（分析化学专业论文）基因检测和点突变识别的dna探针及适配体生物传感新方法研究.pdf

博一 ：学位论文 摘要 随着人类基因组计划的完成和功能蛋白质组学的研究进展，建立简单、灵敏、 快速、特异性强、高通量的蛋白质和基因检测方法，已成为分析科学家们研究的 重点之一。核酸碱基的突变与人类许多疾病有着直接的关系，因此实现单核苷酸 突变准确灵敏的检测对疾病的早期诊断也有着重要的意义。核酸适配体是近年来 发展起来的一类经体外人工进化程序筛选出的寡聚核苷酸。由于其不但和抗体一 样能与配体高效、特异性地结合，而且具有许多抗体无法比拟的优点，因此将核酸适 配体应用于生物传感器实现对包括蛋白质、小分子等目标物的检测有着巨大的发 展潜力。 鉴于电化学及压电检测技术所需仪器简单、检测成本低、易于实现微型化， 且灵敏度较高等优点，本研究论文针对当前传感器设计中的探针固定化和检测方 法两个关键技术，在电化学及压电d n a 传感器用于基因检测和点突变识别以及电 化学适配体传感器两方面开展了一些新方法研究工作。具体内容如下： ( 1 ) 在第2 章中，研制出一种新型的基于纳米多孔c e 0 2 壳聚糖复合膜的固定基质。 用它来固定单链d n a 探针，构建了检测与结肠癌高度相关的基因序列的电化学 d n a 生物传感器。该固定基质制备方法简单，成本低，结合了c e 0 2 和壳聚糖的 优点，具有良好的生物兼容性，无毒性和优越的电子传导性。将其用于固定结肠 癌基因的互补探针序列，能够显著增强s s d n a 探针在电极表面的负载量。制得的 传感器检测目标的线性范围在1 6 1 0 。1 1 1 2 1 0 。7 m ，检测下限为1 0 x 1 0 。1 1m ，具有 识别完全互补目标序列和四碱基错配序列的能力。 ( 2 ) 在第3 章中，基于连接酶的高保真性和生物催化沉积反应，提出了用于高特异 性识别单碱基突变的压电检测方法。实验中，目标d n a 链先与连接在石英晶振上 的d n a 捕获探针杂交，再与生物素标记的等位特异性d n a 检测探针杂交。只有 在目标d n a 链和检测探针完全匹配时，连接反应才能发生，即将捕获探针和检测探 针相连接。否则，即使只有一个等位错配的基因，连接反应也不会发生。经过高 温热处理，形成的双链解开，只有与目标链完全匹配的检测探针保留在电极表面。 生物素化的检测探针继而与链酶亲和素化的辣根过氧化物( s a h r p ) 绑定，辣根 过氧化物催化过氧化氢氧化底物中的3 ，3 一二氨基联苯胺( d a b ) 在电极表面生成不 溶性沉淀物，使压电频率响应显著增大。用该方法对d 地中海贫血基因2 8 位密码 子的突变情况进行了检测，使突变型和野生型得到了很好的区分，对目标的检测 线性范围为0 7 1 0 0n m ，检测下限达o 1n m ，是一个低成本高效率的检测方法。 ( 3 ) 在第4 章中，基于等位基因特异性延伸法，结合酶催化银沉积的放大体系，提 u 基闶检测和点突变识别的d n a 探针及适配体生物传感新方法研究 出了用于单碱基突变的电化学检测方法。首先，在金电极表面固定的等位特异性 捕获探针。由于其与野生型目标链完全互补，在聚合酶的作用下能够发生延伸反 应；而突变型目标链由于3 端与捕获探针发生错配，延伸反应不能进行，从而实 现对突变型和野生型基因的区分。用1mn a o h 进行解链处理后，双链结构解开， 目标链从电极表面脱落。在电极表面滴加与探针延伸部分相互补的生物素化的检 测探针后，只有发生延伸反应的捕获探针链会进一步与生物素化的检测探针杂交， 并引入链亲和素化的碱性磷酸酶，继而发生酶催化沉积银的反应。通过线性扫描 伏安法可以检测出电极表面沉积的银。该方法成功用于p 地中海贫血基因2 8 位密 码子单碱基突变的区分和定量检测，简单、快速、灵敏度高，线性范围为 3 0 1 0 - 1 6 3 o 1 0 m ，检测下限为1 o x1 0 。1 6m 。 ( 4 ) 在第5 章中，报道了基于目标物诱导置换适配体的无标记电化学传感器，用于 以腺苷为分析物模型的目标物检测。该传感器使用l ，6 巯基己醇白组装层修饰的 金电极为传感基底，以巯基己醇为媒介组装金纳米颗粒层，能够增加巯基捕获探 针的表面负载量，提高信号强度。含有腺苷适配体序列的一段寡核苷酸序列一部 分可与捕获探针杂交，在电极表面形成捕获探针与适配体的双链复合物。含有腺 苷的分析物的加入，把腺苷适配体序列置换下来，使其从电极表面解离，从而减 少了电极表面核酸链的数量，使与核酸作用的电化学活性指示剂亚甲基蓝的量相 应减少。指示剂的还原电流的大小能够反映被分析物的浓度。构造的传感器简单、 快速、灵敏、选择性好，线形范围为5 1 0 0 0n m ，检测下限为1n m ，同时具有简 便快速的再生能力。 ( 5 ) 在第6 章中，报道了基于抗体与生物素标记的适配体新型夹心的酶放大电化学 免疫传感器，用于免疫球蛋白e ( i g e ) 的检测。i g e 多克隆抗体作为捕获探针通 过半胱胺自组装层以及交联剂戊二醛的作用共价固定在金电极表面，与目标物发 生免疫反应后，继续捕获生物素化的i g e 适配体的检测探针，从而形成一种新型 的夹心结构。之后，通过生物素与亲和素的特异性亲和作用，亲和素标记的碱性 磷酸酯酶能与电极表面适配体上的生物素相结合，促使碱性磷酸酯酶催化底物抗 坏血酸磷酸酯水解成强还原剂抗坏血酸，并将底液中的银离子还原成单质银，沉 积到电极表面。沉积的银的量与电极表面捕获的目标i g e 的量成正比，可以用溶 出伏安法来定量。结果表明，该免疫传感器结合了抗体和适配体的双重特异性， 并利用了酶催化银沉积体系的高灵敏性，检测目标蛋白的灵敏度高、特异性好， 线性范围为o 1 1 0 0n m ，检测下限为0 0 2n m 。 ( 6 ) 第7 章，同样基于抗体与适配体的新型夹心结构，构建了纳米金壳聚糖电化 学沉积复合膜的新型固定基质用于抗体的固定，采用亚甲基蓝为电活性指示剂， 报道了检测凝血酶的无标记电化学方法。该复合膜结合了纳米金和壳聚糖独特的 i i i 博f j 学位论文 性能，提高了传感器的导电性能以及负载量。实验考察了纳米金壳聚糖电化学沉 积条件，并用扫描电子显微镜对该膜进行了表征。在这个工作中，在不改变适配 体与目标物结合作用的基础上，对原凝血酶的适配体序列进行了适当延伸，以提 高亚甲基蓝嵌入适配体中的量，增强信号响应。传感器构造方法简单、价格低廉， 无需对探针进行任何修饰，凝血酶的线性响应范围是1 6 0n m ，检测下限为0 5n m 。 关键词：固定化方法；电化学检测；压电检测：d n a 传感器；适配体；单核苷 酸多态性：核酸连接反应；等位特异性延伸 基冈检测和点突变识别的d n a 探针及适配体生物传感新方法研究 a bs t r a c t w i t ht h ei m p l e m e n to ft h eh u m a ng e n o m ep r o j e c ta n dt h ed e v e l o p m e n to ft h e f u n c t i o n a lp r o t e o m i c sr e s e a r c h ，i t sa ni m p o r t a n td o m a i nt h a th i g hs e n s i t i v ea s s a y m e t h o d sw e r ed e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no ft h ep r o t e i n sa n dd n a b e c a u s ep o i n t m u t a t i o n si ng e n o m i cd n ah a v ed i r e c tl i n kw i t hh u m a nd i s e a s e s ，t h e r eh a sb e e n c o n s i d e r a b l ei n t e r e s ti n d e v e l o p i n gr a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d st o d e t e c t p o i n t m u t a t i o n s d n aa p t a m e r sa r es h o r tn u c l e i ca c i dl i g a n d sa r t i f i c i a l l ys e l e c t e df o rt h e i r h i g hs p e c i f i c i t ya n da f f i n i t yf o rv a r i o u st a r g e t si n c l u d i n gp r o t e i n s ，s m a l lm o l e c u l e sa n d e v e nc e l l s b e c a u s eo ft h e i rn u m e r o u sa d v a n t a g e so v e ra n t i b o d i e ss u c ha sa d a p t a b i l i t y t ov a r i o u st a r g e t s ，e a s ei n s y n t h e s i sa n ds t o r a g e ，a n dv e r s a t i l i t y i n l a b e l i n g ， i m m o b i l i z a t i o n ，s i g n a l i n ga n dr e g e n e r a t i o n ，t h ew i d e s p r e a da p p l i c a t i o no fa p t a m e r st o b i o s e n s o r si se x p e c t e dt oh o l dp o t e n t i a li nt h ed e t e c t i o no fv a r i o u sp r o t e i n sa n ds m a l l m o l e c u l e s e l e c t r o c h e m i c a la n dp i e z o e l e c t r i cb i o s e n s o r sa t t r a c t s i g n i f i c a n ta t t e n t i o na n d b e c o m et h er e s e a r c hh o t s p o tf o rt h e i rl o w c o s t ，f a s tr e s p o n s e ，b e i n gs i m p l e ，s e n s i t i v e a n dc o m p a t i b l ew i t hm i c r o f a b r i c a t i o nt e c h n o l o g i e s a i m i n ga tt h ek e yt e c h n i q u e i n c l u d i n gp r o b ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o da n dd e t e c t i o nm e t h o du s e di ne l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r , s e v e r a ln o v e lm e t h o d sb e e nd e v e l o p e df o re l e c t r o c h e m i c a l ，p i e z o e l e c t r i c d n ab i o s e n s o r sa n de l e c t r o c h e m i c a la p t a s e n s o r t h ed e t a i l e dc o n t e n ti sd e s c r i b e da s f o l l o w s 1 ) i nc h a p t e r2 ，c e 0 2 c h i t o s a nc o m p o s i t em a t r i xw a sf i r s t l y d e v e l o p e df o rt h e s i n g l e - s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) p r o b ei m m o b i l i z a t i o na n dt h ef a b r i c a t i o no fd n a b i o s e n s o rr e l a t e dt ot h ec o l o r e c t a lc a n c e rg e n e t h ep r e p a r a t i o nm e t h o di sq u i t es i m p l e a n di n e x p e n s i v e s u c hm a t r i xc o m b i n e dt h ea d v a n t a g e so fc e 0 2a n dc h i t o s a n ，w i t h g o o db i o c o m p a t i b i l i t y ，n o n t o x i c i t ya n de x c e l l e n te l e c t r o n i cc o n d u c t i v i t y t h em a t r i x w a su s e dt oi m m o b i l i z ec o m p l e t e l yc o m p l e m e n t a r ys s d n ap r o b ew i t ht h et a r g e t s e q u e n c ea n ds h o w e d t h ee n h a n c e dl o a d i n go fs s d n a p r o b eo nt h es u r f a c eo fe l e c t r o d e t h ee s t a b l i s h e db i o s e n s o rh a sh i g hd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y ，ar e l a t i v e l yw i d el i n e a rr a n g e f r o m1 6 x l o 1 1 1 2 1 0 。7ma n dt h ea b i l i t yt od i s c r i m i n a t ec o m p l e t e l yc o m p l e m e n t a r y t a r g e ts e q u e n c ea n df o u r b a s e - m i s m a t c h e ds e q u e n c e t h el i m i to ft h ed e t e c t i o ni s 1 0 x 1 0 l lm 2 ) i nc h a p t e r3 ，an o v e lb i o s e n s i n gt e c h n i q u ef o rh i g h l ys p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o no f v 博士学位论文 g e n ew i t hs i n g l eb a s em u t a t i o ni sp r o p o s e db a s e do nt h ei m p l e m e n t a t i o no ft h ed n a l i g a s er e a c t i o na n dt h eb i o c a t a l y z e dd e p o s i t i o no fa ni n s o l u b l ep r o d u c t t h et a r g e tg e n e m e d i a t e dd e p o s i t i o no fa ni n s o l u b l ep r e c i p i t a t ei st h e nt r a n s d u c e db yq u a r t zc r y s t a l m i c r o b a l a n c e ( q c m ) m e a s u r e m e n t s i nt h i sm e t h o d ，t h ed n at a r g e th y b r i d i z e sw i t ha c a p t u r ed n ap r o b et e t h e r e do n t ot h eg o l de l e c t r o d ea n dt h e nw i t hab i o t i n y l a t e d a l l e l e 。s p e c i f i cd e t e c t i o nd n a al i g a s er e a c t i o ni sp e r f o r m e dt og e n e r a t et h el i g a t i o n b e t w e e nt h ec a p t u r ea n dt h ed e t e c t i o np r o b e s ，p r o v i d e dt h e r ei s p e r f e c tm a t c hb e t w e e n t h ed n at a r g e ta n dt h ed e t e c t i o np r o b e o t h e r w i s ee v e nw h e nt h e r ei sa na l l e l e m i s m a t c hb e t w e e nt h e m ，n ol i g a t i o nw o u l dt a k ep l a c e a f t e rt h e r m a lt r e a t m e n ta ta n e l e v a t e dt e m p e r a t u r e ，t h ef o r m e dd u p l e xm e l t sa p a r tt h a tm e r e l ya l l o w st h ed e t e c t i o n p r o b ep e r f e c t l ym a t c h e dw i t ht h et a r g e tt or e m a i no nt h ee l e c t r o d es u r f a c e t h e p r e s e n c eo ft h eb i o t i n y l a t e da l l e l e m a t c h e dp r o b ei st h e nd e t e c t e db yt h eq c mv i at h e b i n d i n gt os t r e p t a v i d i n - p e r o x i d eh o r s e r a d i s h ( s a h r p ) ，w h i c hc a t a l y z e st h eo x i d a t i v e p r e c i p i t a t i o no f3 ，3 - d i a m i n o b e n z i d i n e ( d a b ) b yh 2 0 2o nt h ee l e c t r o d ea n dp r o v i d e s a n a m p l i f i e df r e q u e n c yr e s p o n s e t h ep r o p o s e da p p r o a c hh a sb e e ns u c c e s s f u l l y i m p l e m e n t e df o r t h ei d e n t i f i c a t i o no fs i n g l eb a s em u t a t i o ni n 2 8s i t eo ft h e f l - t h a l a s s e m i ag e n e t h et a r g e tg e n ec a nb ed e t e r m i n e di nt h er a n g ef r o m0 7n mt o10 0 n mw i t had e t e c t i o nl i m i to fo 1n m 3 ) i nc h a p t e r4 ，an o v e le l e c t r o c h e m i c a lm e t h o df o rs n pd e t e c t i o ni sp r o p o s e db a s e d o n a l l e l e s p e c i f i c e x t e n s i o na n d e n z y m a t i c i n d u c e ds i l v e rd e p o s i t i o n b r i e f l y ， a l l e l e s p e c i f i cc a p t u r ep r o b ef i r s t l yi m m o b i l i z e do nt h eg o l de l e c t r o d e ，w h i c hp e r f e c t l y m a t c h e sw i t hw i l dg e n ea n dc a nb ee x t e n d e d ，w h e r e a sm i s m a t c h i n gw i t ht h em u t a n t g e n ea t3 t e r m i n a lb a s e sc a n n o tb ee x t e n d e d a f t e rd e n a t u r a t i o nw i t h1mn a o h t h e f o r m e dd u p l e x e su n f o l da n dt a r g e ts e q u e n c e sd i s s o c i a t ef r o mt h ee l e c t r o d es u r f a c e b e c a u s et h es e q u e n c ee x t e n d e dp e r f e c t l ym a t c hw i t hb i o t i n m o d i f i e dd e t e c t i o np r o b e ， h y b r i d i z a t i o nt a k ep l a c e ，a n dt h e ns t r e p t a v i d i n c o n j u g a t e da l k a l i n ep h o s p h a t a s ec a nb e c a p t u r e d t ot h ee l e c t r o d es u r f a c ed u et ot h e s p e c i f i c i n t e r a c t i o no fb i o t i na n d s t r e p t a v i d i n t h ee n z y m e - i n d u c e ds i l v e rd e p o s i t i o ni su s e dt oa m p l i f yt h er e s p o n s e t h ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lo fs i l v e ri so b t a i n e db yu s i n gl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y t h ep r e s e n ta p p r o a c hh a sb e e nd e m o n s t r a t e dw i t ht h ei d e n t i f i c a t i o no fs i n g l e b a s e m u t a t i o ni n 一2 8s i t e ( at og ) f o ri b - t h a l a s s e m i ag e n ea n dt h ew i l dt y p et a r g e tc a nb e d e t e r m i n e di nt h er a n g ef r o mw i t h3 0 x 1 0 - 1 6 3 0 1 0 一mw i t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f 1 0 1 0 1 6m 4 ) i nc h a p t e r5 ，al a b e l - f r e ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s o ru s i n ga p t a m e rb a s e do n t a r g e t - i n d u c e dd i s p l a c e m e n ti sr e p o a e dw i t ha d e n o s i n ea st h em o d e la n a l y t e t h e v i s e n s i n gs u b s t r a t ei sp r e p a r e du s i n gag o l de l e c t r o d em o d i f i e dw i t has e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e ro f1 ，6 - 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b a s e de n z y m a t i ca m p l i f i c a t i o nw i t hi m m u n o g l o b i ne ( i g e ) a st h em o d e l a n a l y t e t h ei g e - a n t i b o d yi sc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e da st h ec a p t u r ep r o b eo nt h eg o l d e l e c t r o d ev i aas e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e ro fc y s t e a m i n e a f t e rt h et a r g e tc a p t u r e d ，t h e b i o t i n l y n a t e da n t i - i g ea p t a m e ri su s e da st h ed e t e c t i o np r o b e t h es p e c i f i ci n t e r a c t i o n o fs t r e p t a v i d i n - c o n j u g a t e da l k a l i n ep h o s p h a t a s et ot h es u r f a c e b o u n db i o t i n l y n a t e d d e t e c t i o np r o b em e d i a t e sac a t a l y t i cr e a c t i o no fa s c o r b i ca c i d2 - p h o s p h a t es u b s t r a t et o p r o d u c ear e d u c i n ga g e n ta s c o r b i ca c i d t h e n ，s i l v e ri o n si nt h es o l u t i o nc a nb e r e d u c e d ，l e a d i n gt ot h ed e p o s i t i o no fm e t a l l i cs i l v e ro nt h ee l e c t r o d es u r f a c e t h e a m o u n to fd e p o s i t e ds i l v e r ，w h i c hi sd e t e r m i n e db yt h ea m o u n to f i g et a r g e tb o u n do n t h ee l e c t r o d es u r f a c e ，c a nb eq u a n t i f i e du s i n gt h es t r i p p i n gv o l t a m m e t r y t h er e s u l t s o b t a i n e dd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o r p o s s e s s e sh i g h s p e c i f i c i t ya n daw i d ed y n a m i cr a n g ef r o m0 1 10 0n mw i t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f o 0 2n m ，w h i c hp o s s i b l ya r i s e sf r o mt h ec o m b i n a t i o no ft h eh i g h l ys p e c i f i ca p t a m e r a n dt h eh i g h l ys e n s i t i v es t r i p p i n gd e t e r m i n a t i o no fe n z y m a t i c a l l yd e p o s i t e ds i l v e r 6 ) i nc h a p t e r7 ，b a s e do nt h ep r i n c i p l eo fa n t i b o d y a p t a m e rs a n d w i c hi nc h a p t e r6 ， w er e p o r t e dal a b e l - f r e ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rf o rt h r o m b i nd e t e c t i o n an o v e l n a n o g o l d c h i t o s a nc o m p o s i t ef i l mu s i n gt h ee l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o nm e t h o dw a s p r e p a r e dt oi m m o b i l i z et h r o m b i na n t i b o d y c o m b i n e dt h es p e c i a lp r o p e r t i e so fg o l d n a n o p a r t i c l e sa n dc h i t o s a n ，t h ec o m p o s i t ef i l ms h o w e de n h a n c e dc o n d u c t i v i t ya n d l o a d i n ga b i l i t y t h ee l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o nc o n d i t i o n so ft h ec o m p o s i t ef i l mw a s i n v e s t i g a t e da n di t ss u r f a c em o r p h o l o g yw a sc h a r a c t e r i z e db ys e m m e t h y l e n eb l u e ( m b ) a st h ee i e c t r o c h e m i c a la c t i v em a r k e ri n t e r c a l a t i n gi nt h ep r o b i n ga p t a r n e rw a s a p p l i e dt oo f f e rt h er e s p o n s es i g n a lb yd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) w i t h v i i 博l 学位论文 a p p r o p r i a t ee x t e n d e dd e s i g no ft h ea p t a m e rs e q u e n c e ，t h ea m o u n to fm bi n t e r c a l a t i n g i nt h ea p t a m e rw a si n c r e a s e da n dt h e s i g n a lr e s p o n s ew a sa l s oe n h a n c e d t h e f a b r i c a t e ds e n s o rw a ss i m p l ea n dl o w - c o s ta n dw i t h o u tt h en e e do fl a b e l i n g t h el i n e a r r e s p o n s er a n g ef o rt h r o m b i nd e t e c t i o nc o v e r e d1 - 6 0n mw i t had e t e c t i o nl i m i to f o 5 n m k e yw o r d s ：l m m o b i l i z t i o nm e t h o d ；e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ；p i e z o e l e c t r i c d e t e c t i o n ；d n as e n s o r ；a p t a m e r ；s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ；d n al i g a s er e a c t i o n ；a l l e l e - s p e c i f i ce x t e n s i o n 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：翻q 矿 日期：伽7 年m r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 日期：炒，年f 月yh 日期：1 年f 月y 日 多 留孑， 猁 汜 名名 ，夕 签签 麴 者师 黧斜 博j 二学位论文 第1 章绪论 生物传感技术是一门多学科交叉的技术，它是在化学传感技术的基础上发展 起来的。生物传感器一般都由敏感膜，换能器和信号处理器三部分组成。根据所 用敏感材料的不同，生物传感器可以分为酶传感器，免疫传感器，核酸传感器， 细胞传感器等。d n a 生物传感器是基于核酸分子杂交和w a t s o n c r a c k 碱基配对原 理而发展起来的一种用于核酸序列识别检测的新技术。与其他检测方法如凝胶电 泳检测相比，它的出现大大缩短了目标物的检测时间，而且无污染、操作简单化， 既可定量，又可定性，为d n a 序列检测和单碱基突变的识别提供了新型高效的检 测手段，并在基因检测诊断【1 5 1 、环境监测【6 刖1 、药物机理分析【1 2 1 4 1 及d n a 损伤 研究【1 5 17 】等方面发挥了重要作用。伴随指数富集配体系统进化技术的发展，核酸 适配体被筛选出来，并能与各种靶物质发生高特异性结合，因此开发基于适配体 的生物传感器具有很大的发展潜力。 1 1 用于基因序列检测和点突变识别的d n a 生物传感器 1 1 1 基因序列和点突变的检测意义 伴随遗传学、分子生物学、生物化学等领域的研究发展，以及人类基因组计 划的顺利推进，对遗传物质d n a 的认识要求日益迫切。基因是带有遗传信息的d n a 片段。特定序列的d n a 分子对基因的表达、调控、转录与翻译具有重要的作用。 单碱基多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 是指基因组水平上单个核苷 酸的变异，包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失。它在人群中的发生频率大于 1 ，人类基因组9 0 的多态性是由s n p 造成的，是最常见的遗传变异类型【1 8 , 1 9 】。 在人类基因组中，大约每1 0 0 0 个碱基就有一个碱基可能发生突变。如果这种突变 发生在遗传基因的编码区，就有可能会引起它所编码的蛋白质结构或功能的改变， 从而引起基因疾病的发生【2 0 ，2 1 1 。人类的许多疾病，如b 地中海贫血、囊性纤维化 病、镰刀形红细胞贫血病以及许多肿瘤，都与基因序列上单碱基突变有着直接的 关系2 2 , 2 3 1 。单碱基突变可以作为遗传标志物，实现对部分疾病的早期医学诊断【2 4 1 。 因此，对特定基因序列以及与遗传疾病高度相关的单碱基突变的识别检测，在分子 生物学、遗传学、疾病的发病机理研究及早期诊断与治疗等方面都具有非常重要 的意义。 1 1 2d n a 生物传感器的概念和分类 d n a 生物传感器是以d n