（分析化学专业论文）基于功能磁性材料的蛋白质组学分离鉴定新方法研究.pdf

复旦大学博士学位论文 摘要 本论文针对目前蛋白质组学研究中面临的分离富集及鉴定方面的热点难点问 题，将功能磁性材料与蛋白质分析结合起来，开展了一系列研究工作，发展了相 关的新技术新方法并进行了实际的应用研究，取得了一些创新性研究结果。主要 研究内容和取得的主要研究成果摘要如下： 第一章概述了蛋白质组学目前分离鉴定研究的主要技术手段及分离富集新 技术研究的发展趋势：概述了磁性聚合物微球的特点及其应用；就功能材料应用 于分离富集低丰度蛋白和翻译后修饰蛋白质的研究进展进行了综述；提出了本论 文选题的目的和意义。 第二章针对低丰度蛋白及肽段的分离鉴定，采用水热法制备了具有超顺磁性 的四氧化三铁磁性微球；采用溶胶凝胶法在其表面包覆二氧化硅层，合成制备 了具有核壳结构的f e 3 0 4 s i 0 2 磁性硅球；并在其表面进行硅烷化修饰。利用振 动样品磁场计、傅立叶变换红外光谱仪、透射及扫描电子显微镜、热失重分析仪 等对我们制备的c 8 键合相疏水性硅球磁性材料c 8 f - f e 3 0 4 s i 0 2 进行了表征。 该材料的硅层表面与报道过的同类材料的聚合物表面相比，具有更好的生物相容 性。将其应用于富集低丰度肽段，富集倍数达到1 0 0 倍以上；即使对高浓度的盐 溶液中的肽段仍能实现有效富集。进一步用于血清中游离低丰度肽段的分离富 集。实验结果表明，其对于血清中游离肽段的富集效果达到并超过了已经报道的 同类材料的效果。 第三章针对翻译后修饰蛋白质组中的磷酸化蛋白及肽段的分离富集问题，采 用固定金属亲和色谱( i m a c ) 原理，在f e s 0 4 s i 0 2 磁性硅球表面键合上螯合 金属离子的官能团，将f e ( i i d n 定在磁球表面。采用傅立叶变换红外光谱仪等对 其进行了表征与确认。 以1 3 - c a s e i n 标准蛋白为测试对象，实验证明该材料对于磷酸化肽段具有很好 的选择性富集效果，信躁比可提高l o 倍以上。实验得到了该材料选择性富集磷 酸化肽段的最佳条件并考察了该材料对于混合蛋白酶解肽段体系中磷酸化肽段 的选择性富集性能，富集到的磷酸化肽可洗脱分析也可无需洗脱直接进行质谱分 析，显示了该方法的灵活性。在此基础上，进一步用于人血清中游离的磷酸化肽 段的富集，并采用质谱进行了磷酸化肽段结构以及磷酸化位点的鉴定，获得了一 批磷酸化肽段数据。以鼠肝蛋白提取物为研究对象，将提取蛋白酶解得到的鼠肝 肽段混合物，分别采取两条技术路线进行分离鉴定：( a ) 将肽段混合物中所有的磷 酸化肽段富集到材料上，将其洗脱，进行n a n o l c l t qm s m s 分析，鉴定了6 6 条磷酸化肽段。( ”将肽段混合物进行色谱分离，按时间收集2 9 个馏分，降低 复旦大学博士学位论文 了富集体系的复杂性后再用材料富集各个馏分中的磷酸化肽，对每个馏分中富集 到的磷酸化肽段采用m a l d it o fm s 进行磷酸化肽段及其位点的鉴定，显示了 该材料对磷酸化肽段具有较好的选择性和适用性。 论文还发展了更为简便的方法，合成了氨基四氧化三铁磁性纳米材料，在其 表面键合上螯合金属离子的官能团，将f e ( n i ) 、a l ( i i i ) 、g a ( i i i ) ，i n o i i ) 、z r ( i v ) 、 c e ( i 田等离子固定到磁球表面。通过傅立叶变换红外光谱仪、能量弥散x 射线分 析仪等对其进行表征。考察了表面固定f e c i i i ) 、a 1 ( i i i ) 、g a ( i i i ) 、i n ( i i i ) 、z r 0 v ) 、 c e ( i i i ) 等离子的氨基四氧化三铁磁性纳米材料对于磷酸化肽段的选择性富集能 力，结果表明，所有材料对于磷酸化肽段都有较好的分离富集选择性，其中 f e ( i i i ) 、a l ( i i i ) 、g a ( t i d 和z r ( i v ) 较i n ( i i i ) 、c e c i i i ) 的选择性更加突出。 第四章研究探索了二氧化钛的包覆新方法，采用磁球外部包覆碳层为模板包 覆二氧化钛、随后灼烧去除碳层的方法，制备了结构紧密的具有核壳结构的 f e 3 0 4 t i 0 2 超顺磁性微球。该新材料具有与i m a c 材料完全不同的富集机理， 且具有更高的化学惰性和稳定性。采用振动样品磁场计、傅立叶变换红外光谱仪、 透射及扫描电子显微镜等对产物进行了表征与确认。该合成新方法为在磁球表面 包覆其他金属氧化物提供了很好的借鉴作用。实验进而优化了该材料富集磷酸化 肽段的实验条件，包括富集体系、富集时间、样品洗脱时间等，验证了该材料对 于复杂体系中磷酸化肽段有很好的选择性富集性能。并将其应用于人血清磷酸化 肽富集和鼠肝蛋白中磷酸化肽鉴定，获得了7 9 条磷酸化肽段的数据。 第五章针对翻译后修饰蛋白中糖基化蛋白及肽段的分离富集问题，论文研究 制备了表面键合硼酸基团c o n a 凝集素的氨基磁性纳米粒子新材料，采用傅立叶 变换红外光谱仪进行表征；对该材料应用于糖基化蛋白的选择性富集进行了初步 实验探索，实现了对糖蛋白的选择性富集，获得了有价值的研究结果。论文还研 究了糖蛋白的酶解方法，优化了酶解的条件，采用色谱分离的方法获得了目标糖 肽段。 总之，本论文围绕蛋白质组学研究的新技术新方法，发展了多种功能化磁性 材料并建立了多种有效的分离富集方法，为解决蛋白质组学分析中的低丰度蛋白 质、翻译后修饰的磷酸化和糖基化蛋白的分离富集及鉴定问题提供了新颖有效的 研究手段和方法。 关键词：磷酸化肽富集，糖蛋白富集，低丰度蛋白质富集，功能磁性材料，色谱 分析，生物质谱鉴定。 2 复旦大学博士学位论文 a b s t r a c t b a s e do nt h ep r o t e o m er e s e a r c hb a c k g r o u n da n dt h ed e v e l o p m e n tt r e n do f p o l y m e rm a g n e t i cm i e r o s p h e r e s ，t h er e s e a r c hi n t e r e s to ft h i s w o r kf o c u s e do n p r e p a r i n gs e v e r a lk i n d so fn o v e lf u n e t i o n a l i z e dm a g n e t i cp o l y m e rm i e r o s p h e r e sa n d d e v e l o p i n gas e r i e so ft e c h n i q u e sa n dm e t h o d st or e s o l v ec u r r e n tp r o b l e m si nt h e s e p a r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o no fl o w - a b u n d a n c ea n dp o s t - t r a n s l a t i o n a lp r o t e i n s t h i s d i s s e r t a t i o ni sd i v i d e di n t of i v ep a r t s i nc h a p t e r1 ，a d v a n c e si nc u r r e n tp r o t e i ns e p a r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e s ， a p p l i c a t i o n s o ff u n c t i o n a l i z e dm a g n e t i cp o l y m e rm i e r o s p h e r e s t e c h n i q u e sa n d a p p l i c a t i o no ff u n c t i o n a lm a t e r i a l si np r o t e o m er e s e a r c hw e r es u m m a r i z e di nd e t a i l s t h ei n t e n t i o na n dm e a n i n go f t h i sd i s s e r t a t i o nw e l ee x p l a i n e d i nc h a p t e r2 ，m a g n e t i t ep a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e dv i as o l v o t h e r m a lr e a c t i o n ；a n d t h e nm a g n e t i t em i c r o s p h e r e sw e r ec o a t e dw i t hs i l i c at h r o u g h s o l g e lm e t h d ； s u b s e q u e n tm o d i f i e dw i t hc h l o r o ( d i m e t h y l ) o c t y l s i l a n e ；t h u san o v e lc 8 - f u n c t i o n a l i z e d m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e w a sp r e p a r e d w i t ht h ec h a r a c t e r i z a t i o no f v i b r a t i n g - s a m p l em a g n e t o m e t e r , f t - i r , t e m ，s e ma n dt h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s , t h er e s u l t i n gc 8f u n c t i o n a l i z e dm a g n e t i cs i l i c am i e r o s p h e r e se x h i b i t e dw e l l - d e f i n e d m a g n e t i t e - c o r e s i l i c a - s h e l l s t r u c t u r ea n dp o s s e s sh i g hc o n t e n to fm a g n e t i t e ，w h i c h e n d o wt h e mw i t hh i g hd i s p e r s i b l i t ya n de x c e l l e n tm a g n e t i cr e s p o n s i b i l i t y a sar e s u l t o ft h e i re x c e l l e n tm a g n e t i cp r o p e r t y , t h es y n t h e s i z e dc 8 - f i m c t i o n a l i z e dm a g n e t i c s i l i c am i c r o s p h c r e sw e r es u c c e s s f u l l ya p p l i e df o rc o n v e n i e n t , f a s ta n de f f i c i e n t e n r i c h m e n to fl o w - a b u n d a n c ep e p t i d e sf r o mt r y p t i cp r o t e i nd i g e s ta n dh u m a ns e r u n l v i aad i r e c tm a l d i t o fm a 船s p e c t r o m e t r ya n a l y s i s t h es i g n a li n t e n s i t yc o u l db e i m p r o v e db ya tl e a s tt w oo r d e r so f m a g n i t u d e e v e ni nh i 曲s a l tc o n c e n t r a t i o ns o l u t i o n , t h ep e p t i d e sc o u l da l s ob ei s o l a t e de f f e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sw e r ea l m o s tt h e s a m ew i t ht h er e s u l t sg a i n e du s i n gt h ec 8 一f u n c t i o n a l i z e dm a g n e t i cs i l i c af r o mb r o k e r c o m p a n yi nt h er e f e r e n c e t h ef a c i l es y n t h e s i sa n dt h ec o n v e n i e n ta n de f f i c i e n t e n r i c h m e n tp r o c e s so ft h en o v e lc 8 f u n c t i o n a l i z em i e r o s p h e r e sm a k ei tp r o m i s i n g c a n d i d a t ef o ri s o l a t i o no f p e p t i d e se v e ni nc o m p l e xb i o l o g i c a ls a m p l e s c h a p t e r3p r e s e n t s af a c i l ew a yt om o d i f yt h es u r f a c eo fm a g n e t i cs i l i c a m i c r o s p h e r e sa n dt h e ni m m o b i l i z ef e 3 + i o n so nt h e f ts u r f a c eb a s e do nt h ep r i n c i p l eo f i m a c ，t h u sf e 3 + - 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m a g n e t i t en a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e db ys o l v o t h e r m a lr e a c t i o na n dw f f l e f l l r t h e rc o n v e r t e di n t oc a r b o x y - m a g n e t i t en a n o p a r t i c l e st h r o u g ht w o - s t e pa m i d a t i o n r 嘲- c d o nt h e n , f e ( i i i ) 、a i ( i i d 、g a o i i ) 、i n ( i i i ) 、z r ( r v o 、c e ( i i i ) i o n sw e r ci m m o b i l i z e d 0 nt h e 汕- f a c eo ft h en a n o p a r t i c l e sv i ac h e l a t i o nr e s p e c t i v e l yw h i c hw e r ec o n f i r m e d b yc h a r a c t e r i z a t i o nw i t hf t - i p t e m s e ma n de d x aa n a l y s i s a l lo ft h es i x m a t e r i a l ss h o w e dg o o ds e l e c t i v i t i e st op h o s p h o p e p t i d e s ，e s p e c i a l l yf e ( i i d 、a l ( i i i ) 、 g a ( i i i ) a n dz r ( r v i nc h a p t e r4 ，w ep r e s e n ta l li n n o v a t i v ea p p r o a c hf o rt h es y n t h e s i so ft i 0 2 c o a t e d m a g n e t i t em i c r o s p h e r e s ( f e 3 0 4 t i 0 2m i c r o s p h e r e s ) w i t hw e l l - d e f i n e dc o r e - s h e l l s t r u c t u r e ，w h i c hw e r ec o n f i r m e db yc h a r a c t e r i z a t i o nw i t hf t - i kt e m ，s e ma n d e d x aa n a l y s i s t h i sm a t e r i a le n r i c h e dp h o s p h o p e p t i d e sb yt h ea f f i n i t yb e t w e e nt i 0 2 a n dp h o s p h o p e p t i d e sa n d w a sm o r es t a b l et h a nt h ei m a cm a t e r i a l s b yu s i n gt h e 4 复旦大学博士学位论文 f e 3 0 4 t i 0 2m i c r o s p h e r e s w i t ht h ea s s i s t a n c eo fa p p l i e d m a g n e t i cf i e l d ，w e d e m o n s t r a t et h eh i g he f f i c i e n c yo ft h es m a r ta p p l i c a t i o no ft h e s em i c r o s p h e r e sa s s p e c i f i cc a p t u r eo f p h o s p h o p e p t i d e sf o rm a l d i t o fm sa n a l y s i s t h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sf o rt h ee n r i c h e m e n to fp h o s p h o p e p t i d e sw e r eo p t i m i z e d i nm o r ec o m p l e x s a m p l e ，p h o s p h o p e p t i d e sc o u l da l s ob es e l e c t i v e l ye n r i c h e de f f e c t i v e l y t h ep r o c e s so f e n r i c h m e n ti sv e r yf a c i l e ，e f f i c i e n ta n d h i g h l ys e l e c t i v e t h ep e p t i d e sa d s o r b e do nt h e f e 3 0 4 t i 0 2c o r c - s h e l lm i c r o s p h e r e sc a nb ed i r e c t l ya n a l y z e db ym a l d i t o f m s a n a l y s i sw i t h o u te l u t i o nf r o mt h ef e 3 0 4 t i 0 2c o r e s h e l lm i c r o s p h e r e s t h e f e 3 0 4 t i 0 2 c o r e s h e l l m i c r o s p h e r e s w e r e a p p l i e d t o c a p t u r e t h e p h o s p h o p e p t i d e si nn o r m a lh u m a ns e r u m t w op h o s p h o p e p t i d e sw e r ee n r i c h e da n d t h e i rc o m p o s i t i o na n d p h o s p h o t y l a t e ds i t ew e r ed e t e r m i n e db ym a l d i t o fm s m s i tw a sa l s oa p p l i e dt oi s o l a t et h ep h o s p h o p e p t i e d si nt r y p s i nd i g e s to fr a tl i v e rp r o t e i n l y s a t ea n dt h e nt h ee l u t e ds a m p l ew a sa n a l y z eb yn a n o l c - l t qm s m sa n d7 9 p h o s p h o p e p t i d e sw e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e d t h e s er e s u l t sa r ee x p e c t e dt oo p e nu pa n e wp o s s i b i l i t yf o r t h ee n r i c h m e n to fp h o s p h o p e p t i d e s m o r e o v e r , t h ev e r s a t i l e ， l o w - c o s ta n dr e p r o d u c i b l es y n t h e s i sm e t h o dc o u l de x t e n dt oo t h e rc o r e - s h e l l s t r u e m r e dm i c r o s p h e r e so f m e t a lo x i d e s i nc h a p t e r5 ，t h eb o r o n i ca c i do rc o nam o d i f i e dm a g n e t i cn a n o p a r t i l e sw e r e s y n t h e s i z ea n da p p l i e dt os e l e c t i v e l ye n r i c hg l y c o p r o t e i nf r o mp r o t e i nm i x t u r e t h e e x p e r i n m tr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eb o r o u l ca c i dm o d i f i e dm a g n e t i cn a n o p a r t i l e s e f f e c t i v e l yc a p t u r e d t h e g l y c o p r o t e i n i na d d i t i o n , t h ed i g e s tc o n d i t i o n s o f o y c o p r o t e mw e r em o d i f i e da n dg l y c o p e p t i d e sw e r es e p a r a t e df r o mt h ed i g e s tm i x t u r e b yr p l ca n dt h e nc o n f i r m e db ym a l d i - t o f - m s i ns u m m a r y , t h em a i nc o n t r i b u t e so ft h i sd i s s e r t a t i o ni st od e v e l o ps e v e r a l f u n c t i o n a l m a g n e t i cm a t e r i a l sa n df o u n ds e v e r a ln e ws e p a r a t i o n m e t h o d sf o r l o w - a b u n d a n c ea n dp o s t - t r a n s l a t i o n a lp r o t e i n s w ea i ma te x p l o r i n ga n df i n d i n go u t n e w t e c h n i q u e si nt h es e p a r t i o na n dc o n c e n t r a t i o no f p r o t e o m er e s e a r c hf i e l d s ，s ot h a t m o r eb r e a k t h r o u g h sc a nb eo b t a i n e di nt h ep r o t e o m er e s e a r c hs t u d y k e yw o r d s ：e n r i c h m e n to fp h o s p h o p e p t i d e ；e n r i c h m e n to fg l y c o p r o t e i n ；e n r i c h m e n t o fl o w - a b u n d a n c ep r o t e i n ；l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s ；f u n c t i o n a lm a g n e t i c m a t e r i a l ；m a l d i t o fm s 5 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名： 论文使用授权声明 日期：复坚! ：! 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 日期：皇翌e 垒! 复旦大学博士学位论文 第一章绪论 随着基因测序的基本完成，人类基因组计划已经进人到后基因组时代。在此 期间，蛋白质组学的研究受到了广泛的关注【1 2 】。通常情况下，尽管同一种细胞 含有相同的基因序列，但是每个个体包含的蛋白质的种类和数量并不相同。即使 对于同一个细胞，它的组成蛋白质在不同时期也是变化的【3 】。蛋白质本身的存 在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题， 仍依赖于对蛋白质的研究来解决。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认 识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此，在2 0 世纪9 0 年代中期，国际上产生了一门新兴学科一蛋白质组学( p r o t e o m i e s ) ，它以细胞内 全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，从更为深入的一个层次上去认识生 命活动的规律【4 5 】。自1 9 9 5 年蛋白质组概念的提出到现在，虽然只有短短的十几 年时间，蛋白质组学研究却已经得到了突飞猛进的发展。在目前功能基因尚不很 清楚的情况下，发现功能蛋白有重要的意义。蛋白组学作为后基因组学中的重要 组成部份的地位正在得到加强，蛋白质组学正在成为本世纪科学研究的前沿。 1 1 蛋白质组分离富集新技术研究发展趋势 蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用 高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种 观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。 但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是 一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白 质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类 为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。 与之相应产生了蛋白质组学研究的两大方面。一方面是对一个基因、一个组织、 细胞或生物体所表达的全部蛋白质进行分离、识别、定量、定位，翻译后修饰的 鉴定，从而构建蛋白质的表达谱，称为表达蛋白质组学( e x p r e s s i o n p r o t e o m i c s ) 研 究。例如对己建立基因组数据库和基因表达谱的生物体或特定组织细胞的蛋白 质组表达谱的研究，可以发现蛋白质水平上基因表达的群集调控规律及转录、翻 译差异调控的规律。另一方面以特定细胞和生物体系为对象，研究蛋白质之间的 相互作用，确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用，研究蛋白质结构和功能 间的相互关系以及在不同生理、病理条件下蛋白质表达的差异，称为功能蛋白组 学( f u n c t i o n a lp r o t e o m i c s ) 研究。功能蛋白质组学的研究可以帮助我们认识基因的 功能，发掘与特定生理、病理条件相关的蛋白质，构建蛋白质的功能网络等。早 期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式( e x p r e s s i o np r o f i l e ) ，随着 复旦大学博士学位论文 学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。具有重要功能的低丰 度蛋白、蛋白质翻译后修饰以及蛋白质一蛋白质相互作用等功能蛋白质组学的研 究都己越来越成为蛋白质组学研究的重要部分。 1 1 1 低丰度蛋白的分离富集 复杂样品体系指组分种类多、含量差别大、已知信息量少的混合物。从组织 和细胞中直接提取的蛋白质，以人类细胞为例，种类高达上万种，而高丰度蛋白 质与低丰度蛋白质在浓度范围上相差六个数量级甚至更高，样品中低丰度蛋白质 含量太少，低于仪器的最低检测限，造成低丰度蛋白质难以检测。低丰度蛋白的 分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之- 6 - 7 1 ，在生物体中承担重 要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测 带来困难，限制了人们对它们的研究和认识，然而这一困难是目前已有的分离富 集技术均无能为力的，要解决这个问题必须有新的思路。 在现有技术的分离能力没有突破性提高的前提下，研究人员在简化样品复杂 程度及富集中低丰度蛋白方面做了很多工作，目前多采用预分馏的方法。 常用的几种典型的预分馏方法有以下几种，首先是经典的亚细胞器的提取 9 ， 1 0 1 ，该法是基于不同有机体在大小和密度上的差异采用密度梯度离心或差速离 心的方法使之分离，但是利用提取亚细胞器对蛋白质组进行预分组的方法往往需 要的样品量较大，从而限制了该方法的广泛使用。制各级等电聚焦也是常用的一 种预分离手段【1 1 1 4 】，这种方法很大程度上依赖于仪器设备，高的上样量是这种 方法的主要优点，这种方法所使用的大量的两性电解质就会干扰下游的分离和分 析，给后续的分离和分析工作造成困难。最近有报道使用反相液相色谱【8 ，1 5 ，1 8 】 和离子交换色谱【1 2 】用于蛋白质预分离。亲和色谱利用特异性反应来有针对性地 选择分离富集某一种或多种特定的蛋白质，使分析体系得以简化进而实现对低丰 度蛋白的富集检测1 9 2 4 1 。因此，低丰度蛋白的分离富集是目前蛋白质组学研究 的一个热点。 1 1 2 翻译后修饰蛋白质组学 蛋白质的翻译后修饰在细胞的生物学过程中起着关键的作用，如细胞的识 别、信号传导、生长与分化等。而这种关键调控作用在功能蛋白质形成过程中的 规律性又无法在基因水平得到答案。因此，蛋白质的翻译后修饰已经成为蛋白质 组研究的重要内容之一。迄今为止，目前有报道的翻译后修饰超过1 5 0 种，常 见的有磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化和泛素化修饰等。其中磷酸化和糖基化 修饰研究较多【2 5 】。 2 复旦大学博士学位论文 1 1 2 1 磷酸化蛋白质组学 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。在哺乳动物细 胞生命周期中，大约有l 3 的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中， 有5 的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸 ( 酯) 酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供 体a t p 的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调 控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、 发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内 的所有生命活动，目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引 起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果 2 6 1 。鉴于磷酸化修饰在生命 活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对功能的影响已成为 众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研 究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变 化，对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补 充，并提供了一个全新的研究视角，由此派生出磷酸化蛋白质组学 ( p h o s p h o p r o t e o m i c s ) 这一新概念。 规模化的识别和鉴定生物体内磷酸化蛋白质的表达及其变化，在技术方法 上还存在很大问题，其中磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组 学研究的关键技术之一。细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化，即使蛋白质的表达 量处于相对较高的水平，该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难，主要原因是： ( 1 ) 高通量磷酸化蛋白质组分析主要通过利用液相色谱质谱联用技术分析由磷 酸化蛋白质经过酶解后产生的磷酸化肽来获得蛋白质磷酸化的信息，由于磷酸化 蛋白在细胞内属于低丰度蛋白，且一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分 仅占其总量的1 0 【2 7 1 ：( 2 ) 磷酸化肽段带负电使其在质谱检测中难以质子化， 而且酶解产物中存在大量的非磷酸化肽段的严重抑制质谱检测中磷酸化肽的离 子信号。因此，目前磷酸化蛋白质分析的主要技术瓶颈是缺少特异性非常强的磷 酸化肽的富集技术，发展高特异性的磷酸化蛋白和肽段的分离富集技术具有很重 要的意义。 目前磷酸化蛋白和肽段的分离富集方法主要有：固相金属亲和色谱法和磷 酸基团亲和取代法。 1 2 1 1 固相金属亲和色谱法 最广泛用来从混合物中选择性富集磷酸化肽的方法是固定化的金属亲和色 谱( i m m o b i