（分析化学专业论文）基于美洲蜚蠊pamericana的整合受体生物传感器研究.pdf

中国科学技术大学博士论文 中文摘要 基于美洲蜚蠊 的整合受体 。f = = 一- - 一p e r i p l a n e t a a m e r i c a n a 生物传感器研究 中文摘要 本论文在综述了离体矛哗合堕鐾签鼍迦垡壁墨的研究进展的基础上，借助 神经生理学家研究昆虫味觉特性的方法，发展出一种基于整合受体组织的新型生 物传感器。整合受体组织既包含受体结合位点又包含神经纤维，前者既是识别元 件又是换能器，而后者则提供了信号传导到记录电极的通路。基于这种组织的传 感器不同于用分离的或重组的受体分子作为识别元件的传感器，它不但使受体保 留在其天然脂膜环境中而且能够通过神经纤维将编码着识别事件信息的生物电 信号一神经冲动传导出来，因此这种传感器能够将灵敏度、选择性和快速响应等 特点结合在一起，从而可能具有大大优于分离受体生物传感器的分析特性，在新 药筛选，环境毒理和环境质量监测等方面具有诱人的应用前景。 ， 1 本论文研究的目的是研制建立一套实验室仪器设备，用于研究基于美洲蜚蠊 l p e r i p l e n i t aa m e r i c a n a 下颚须的整合受体生物传感器。主要探测了四种盐、三种 糖、十八种游离氨基酸和牛血清白蛋白等刺激物质作用下美洲蜚蠊下颚须味觉毛 的响应及其特点；并对这一生物传感器的分析特性诸如选择性、灵敏度、重现性、 响应时间、寿命、和剂量响应关系等方面进行考察。 我们首先参照典型的电生理仪器配置，建立了一套用于刺激和记录整合受体 生物传感器的仪器设备，发展了相应的实验方法和数据处理方法，并用家蝇唇瓣 味觉毛检验了这套设备的可用性。针对输出信号失真，噪声偏大以及难以长时间 采集的问题，将原来记录用的两电极系统改为三电极系统，并发展出声卡采集技 术，基本解决了上述问题，得到了良好的效果。 其次，由于美洲蜚蠊下颚须末端腹面味觉毛的化学感受能力至今未见有电生 理研究的工作报道。我们第一次对美洲蜚蠊下颚须味觉毛的电生理响应特性进行 了研究，发现下颚须上大量密集排列的同类感觉毛和感觉细胞高度协同作为一个 整体起作用的现象。这一发现突破了传统认为昆虫的感觉毛是单独起作用的观 ! 里翌兰垫查盔堂苎主丝苎主苎塑l 念，对进一步深入的研究有重要意义。这种协同作用导致下颚须感觉区对有些刺 激物如n a c i ，k c i ，蔗糖，甘氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，牛血清白蛋白 的响应阈值比一般单根感觉毛( 苍蝇) 至少低2 - 3 个数量级，达1 0 6 m o l l 4 以下； 信号幅度提高约十倍，是一种新型的适合用作传感器的敏感材料。 我们的实验结果显示：美洲蜚蠊下颚须对不同的盐有选择性响应，并表现出 良好的重现性、很短的响应时间( 胆碱阳 离子；发现柠檬酸阴离子比氯离子引发更多的负相脉冲。 对糖的选择性表现为对不同的糖尤其对低浓度的糖的敏感性不同，对蔗糖最 敏感，果糖其次，葡萄糖最后。而且随着蔗糖浓度的增大，盐感受细胞的活性被 抑制，美洲蜚蠊可能正是通过对盐的抑制来增强对糖的取食敏感性的。 现有数据还不能确定美洲蜚蠊下颚须对氨基酸的响应是否有统一的结构一响 应关系，但已经发现不同的氨基酸所引发的响应是明显不同的。下颚须感觉毛对 甘氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸比对其它氨基酸更为敏感，而对丙氨酸的响 应与浓度不成线性关系，当丙氨酸的浓度高于定值( l o o m m o l l 。1 ) 时能引发 出强烈的响应。 研究发现牛血清白蛋白能够引发不同于其他刺激物的脉冲，但还不能确定这 种脉冲信号是否是一种对蛋白质特殊敏感的受体细胞所引发的。由于至今人们尚 未在昆虫的味觉感受器中发现对蛋白质具有专一响应的感觉细胞，因此这一发现 对深入研究其中机理是很有意义的。 总而言之，本论文首次从电生理信号上对美洲蜚蠊下颚须的化学响应进行研 究，初步探讨了基于美洲蜚蠊下颚须的整合受体生物传感器的特性；发现了美洲 蜚蠊下颚须能够整合其密集的感觉毛阵列对化学刺激的响应；得到了蜚蠊对氨基 酸和蛋白质等生物分子以及简单物质如盐和糖等的敏感而具有选择性的响应信 号，并发现了糖和蛋白质的特殊响应信号；表明了美洲蜚蠊下颚须是一种新型整 合受体生物传感器的敏感材料，进一步深入地研究信号波形及其整合原理、探寻 糖和蛋白质的特殊受体细胞等，对这一类型整合受体传感器的研究发展是很有意 八 义的。， 中国科学技术大学博士论文 英文摘要 s t u d y o nab i o s e n s o rb a s e d o nt h e m a x i l l a r yp a l po fc o c k r o a c h ， a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to fb i o s e n s o r sb a s e do ni s o l a t e da n di n t a c t r e c e p t o r sw a s r e v i e w e d a d a p t e d f r o mt h et e c h n i q u eu s e d b yn e u r o p h y s i o l o g i s t si ns t u d i e so f i n s e c t g u s t a t i o n ，an e wt y p eo f b i o s e n s o rb a s e do i lt h eu s eo fi n t a c tc h e m o r e c e p t o rs t r u c t u r e s c a nb e d e v e l o p e dt h a t d i f f e r s t o t a l l y f r o mp r e v i o u sa n a l y t i c a l a t t e m p t s i nw h i c h i s o l a t e do rr e c o n s t i t u t e dr e c e p t o rm o l e c u l e sa r eu s e da st r a n s d u c e r s t h i st y p eo f b i o s e n s o r so f f e r s s i g n i f i c a n ta d v a n t a g e o fa t t r a c t i v ec o m b i n a t i o no f s e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t ya n dr a p i dr e s p o n s ed u et o t h a tt h er e c e p t o rs i t e so ft h es t r u c t u r e sa r e m a i n t a i n e di nt h e i rn a t u r a le n v i r o n m e n ta n da r ea l r e a d yp r o v i d e dw i t har e c a l l so f s i g n a lc o n d u c t i o nt h r o u g ht h en e r v ef i b e r t h e s ei n t a c t r e c e p t o rb a s e db i o s e n s o r s w e r e p r o m i s e dw i t ha t t r a c t i v ea p p l i c a t i o nf o r e g r o u n de s p e c i a l l yo nt h en e wm e d i c i n e s c r e e n ，e n v i r o n m e n t a lt o x i c o l o g i c a ls t u d ya n de n v i r o n m e n t a lq u a l i t ym o n i t o r t h e p u r p o s e o ft h i sd i s s e r t a t i o ni st os e t u p ai n s t r u m e n t a t i o nt o s t u d y i n t a c t - r e c e p t o rb a s e db i o s e n s o r se s p e c i a l l yt h eb i o s e n s o rb a s e do nm a x i l l a r yp a l po f c o c k r o a c h p e r i p l a n e t a a m e r i c a n a t h e r e s p o n s eo f t h e s e n s i l l a rf i e l do nt h e m a x i l l a r y p a l po ft h ec o c k r o a c hw a ss t u d i e df o rd i f f e r e n ts t i m u l a n t ss u c ha sf o u rs a l t s ，t h r e e s u g a r s ，e i g h t e e na m i n o a c i d sa n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n a l y t i c a lp r o p e r t i e s s u c ha s s e l e c t i v i t y ，s e n s i t i v i t y , r e p e a t a b i l i t y ，r e s p o n s et i m e ，l i f e t i m e ，a n d d o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i pe t c w e r ei n v e s t i g a t e d f i r s t l y ，t h ei n s t r u m e n t a t i o ns y s t e mf o rh o l d i n ga n ds t i m u l a t i n gt h es e n s o r s ，a n d r e c o r d i n gt h ee x p e r i m e n t a ld a t aw e r ee s t a b l i s h e di n t h i s l a b o r a t o r y ，r e f e r r i n gt o a t y p i c a le l e c t r o p h y s i o l o g i c a li n s t r u m e n t a t i o n ；c o r r e s p o n d i n ge x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e a n dd a t ap r o c e s s i n gm e t h o d sw e r ee s t a b l i s h e da n dt e s t e dw i t ht y p i c a ll a b e l l a rt a s t e 中国科学技术大学博士论文英文摘要 h a i r so fh o u s ef l y a n dt h e n ，at h r e e - e l e c t r o d es y s t e mw a sd e s i g n e di n s t e a do ft h e o r i g i n a lt w oe l e c t r o d es y s t e mf o rt h eh e a ds t a g eo f t h ep r e - a m p l i f i e r , w h i c hl e a d st o a n s i g n i f i c a n t i n c r e a s eo ft h e s i g n a l - t o n o i s e r a t i oa n de v i d e n t r e d u c i n g o ft h e d i s t o r t i o no ft h es p i k e s ( s i g n a lw a v ef o r m ) t h i r d l y , as o u n dc a r dr e c o r d i n gm e t h o d w a s d e v e l o p e d f o rl o n gt i m er e c o r d i n ga n dd a t a m a n i p u l a t i o n a l t h o u g h al o to fb e h a v i o r a ls t u d yo ft h ei n s e c t sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e df o rt h e i r c h e m i c a ls e n s ea b i l i t y , t h em a x i l l a r yp a l po fc o c k r o a c hh a sn e v e rb e i n v e s t i g a t e d e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l l y f o r t h ef i r s t t i m e ，t h ep r o p e r t i e s o f e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e so f t h e m a x i l l a r y p a l p o f c o c k r o a c h p e r i p l e n a t a a m e r i c a n a w a ss t u d i e d w i t h c h e m i c a ls t i m u l a t i o n i tw a se x p l o r e dt h a tal a r g ea m o u n to ft a s t eh a i r s d e n s e l y c o m p a c t e d o nt h ev e n t r a ls i d eo ft h em a x i l l a r yp a l pr e s p o n dt os t i m u l a n t sw i t h h i g h l y c o h e r e n c ea sa n o r g a n i ti sb e l i e v e dt h a tt h ed i s c o v e r yb r o k et h r o u g ht h eg e n e r a li d e a t h a tt a s t eh a i rf u n c t i o n e da sa s i n g l eu n i tf o rt h eg e n e r a lc a s e s a sar e s u l t ，b o t ht h e d e t e c t i o nl i m i to ft h es e n s o rd e c r e a s e db y2 - 3m a g n i t u d e sa n dt h es i g n a lm a g n i t u d e i n c r e a s e da b o u tt e nt i m e st h a nt h a to f f l yl a b e l l a rs i n g l eh a i r s t h es e n s i t i v i t yt om a n y s t i m u l a n t sf r o ms i m p l em o l e c u l e ss u c ha s n a c i ，k c i ，s u c r o s e ，g l y c i n e ，p r o l i n e ， g l u t a m i ca c i da n da s p a t i ca c i dt om a c r o m o l e c u l es u c ha sb o v i n es u r e ma l b u m i nw a s l o w e rt h a n1 0 。m o ll f o rt h i sr e a s o n ，t h em a x i l l a r y p a l po f c o c k r o a c hi sr e v e l e da s a ni m p o r t a n tc a n d i d a t ef o rc o n s t r u c t i o no fan e w t y p eo fi n t a c t - r e c e p t o rb i o s e n s o r s i tw a sd i s p l a y e dt h a tt h em a x i l l a r yp a l po fc o c k r o a c hs e l e c t i v e l y r e s p o n d e dt o d i f f e r e n ts l a t sw i t hg o o d r e p e a t a b i l i t y ，r a p i dr e s p o n s e ( c o l i n ec a t i o n o nt h eo t h e r h a n d ，c i t r a t ea n i o nc a u s e dm o r es p i k e sw i t hn e g a t i v ep h a s et h a nc h l o r i da n i o n i tw a sa l s od i s p l a y e dt h a tt h em a x i l l a r yp a l po fc o c k r o a c h s e l e c t i v e l yr e s p o n d e d t od i f f e r e n ts u g a r s i ts h o w e dm o r e s e n s i t i v i t yt os u c r o s et h a nt of r u c t o s ea n dg l u c o s e ， e s p e c i a l l y w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f s u g a r s w e r el o w w i t ht h ei n c r e a s eo f 中国科学技术大学博士论文 英文摘要 c o n c e n t r a t i o no fs u c r o s e ，t h ea c t i v i t yo f s a l tc e l l sw e r es u p e r i m p o s e d ，a sap o s s i b l e r e s u l t r o a c h e si n c r e a s e dt h e i rs e n s f f i v i t yt os u g a r sb y t h i sw a y 1 1 1 ep a l p ss e l e c t i v e l y r e s p o n d t oa m i n oa c i d s ，t o o ，a l t h o u g hn og e n e r a ls t r u c t u r e 。r e s p o n s er e l a t i o n s h i pc a l l b ef o u n da c c o r d i n gt ot h ep r e l i m i n a r yd a t a i ts h o w e dm o r es e n s i t i v et og l y c i n e ， p r o l i n e ，g l u t a r n i ca c i da n da s p a t i ca c i d t h a na n yo t h e ra m i n o a c i d s a l t h o u g hn oc e l l s w i t hh j i g hs e l e c t i v i t yt op r o t e i n sh a db e e nd i s c o v e r e di nt h eg u s t a t i o no r g a no fi n s e c t s t i l ln o wi nt h el i t e r a t u r e ，h o w e v e r , b o v i n es e r u ma l b u m i nw a sf o u n dc a l ll e a dt os t r o n g s p i k e s o nt h i ss e n s o r , w h i c ha r ed i f f e r e n tf r o mt h a tc a u s e db ya n yo t h e rs t i m u l a n t st h a t h a db e e nt e s t e d i tm a yb et h er e s p o n s eo f s p e c i a ls e n s ec e l l so nt h em a x i l l a r yp a l pf o r p r o t e i n s a l t h o u g h t h ei n t a c t - r e c e p t o rb a s e db i o s e n s o r so ft h em a x i l l a r yp a l po fc o c k r o a c h p e r i p l a n e t aa m e r i c a n aa r e n o ty e t p r a c t i c a la n a l y t i c a l d e v i c e sa t p r e s e m y e t ， s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v er e s p o n s e st ob i o m o l e c u l e si n v o l v i n ga m i n oa c i d sa n d p r o t e i n ， a sw e l la ss o m es i m p l es u b s t a n c es u c ha ss a l t sa n ds u g a r sh a v e b e e nf i r s t l yo b t a i n e d i ti sa l r e a d ye v i d e n tt h a tr e c e p t o rb a s e db i o s e n s o r sa r ee n o r m o u s l ys u p e r i o rt oi s o l a t e d r e c e p t o rb i o s e n s o r si nt e r m so fr e s p o n s e t i m ea n dr e c o v e r yt i m e s ，t h u s ，t h ei n t a c t r e c e p t o rb i o s e n s o r w o r t ho f f u r t h e ri n v e s t i g a t i o na n d d e v e l o p m e n t 第一章文献综述：生物材料中的膜受体蛋白及其作为分子识别元件 的生物传感器研究和应用情况 1 - 1 引言 传感器是获取和量化各种信息的重要手段，是信息科学的支柱技术之一“1 。 生物传感器是传感器领域的一个重要分支，在涉及生物环境的学科和应用领域如 医药卫生，环境监测，农、林产品保护等方面，起着不可替代的作用。生物传感 器的结构上主要可分为两个部分：一是生物敏感成分，实现分子水平上的识别， 另一是换能器，将识别事件转换成输出信号。 图1 - 1 生物传感器示意图 可测信号 ( 光、声、电、热) 生物敏感成分是生物传感器的灵魂，许多生物材料诸如酶、免疫化合物( 如 抗体) 、分离提纯的受体、微生物细胞群、单细胞、动植物组织切片、以及感觉 器官和神经组织等都可以用作为传感器的生物敏感成分。它们在选择性识别被分 析物的同时排除其他具有类似结构或相关性质的化合物。生物识别成分与被分析 物分子的选择性结合是识别产生的机制。换能器部分通常并不使用生物材料，而 是使用物理或化学变化将上述选择性结合事件转换成可读的输出信号。表1 对上 述生物传感器的两方面作了一个总结。 本章将重点讨论利用各种生物材料中的膜受体蛋白作为生物传感器的分子 识别元件的应用情况。 中国科学技术大学博士论文 第一章文献综述 1 - 2 受体在活体内的作用机制： 表1 所列的生物材料中除酶和抗体外，其分子识别机制都是由于材料中固有 的膜受体蛋白与被测化合物的选择性结合。受体在其天然环境中对细胞间信号的 传递与放大起着举足轻重的作用。 表i - 1 ：生物传感器所用生物材料和换能器方式列表 分子识别成分( 生物材料)换能器方式 酶电化学光学热学 抗体( 抗原)电流法吸收( 可见或紫外)热敏电阻 组织切片电势法光纤技术 器管电量法荧光或发光 单细胞电容法 微生物场效应管 神经受体压电( 频率或相变) 1 - 2 - l 受体的基本概念【2 i 受体是细胞表面或亚细胞组分中的一种天然分子，可以识别并特异地与有生 物活性的化学信号物质( 配体) 结合，从而激活或启动一系列生物化学反应，最 后导致该信号物质特定的生物效应。 根据以上定义，受体有两方面的功能：第一是识别自己特异的信号物质 配体，识别的表现在于两者结合。但是仅仅特异识别还不够，例如突触后膜表面 存在乙酰胆碱脂酶，它也可与底物乙酰胆碱特异结合并使其分解，但并不产生胞 内信号，所以，受体的第二个功能是把识别和接受的信号准确无误地放大并传递 到细胞内部，启动一系列胞内生化反应，最后导致特定的细胞反应。要使胞间( 外) 信号转换为胞内信号，受体的两个功能缺一不可。 1 2 2 细胞受体的作用机制 根据在细胞中的位置，受体可分为细胞膜受体和胞内受体。胞内受体与疏水 性小分子甾类激素和水溶性多肽激素结合，调节许多与发育有关的生理过程，常 常引起长期的生理效应。而细胞膜受体的作用往往是通过胞外配体结合后使“胞 内第二信使”水平增加而引起生理效应，它虽也可调节基因表达产生长期效应， 中国科学技术大学博士论文 第一章文献综述 但常常具有引起短暂而迅速生理反应的特点。下面重点讨论细胞膜受体。 1 2 3 细胞膜受体的种类与结构 基于质膜表面受体信号转换的机理和受体分子的结构特点，可将其分为激动 剂控制的离子通道型受体、g 蛋白偶联型受体和具有酶活性的受体，如图2 所示。 离子通道型受体 此类受体共同特点是由多亚基组成受体离子通道复合体，除本身有信号接 受部位外，又是离子通道，其跨膜信号转导无需中间步骤，反应快，一般只需几 毫秒。它们分为二类，一类是配体( 非电压) 依赖性复合体，另一类为电压依赖 性复合体。前者常见于神经细胞和神经肌肉接头处，属于此类受体典型的有烟 碱型乙酰胆碱受体( n a c h r ) 、y 一氨基丁酸受体( g a b a r ) 、甘氨酸受体等。它 们都是由几个亚基组成的寡聚体蛋白，除含有配体结合部位外，本身就是离子通 道，籍此将信号传人胞内。依赖于神经递质的离子通道型受体属于这类受体，它 位于突触后膜上，接受神经递质刺激后，通道开放，导致离子跨膜流动，引起突 触后膜去极化或磁极化，继而产生生物效应。 电压依赖型受体离子通道复合体的特点为它是单个大分子多肽，二氢吡啶 受体是这类复合体的代表。 g 蛋白偶联型受体 勰垮 图1 - 2 受体结构模式图 a ：离子通道型受体；b ：g 蛋白偶联型受体 中国科学技术大学博士论文 第一章文献综述 g 蛋白偶联型受体，如啦与p 肾上腺素受体、毒覃碱型乙酰胆碱受体 ( m a c h r ) 和视网膜视紫红质( r h ) 受体等都属此类。它们必须与g 蛋白偶联 才能产生胞内信使如环化腺嘌呤核苷酸( c a m p ) 、环化鸟嘌呤核苷酸( c g m p ) 、 d g ( 甘油二脂) 、i p 3 ( 三磷酸肌醇) 等，将信号传到胞内。 具有酶活性的受体 这类受体的特点是：受体本身是一种具有跨膜结构的酶蛋白，其胞外域与配 体结合而被激活，通过胞内侧激酶反应将胞外信号传至胞内。此类受体中最重 要的是动物细胞生长因子，如表皮生长因子( e g f ) 和胰岛素等的受体，它们本 身具有酪氨酸蛋白激酶活性。此外，细胞膜上的鸟菅酸环化酶 ( g u a n y l y l c y c l a s e s ) 也通过类似的方式进行跨膜信号转导。 1 - 3 直接利用膜受体作为生物传感器的分子识别成分： 1 3 1 受体的获得： 由于膜受体的选择性结合特性，有人直接利用分离的膜受体，主要是神经递 质受体作为生物传感器的分子识别成分。一个神经递质分子结合到位于胞外侧的 受体上通过两种确定的途径可导致胞内过程被修饰，( 1 ) 跨膜离子通道开放( 2 ) 位于膜上的酶被激活或抑制，而此酶能促进产生第二信使化合物。第二信使( 物 质) 控制着以后的变化。如胞内钙离予的释放或特定的胞内反应过程所需的关键 磷酸化酶被激活。无论是利用离子通道开启途径还是酶激活途径，对将结合事件 转换成生物传感器的输出信号都是颇具吸引力的方法。但目前只有前者用于生物 传感器。 这方面的工作首先涉及到膜受体的分离与纯化。对于离子通道受体而言，最 容易获得的神经受体是加里佛尼亚电鳐( c a l i f o r n i a e e l ) 电器官中的n 型乙酰胆 碱受体【3 l ，当电鳐供应充足时，每次可分离出1 0 0 5 0 0 m g 受体蛋白。此外除了钠 通道蛋白可能有较集中的天然来源外，还没发现其他类型的受体具有可与n 型 乙酰胆碱受体相匹敌的浓度集中的天然来源。受体蛋白在其他物质中都以很低的 浓度存在。即使受体可被分离出来，随之而来的问题是分离出的受体蛋白不稳定， 中国科学技术大学博士论文 第一章文献综述 况且极少量的受体蛋白用于受体传感器是没有实际应用价值的。 还有人报道4 1 ，用去垢剂从鼠脑及s w i s s3 t 3 细胞中溶解出一种神经肽一蛙 皮素( 促胃泌素释放肽g r p ) 的受体，其结合活性在有甘油存在的缓冲溶液中 可很好地保留下来，并由与各种蛙皮素类似物结合的实验得到进一步证实。 表1 2 ：几种主要类型或亚类型的神经受体 另一种获得受体的方法是利用基因工程和细胞培养结合进行受体蛋白的合 成，到8 0 年代中期，分子克隆技术的研究发展使制备大量重要受体成为可能。 这种技术可以不必预先提纯受体，而是从c d n a 碱基顺序，根据蛋白质一核酸 三联密码获知受体的氨基酸顺序。这种技术的优点还在于可利用d n a 重组使原 来无此受体的细胞合成该受体肽链；然后外源的肽链可以被转移到细胞表面，并 使细胞具有专一地与相应配体结合的能力。表达克隆法( e x p r e s s i n gc l o n i n g ) 就是这类方法中的一种( 如图3 示) 。此法先从细胞中提取出所有的m r n a ( 其 中含有能正常表达所需受体蛋白的m r n a ) ，它们可逆转录c d n a ；然后所有的 c d n a 群体重组入质粒的启动子与终止信号之间，继而让其转染缺乏受体的培养 中国科学技术大学j 尊士论文 第一章文献综述 细胞群体，其中少数转染细胞含有能编码所需受体的c d n a ， 并合成了表面受 体：这些细胞可粘附在结合有该受体之配体( 或抗体) 的培养瓶底面，其它细胞 则被洗去；粘附细胞的质粒可分离纯化出来，并加以克隆，最终编码产生大量所 需受体。 a 表达蝶介 i ：普菩霎：苫慧2 s v 【i 穗巾的订 d n a 量卅启动于 b 转染盈嵌达c l l 嚣毳蒿： 固 挂内囊位蔓一i 。滔蛐”“ l 鼎嗨 c 袭选所嚣受体的细胞桔跗十培养瓶庇 d 从粘附细胞中提纯厦粒d n a ，f 克隆 蓦争 图i - 3 制备所需细胞膜受体的表达克隆法( 仿j d a r n e l l 等) 但到目前为止此法也不十分成功，因为很难获得足够高浓度的特定类型受体 的细胞系。有人试着将哺乳动物受体d n a 在异种细胞系中进行表达，结果成败 参半。据报道，构成n 型乙酰胆碱受体的亚基已有四分之三在酵母菌中得以表 达和合成，但是在酵母中得到的6 亚基的情况尚不清楚。w i n g a r d j r 实验室1 5 , 6 】 曾致力于将g a b a a 型受体亚基在一种昆虫病毒( b a c u l o v i r u s ) 中进行表达。这 种病毒能使目标受体蛋白在所培养的昆虫细胞中生长。利用b a c u l o v i r u s 体系的 好处在于能产生相对高浓度的异源受体蛋白，而且还能进行受体蛋白的后续转化 过程如糖基化。至今为止大多数受体d n a 表达研究的目的是将产生的受体蛋白 用于探索受体的结构和功能。而不是用于生物传感器之类的应用研究。受体d n a 在异源细胞系中表达所得产品虽然与自然生长的“土著”受体蛋白不尽相同，但 可能在生物传感器应用上是颇为有用的蛋白。甚至有可能从多亚基受体组中取用 单个受体亚基用于生物传感器的制作。 r 中国科学技术大学博士论文 第一章文献综述 1 3 2 受体整合入生物传感器 神经受体表现出三个特征结合的特异性；开启离子通道： 酶激活信 号转换。这三种过程都能为受体在生物传感器中的应用提供创新的可能。然而， 目前似乎只有特异性结合一项在实际中得以应用。 至今为止将神经受体作为识别成分用于生物传感器的探索大多是基于分离 的烟碱型乙酰胆碱受体的结合识别作用。g o t o h m 等【7 j 以吸附方式或用戊二醛耦 合方式将受体固定在离子选择性场效应管( i s f e t ) 的删极上，检测它与不含受 体的对照i s f e t 之间的电位差。输出的电位差与乙酰胆碱的浓度相联系。但是 此文没有单独进行特异性结合实验的描述，以表明固定的受体仍能进行选择性结 合。在另一篇文章中，e l d e f r a w i ，m e 等悼】将乙酰胆碱受体吸附在支持物上并记录 在a c h 存在的情况下，离子通道阻遏剂阻断通道的效应引起的电量的改变。不 过，这种电量的改变也可能由其他因素引起，例如溶液组成的不同等。所以其结 果难以定论。在第三篇文章中，t a y l o r , r e 1 9 】没有说明受体的固定方法，所以其 可靠性令人怀疑。而r o g e r s ，k r 【l0 】在固定的a c h 受体生物传感器上，用一些光 学方法得到的结果较可靠地表明受体与分析物的选择性结合是发生了。 利用神经受体作为生物传感器的一部分所要面临的主要问题之一是稳定性。 当受体从脂膜环境移开之时通常它就不再具有功能性。然而，它的某些结合选择 性可能仍然存在。所以，受体固定化可能需要考虑用脂膜，尤其是当需要保留受 体的通道开启或酶激活转换功能时。t a l o r 课题组 i l l 曾报道烟碱型乙酰胆碱受体 在3 7o c 稳定存放了几个月，但他们并未给出受体的固定方法。 w i n g a r d 1 2 i 实验室研究过g a b a a 型受体，它包含两个o 【和两个b 亚基。虽 然单个亚基与配体结合作用的程度不如多亚基体系，但单个亚基仍具有g a b a 结合能力和形成c l 。离子通道的能力。所以，用g a b a a 型受体的单个亚基进 行生物传感器的设计工作也许是可行的。 m i n a m i 等【1 3 】将从兔脑中分离并纯化的谷氨酸受体( g l u r ) 钠离子通道蛋白 嵌入到用折叠法制备的平板双层磷脂膜上，制成了单通道和多通道两种离子通道 型受体生物传感器，得到了依赖谷氨酸浓度变化的综合通道电流。对于多通道传 感器，l 谷氨酸的检测限可达t t m o l l 级。 虽然离体受体分子生物传感器在灵敏度和选择性方面具有优势，但遇到的最 ! 曼型竺垫查查兰竖圭堡塞茎二兰塞坚鳖垄 大困难是分离和纯化的受体很难得到：其次是得到的受体又相当不稳定，往往完 全或部分地丧失其功能性；而且受体传感信号的转换和放大亦是一个难点，因为 受体分子的结合行为不产生可直接检测的信号。在活细胞中，膜上的一些受体是 通过第二信使来转换和放大信号的，离体受体分子敏感膜上一般靠加入合适的信 号转换物质如酶等蛋白质分子以及一些离子等来实现信号的转换。上述这些困难 阻碍了离体受体生物传感器的发展。一种绕开这个难点的替代方法是利用微生物 细胞群、单细胞以及感觉器官和神经组织等作为生物传感器，使受体分子完整地 保留在它的天然环境中。 1 - 4 利用活细胞上的受体制作生物传感器 具有某种特定类型受体的细胞可以认为是某种化合物( 激动剂) 的感受器， 其灵敏度由受体一配体结合稳定常数决定。 前人的工作中有一大类体系是利用基因工程使细菌对某特定物质敏感，然后 用电流法检测，如检测草药1 1 4 】、苯1 1 5 1 、乙醇【1 6 1 、三甲胺1 1 7 1 等。另一种检测细菌 敏感反映的方法是近年来热门的生物发光( b i o l u m i n e s c e n c e ) 法。k i n g i l 8 l 等首先 报道了这种方法。其工作是将细菌生物发光基因( 取自v i b r i o h a r v e y i 的i u x c d a ) 与由萘诱导的表达启动子融合在起，然后将融合物导入到( 含有对萘响应的受 体的) 假单胞菌( p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ) 细胞中。如果将细胞置于有萘存在 的环境，生物发光基因的转录活性便被激活，产生发光效应，光强度与环境中萘 的浓度有关。并在此基础上建立了用固定化细菌测定萘和水杨酸的光纤传感器体 系【1 9 1 。基于相同原理，将一种诱导启动子与无启动子的l u x 基因之间的融合物 作为探针，用来检测环境中的各种有毒金属，如用修饰的e c o l i 细菌测汞 2 0 】，铝 2 1 1 ，砷，铬眵2 1 ，以及其他金属如铜，锌【2 3 】。这种检测法有可能达到很高的灵敏 度，椐报道对汞的灵敏度达0 2p p b 【2 4 j 。 但是，这种利用微生物细胞群的传感器，由于受化学层向生物层扩散的速率、 细胞的新陈代谢速率以及新陈代谢产物随后扩散到检测层的速率等的影响，传感 器的响应速度较慢，而且，生物成分的寿命通常较短，这些问题至今尚未很好解 决。为提高细胞生物传感器的响应速度和灵敏度，人们尝试通过检测单细胞受刺 激后发放的生物电信号的方法来制作生物传感器。 ! 里型堂垫查查兰竖主堡壅 苎二兰奎堕堡鎏 一 z a r c 研究纠2 5 1 首先利用爪蟾卵母细胞和p c - 1 2 鼠细胞与电生理法结合制成 单细胞一生物传感器检测了经微电泳分离的生物大分子。此分析体系能检测混合 物中具有生物活性的配体成分，并表现出很好的灵敏度和选择性，其检测限在 1 1 0 0 t o o l 。 1 5 利用组织切片或神经器官中的受体的生物传感器 r c c h n i t z 在这方面的工作思路比较开阔，他曾用植物组织 2 6 - 3 0 1 如南瓜 ( y e l l o ws q u a s h ) ，香蕉，茄子等的组织与c 0 2 电极、碳糊电极或氧化锡电极结 合制成的电压式或电流式生物传感器测定了l 谷氨酸，儿茶酚，多巴胺等。多 巴胺的检测下限可达1 3 1 0 一m o l l 。 八十年代中期以来，r e c h n i t z 课题组又致力于利用甲壳类动物如蓝蟹( b l u e c r a b ) 和螯虾( c a r f i s h ) 的神经组织制作生物传感器1 3 1 _ 3 9 】。甲壳类动物的触角 和步足上有可感受环境中化学刺激物的感受器一感觉毛，感觉毛内有感觉神经元 伸出的树突，树突膜上分布着化学受体( 为离子通道型受体) 。利用这种组织制 成的生物传感器，其好处一是化学受体完整地保留在组织中，二是神经组织既作 为分子识别元件又作为换能器。由于受体的结合位点具有高度的选择性，从而使 之可以作为选择性的分子识别元件，化学感受神经元则起换能器的作用，将受体 结合位点编码的生物化学信号转换成电脉冲。 该研究组发现螯虾神经元受体传感器对抗结核药物p y r a z i n a m i d e 具有选择性 响应，并用它检测了多种神经毒剂和麻醉剂如3 一乙酰吡啶、普鲁卡因、卢弗卡 因等，还对一些夏威夷植物进行了药物筛选实验。这种传感器可以达到人们所期 望的分析特性，如很快的响应时间( 毫秒级) ，较好的重现性和选择性，相当宽 的测定范围( 约4 6 个数量级) 等。 近些年，r e c h n i t z 研究组在进一步提高神经传感器的选择性、灵敏度和寿命 等方面做了许多工作。他们发现，利用脂质体包裹难溶化合物，既可以扩大传感 器的应用范围又能提高其灵敏度，用感应磁场代替电流和玻璃微电极对神经 进行刺激和检测神经冲动，可避免神经的直接损伤而延长传感器的寿命【4 卜4 4 】等。 r s s k e e n 4 5 , 4 6 等用池塘蜗牛l y m n e as t a g n a l i s 腹神经节作为传感器的识别 元件测定了神经递质五羟色氨( 5 h t ) ，并对这方法的实用性进行了评估，讨 论了提高传感器的选择性、延长使用寿命和克服干扰等的优选方案。 中国科学技术大学博士论文第一章文献综述 德国科学家1 4 7