；离子液体具有高的热稳定性；较好的化学 稳定性；宽的电化学窗口常温下离子液体的粘度是水的粘度的几十到上百倍； 离子液体的导电率与粘度、密度、离子的体积有很大关系，室温下，一般在 1 0 s c m 1 数量级。 5 r ri时卜r r r ri脊r r r 上海师范大学硕士学位论文 第1 章 1 3 2 室温离子液体在生物电化学研究中的应用研究 虽然离子液体的研究可源于上个世纪初，但是其实际研究时间并不长，而且 研究内容大多集中于绿色化学、有机合成、材料化学等领域f 3 7 1 。离子液体和大 分子的复合可以产生新型的材料，正是基于这一特性，离子液体的研究也可为生 物酶直接电化学、生物传感器和生物催化提供了新的可能和方向。 一方面，基于离子液体制成的碳糊电极已有一定的报道，研究结果发现随着 离子液体的加入可以改善碳糊电极的电极性能。孙伟等人研究采用疏水性离子液 体正丁基吡啶六氟磷酸盐( b p p f 6 ) 为粘合剂代替传统固体石蜡，考察了制备 b p p f 6 离子液体修饰碳糊电极的条件，对其形貌和电化学行为进行了研究【3 8 】。随 后，孙伟等人又采用疏水性离子液体1 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐( b m i m p f 6 ) 为粘合剂代替传统液体石蜡制备j b m i m p f 6 离子液体修饰碳糊电极，并以其为 基底电极，以壳聚糖和皂土形成的有机无机复合材料为固定膜将f r o 固定于离子 液体碳糊电极表面。因为壳聚糖是一种无毒的、且具有生物相容性的天然高分子 材料，而皂土具有一定的空间骨架和较强的吸附性，所以与单一的膜材料相比， 这种有机一无机复合材料在生物相容性和稳定性上更有优势p 川。n o r o m z 等也报 道了采用吡啶类离子液体- - n 辛基吡啶六氟磷酸盐作为粘结剂制备了碳糊离子 液体电极，以上大量文献研究都表明在碳糊电极的制备中添加了离子液体不 仅能够为电极提供低的背景电流，而且还表现有更好的电化学性能。这是由于离 子液体作为粘结剂改变了电极表面的微观结构，有利于提高电子的传递速率，此 类电极一般具有能够降低电活性物质的过电位，尤其是生物分子的过电位的优 点。 另一方面一些学者也尝试了将离子液体作为一种新型的电极表面修饰材料 应用于生物酶分子的固定。李景虹研究小组将h b 、1 丁基3 甲基四氟硼酸盐 b m i m b f 4 、壳聚糖溶液混合后滴到玻碳电极表面，考察了修饰电极在磷酸盐缓 冲溶液中的电化学行为，证实 b m i m b f 4 亲水性离子液体作为电极表面材料可 - ： 以很好的促进m 溶液的直接电子传递【4 l 】。l u 等人已研究出了一种以壳聚糖和 1 一丁基- 3 甲基咪唑四氟化硼盐为基质的新型复合体系，将h b 蛋白质分子包埋在 壳聚糖和离子液体的混合基质中修饰玻碳电极【4 2 1 。通过循环伏安测量显示，h b 在修饰电极发生了直接的电子迁移，该修饰电极对三氯乙酸和氧气的还原反应均 6 上海师范大学硕士学位论文第1 章 显示很好的催化活性。热重分析和红外图谱测试显示该修饰电极的稳定性比较 高，而且在该混合体系在溶液中有很好的稳定性，对蛋白质有很好的相容性。这 种以高聚物和室温离子的复合体系在生物传感器和生物催化体中将会有更广泛 的应用。另外李红丽等人的实验也表明，细胞色素c 在离子液体修饰的玻碳电极 上能进行直接的电子传递【4 3 】。 1 4 本论文的主要研究内容 首先选取h b 作为蛋白质模型来探索酶固定方法，并试图从酶的固载量、修 饰电极的稳定性以及制备方法的难易程度方面进行比较各种固定方法。综合考虑 各种因素，选择离子液体和魔芋水凝胶共同固定酶的方法，并将此方法运用于氯 过氧化物酶的固定，实现氯过氧化物酶在电极表面的直接电子传递的基础上，再 深入研究其对氧气和过氧化氢的电催化活性及其初步的机理探讨，开发氯过氧化 物酶在电化学分析领域的应用 1 4 1h b 在离子液体聚合物膜修饰电极上的电化学行为研究 采用简单的滴涂法在玻碳电极上制备离子液体聚合物薄膜，研究血红蛋白 在该修饰电极上的直接电化学行为。并探讨修饰电极制备过程中不同溶剂对离子 液体聚合物成膜质量的影响。 1 4 2h b 在离子液体硅溶胶凝胶膜修饰电极上的电化学行为研究 以玻碳电极为基底电极，利用层层涂布法，分别在电极表面制备成离子液体 膜和硅溶胶凝胶膜，并将h b 固定于该电极表面，研究血红蛋白在修饰电极上的 直接电化学行为，并探讨不同干燥条件对凝胶膜成形的影响。 1 4 3 血红蛋白在离子液体魔芋水凝胶膜修饰电极的电化学行为研究： n ) s o 坍玎几小a 丘o n g c 电极研究的基础上，选用制备过程简单的魔芋水凝 胶( k g m ) 代替制备过程相对复杂且成膜质量较差的硅溶胶凝胶膜。研究了h b 在该修饰电极上的直接电化学行为，并比较不同离子液体对蛋白质分子电子传递 7 上海师范大学硕士学位论文第1 章 促进作用。 1 4 4 离子液体魔芋水凝胶氯过氧化物酶膜修饰电极的制备及其应 用研究 实现氯过氧化物酶在该修饰电极表面的直接电子传递的基础上，继续研究固 定化的c p o 对氧气和过氧化氢的电催化活性以及具体机理，该修饰电极对溶液相 中过氧化氢浓度具有线性电流响应，可以利用此特性开发氯过氧化物酶在传感器 领域的应用 1 5 本论文的创新点 离子液体在修饰电极制备及其对生物分子直接电化学研究中的应用相当有 限。一方面，基于吡啶类离子液体制成的碳糊电极已有一定的报道。另一方面， 作为生物催化介质的离子液体主要是咪唑类离子液体，但是人们对它们的溶剂性 质研究较多，而离子液体与酶之间相互作用的报道却很少。 本研究中采用制备过程简便的魔芋葡萄甘露聚糖水凝胶膜代替硅溶胶凝胶 膜，可改进修饰电极的制备方法，提高其实际应用的可行性。此外，c p o 的电 化学行为研究目前国内外很少有报道，因而，开展对c p o 直接电化学行为的研 究，并探索其在生物传感器领域的应用具有重要意义。本研究工作取得的c p o 固定化技术、c p o 修饰电极对氧气和过氧化氢的电催化活性以及初步的机制研 究的成果，将为氯过氧化物酶进一步在生物传感器领域的应用提供可借鉴的实验 技术以及深入进行理论研究的基础。 8 上海师范大学硕士学位论文第2 章 第二章离子液体聚合物膜修饰电极的制备及其h b 的电化 学行为研究 2 1 引言 血红蛋白( h e m o g r o b i n , 舶) 在生命活动和生物代谢过程中起着重要的作用， 其主要功能是储存和运输氧气【4 3 】。由于价廉易得，己成为研究生物大分子直接 电化学的理想模型物。h b 的摩尔质量为6 4 5 0 0 咖0 1 ，其分子具有四级结构，由两 条q 和两条b 多肽链，是一种四亚基的蛋白质，每一个亚基含有一个血红素基团。 从结构上看，血红蛋白的血红素中心铁原子只有一个轴向配位键，另一个配位点 空着或结合水分子，它很容易结合0 2 、h 2 0 2 和n o 等其它一些分子，。发生一 系列氧化还原反应m 。血红蛋白中的血红素铁以f e 2 + 和f e 3 + 两种状态存在，只有 以f e 2 + 状态存在的血红蛋白才能结合0 2 ，以f e 3 + 血红蛋白状态存在的血红蛋白称 高血红蛋白，无结合氧的功能。 ： 血红蛋白分子空间结构庞大，电活性中心不容易暴露，而且易吸附在电极表 面使固体电极表面钝化。同时，因其过电位较高，在电极上电子传递速率很慢， 难以得到有效的电化学信号【4 5 j 。为了实现蛋白质和酶在电极表面发生可逆的直 接电子传递，探索合适的电极材料和固定方法就非常重要。m 在某些特殊制备 的修饰电极上呈现出直接的电化学氧化还原行为。如董绍俊等采用染料修饰电极 对m 、h b 的氧化还原热力学和动力学进行了系统、深入的研究，获得了蛋白质 的准可逆反应的热力学及动力学参数。陆天虹等i 蛔报道了m 在氧化铟电极上的 直接电化学反应，测得式量电位为2 0 6 m v ，与h b 的标准氧化还原电位相近。 考虑到离子液体聚合物薄膜具有有较宽的电化学窗口，较高电导率，很好的 电化学稳定性，并且与电极材料和其它组成具有较好的化学及电化学相容性以及 对环境无毒等特征。本工作中试图将其作为一种电极修饰材料，用于h b 的固定， ! ： 以此拓展离子液体聚合物在电化学分析领域的应用。 9 上海师范大学硕士学位论文 第2 章 2 2 实验部分 2 2 1 试剂和仪器 牛血红蛋白( 上海伯奥生物科技有限公司) 用1 0m m o l lk h 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 缓 冲溶液( p h = 7 o ) 配制浓度为1 3 4 x1 0 4 m o l l 的研究溶液。实验中所采用的离 子液体聚合物是由本研究室自行合成的，1 ，4 二溴丁烷咪唑和六氟磷酸钾反应生 成的产物，是一种疏水型的离子液体聚合物( p - b m i p f 6 n ) 。不同p h 的5 0m m o l l m o l l 磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 由k h 2 p 0 4 和n a 2 h p 0 4 按不同比例配制而成，所 用溶剂二甲基甲酰胺( d m ) ，丙酮均为分析纯。研究溶液均用超纯水配制( h e a l f o r c e 超纯水器，上海康雷分析仪器有限公司) 。按实验要求用高纯氮除氧或经高 纯氧气饱和下进行电化学测试。实验均在室温下进行。 离子液体聚合物溶液的配制：称取一定量的离子液体聚合物固体粉末分别溶 于d 、丙酮中，配制成1 的聚合物溶液。 循环伏安等电化学实验使用电化学工作站( c m6 5 0 ，上海辰华公司) ，常规 三电极体系。其中，工作电极为玻碳电极( g l a s s yc a r b o n , g c ，由= 3 r a m ) ，铂片 电极为对电极，饱和甘汞电极作参比电极。 2 2 2 修饰电极的制备及h b 的固定 玻碳电极依次用1 o 、o 3 、o 0 5l a i n 的氧化铝抛光，然后分别用超纯水和乙醇 置于超声波清洗器中超声清洗，用微量进样器吸取2 5ul 离子液体聚合物溶液 滴在g c 电极上，室温下待溶剂挥发后，再移取3 0pl 浓度为1 3 4 1 0 4 m o l l 的 h b 溶液滴于电极表面，室温下干燥，即制得研究所用的修饰电极，记为 h b p b m i p f d d o c 电极。 2 3 结果与讨论 2 3 1 溶剂对离子液体聚合物修饰电极的影响 实验中采用的离子液体聚合物，为白色固体粉末状态，所以将其作为电极材 1 0 上海师范大学硕士学位论文 第2 章 料，就必需找到合适的溶剂，配制成一定浓度的溶液后，再滴涂到电极表面，以 形成均一的薄膜，才能达到促进电子传递的作用。所以实验中，溶剂的选择是优 化实验条件的第一步。 根据表2 1 提供的溶解度分析，实验中分别选取d m f 、丙酮作为溶剂配制成 一定浓度的h b 溶液滴涂到电极表面，制备成h b 修饰电极，分别标记 h b p b m i p f 6 n - d m f g c 、h b p 一 b m i p f 6 n 丙酮g c 。测得的两支电极相应的循 环伏安曲线表明，d m f 和丙酮作溶剂对c v 曲线没有显著的影响，都出现一对氧 化还原电流峰( 图2 1 ) ，氧化还原峰电位分别为o 2 8v 和0 3 7v ，厶印为9 0m v ， 矿为0 3 2 5v ( 与文献报道值相近【4 7 】) ，对应于血红蛋白血红素辅基中氧化还 原中心f e f e i i 的氧化还原峰。 表2 1 离子液体聚合物p - b m i p f d 。在不同溶剂中的溶解度 t a b l e 2 - 1t h es o l u b i l i t yo fp - i b m i p f d ti nd i f f e r e n ts o l v e n t s 试剂名称溶解度 乙酸乙酯微溶 丙酮溶 乙醇不溶 d 限 溶 异丙醇不溶 苯甲醛不溶 甲醇 不溶 然而，对比两者的峰电流，选择丙酮作为溶剂的修饰电极的峰电流几乎是 d m f 作溶剂的1 6 倍。这可归因于离子液体聚合物中溶剂挥发特性的差异，由于 丙酮的挥发速度远远快于d m f ，在h 1 ) 伊一【b m i p f 6 】n g c 电极的制备中，离子液体 聚合物薄膜形成速度更快，一定程度上阻止了聚合物在成膜过程中的团聚现象， 更容易形成空隙均一的薄膜，因而给h b 的直接电子传递创造了更加有利的微环 境。所以以下修饰