（分析化学专业论文）基于构象转换和聚合酶反应的核酸适配体传感分析方法及应用研究.pdf

s t u d i e so nn e wm e t h o d sa n d a p p l i c a t i o n so fa p t a m e r i cs e n s i n g a n a l y s i sb a s e do nc o n f o r m a t i o n a ls w i t c ha n dp o l y m e r a s e r e a c t i o n b y h ej i n g l i n m e ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 6 ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f d o c t o ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h eg r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o ry ur u q i n n o v e m b e r ，2 0 1 0 ，t， 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：f 滚琳日期：工、，p 年f 1 月占 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密盯。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：1 壤冰 导师签名：缩h 北劫 日期：2 0 1 0 年11 月8 日 日期：2 0 1 0 年11 月8 日 博士学位论文 摘要 核酸适配体( n u c l e i ca c i da p t a m e r s ) 是通过配体指数级富集系统进化 ( s e l e x ) 技术，筛选到的与生物小分子、蛋白质分子、细胞等高特异性结合的 d n a 或r n a 片段。它们形成的高级结构能够识别与之相对应的靶分子，并形成 高亲和力的靶分子适配体复合物。与蛋白质抗体相比，适配体具有靶分子范围 广、容易人工合成与修饰、高亲和力、分子量较小、稳定性好、变性和复性快速 可逆等很多独特优势。 在分析化学领域，核酸适配体可以代替传统抗体、酶等物质，作为特异的 分子识别元件用于生物传感体系中。适配体工作的基本原理是靶分子的引入能够 使适配体发生构象转化，从而导致一系列光化学、电化学等可检测的信号改变。 基于上述考虑，综合前人的工作，我们开发出基于结构转化的适配体传感体系用 于检测蛋白质或小分子，这些传感体系灵敏、快速、选择性好。然而，单纯利用 适配体结合靶分子前后构象变化引起信号改变的检测方法，在进一步提高灵敏度 方面已经十分有限。为了对低含量的靶分子进行超灵敏检测，必须对检测体系进 行放大信号或者降低背景的处理。我们设计的实验方法是在适配体结合可卡因发 生构象变化后，引发聚合酶反应，将适配体结构进一步改变，从而使得光信号或 电信号的放大，传感体系的灵敏度由此提高。 具体情况如下： 第2 章描述了一种基于适配体靶分子相互作用引起链置换聚合酶反应的新 型荧光方法，它可以用于可卡因的检测。新设计的探针分别为发卡型探针和单链 探针，它们分别含有部分可卡因适配体的识别序列。当可卡因存在时，这两条探 针与靶分子结合形成三元复合物。发卡探针构象的变化导致发卡结构打开与引物 杂交。在聚合酶与d n t p s 的作用下，复制发卡探针的单链部分引发了引物延长 进程。当发卡探针完全变成双链结构，单链探针和可卡因被释放出来与另一个发 卡探针结合，从而开始新一轮的放大循环。在双链嵌入剂s y b rg r e e ni 插入到 新合成的d n a 双螺旋结构后可以观察到荧光信号成倍增强。这种新设计方案检 测可卡因浓度可低至2n m ，整个反应仅使用一支封闭离心管让均相检测十分方 便。与已经报道的可卡因适配体传感体系相比，我们提出的方法经济实用，具有 优良的灵敏度和选择性。 我们利用相似的原理在第3 章设计了利用聚合酶反应构建电化学适配体传感 器，用于可卡因的高灵敏检测。游离在溶液中的发卡探针含有可卡因适配体序列， 固定在电极表面的短链探针可与发卡探针茎干部杂交。可卡因的引入可使发卡探 基于构象转换和聚合酶反应的核酸适配体传感分析方法及应用研究 针打开与固定探针结合。在聚合酶作用下，固定探针作为引物d a t p 、d g t p 、d c t p 以及二茂铁标记的d u t p 依序生长。洗去未反应物质后，电极表面的一条固定探针 上标记着多个二茂铁分子，实现电化学信号放大。 为了提高小分子腺苷传感体系的灵敏度以及进一步降低检测成本，第4 章开发 了一种利用双链嵌入剂s y b rg r e e ni 作为报告基团的非标记适配体荧光传感探 针。将腺苷适配体序列分为两段，分别延长形成两条探针。在自由状态下，两条 探针呈游离状单链形式，双链嵌入剂的荧光很弱。腺苷引入后，由于适配体与腺 苷固有的亲合力作用，两条探针相互结合形成双链结构。随着双链嵌入剂的加入， 可以测到较强的荧光信号。由于传感探针采用了双链嵌入剂作为报告基团，探针 能够以较低的浓度存在于体系中，而腺苷不需要过高浓度就可以引起适配体发生 构象改变，这样的设计提高了传感体系的灵敏度。与使用标记荧光基团的探针相 比，本实验方法价格低廉，具有更佳的实用性。 第5 章提出了i g e 荧光增强均相检测体系。以德克萨斯红标记的d n a ( t d n a ) 作为信号探针，以4 ( 4 二甲基氨基叠氮苯) 苯甲酸( d a b c y l ) 标 记的另一条d n a ( q d n a ) 为淬灭探针，两条探针分别能够在i g e 适配体相邻 部位发生杂交。i g e 不存在时，由于淬灭基团与荧光基团之间发生能量转移而有 效降低荧光背景。i g e 存在时，形成i g e 适配体t d n a 的三元复合物而释放出 q d n a ，其荧光强度明显升高。用这种方法检测i g e 取得的动力学响应浓度范围 为9 2 x 1 0 0 1 到3 7 l o 培m ，检测限为5 7 1 0 。1 1m 。 第6 章中，我们报道了在均相中检测人弹性蛋白酶( h n e ) 的荧光适配体 传感探针。该生物传感探针包含一条短的d n a 抓取序列( s s ) ，它同时与部分 适配体探针序列以及分子信标的环状部分互补。其工作原理是适配体与分子信标 同时竞争结合s s 序列。适配体h n e 识别后降低了适配体结合s s 序列的能力， 而双标记的分子信标更多地与s s 序列结合导致荧光增强。该新型的生物传感探 针可以检测到o 3 4n mh n e ，线性范围在0 3 4n m 6 8n m 之间，其检测下限为 4 7p m 。 第7 章描述了在金电极上生物催化生长高密度金团用作固定适配体探针载体 的方法。这种方法提供了在表面活性剂和还原辅酶存在的情况下，以连接在电极 表面的1 2n m 纳米金为金种从a u c l 4 - 生物催化还原a u 原子的简便策略。生长过程由 电化学阻抗( e i s ) 和扫描电子显微镜( s e m ) 监测。这种纳米结构界面非常有效 地用于适配体探针固定。由于该增强基底良好的性能，适配体传感界面在交流伏 安( a c v ) 和表面增强共振拉曼光谱( s e r r s ) 检测中表现出良好的应用性能。 关键词：核酸适配体；链置换放大检测；聚合酶延长；双链嵌入剂；分子信标； 荧光光谱分析；金纳米粒子；电化学传感器；生物催化沉积 m 博士学位论文 a bs t r a c t w i t hac o m b i n a t o r i a lm e t h o dc a l l e di nv i t r o o fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ( s e l e x ) ， s e l e c t i o no rs y s t e m a t i ce v o l u t i o n s h o r ts y n t h e t i cd n aa n dr n a s e q u e n c e sk n o w n a sa p t a m e r sh a v eb e e ns e l e c t e da sl i g a n d st ob i n da n a l y t e s ，r a n g i n g f r o ms m a l lm o l e c u l e st ol a r g ep r o t e i n sa n de v e nc e l l s t h ea b i l i t yo fa p t a m e r st of o l d i n t on u m e r o u st e r t i a r yc o n f o r m a t i o n st oi n t e r a c tw i t ht h e i rt a r g e ti sr e l a t e dt ot h e i r d i v e r s i t yi ns e q u e n c e sm a k i n ga p t a m e r si d e a le l e m e n t st og e n e r a t ec a p t u r em o l e c u l e s o fh i g ha f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t y a p t a m e r sp o s s e s su n p r e c e d e n t e da d v a n t a g e s a s r e c o g n i t i o n e l e m e n t si nb i o s e n s i n gw h e nc o m p a r e dt o t r a d i t i o n a la n t i b o d i e s a p t a m e r sw i t hh i g hs p e c i f i c i t ya n da f f i n i t yc a ni np r i n c i p l eb es e l e c t e di nv i t r of o r a n yg i v e nt a r g e t t h e yc a nb es y n t h e s i z e da n dm o d i f i e dw i t hh i g hr e p r o d u c i b i l i t ya n d p u r i t yf r o mc o m m e r c i a ls o u r c e s t h e ya r es m a l li ns i z e ，c h e m i c a l l ys t a b l e a n dc o s t e f f e c t i v e t h e yh a v ef a s tr e s p o n s et i m e ，l o n gs h e l fl i f e ，a n dg o o dg e n e r a l i t yf o r d e t e c t i n gab r o a dr a n g eo fa n a l y t e sw i t ht h es a m ec l a s so fr e c o g n i t i o ne l e m e n t m o r e i m p o r t a n t l y ，a p t a r n e r so f f e rr e m a r k a b l ef l e x i b i l i t ya n dc o n v e n i e n c e i nt h ed e s i g no f t h e i rs t r u c t u r e s i nt h ef i e l do fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，a p t a m e rc a nb e u s e da sm o l e c u l a r r e c o g n i t i o ne l e m e n ti nb i o s e n s o rd e s i g ni n s t e a d o fa n t i b o d i e sa n de n z y m e s t h e p r i n c i p l eo fa p t a m e r i cs e n s o r si st h a tt h ec o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o no ft h ea p t a m e r u p o nb i n d i n gt oi t st a r g e tl e a d st ot h ec h a n g eo fo p t i c a lo re l e c t r o c h e m i c a ls i g n a l i n g p r o p e r t i e s s u m m i n gu pt h ep r e v i o u sw o r k ，w ed e v e l o p e d s o m ec o n f o r m a t i o n a l s w i t c hb a s e da p t a m e r i cs e n s o r sw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rp r o t e i no r s m a l lm o l e c u l ed e t e c t i o n h o w e v e r ，t h eu s eo fc o n f c l r m a t i o n a l s w i t c hb a s e d a p t a m e r i cs e n s i n gm e t h o d sh a sb e e n1 i m i t e d i nf u r t h e rs e n s i t i v i t yi m p r o v e m e n t n e v e r t h e l e s s ，s o m es u c c e s sh a sb e e no b t a i n e db ys i g n a la m p l i f i c a t i o no rb a c k g r o u n d r e d u c t i o nf o ru l t r a s e n s i t i v et a r g e td e t e c t i o n s t r a n dd i s p l a c e m e n ta m p l i f i c a t i o nb a s e d a p t a m e rs e n s o ri sa nu l t r a s e n s i t i v es e n s i n ga p p r o a c hb a s e do np o l y m e r a s er e a c t i o n a f t e rt h ea p t a m e r t a r g e tb i n d i n g ，t h ea p t a m e rc o n f o r m a t i o n a lc h a n g ei n i t i a t e s p o l y m e r a s er e a c t i o n t h ef u r t h e rc h a n g eo fa p t a m e rc o n f o r m a t i o nr e s u l t e d f r o m p o l y m e r i z a t i o nl e a d s t oo p t i c a lo re l e c t r o c h e m i c a ls i g n a la m p l i f i c a t i o n t h u st h e s e n s i t i v i t yh a sb e e ni m p r o v e db yo u rd e s i g n t h ed e t a i l sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) i nc h a p t e r2 ，an e wf l u o r e s c e n c e m e t h o db a s e do n a p t a m e r t a r g e t i v i n t e r a c t i o n sh a sb e e nd e v e l o p e df o rc o c a i n ed e t e c t i o nw i t ht a r g e t i n d u c e ds t r a n d d i s p l a c e m e n t h e r ew ed e s c r i b e n e wp r o b e s ，t h e h a i r p i n p r o b ea n d t h es i n g l e s t r a n d p r o b e ，p o s s e s st w or e c o g n i t i o ns e q u e n c e so f c o c a i n ea p t a m e r i nt h ep r e s e n c e o fc o c a i n e ，b o t hp r o b e sw o u l da s s o c i a t ew i t ht h et a r g e tt of o r mat r i p a r t i t ec o m p l e x t h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g ei nt h eh a i r p i n - p r o b ec a u s e st h eo p e n i n go fah a i r p i n s t r u c t u r ea n dt h eh y b r i d i z a t i o nt op r i m e r w i t hp o l y m e r a s ea n dt h ed n t p s ，t h e r e p l i c a t i o no ft h es i n g l e s t r a n d e dd o m a i no fh a i r p i n - p r o b et r i g g e r st h ep r o c e s so f p r i m e re x t e n s i o n w h e nt h eh a i r p i n p r o b ei sc o n v e r t e di n t oaf u l l yd o u b l e - s t r a n d e d f o r m ，t h es i n g l es t r a n d p r o b ea n dc o c a i n ea r ed i s p l a c e dt ob i n da n o t h e rh a i r p i n p r o b e a n di n i t i a t en e wa m p l i f i c a t i o nc y c l e s f l u o r e s c e n c es i g n a lg e n e r a t i o nw o u l db e o b s e r v e du p o ns y b rg r e e nii n t e r c a l a t i n gi n t ot h en e wd n ad o u b l eh e l i x t h en e w p r o t o c o ld e s i g np e r m i t sd e t e c t i o no f 嬲l o wa s 2n mc o c a i n ei nac l o s e d t u b e ， o f f e r i n gac o n v e n i e n ta p p r o a c hf o rh o m o g e n e o u sa s s a y c o m p a r e dw i t hp r e v i o u s l y r e p o r t e dc o c a i n ea p t a m e r i cs e n s o r s ，o u rn e wm e t h o di sh i g h l ys e n s i t i v e ，s e l e c t i v ea n d e c o n o m i c a l ( 2 ) i nc h a p t e r3 ，a ne l e c t r o c h e m i c a la p t a m e r i e s e n s o rb a s e do np o l y m e r a s e e x t e n s i o nr e a c t i o nw a sp r o d u c e df o rs e n s i t i v ec o c a i n ed e t e c t i o n a nu n m o d i f i e d h a i r p i ns t r a n di ns o l u t i o nc o n t a i n st h ec o c a i n ea p t a m e rs e q u e n c e ，w h i l eat h i o l - s h o r t s t r a n di m m o b i l i z e do nt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c ec o n t a i n st h es e q u e n c ec o m p l e m e n t a r y t os t e mp a r to ft h eh a i r p i ns t r a n d w h e nc o c a i n ei si n d u c e d ，t h et e r n a r yc o m p l e xi s f o r m e da n dt h eh a i r p i ns t r a n di so p e n e d t h eh y b r i d i z a t i o no fh a i r p i ns t r a n da n dt h e s h o r ts t r a n di n i t i a t e s p o l y m e r a s e e x t e n s i o nw i t hd a t p ，d g t p ，d c t pa n d f e r r o c e n e d u t p e l e c t r o c h e m i c a ls i g n a la m p l i f i c a t i o nc o u l db eo b s e r v e dd u et ot h e e x t e n d e dt h i 0 1 s t r a n dl a b e l e dw i t hs e v e r a lf e r r o c e n em o l e c u l e s ( 3 ) i nc h a p t e r4 ，w ed e v e l o p e dal a b e lf r e ea p t a m e rf l u o r e s c e n c ep r o b eu s i n g i n t e r c a l a t i n gd y e ( s y b rg r e e ni ) t oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo fa d e n o s i n es e n s i n ga n d r e d u c et h ec o s to fe x p e r i m e n t s t h eb i n d i n gs i t eo fa d e n o s i n ea p t a m e rh a sb e e ns p l i t i n t ot w oh a l fs i t e s i nt h ea b s e n c eo ft h ea d e n o s i n e ，l i t t l eh y b r i d i z a t i o no c c u rb e t w e e n t h et w od n ap r o b e s ，e a c hc o n t a i n i n gh a l fo ft h ed n as e q u e n c ec o r r e s p o n d i n gt oa b i n d i n gs i t e i nt h ep r e s e n c eo ft h ea d e n o s i n e ，i t sh i g ha f f i n i t yf o ra p t a m e ro ft h e a d e n o s i n eb i n d i n gs i t ed r i v e st of o r mad o u b l es t r a n ds t r u c t u r et h a tp r e f e r a b l yb i n d st o s y b rg r e e ni a sar e s u l t ，t h ef l u o r e s c e n c eo fam i x t u r eo ft w od n ap r o b e sa n d s y b rg r e e nii n c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo fa d e n o s i n e i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e p r e s e n t e da p t a m e rs e n s i n gm e t h o dw a sh i g h l ys e n s i t i v ea n ds p e c i f i cw i t had e t e c t i o n r a n g eo f3o r d e r so fm a g n i t u d e v 博士学位论文 ( 4 ) i nc h a p t e r5 ，w ed e m o n s t r a t eaf l u o r e s c e n c ei m m u n o g l o b u l i ne ( i g e ) a s s a y p r o b eb a s e do nd n aa p t a m e r at e x a sr e dl a b e l e ds h o r td n as t r a n d ( t d n a ) c o m p l e m e n t a r yw i t hp a r to ft h ei g ea p t a m e rs e q u e n c ew a su s e dt op r o d u c et h e f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ta f f e c t e du p o nt h eb i n d i n go fi g et ot h ea p t a m e r a n o t h e r s h o r td n as t r a n dl a b e l e dw i t hd a b c y lq u e n c h e r ( q - d n a ) c o m p l e m e n t a r yw i t hp a r to f a p t a m e rs e q u e n c en e a r b yt h et - d n al o c a t i o nw a su s e dt ol o w e rt h eb a c k g r o u n d f l u o r e s c e n c e t h ei g ec a nb ed e t e c t e di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m9 2 x10 川t o 3 7 1 0 。8t 0 0 1 l 。1w i t had e t e c t i o nl i m i to f 5 7 1 0 1 1t 0 0 1 l 1 ( 5 ) i nc h a p t e r6 ，w er e p o r taf l u o r e s c e n c ea p t a m e rp r o b ef o rd e t e c t i n gh u m a n n e u t r o p h i le l a s t a s e ( i - i n e ) i nh o m o g e n e o u ss o l u t i o n t h eb i o s e n s o rc o n t a i n sas h o r t d n as c r a m b l e ds e q u e n c es t r a n dc o m p l e m e n t a r yt op a r to ft h ea p t a m e rs e q u e n c eo rt h e l o o po fm o l e c u l a rb e a c o n t h ea p t a m e r h n er e c o g c f i t i o ne v e n ti n v o l v e sc o m p e t i t i o n b e t w e e nt h em o l e c u l a rb e a c o na n dl o o s eh n e a p t a m e rf o rt h eb i n d i n gt h es h o r td n a s t r a n d t h en e wb i o s e n s i n gm e t h o dc a nd e t e c ta sl i t t l ea so 3 4n mo fh n e ，a n dt h e r e s p o n s ei s l i n e a ri nt h et e s t e dc o n c e n t r a t i o nr a n g eo f0 3 4n m 一6 8n mw i t ht h e d e t e c t i o nl i m i to f4 7p m ( 6 ) i nc h a p t e r7 ，w ed e s c r i b et h eb i o c a t a l y t i cg r o w t ho fh i g h - d e n s i t yg o l d a g g l o m e r a t e s o n g o l de l e c t r o d e s u r f a c et of o r mac a r r i e rf o r a p t a m e r p r o b e i m m o b i l i z a t i o n t h ep r e s e n ta p p r o a c hp r o v i d e sas i m p l es t r a t e g yt op r o m o t et h e s e e d m e d i a t e dd e p o s i t i o no fa uf r o ma u c l 4 一o n t os u r f a c e - a t t a c h e d12n md i a m e t e ra u n a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) i nt h ep r e s e n c eo fr e d u c t i v ec o e n z y m ea n ds u r f a c t a n t t h e g r o w t hp r o c e s sw a ss t u d i e db ye l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p ya n ds c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y t h i sn a n o s t r u c t u r e dp l a t f o r mi se f f e c t i v ea n dp r o s p e c t i v et o w a r d t h ea p t a m e rp r o b ei m m o b i l i z a t i o n f o rt h en i c ep e r f o r m a n c eo fe n h a n c e ds u b s t r a t e ，t h e a p t a m e rs e n s i n gi n t e r f a c es h o w e de x c e l l e n ta p p l i c a b i l i t yu n d e rt h ei n v e s t i g a t i o n ss u c h a sa l t e r n a t i n gc u r r e n tv o l t a m m e t r ya n ds u r f a c e - e n h a n c e dr e s o n a n c er a m a ns c a t t e r i n g s p e c t r a k e yw o r d s ：a p t a m e r ；s t r a n dd i s p l a c e m e n ta m p l i f i c a t i o na s s a y ；p o l y m e r a s ee x t e n s i o n ； i n t e r c a l a t i n gd y e ；m o l e c u l a rb e a c o n ；f l u o r e s c e n c es p e c t r aa n a l y s i s ；g o l d n a n o p a r t i c l e s ；e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r ；b i o c a t a l y t i cd e p o s i t i o n v i 摹于构象转换和聚合酶反应的核酸适配体传感分析方法及应用研究 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 第l 章绪论1 1 1 核酸适配体及指数级富集系统进化技术概述1 1 1 1s e l e x 技术的基本原理与技术流程1 1 1 2 核酸适配体的空间结构及其与靶分子的结合方式一2 1 1 3 核酸适配体用于构建生物传感体系的优点3 1 2 核酸适配体在生物分析方面的应用4 1 2 1 荧光适配体传感探针4 1 2 2 比色适配体传感探针。一9 1 2 3 表面增强拉曼散射适配体传感器1 0 1 2 4 电化学适配体传感器1 1 1 2 5 压电适配体传感器1