（分析化学专业论文）基于微流控芯片细胞中过氧化氢的检测.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 细胞的代谢过程中不断产生各种活性氧自由基( r o s ) ，例如超氧阴离子自由 基( 0 2 - ) 、羟自由基( o h ) 、脂自由基( r o o ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 等。它们一方 面能够介导生命活动的众多生理过程，另一方面也能够对组织细胞的化学结构 发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和功能。研究表明，细胞中产生的过 氧化氢，在一般情况下常被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶清除，如果得不到 及时清除，它可透过细胞膜与膜外的f e 2 + 或c u 十等金属离子结合生成h o ，从 而导致膜脂过氧化、碱基突变、d n a 链的断裂和蛋白质的损伤。因此对过氧化 氢进行高灵敏度、高选择性的分析与检测对于研究过氧化氢如何参与各种生命活 动是极为必要的。 由于细胞尺度小、细胞内过氧化氢含量低、产生与转化速度快，使得目前一 些传统的观察与分析方法多是将各种活性氧作为一个整体，获得的结果多是基于 静态、宏观的观察和整体平均而推导出来的。它们普遍存在取样体积大、质量检 测限高、分析信号的获得时间长、仪器价格昂贵等方面的不足。因此，在细胞层 面上定性及定量测定过氧化氢的含量对当今自由基生物学研究具有重要的学术 意义和应用价值。 微流控芯片分析( m i c r o f l u i d i cc h i pa n a l y s i s ) 具有快速、低耗，并且能将多种 功能单元集成于一个芯片等特点，它向实现维持一个闭合系统迈进了一大步。由 于它可以实现完全的自动化，减少污染，降低干扰和人为误差，因而成为近年来 生物、化学、医学等领域研究的重要平台之一。 本论文以微流控芯片电泳激光诱导荧光分析系统为技术依托，以实验室自行 合成的荧光探针为基础，对细胞中的过氧化氢( h 2 0 2 ) 的检测进行了研究。论文 共分三个部分。 在第一章中，简要阐述了微流控芯片在细胞分析领域的研究的进展。主要对 微流控芯片在细胞培养、细胞操纵、细胞溶膜、细胞组分的检测等方面的应用进 行了简单的介绍及综述。 在第二章中，我们选择实验室内部合成的荧光探针二( 对甲苯磺酰基) 一二 氯荧光素作为荧光标记试剂，以微流控芯片电泳激光诱导荧光法作为分析平台， 山东师范大学硕士学位论文 建立了一种未见报道的过氧化氢的检测方法，并且成功的用于r a w 2 6 4 7 细胞提 取液中过氧化氢的检测。本方法在5 5 s 内完成了对p m a 刺激的r a w 2 6 4 7 细胞 提取液中过氧化氢的检测，测得的结果与文献报道相符。这项应用为测定其他生 物样品中的过氧化氢提供了一种思路。 在第三章中，我们基于第二章中已建立的分析体系，在进样通道两侧设计有 辅助通道的双t 形芯片上，对单个r a w 2 6 4 7 细胞在微流控芯片上的进样、分 离及过氧化氢的测定进行了探索试验，初步实现了微流控芯片上单个r a w 2 6 4 7 巨噬细胞中过氧化氢的测定。 关键词：活性氧，过氧化氢，微流控芯片电泳，激光诱导荧光检测，二( 对甲苯 磺酰基) 一二氯荧光素 论文分类号：0 6 5 7 3 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t v a r i o u sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a r eg e n e r a t e di nt h ec o u r s eo fb i o l o g i c a l m e t a b o l i s m ，s u c ha ss u p e r o x i d e ( 0 2 。) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ，h y d r o x y lr a d i c a l ( h o ) ，n i t r i co x i d e ( n 0 ) a n dp e r o x y n i r t e ( o n o o ) t h e ya r ei m p o r t a n tm e d i a t o r so f p a t h o l o g i c a lp r o c e s s e si nv a r i o u sv i t a lp r o c e s s e s t h e yc a nm e d i a t em u c ho ft h e e s s e n t i a lb i o c h e m i s t r yr e a c t i o no fv i t a lp r o c e s s e s ，i n v o l v e di nc e l l u l a ri m m u n e f u n c t i o n ，b u ta l s oc a nc r e a t ed e s t r u c t i v em o d i f i c a t i o nt ot h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f t i s s u e sa n dc e l l sa n di n j u r yt h en o r m a lm o r p h o l o g ya n dm e m b r a n o u sf u n c t i o no f t i s s u e sa n dc e l l s u n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，t h eg e n e r a t i o na n de l i m i n a t i o no fr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s a r ec o e x i s ti nc e l l sa n dm a i n t a i nh o m e o s t a s i s t om a i n t a i n h o m e o s t a s i s ，a c c u m u l a t i o no fe x c e s sh y d r o g e np e r o x i d ei sp r e v e n t e db ym u l t i p l e e n z y m a t i ca n dn o n - e n z y m a t i cs y s t e m ss u c ha sc a t a l a s ea n dg l u t a t h i o n ep e r o x i d e s w h e nt h e yf a i l ，e i t h e rb e c a u s eo fe x c e s sp r o d u c t i o n ，o rb e c a u s eo fad e c r e a s ei nt h e c a p a c i t yo ft h ec e l l st oe l i m i n a t et h e m ，i nt h ep r e s e n c eo ff e 2 + o rc u + ，v i at h e s o c a l l e df e n t o nr e a c t i o n ，h 2 0 2i sc o n v e r t e dt o o h ，w h i c hc a nr e s u l ti n l i p i d p e r o x i d a t i o n ，d n ad a m a g ea n dm a n yb i o l o g i c a le f f e c t s m a n ya n a l y t i c a lt e c h n i q u e sh a v eb e e nr e p o r t e df o rd e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e n p e r o x i d e ，s u c ha sf l u o r e s c e n ts p e c t r o s c o p y ，s p e c t r o p h o t o m e t r y ，e l e c t r o c h e m i s t r y ，a n d c h e m i l u m i n e s c e n c e h o w e v e r , t h es h o r tl i v ea n dl o wc o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2m e a n d i f f i c u l tt ot h ed e t e r m i n a t i o n ，e s p e c i a l l yt h ed e t e r m i n a t i o ni nv i v oa n di n s i t uh a sa t ) b r e a k t h r o u g h t h e r e f o r e ，i ti so fc r i t i c a li m p o r t a n c ef o rh 2 0 2d e t e c t i o ni nb i o l o g i c a l s a m p l e sb e c a u s eo fi t sp o t e n t i a lt oa c ta sad i a g n o s t i cb i o m a r k e ro fd i s e a s e si n d u c e d b yo x i d a t i v es t r e s sa n dd a m a g ee v e n t s m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，i - t t a s ) h a sb e c o m ev e r y m u c ha h o tt o p i c i na n a l y t i c a lc h e m i s t r ys i n c ee a r l y19 9 0 sd u et ot h ep o t e n t i a l a d v a n t a g e so fm i n i a t u r i z a t i o n ，r e d u c e dr e a g e n tc o n s u m p t i o n ，h i g hs p e e da n d i n t e g r a t i o n m i c r o f l u i d i c - b a s e dr e s e a r c hh a sm a d es i g n i f i c a n ta d v a n c e so v e rt h el a s t f e wy e a r s ，a n db e c a u s eo ft h e i ra d v a n t a g e si n c l u d i n gp o r t a b i l i t y ，l o wr e a g e n ta n d p o w e rc o n s u m p t i o n ，s h o r tr e a c t i o nt i m e m i c r o f l u i d i cc h i p - b a s e ds y s t e m sf o r 山东师范大学硕士学位论文 b i o l o g i c a lc e l ls t u d i e sh a v ea t t r a c t e ds i g n i f i c a n ta t t e n t i o n m i c r o f l u i d i ct e c h n i q u eh a s b e c o m ean e wp l a t f o r mi nt h ef i e l do fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，e s p e c i a l l yi nt h el i f e s c i e n c e ，d r u gd i s c o v e r ya n dm e d i c i n e i nt h i st h e s i s ，an e wf l u o r o g e n i cr e a g e n ts y n t h e s i z e db yo u rl a b o r a t o r yw a s e m p l o y e da sal a b e l i n gr e a g e n t ；m i c r o f l u i d i cd e v i c ec o u p l e dw i t hl a s e r - i n d u c e d f l u o r e s c e n c ew a se m p l o y e da sat e c h n i c a lp l a t f o r mf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) t h r e ec h a p t e r sa r ei n c l u d e d i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ep r o g r e s so ft h ea p p l i c a t i o no fm i c r o f l u i d i cd e v i c ei nt h ea r e a o fc e l la n a l y s i si sd e s c r i b e d ，i n c l u d i n gt h ec e l l sc u l t u r e ，c e l l sm a n i p u l a t e ，c e l l sl y s i s a n dc e l l sa n a l y s i so nt h em i c r f l u i d i cc h i p i n t h es e c o n dc h a p t e r , an e wm e t h o du s i n gm i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sw i t h l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ( l i f ) i sd e v e l o p e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no f h y d r o g e np e r o x i d e b i s ( p m e t h y l b e n z e n e s u l f o n y l ) d i c h l o r o f l u o r e s c e i n ( f s ) ，an e w f l u o r o g e n i cr e a g e n ts y n t h e s i z e db yo u rl a b o r a t o r yw a se m p l o y e da sal a b e l i n gr e a g e n t t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e r m i n eh y d r o g e np e r o x i d ei np m a s t i m u l a t e dr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g e s t h i sa p p l i c a t i o ni m p l i e si t sp r a c t i c a lv a l u ei n m o n i t o r i n g c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s i n h y d r o g e np e r o x i d eg e n e r a t e d w i t h i n h e t e r o g e n e o u sb i o l o g i c a ls a m p l e s ，e s p e c i a l l yf o rc e l l s i nt h et l l i r dc h a p t e r b a s e do nt h ee s t a b l i s h e da n a l y s i ss y s t e mi nt h es e c o n dc h a p t e r , t h el o a d i n g ，s e p a r a t i o na n de l e c t r o p h o r e s i sd e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ei n f s - d e r i v a t i z e dr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g e sa r ep r e s e n t e d k e y w o r d s ：r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，h y d r o g e np e r o x i d e ，m i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i s ， l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，b i s ( p - m e t h y l b e n z e n e s u l f o n y l ) d i c h l o r o f l u o r e s c e i n c a t e g o r yn u m b e r ：0 6 5 7 3 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 一 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：小砸 们乡；缸 导师签字： l 李l2 i 力嗜山 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本入授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：佘荔难、 导师签字： 签字日期：2 0 0 9 年歹月，日签字日期： 似乡泄 鸳籀 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 l 引言 细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元，各种生命运动都是在细胞 内实现的。为了掌握生命活动的规律，必须以细胞为研究基础，深入探索细胞的 行为。细胞的异质性导致了细胞在化学组成、生理响应时间等方面存在着差异， 因此在单个细胞水平上研究细胞的超精细结构和各种生化性质有可能解决细胞 的生理功能和活动等生物化学、生物物理学及医学上悬而未决的问题【1 】，将人们 对细胞微环境的认识提升到一个更深更清晰的层次。比起常规细胞分析，单细胞 分析更注重细胞个体差异，细胞间相互作用和信息传递，可以检测到细胞群体分 析获得的平均结果掩盖掉的重要生物信息，这在疾病早期的诊断和预防方面是非 常重要的。 细胞在代谢过程中会不断产生各种活性氧，如超氧阴离子( 0 2 。) 、羟基自由 基( o h ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、脂自由基( r o o ) 等。它们参与许多生理活动， 对于生物体是至关重要的【2 5 】。自由基与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重 要关裂鲥1 1 。在正常情况下，细胞内存在自由基的产生和消除两个过程并处于平 衡状态，自由基的含量维持在较低的水平，并且生物体内自由基的寿命非常短。 在一般情况下，生物体内产生的h 2 0 2 常被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶清 除，如果得不到及时清除，它可透过细胞膜与膜外的f e 2 + 或c u + 等金属离子等结 合生成h o ，从而导致膜脂过氧化、碱基突变、d n a 链的断裂和蛋白质的损伤 1 2 - 1 3 】。因此对细胞内h 2 0 2 进行高选择性、高灵敏度的测定，使之能够给出细胞 内某- - 亥i j h 2 0 2 的量，进而可以研究h 2 0 2 的量及相互转化对疾病的产生、发展的 影响。 由于细胞尺度小( 直径在p m 级、体积在p l - f l 级) 、胞内组分含量低( z m o l 级) 、 生化反应快( 通常在m s 级) ，而且随着细胞研究的不断深入，细胞研究的领域已经 从细胞群体、细胞整体、亚细胞结构进入到分子结构，对细胞呼吸作用、光合作 用、信息传递、跨膜运输等各种生命活动进行研究，因此单细胞分析对分析装置 及方法提出了更高的要求。如何利用和发展各种分析检测技术来观测、分析细胞 的各种变化，从细胞中提取生命信息，搞清单细胞中各种化学物质的定性、定量及 山东师范大学硕士学位论文 结构的变化等具有重要的学术意义和应用价值。要开展单细胞水平的研究，必须 设计与极小体积( 单个细胞) 相匹配、能同时测定多种物质、并能给出良好的定性 和定量信息的分析方法。 微全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，g - t a s ) 的概念自1 9 9 0 年瑞 士科学家m a n z 和w i d m e r 【1 5 】首次提出以来，在短短的1 0 余年中已进入当前世界上 最前沿的科技领域【1 6 】。g - t a s 发展的策略是将生物化学、分析化学、医学等领域 所涉及的生化样品的筛选、进样、混合、反应、分离、检测等基本操作单元集成 或者基本集成到一个几平方厘米的微芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过 程，并对其产物进行分析【1 7 1 ，它为生化分析仪器新局面的开创提供了一个新型 研究平台。其“微型化、集成化及自动化 思想是分析仪器发展的理想境界。微 流控芯片( m i c o f l u i d i cc h i p ) 、芯片实验室( 1 a b o n c h i p ，l o c ) 和生物芯片( b i o c h i p ) 都属于p t a s 的范畴。其中微流控芯片分析系统是以微机械加工、微流体驱动 控制、检测技术为依托，以微通道网络为结构特征，以分析化学为基础，以毛细 管电泳为核心技术，以生命科学为主要应用对象的发展领域。由于具有液体流动 可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，它可以在几 分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析，并且可以实现样品的在线预 处理及分析全过程；同时将多种分析功能单元集成于一个芯片向实现维持一个闭 合系统迈进了一大步可以实现完全的自动化，减少污染、降低干扰和人为误差， 因而它成为近年来生物、化学、医学等领域微全分析系统研究的重点【1 8 , 1 9 。由于 微流控芯片能够实现多种单元操作技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模 集成，已经成为一种最具有发展潜力的细胞研究平台【2 0 之2 1 。与传统的宏观研究体 系相比，微流控芯片在细胞研究方面具有以下优势【2 4 j ： ( 1 ) 微流控芯片通道尺寸( 1 0 1 0 0l a m ) 与生物细胞在尺度上具有相容性， 在微流控芯片上对细胞的研究可深入到单细胞水平； 7 ( 2 ) 芯片设计灵活多样，可与相关分析仪器集成或联用； ( 3 ) 微流控芯片具有网络式二维或三维通道，容易操纵细胞； ( 4 ) 微流控芯片几何尺寸较小，可以用较小的电压获得较大的电场强度； ( 5 ) 微流控芯片为平板式几何构型，更容易对细胞进行观察、检测。 因此，微流控芯片技术在细胞分析方面的应用取得了快速的发展。自1 9 9 7 6 山东师范大学硕士学位论文 年l i 等【2 3 】首次在微流控芯片上实现单细胞的操纵、反应以来，许多分析工作者致 力于这一领域的研究，近些年来，这些研究小组也出版了相关的专著，发表了一 些综述性文献【2 4 。2 6 】及大量的研究报道。微流控芯片上细胞分析步骤通常包括细胞 培养、细胞操纵、细胞溶膜、细胞组分分析等，本章主要对近年来微流控芯片上 细胞分析的应用进行简单的综述。 2 微流控芯片在细胞研究中的应用 2 1 细胞培养 细胞培养是生物学研究的基本操作单元，通过设计一个能模拟体内环境的体 外空间，配置以无菌、适当温度、酸碱度和一定营养条件培养细胞，使之繁殖并 维持其结构和功能。传统细胞培养所用的皿板提供的静态培养环境，与体内环境 相差甚远，难以真实反映生理状态下细胞的生物学特征。在微流控芯片常用的细 胞培养方法是微流控灌流式培养( m i c r o f l u i d i cp e r f u s i o nc u l t u r e ) ，是将细胞悬液 注入微通道或者微反应室，待细胞贴壁后，通过微通道将培养液连续灌入培养区 域完成培养液的连续更新以及代谢物的清洗【2 7 】。微加工技术的发展，微流控芯 片构建的不同尺度( 纳米级至百微米级) 且相对独立的二维或三维网络结构，以 及各种功能单元如微泵微阀等在芯片上的集成为芯片在液流控制，细胞生长环境 的模拟，培养效率的提高及微结构高通量加工等方面提供了很大的优势。 t o h 等2 9 1 设计了一种微阵列微流控芯片装置，可对细胞实现灌流式培养， 并为其提供了一个三维的细胞一细胞和细胞一基质相互作用的微环境。 t o u r o v s k a i a 等【3 0 】设计了一种能长时间( 2 周) 维持心肌细胞生长的微流控灌 流系统，心肌细胞通过重力流实现了由成肌细胞到多核肌纤维的分化，而且他们 通过细胞贴壁和细胞防贴壁微单元，对c 2 c 1 2 精确分化为连结多核肌纤维进行了 追踪。 n e v i l l 等【3 l 】研制出一种新型芯片，集成了细胞自动培养和细胞自动溶解的 功能。他们利用这种芯片对h e l a 、m c f 7 、j u r k m 和c h o k 1 细胞培养了5 天，然 后利用芯片上微室自动生成的氢氧根离子对细胞进行电化学溶解，无需另加溶膜 试剂。 g o t t w a l d 等【3 2 1 开发了一种多功能三维组织培养装置，它能根据特定的细胞类 m 东师范人学颈i 学位论文 型，通过合适的通道修饰调整细胞培养环境。实验证明这个装置能提供胚胎癌细 胞和胚胎干细胞细胞中胚层分裂所需的生长环境。 2 2 细胞操纵 微流控芯片细胞分析中非常关键的一步是在分析之前如何重现性的将细胞 运送到预定位点【州，它包括从细胞群体中目标细胞的分离、筛选和捕获。目前 在微流控芯片上进行细胞操纵的方法主要有：机械操纵法、介电甩泳法，光学操 纵法、电场操纵法和磁力操纵法等。 2 2 1 机械力操纵 机械力操纵法主要是指利用微机械加工技术，在芯片上刻蚀出各种结构，如 微筛、微阱、微沟、梳状、堰状、沙袋等，根据细胞尺寸的差异进行物理分离的 一种方法。它的工作原理简单，无需特殊的缓冲液。但是微结构制作较复杂，而 且要求目标细胞和杂质细胞具有显著的尺寸差异。 y a o 等f 州石英玻璃上设计刻蚀了如图( f i g l - 1 ) 的通道。该芯片以液压作 驱动用通道中心的坝拦截标记了钙荧光试剂f l u 0 3 a m 的细胞当通道5 中液流 压力大于通道4 时，部分液流越过坝到达通道4 ，导致通道5 中的细胞沿坝停留。 待细胞完全固定在坝上之后，减少流过坝的液流，多余的细胞会被通道5 中的主 液流携带出去，而后坝上形成一层固定的单细胞。具有梯度浓度的三磷酸腺苷 ( a t p ) 溶液流过贴壁细胞会引起细胞内钙离子浓度的变化，然后显微镜检测 荧光信号的变化。 f i g u r e 卜l ( a ) 3 dv i e w ( c a di m a g e ) o ft h em a i nf e a t u r e s ( c h a n n e l s ，d a m sa n d i n t e r s e c t i o n s ) i nt h i sm i c r o d e v i c e ( b ) ，( c ) c e l ld o c k i n ga tap a r a l l e ld a m 8 m 东9 m 范大学硕学位论文 w h e e l e r 等通过多层软刻蚀技术制作了一种p d m s 多层微流捧芯片如图 ( f i gl - 2 ) ，通过设计一系列泵阀柬实现液体的流速和流向的控制。细胞悬液由 t 形通道顶部流向底部，由左右分成两股液流，在交叉点处出现静止点，通道底 部设爱了超微型的隔离室，单个细胞进a 隔离室后，其他细胞由于受到隔离室体 积的限制而无法进八，可以将单个细胞从细胞悬液中分选出来。 ab j i o 马l f i g u r e 卜2 s i n g l e c e l la n a l y s i sd e v i c e ( a ) s c h e m a t i co f d e v i c e ( b ) c c di m a g eo f a ni n d i v i d u a lj u r k a tt c e l lt r a p p e di nc e l ld o c k 黄等【3 日设计了一种芯片结构如图( f i gl 一3 a ) 。上层是加工了微通道的p d m s 盖片( f i g 】一3 b ) ，下层是刻蚀了微坑的玻璃底片( f i gl 3 c ) 。以静压力流驰 动单个鼠嗜硌神经癌细胞( p c i 2 ) 进行传输和定位由另通道引入尼占丁刺 激荆，以低噪声碳纤维电极实时监测了单个p c i 2 细胞神经递质多巴胺的量子释 放( f i gl - 4 ) 。 f i g u r e l 3s c h e m a t i co f t h e m j c r o c h i p f i g u r e l - 4d e t e c t i o no f t h es i n g l ec e l l l i 等设计了一种用于单细胞分析的微流控芯片如图f 唔i - 5 。他们在主通 篓 m 求n j 、学硕l # 位论文 道中设计了一个细胞截留结构，通过调节进样池与废液池的液面高度使细胞悬 液向着废液池运动当观察到细胞经过细胞截留微室时，由储液池3 中引入药物， 研究了癌细胞在药物刺激下的受抑制情况。 五! i 旦。藕 t ：一i j 謦 ：l j 丝雪二_ f i g u r ej - 5l a y o u to ft h em i c r o f l u i d i cc h i p ( a ) t h es c h e m a t i c so ft h em i c r o t l u i d i c c h i p ( b ) a ni m a g eo ft h en u c r o c h i pf i l l e dw i t har e df o o dd y e ( c ) a ni m a g eo fa r e t a i n e dl i v es i n g l ec e m v l bc e l l ，a ss t a i n e db yf l u o r e s c e i nd i a c e t a t e 2 2 2 光学操纵 光学操纵的基本原理是：当光束照射到细胞时，对细胞产生作用力细胞被 捕获在光束的焦点附近或者在这个力的作用下，细胞被运送到目标检测分析 位置。光学操纵注的优点是无接触式操纵、不损伤细胞，污染少，便于微尺寸范 围的精细操作，可达微米级的精确定位：缺点是设各昂贵，仅适于细胞短距离 操纵。 w a n g 等”1 设计的种微流控装置，能够精确控制细胞的位移而达到细胞分 选的目的。预先经过标记的细胞在经过两侧旁通道的液流的聚焦之后，形成鞘流 到达激光位置，在激光束的照射下，通过绿色荧光蛋白表达发出荧光的细胞在光 镊作用下流向收集池，而非绿色荧光蛋白表达的细胞囡未受光镊作用而流向废 液池( f j gl 一6 ) c m 东m 范 # 目学位论2 f i g u r e1 6l a y o u to f t h e m i c r o f l u i d i cs o r t i n gj u n c t i o na n d t h eo p t i c a ls w i t c h w a k a m o t o 等在芯片上利用微培养系统和光学陷阱对基因相同的细胞进行 了比较和区分。用激光镊子将细胞从培养微室转移到分析微室，或从分析微室转 移到废液微室可以除去基因变异的细胞，实现细胞的纯化。 雯义少渭i i 曩l 囊捌垂 雩：烈谶 “ll 。j _ 盗l ! 墨参灌商j 温鳖l f i g u r e l - 7 p r i n c i p l e a n di l l u s t r a t i o no f , u f a c sb a s e do no p t i c a lf o r c e st h e h y d r o d y n a m i c a l l yf o c u s e dm a c r o p h a g e ：( a ) i sd e t e c t e db yf o r w a r ds c a t t e r i n g ；( b ) e n t e r st h ei rl a s e rs p o t ；( c ji sd e f l e c t e db yo p t i c a lg r a d i e n tf o r c e s ；( d ) a n df i n a l l yi s r e l e a s e di nad i f f e r e n tl a m i n a rf l o ws t r e a m k a m l e s h 等【”1 利用光镊技术设计了一种微流控芯片荧光激发细胞分选装置 扯f a c s ) 。细胞在经过静压力聚焦之后，在经过4 8 8n m 的澈光检测为目标细胞后， m 东师范学l 学m 论女 启动近红外激光光束，目标细胞在激光作用下偏移至收集池g f a c s 的流程示意 图女l l f i gi 7 。 2 2 3 电场力操纵 在各种操纵技术中，电场力操纵技术具有高速、灵活、可控性强、易于实现 自动化等优点。根据细胞或生物粒子的自然属性不同可选用不同的电场进行操 纵：( 1 ) 可用直流电场产生的电泳力驱动带电粒子；( 2 ) 可用高频交流电场操纵可 极化( 带电或中性) 粒子：( 3 ) 可用直流和交流电场结合操纵带电或中性粒子。 细胞表面带有静电荷，在电场力的作用下会发生运动，即电泳现象。 y a s u k a w a 等设计了一种用于电泳操纵细胞及对酵母双杂交体系进行电化学基 因表达分析的新型微流控装置如f i g1 - 8 。在刻蚀于玻璃底片的分析微室中沉积 两个微型电极，作为电泳操纵细胞和电化学检测的工作电极。携带卢一半乳糖苷酶 报告基因的酵母细胞在屯场作用下，进行分析微室引发基因表达，基因表达产物 催化对氢基苯胡d 半乳糖苷水解，产生电活性物质对氨基苯苯酚，然后通过循 环伏安法等对产物进行电化学检测。 5 m m 。+ 。2 。( 3 。1 3 ：。m- ：- g ：_ ，= n - - o ：- ：= 盯一 - - _ - - - 一+ + 墨圆圈墨墨墨 。轴 d b 叫 | ! ! i j r 肾叵i f i g u r e1 - 8 ( a ) o p t i c a li m a g eo f t h ew h o l em i c r o f l u i d i cd e v i c ew i t h “yo f f o u r a n a l 外i c a lc h a m b e r s ( b ) p r i n c i p l e so f ( c - 1a n dc 3 ) t h em a n i p u l a t i o no fc e l l sa n d f c 2 1t h ee l e c t r o c h e m i c a lm e a s u r e m e n to fe x p r e s s e de n z y m ei nt h em i c r o f l u i d i c d e v i c e 介电电泳( d i e l e c t r o o h o r e s i s ，d e p ) 是指电中性颗粒在非均匀电场下，会产生诱 山东师范大学硕士学位论文 导极化并与电场相互作用而产生的介电电泳现象。m i i l l e r 等【4 2 】设计了具有三维结 构的微电极阵列，采用阴极介电电泳技术( d e p ) 实现了真核细胞的聚焦、捕获和 分离等功能。 t a i 等【4 3 报道了一种利用介电力对细胞进行分离和对细胞核进行收集的新型 生物芯片。通过微机电加工技术将d e p 电极阵列、微通道、微泵和微阀都集成在 微流控芯片上，可实现细胞自动转运、分离和收集。 d e p 技术在很大程度上解决了细胞耐高压能力差的问题，但是由于电极阵列 加工技术复杂，而且对细胞的驱动速度缓慢，因此限制了该技术更广泛的使用。 2 2 4 磁力操纵法 磁力操纵的原理是借助偶联在磁性颗粒上的抗体高特异性识别并标记目标 细胞表面抗原，再让混有磁珠的细胞悬液通过磁场，结合了磁珠的细胞被吸附在 磁场侧壁上，而未结合的细胞被除去，得到纯化的目标细胞。由于它主要借助抗 体抗原的识别，因此又称免疫磁珠法。它可以手动完成，简单快速，不需要昂贵 仪器，实验流程对细胞损伤小。 h a r r i s o n 等删以t 淋巴细胞系作为实验对象，设计了微流控芯片磁分选细胞 的装置如图f 嘻1 9 。先将结合了抗人c d 3 的蛋白质修饰的顺磁性磁珠注入芯片通 道，它会被外加磁铁产生的磁场捕获固定在芯片上，而后引入血液样品，抗人 c d 3 分子与t 细胞表面的抗原受体紧密结合。培养液冲洗掉未结合的血细胞，撤 去磁铁，收集t 细胞进行p c r 分析，以验证捕获效率。 p a m m e 等【4 5 】报道了一种应用磁场对细胞进行连续分选的微流控芯片装置。 细胞从阵列通道中最下面的一根通道泵入，其余通道则泵入缓冲液。未标记纳米 磁珠的细胞，不受磁力作用，在层流作用下不发生偏转，只会从右侧的对称通道 流出。标记了纳米磁珠的细胞，在外加磁场的作用下，因所受的磁力大小不同， 会发生不同程度的偏转，从不同的通道出口流出。他们用这套装置实现了小鼠巨 噬细胞和人类卵巢癌细胞的分离。 2 2 5 其他操纵法 微流控芯片上进行细胞操纵除了上述的几种方法之外还有许多其他的方法， 如库尔特计数法【倒，体积细胞筛选法【绷，声场力操纵【4 8 】等。 m 东大硕学位论女 芯片表面进行特异性修饰，利用不同细胞对芯片通道表面的选择性黏附特征 来捕获细胞，达到细胞操纵的目的。z h e n g 等1 4 9 1 将凝集素固定在微通道表面，根 据细胞对凝集素亲和力的不同分离了两种不同的细胞。也可以将特异性抗体键合 在通道管壁上，用于凡血红细咆f 5 q 或癌细胞的捕获。 9 义一：釜g j 一 f i g u r e1 9l m m u n o m a g n e t i cs e p a r a t i o no fq - c e l l su s i n gy - i n t e r s e c t i o nd e v i c e ；( a ) s 埘n g ep u m pd r a w sm a g n e t i cb e a d si n t ot h ec h a n n e lf o rc a p m r ew i t ham a g n e t ；( b ) b l o o ds a m p l e sa r ei n t r o d u c e df r o mb o t hc h a n n e l s ，( c ) m a g n e t sw c r er e m o v e da n d c a p t u r e dc e l l sa n dm a g n e t i cb e a d sw e r et r a n s f e r r e df r o mt h eo u l l e lw i t ham i c r o p i p e t 2 3 细胞溶膜 细胞溶膜是进行细胞内组分电泳分离和检测的重要步骤。能否快速、有效地 裂解细胞，是后续细胞组分检测的关键。目前，基于微流控芯片的细胞溶膜方法 主要有化学试剂溶膜法、电场溶膜法、电泳缓冲溶液溶膜法、机械溶膜法等。 2 3 1 化学试剂溶膜法 相对而言，化学试剂溶膜是生物实验中最为常用的方法。这类化学溶膜剂主 要有十二烷摹磺酸钠( s d s ) 、毛地黄皂苷、强碱如n a o h 等。它简单、有效、无 需附加设备并且易于实现。 l e e 等设训了一种新颖的芯片在线溶膜方法。由电极产生f l o h 进入细胞 膜诱使细胞溶膜。溶膜完毕之后，芯片电极上产生h + 中和多余的o h ，使细胞 溶解物显中性无需另外的清洗步骤( f l g1 t o ) 。芯j t-c一3l世 e - 3 山叱 山东师范人学硕士学位论文 条件下测得的h 2 0 2 浓度检测限为0 2 0p m 。通过对进样分离过程中交叉口的样品 体积进行显微镜( d m - i l ，莱卡，德国) 观察和c c d ( d f c 3 0 0 f x ，