（分析化学专业论文）恒电位法对氨基酸的测定.pdf

摘要 摘要 生命科学是二十一世纪一项最为重要的研究，而氨基酸分析是生命科学研究 中最重要的技术之一。目前氨基酸分析方法主要有离子交换色谱( m c ) 、高效液 相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 或毛细管电泳( c e ) 等，而以恒电位滴定法 对氨基酸进行分析研究尚不多见。恒电位滴定法的原理在于滴定曲线上的每一电 位( 或p h 值) 处滴定剂消耗的量与待测物的浓度成比例关系。本文以氢离子选择 性电极为工作电极，以一定浓度的氢氧化钠溶液为滴定剂( 根据需要可加入一定 量的盐酸调节p h 在较大范围内变化) ，采用恒电位滴定法对单组分谷氨酸、丝氨 酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸溶液及其两组分混合溶液进行研究，做了以下工作： ( 1 ) 测定了谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸溶液的含量，实验结果 良好，实验误差基本控制在3 以内。( 2 ) 测定了谷氨酸和丝氨酸、组氨酸和谷 氨酸、丝氨酸和组氨酸、谷氨酸和丙氨酸、组氨酸和赖氨酸的混合溶液的含量， 实验误差一般不超过5 ，体现了较好的实验效果。其中，丝氨酸和组氨酸混合 溶液测定时采用分段电位区间选取，从而增加了累积误差，因此此组实验误差相 对较大。( 3 ) 探讨了上述五种氨基酸在水溶液中的存在形式、混合溶液中的反应 顺序等理论问题，并且进一步讨论了两种氨基酸在滴定方向上的电离平衡常数的 相关规律及不同类别氨基酸水溶液所呈现p h 的规律。( 4 ) 分析和讨论了谷氨酸 和丝氨酸、组氨酸和谷氨酸、丝氨酸和组氨酸混合溶液的滴定曲线，从而进一步 探讨了混合氨基酸溶液中的反应情况。在此基础上，对恒电位滴定时工作电位的 选择方法进行了一定的总结。( 5 ) 讨论了实验误差及造成误差的各种影响因素。 ( 6 ) 总结了恒电位滴定法测定氨基酸的优点及局限性。 关键词：氨基酸，酸碱滴定，恒电位滴定，氢离子选择性电极 a b s t r a c t a b s t r a c t t h es t u d yo fl i f e s c i e n c ei sv e r yi m p o r t a n ti n2 1 s tc e n t u r y , a n da m i n oa c i d a n a l y s i si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tt e c h n o l o g i e si nt h el i f e s c i e n c er e s e a r c h t h e m a i nm e t h o d sf o ra m i n oa c i da n a l y s i sa r er e v i e w e d t h e s em e t h o d si n c l u d ei o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( i e c ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，g a s c h r o m a t o g r a p h y ( g qa n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) b u t i ti sr a r et ou s e m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt i t r a t i o nt os t u d yt h ea m i n oa c i d m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o n t i t r a t i o nb e l o n g st op o t e n t i o m e t r i ct i t r a t i o n t h i sm e t h o di sb a s e do nt h ep r o p o r t i o n b e t w e e nt h e c o n c e n t r a t i o no ft h eu n k n o w ns a m p l ea n dt h ev o l u m eo ft h et i t r a t i o n t h e d e t e r m i n a t i o no fp u r ea n dm i x e da m i n oa c i d si ss t u d i e db ya u t o m a t i cp o t e n t i o m e t r i c t i t r a t o r , w i t hn a o ha st h et i t r a n t , w h o s ec o n c e n t r a t i o i ni ss e t t l e d ，h y d r o g e ni o n s e l e c t i v ee l e c t r o d ea st h e d i r e c t i n ge l e c t r o d e ，a g - a g c l e l e c t r o d ea st h e i n s i d e r e f e r e n c e e l e c t r o d e ，1 0 m o l ln a n 0 3a si o n i cs t r e n g t ha d j u s t m e n tb u f f e r , a n d w h e ni t sn e c e s s a r y , 0 0 2 m e l lh c ii su s e dt oa d j u s tt h ea c i d i t yo ft h es o l u t i o n t h e j o bi n c l u d e s ：( 1 ) t h ec o n c e n t r a t i o no fg l u ，s e t , h i s ，a 1 a l y si s d e t e r m i n e da n dt h e r e s u l t sc a nb ea c c e p t e d t h ee r r o r sa r eb a s i c a l l yu n d e r3 ( 2 ) t h ec o n c e n t r a t i o no ft h e m i x e da m i n oa c i d si sd e t e r m i n e d ，s u c ha sg l ua n ds e t , h i sa n dg l u ，s e ra n dh i s ，g l u a n da l a ，h i sa n dl y s ，t h er e s u l t sa r es a r i s f y i n g t h ee r r o r so ft h ed e t e r m i n a t i o na r ea n u n d e r5 t w op o t e n t i a lr a n g e sa r es e l e c t e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fs e r a n dh i s ，s ot h e c u m u l a t i v ee r r o r si n c r e a s e ，t h ee l t o r so ft h i sg r o u pa r eal i t t l eb i gc o r r e s p o n d i n g l y ( 3 ) t h ee x i s t e n tf o r mo fa m i n oa c i d si si n v e s t i g a t e da n dt h es e q u e n c eo ft h er e a c t i o n s b e t w e e nd i f f e r e n ta m i n oa c i d s t h e nd of u r t h e rr e s e a r c ho nt h er e g u l a r i t yo ft h e i r i o n i z a t i o n e q u i l i b r i u mc o n s t a n t sa n dt h ep ho ft h e d i f f e r e n tk i n d so fa m i n o a c i d s ( 4 ) a c c o r d i n gt ot h e i rt i t r a t i o nc u r v e s ，t h er e a c t i o ni nt h em i x e da m i n oa c i d si s s t u d i e d o nt h i sb a s i s ，as u m m a r yi sm a d eo nh o wt os e l e c tt h ew o r k i n gp o t e n t i a lo f m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt i t r a t i o n ( 5 ) t 1 1 ef a c t o r sw h i c hm a yc a u s ee r r o r sa r e d i s c u s s e d ( 6 ) t h ev i r t u ea n dt h el i m i t a t i o no ft h ed e t e r m i n a t i o no fa m i n oa c i db y m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt i t r i m e t r yi ss u m m a r i z e d k e yw o r d s ：a m i n oa c i d ，a c i d b a s et i t r a t i o n ，m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt i t r a t i o n ， h y d r o g e ni s e i i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：去l 昔青 函旬年g 月莎e t 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名： 珊畸 年弓月匹日 第1 章绪论 1 1 前言 第1 章绪论 氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元；而蛋白 质又是生物体的主要组成物质。氨基酸主要有两种存在形式，一种是以游离态存 在于生理体液( 血浆、尿) 、食品( 酒、饮料) 中，另一种是以结合态存在于肽 和蛋白质中。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重 要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配合，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供 信息。各种氨基酸在生物体中有不同的生物功能，如生物体中的色氨酸与脑的正 常代谢有密切的关系，l 一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力。因此，准确灵敏 的测定食物、药物和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。 目前氨基酸主要用作食品补充剂、动物营养饲料添加剂，临床营养制剂以及 氨基酸药物如氨基酸注射液、氨基酸口服液、氨基酸制剂、要素膳等，且多以混 合的形式存在目前一般采用的是分离之后再分别检测各氨基酸含量的方法，即 分离分析法，如离子交换色谱( i e c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 或毛细管电泳( c e ) 等。但由于各种原因，这些方法在使用时受到一定的限制。 本文则采用恒电位滴定法对混合a 氨基酸的含量进行同时测定。 1 2 关于氨基酸 1 2 1 氨基酸概述 迄今为止，从各种生物体中发现的氨基酸已有1 8 0 多种，但是参与蛋白质组 成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有2 0 多种。此外在某些蛋白质中还存在若干 种不常见的氨基酸，它们都是在己合成的肽链上由常见的氨基酸经专一酶催化的 化学修饰转化而柬的。1 8 0 多种天然氨基酸中，大多数是不参与蛋白质组成的， 这些氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。参与蛋白质组成的2 0 种氨基酸称为蛋白质 氨基酸，确切地说为1 9 种氨基酸和1 种亚氨基酸( 即脯氨酸) 。除脯氨酸及其衍 生物外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相邻的n 碳原子( c 。) 上都有 一个氨基，因此称为a 一氨基酸。连接在o 碳上的还有一个氢原子和一个可变的 侧链，称r 基，各种氨基酸的区别在于r 基的不同。 第1 章绪论 氨基酸在中性p h 时，羧基以一c o o 。，氨基以一n h 3 + 形式存在。这样的氨 基酸分子含有一个正电荷和一个负电荷，称为偶极离子。o 氨基酸除r 基为氢 ( 甘氨酸) 之外，其n 碳原子是一个手性碳原子，因此都具有旋光性；并且蛋 白质中发现的氨基酸都是l 型的。n 氨基酸都是白色晶体，熔点很高，一般在 2 0 0 以上。每种氨基酸都有特殊的结晶形状。利用结晶形状可以鉴别各种氨基 酸。 本文以下所述氨基酸皆指n 氨基酸，即常见的蛋白质氨基酸。 1 2 2 氨基酸分类 氨基酸的分类主要是根据其侧链上的不同r 基团进行的。结合研究的目的和 需要，本文主要介绍两种氨基酸的分类方法。 1 按照氨基酸的侧链( r 基) 的不同极性分类 2 0 种氨基酸可分为两大类：极性氨基酸和非极性氨基酸，其中，极性氨基 酸又可分为不带电荷的极性氨基酸，酸性氨基酸( 带负电荷) 和碱性氨基酸( 带 正电荷) 。非极性氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 丙氨酸和缬氨酸；极性氨基酸包括酸性氨基酸( 天冬氨酸、谷氨酸) ，碱性氨基 酸( 赖氨酸、精氨酸和组氨酸) ，极性中性氨基酸( 丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸) i ”。 2 按照氨基酸的营养学价值分类 氨基酸在营养学上可分为必需氨基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸。必需 氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄 取的氨基酸，包括赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色 氨酸和缬氨酸；非必需氨基酸指的是人体可以自身合成或由其它氨基酸转化而得 到，不一定非从食物直接摄取不可的氨基酸，包括谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘 氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰氨、脯氨酸和酪氨酸：半必需氨基 酸是指虽然机体能合成，但在严重应激状态或某些疾病情况下容易缺乏的氨基 酸，包括组氨酸和精氨酸1 2 j 。 依据氨基酸的极性分类及营养学价值分类，并结合各氨基酸不同的生理功能 和药理作用，可使研究者在所测定氨基酸的选择上有较强的针对性，因而对于混 合氨基酸含量测定的研究也有初步的指导意义。 1 2 3 氨基酸的酸碱性质 2 第1 章绪论 氨基酸的酸碱性质是了解蛋白质性质的基础，也是氨基酸的分析分离工作的 基础。 依照b r 6 n s t e d - l o w r y 的酸碱质子理论，氨基酸在水中的偶极离子既起酸( 质 子供体) 的作用： c o o 9 0 0 + h 3 n 一一h ；= h 2 n 一中一h + h + f ! l r 也起碱( 质子受体) 的作用： 因此是一类两性电解质 氨基酸完全质子化时，可以看成是多元酸，侧链不解离的中性氨基酸可看作 二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基酸可视为三元酸。现以甘氨酸为例，说明氨基酸 的解离情况： c o o h 9 0 0 - c o o - + h 3 n c i h ；= = 。= + h 3 n 一9 一h ；2 。h 2 n 一9 一h i ! ih+h 一h h 目i 离子( h 2 a )偶极离子( i a )阴离子( a 一) 第一步解离 第二步解离 即器 = 酱 解离的最终产物( a ) 相当于甘氨酸盐。 在上述公式中，墨1 和分别代表a - 碳上c o o h 和n h 3 + 的解离常数。一般， 共轭酸的解离常数按其酸性递降顺序编号为厩1 ，等。表1 1 是各种氨基酸的 解离常数值及其溶解度。 下表数据显示：带正电荷的极性氨基酸( 碱性氨基酸) 等电点均在7 以上，带 负电荷的极性氨基酸( 酸性氨基酸) 等电点均在4 以下，而不带电的极性氨基酸 以及非极性氨基酸的等电点一般在5 7 之问。在同一类别的氨基酸中若干组分， 其结构相似、性质接近，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸这三种支链氨基酸，因为 三者都是不含其它基团的一氨基一羧基酸。其羧基的龟离都大于氨基的电离，它 们的等电点皆小于7 ，且三者相差很小。 3 第1 章绪论 表1 1 各类氨基酸在2 5 时的p k 值，p i ( 等电点) 及溶解度近似值” 极性带电缩写水中溶解度 状况状况 氨基酸 p k c o o hp k p k r p i 符号 2 5 c g 1 0 0 m l 带正 组氨酸h i s1 8 29 1 76 o7 5 94 2 9 赖氨酸 l y s 2 1 8 8 9 51 0 5 39 7 4 6 6 6 ( 2 0 。c ) 电荷 精氨酸 a t g 2 1 79 0 41 2 4 81 0 7 6 7 1 8 ( 2 0 c ) 带负天冬氨酸 a s p 1 8 89 6 73 6 52 7 70 5 0 极性 电荷谷氨酸g l u2 1 99 6 74 2 53 2 20 8 4 氨基 丝氨酸 s e r2 2 19 1 55 6 8 2 5 ( 2 0 c ) 酸 苏氨酸 t l l f 2 6 3 1 0 4 36 5 32 0 5 不带 天冬酰氨 a s h2 0 28 8 05 4 1 3 n ( 2 8 c ) 谷氨酰氨g l n2 1 79 1 3 5 6 5 4 2 5 盐酸盐 电荷 酪氨酸 t y r 2 2 09 1 11 0 0 75 6 60 0 4 6 半胱氨酸溶于水 ( 3 0 ) c y s 1 9 61 0 2 88 1 85 0 7 甘氨酸 g l y 2 3 49 6 05 9 72 4 9 9 丙氨酸 a l a2 3 49 6 96 01 6 5 1 缬氨酸 v h l2 3 29 6 25 9 68 8 5 亮氨酸l e u2 3 69 6 05 9 82 1 9 非极异亮氨酸 l i e2 3 69 6 86 0 24 1 2 性氨苯丙氨酸 p h e 1 8 3 9 1 35 4 82 9 6 基酸 蚩氨酸 m e t2 2 89 2 15 7 45 1 4 ( 2 0 c ) 1 6 2 3 脯氨酸 p r o1 9 91 0 6 06 3 0 色氨酸 t r p 2 3 89 3 95 8 91 1 4 电位滴定可从氨基酸溶液开始，用标准氢氧化钠溶液进行滴定，以加入的氢 氧化钠的量对p h 作图，可得滴定曲线。通过氨基酸的滴定曲线可以确定氨基酸 的各个解离基团的p k a 值，见图1 1 ，图1 2 。利用h a n d e r s o n h a s s e l b a l c h 公式 p h 心+ l g 黼 及所给的p 墨1 和p k a 2 等数据，即可计算出在任一p h 条件下一种氨基酸的各种 离子的比例睁6 1 。 因为氨基酸是两性电解质。它在溶液中带电情况随溶液的p h 而变化。可以 使氨基酸带正电荷，也可以使其不带电荷或带负电荷。如果氨基酸带的净电荷为 零，那么它在电泳中就不会发生向正极或向负极移动的现象。在这种状念下，溶 液的p h 称为该氨基酸的等电点，用p i 束表示。不同的氨基酸，其等电点也不同。 也就是说，p i 是氨基酸的一个特征值。在等电点时氨基酸的溶解度最小【7 1 。 4 第1 章绪论 毛 i b 、一i h f # h 舞一2 h c 口护 图1 1 组氨酸的滴定曲线图1 2 丙氨酸的滴定曲线 1 2 4 氨基酸的药理作用 下面是一些重要氨基酸的药理作用，见表1 2 【舡1 。 表1 2 几种重要氦基酸的药理作用 氨基酸药理作用 l - - 半胱氩酸用丁放射性药物中毒、锑中毒、肝炎及预防肝坏死等 l 一丙氨酸作为食品添加剂 l - - 苯丙氨酸维持神经系统健康，减轻压抑感，减轻痴感，提高记忆力，抑制食欲 l - - 色氨酸可用于抑郁、焦虑、失眠等症 l 一酪氨酸戒酒、改善a l z h e i m e r 氏病症、减轻抑郁，提高戒备心理 l - - 赖氨酸 可用下颅脑损伤综合症，脑血管病、老年性脑萎缩及记忆衰退 l 一天冬氨酸对大脑皮层有普遍而强烈的兴奋作用 l 一精氨酸可用于肝性脑病，耱尿病防治、降压、抗动脉硬化、霄溃疡保护治疗 l - - 亮氨酸食品添加剂，可做复方制剂防治肝昏迷，与异亮氨酸。缬氨酸合_ h j l 一谷氨酸用于防治肝昏迷、癫痫小发作、治疗胃酸不足和胃酸过少 l - - 组氨酸可抑制胃酸分泌、用于补充营养承i 治疗消化性溃疡 l 一丝氨酸可用于食品添加剂 通过文献查阅，对于目前主要的氨基酸类药物进行了如下分类 1 2 - 1 4 】： 1 单一氨基酸药物。通常作为缺少某种特定氨基酸所导致的病症的治疗药 物，如谷氨酸，精氨酸。 2 复方氨基酸药物。除3 a a ( 主要成分为三种支链氨基酸) 外，一般含1 0 种以上氨基酸( 通常8 种人体必需氨基酸是必备的) ，主要作为营养液，可用于 肾病、胃病等的治疗。 5 第1 鼋绪论 3 氨基酸复合药物。通常为一种或少量种类氨基酸与维生素、葡萄糖、无 机盐或其他药理物质所组成的复合药物。 1 2 5 氨基酸的分析方法 由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域的研 究中起着重要的作用，因此，对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。 1 9 5 8 年，s p a c k m a n 1 5 j 等首先提出了用阳离子交换色谱与杠后茚三酮衍生结合的 方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，人们不断地发 展新的氨基酸分析方法。柱前衍生反相高效液相色谱法，高效阴离子交换色谱一 积分脉冲安培检测法等相继应用于氨基酸分析。现已是多种氨基酸分析方法并 存、互补。 氨基酸分析，按分离方法可分为纸色谱法、离子交换法、反相高效液相色谱 法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法等；按检测分析方法可分为化学分 析法、电化学分析法( 包括电导检测、安培检测) 、分光光度法( 包括可见分光 光度法、紫外分光光度法和荧光分光光度法) 等：按衍生反应的先后，可分为柱 前衍生和柱后衍生法【1 5 - 1 7 1 。现就目f i , 7 应用于氨基酸分析的主要方法作一简单总 结，见表1 3 。 迄今为止，更多的尖端分析技术已经开始逐步被应用到氮基酸的分离分析 中，如等温滴定反应热测定( 1 t c ) 、核磁共振( n m r ) 滴定分析等方法。 总体来说，目前，对氨基酸的分析测定多采用离子交换色谱0 e c ) 、高效液相 色谱( h p l c ) 或气相色谱( g o 等仪器，这些仪器所用的检测器包括紫外可见光 谱吸收、荧光、化学发光等。然而，由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱， 自身又无荧光，因此不能直接检测，通常需要衍生化处理束提高检测的灵敏度和 选择性。而电化学方法则以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人 们的关注。其中，在电位滴定研究方面，由于氨基酸是弱酸，则多采用的是非水 滴定法，蔡凌霜f 3 2 l 等以电位滴定为基础，确定指示剂终点变色，并进行了常量 和微量方法对比。实验中以冰乙酸为溶剂，用0 1 m o l l 高氯酸的冰乙酸溶液为滴 定剂，以结晶紫作为指示剂，用微型非水滴定法对新合成的甘氨酸和久置异白氨 酸进行了测定：g r a n tg a n s h a w 等采用氟离子选择性电极测定丝氨酸蛋白酶的含 量：李景国1 3 3 j 等用线性滴定法测定氨基酸含量的方法，导出了氨基酸的线性滴 定方程，采用最优化方法，求出滴定方程中的未知参数，使滴定方程成为线性方 程，用线性回归法求解此方程，得到待测氨基酸的含量。该测定方法在水溶液中 进行，避免了非水滴定中有机溶剂带来的不便。实验结果表明，该法准确度高， 6 第1 章绪论 简单实用，完全可替代非水滴定。而本文采用恒电位滴定法对混合氨基酸含量进 行测定，下面将对恒电位滴定法相关知识进行具体介绍。 表i 3 氨基酸主要分析方法总结 类分析测定原理或测定对象特点 应用 别 方法 田 在中性或碱性氨基酸中加入甲醛，简单易行、快速甘氨酸溶液中加入过量的甲 由氨摹酸的氨摹和甲醛形成羟甲基方便醛，用标准氢氧化钠滴定 醛 衍生物降低氮摹酸的碱性，滴定终 准确度差，终点 化 滴 点由p h l 2 左右移至p h 9 附近，即酚 较难以掌握 学 定 酞指示剂变色绝崩“1 分 析 凯定 测定样品中氮的总含量，然后根据准确度较高操 此法由k i e l d a h l 于1 8 3 3 年首 蛋白质和氨摹酸中的氮含量，获知作步骤复杂，试 先提出经长期改进，迄今已 法 氏氮 含氰氨基酸、蛋白质的总量剂消耗量多，测 演变成常量法、微量法，自动 法 定周期长。定氮法、半微量法及改良凯氏 法等多种。 分蛋白质的2 0 种氨摹酸在可见光区 简单易行，快速 车津明等用紫外分光光度 都没有光吸收，但酪氯酸色氪酸 方便法测定林蛙油软胶囊中精氨酸 紫光 和苯丙氨酸都有明显的紫外吸收能 测定范围肯局 的含量 外光 力，因为它们的r 基含柯苯环共轭 限性 光度 双键系统。利用紫外光法可测定这 谱 法 些氨摹酸含量 方 通过使氨基髓分子中的氨基、羧筚刘效兰n 9 1 用邻二甲醛荧光法直 法 分 该方法可能存 或其他活件草团与衍生剂发生化学 在衍生时问长， 接用十测定海水中的氨基酸 荧光 反应，生成能产生荧光的衍生反应 衍生产物组分 陈悦娇等邻苯二甲醛荧光 光光 产物，并以相关检测仪器测定单组 复杂，稳定性 法测定市售白果中游离氨摹酸 分氨基酸的含量。 总量 度 差，选择合适的 衍生试剂町基 法 本解决这问题 7 第1 章绪论 续表l 类分析 别 测定原理或测定对象特点应用 方法 利用氨基酸在电板上氧化所呈现 有研究报道”，不经衍生 直 出的电活性，对十胱氩酸、半胱氨化处理，可以直接检测色氨酸 接分 酸、酪氨酸等电活性的氨草酸般 氨基酸的电分和酪氧酸的含量。 电析 采用直接电分析法 析法由于具有 简单，灵敏、无 化 放射、无污染等 学 特点己越来越 多数氯摹陵于金属电 受到人们的关 赖氡酸是非电活性的，但将其 极上是非电活作的无 注但同时也存与芳醛进行衍生化反应后在 衍 法直接测定一般是采 在卜足，如具有约0 3 m o l l 的磷酸盐缓冲溶 生问用衍生化反应将其转 直接的电化学 渍中( p i t = 1 1 ) 衙生产物于峰 化接化成电活性的物质进活性的氨基酸电位1 1 2 v 处在滴汞电极t 产 反测 行问接测定 不多、可逆性较生一灵敏吸附还原波，导数波 电 应定差、背景十扰较 商与赖氨酸浓度为良好的线 化 大、非电化学活 性关系，榆测限为3x 1 0 。 学 性的氨摹酸仍1 l “。 分 氨离氮基陵作为配体，可与需进行衍生化 6 i i b e r t 等人t l f f i c o z + 催化 析 基子 多种金属离子配位形 反应筹，因此实半胱氢酸产生氯波来测定胱 法 酸问 成电活性的配合物以际应用时选择 氨酸和半胱氧酸的灵敏度很 2 i 间 与接提高氰皋酸自身的检合适的体系发高 接分 金测 涮灵敏度 反应条件便成 电析 属定为研究这类方 化 法的关键。 e e l 是具胄电致化学 基十碱性条件，氮摹酸对次氧 学 发光活性的物质处于艘钠一鲁米诺化学发光体系的 电一定的电位时，与溶液链著增敏作用建屯了反相流 致中存在的氧化还原性动注射化学发光法测定氨基 化分 物质作用生成的小稳 酸的新方法。该法小需对氩皋 学析 定激发态l 口1 至基态时酸进行衍生或转化。检出限为 发所产生的化学发光。根o 0 1 6 pg m l 采样频率为1 5 0 光据发光强度的大小即次h ，对l ug m l 的组氨酸进 可测定氯幕酸的量 行连续1 2 次平行测定其r s d 为0 瞩“ 适合于氨毕艘的手住分离分离效率岛，无翟冉压啪l 等采用反向毛细管 缬梯度沈脱，分电泳模式，存缓冲浊中加入 毛电 析速度快，溶剂 ，表面活性剂使l u 渗漉改向 细泳 消耗少。但重现实现r 对混合氨基簸的帙速 竹差。分离在无需衍生的情况下， 管法 用高频电导枪测器柃删 8 第1 章绪论 续表2 类别 分析测定原理或测定对象特点 应用 方法 离分离氰基酸混合物经常使用强准确可靠，重现杨学猛等采用氨基酸分析 酸型阳离子交换树脂，利用氨基性好，能测定大仪同时测定肝氨散中l - 缬氨 子 酸在酸性条件下形成阳离子而量的氨基酸及其酸、l _ 异亮氨酸和l - 亮氰酸 交 在阳离子交换桂中分离，分离后同系物。但灵敏三种氨基酸的含量。 换 的氨基酸用相应试剂( 如茚三度不高，价格较 酮) 衍生，再用合适的检测手段 昂贵 色 检测( 如紫外分光光度法) 将 谱 高效阳离子交换色谱一柱后茚 法 三酮衍生光度椅测技术商品化 就是自动氨摹酸分析仪。 高 有柱前衍生。柱后衍生两大类灵敏，快速，使牟德海汹1 建立了邻苯二甲醛 目前多用柱前衍生反相高效液用范围广，分析( 嗍) 手动柱前衍生反相高 效 相色谱法，即将氨鼙酸狂柱前转时间短，操作自效波相色谱法测定样品中氨 色 液 化为适于反相液相色谱分离并动化。基酸含量的方法测定牛血清 谱 相 能艘灵敏榆测的衍生物。再进入白蛋白( b s a ) 的氰基酸组成和 色谱柱中分离。小鼠血清中的游离氨草酸，取 分 色 得满意的结果：苗虹汹等采用 析 谱 柱前衍生高效液相色谱法测 方 法 定食物中天冬氨酸，赖氨酸， 亮氨酸等1 6 种氨基酸含量。 新的氨基酸分析方法。此方法足蔡亚歧等m 1 将高效阴离子交 法高积不需要对氨基酸 基于氨摹酸分子中的羧皋在强 进行衍生化处 换色谱一积分脉冲安培直接检 效分 碱性介质中可以形成阴离子，而 理，可直接进行 潮法应用于鱼粉和玉米粉水 阴脉 氨基酸分子中的氨摹在强碱件 分离，检测，对 解液中的氨摹酸的分析测定。 介质中通过施加一定的电位，可该方法使用d i o n e xh m i n o p a c 离冲 氨基酸的检出限 在贵金属( 金、铂) 电极表面发 低一 p a i o 阴离子交换柱为分析柱。 子安 生氧化反应，从而实现氨摹酸的 控制柱温为3 5 ，以n a o f l 和 交培 阴离子交换色谱分离和积分脉n a a c 的强碱性溶液为淋洗液， 冲安培检测在合适的梯度条件下。可以实 换检 现对1 7 种常见氨摹酸的高效 色测 分离。在强碱件条件下，获得 良好分离的各个氨萆酸可在 谱法 配右金工作电檄的电化学检 测器上以积分脉冲安培法获 得高灵敏的检测 气相色 将所分析的氨基酸衍生为易十 分离时间短。柱h u s e k 等”报道r 用g c 同时 谱法气化的物质，可测定多组分的混效岛及易与质潜分析j 0 【浆中的2 0 种氨基酸和 合氨皋酸。 联用；缺点足衍3 0 种非氨基有机醴，样品制 生反应干扰备时间不足3 0 r a i n 9 第1 章绪论 1 3 恒电位滴定法 3 1 计算滴定分析法 计算滴定分析是直接电位法与电位滴定法的综合应用，最早由瑞典化学家 g r a n 在5 0 年代切提出。以后随着计算机和计算数学引入分析化学。这种方法得到 了很大的发展。国内汪葆浚等在8 0 年代初对当时称为“线性滴定法”的计算滴定 分析方法作了介绍，随后又出版了线性滴定法一书对国内计算滴定的发展起 了较大的推动作用。 滴定计算分析法一般要先建立一个包括滴定剂体积、被测物浓度、稳定常数 及其他常数在内的数学模型，也即滴定方程，为了方便计算，必要的时候可作适 当的简化，然后根据滴定过程中记录的滴定数据( 如e ，蜮p h ，y ) ，通过直线 回归或适当的数学计算，确定被测物质的浓度。计算滴定分析的优点是很明显的： 只需用滴定数据e ，l 或p h ，昧入建立好的模型即可获得结果，无需判断滴定终 点，从而避免了一些反应中因终点突跃不明显或根本没有突跃带来的麻烦；由于 不受墨c 1 0 的限制，可用于极弱酸( 碱) 的分析及a p k = 0 2 的混合酸的同时 分析；除此之外，由于该方法中常采用自动或半自动装置与计算机连用处理数据， 因此，非常适于在线分析i 弘捌。 计算滴定分析法分两大类，第一类，即控制体积滴定法，包括线性滴定法、 单点滴定法及双点滴定法。这类方法以热力学平衡关系导出计算模型。将多点滴 定数据代入该计算模型，用适当的数学方法求出待测离子的浓度，即线性滴定法。 将单点滴定数掘代入该计算模型，求出待测离子的浓度，即单点滴定法。将该计 算模型作适当的简化和推导，用两点滴定数据求出待测离子浓度，即双点滴定法。 第二类，即控制电位滴定法，也被称为恒电位滴定法或校正滴定法。控制电位滴 定法还可以分为控制单电位滴定法和控制多电位滴定法。这类方法的基本思想 是：滴定曲线上一定电位对应的滴定剂体积与待测物质的含量有确定的关系，测 出滴定至一定电位所加入的滴定剂体积，便可以求出待测物质的含量3 7 1 。 恒电位滴定法和控制体积滴定法的主要差异是： ( 1 ) 在实验操作上，恒电位滴定法首先确定滴定所应到达的电位数值，其 后通过实验测定达到该电位的；控制体积滴定法是根据加入标准物质的体积，记 录相应的( e ，、( p h ，y ) 值； ( 2 ) 在数学模型上，控制体积滴定法需推导所需数学模型；恒电位滴定法 有着简洁而同一的数学模型。 1 3 2 恒电位滴定法 1 0 第1 章绪论 1 恒电位滴定法基本原理及概述 1 9 8 8 年l i n d b e r g 和k o w a l s h i 首先将多元校正引入滴定分析中，该方法是基于 滴定曲线上每一点p h 处滴定荆消耗的量与酸的浓度成比例关系，即 k 一吒c i + t 。 ( 1 ) j i 因而使用这种方法无须预设特别的数学模型，在数据处理上较为便捷。在式( 1 ) 中， i 和j 分别对应不同的工作电位和混合溶液中的不同组分；m 为达到工作电位时 消耗的滴定剂体积；c j 为混合溶液中j 组分的物质的量浓度；岛和均为常数 2 恒电位滴定法的数据处理 几乎所有的多元校正法都适用于恒电位的数据解析，如经典最小二乘法 ( c l s ) 、偏最小二乘法( p l s ) 、主成分回归法( p c r ) 等，而当数据系列中 存在非线性成分时，则可采用人工神经网络法( a n n ) 等进行计算。 3 恒电位滴定法的应用 目前，控制电位滴定法主要应用于酸碱体系，除了l i n d b e r g 、n o s z a l 、 h a r d c 舔t i e 陋3 9 j 等国外研究者，国内学者也做了相当的研究工作m4 1 1 。随着滴定 计算分析研究的不断发展，这项分析方法也逐步开始应用于配位滴定、沉淀滴定 等体系，但在氨基酸等药物方面的应用尚属空白。 1 4 本文所作工作 本文采用瑞士万通公司的7 9 8 m p t 型全自动电位滴定仪为主要分析仪器，以 氢离子选择性电极为工作电极，以一定浓度的氢氧化钠溶液为滴定剂，根据需要 可加入一定量盐酸调节p h 在较大范围内变化，通过恒电位滴定法分别测定单组 分谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸溶液及其两组分混合溶液的含量， 所得数据用m a t l a b 软件所编制的程序进行处理，并对实验误差进行讨论和分 析。 1 1 第2 章实验臆理 2 ，1 计算模型 第2 章实验原理 本实验的主要原理为恒电位滴定分析法，其数学模型的一般表达式为式( 1 ) ： k 。艺七i ；c j + k j 。 其中，i 和j 分别对应不同的工作电位和混合溶液中的不同组分，m 为组分个数。 根据本实验的测定对象，在进行单组分测定时，恒电位滴定法的般数学模型在 每一个工作电位均可表示为： k - k c + k , o ( 2 ) 其中，k 为达到工作电位时消耗的滴定剂体积；c 为该氨基酸的物质的量浓度； k 项均为常数。 若进行多组分测定，则均可依据式( 1 ) ，得到与之形式相类似的计算模型。 2 2 测定原理 由恒电位滴定法的基本原理可知，其实验步骤可大致分为两个阶段：第阶 段，配制一系列待测物质的标准溶液，在工作电位下进行测定，求出以上数学模 型中各常数k 的准确值。由于该标准溶液的浓度和物质的量是已知的，且在一个 工作电位f 之下，所加入的滴定剂体积v 可以测得，因而通过这些数据可以求出 每个工作电位下数学模型中各常数k 的准确值。第二阶段，在获得各工作电位下 的常数k 值后，对待测溶液进行控制电位滴定，将实验测得的滴定剂体积矿代入 计算模型，经过数据处理，可得出待测物质的含量。 恒电位滴定法可用于单电位滴定法，也可用于多电位滴定法。单电位滴定法 就是固定一个电位占( 或p h 值) ，配制一系列的溶液，根据电位f ( 或p h 值) 点处 滴定剂消耗的量与待测物的物质的量成比例关系即可求得待测溶液的浓度。优点 在于数据处理方便，缺点在于仅适用于测定单组分的溶液而多电位滴定法是固 定一系列的电位f ( 或p h 值) ，在每个电位以或p h 值) 下都存在滴定剂的体积与 待测物的物质的量成比例关系，经过数据处理可求得待测溶液的浓度。优点在于 既可用于单组分测定，亦可同时求得溶液中多组分的浓度，缺点在于滴定过程中， 电极响应的滞后性使滴定剂的体积不易控制，导致测量误差。 1 2 第3 章实验部分 3 1 实验仪器及试剂 3 1 1 实验仪器 第3 章实验部分 7 9 8 一m y t 全自动滴定仪( 瑞士万通) 氢离子选择性复合电极( 瑞士万通) 电子天平 计算机 移液枪( d r a g o n m c d0 5 0 0 m 1 ) 实验室常用玻璃仪器 3 1 2 实验试剂 谷氨酸固体 丝氨酸固体 组氨酸固体 丙氨酸固体 赖氨酸固体 氢氧化钠固体 盐酸 硝酸钠固体 3 2 溶液的配制 3 2 1 氢氧化钠溶液的配制 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 a r a r a r 用托盘天平称取3 2 9 氢氧化钠固体至1 0 0 m l 烧杯中，加入蒸馏水使其逐渐 溶解。将溶解后的溶液转移到4 l 的塑料容器中，润洗烧杯数次，最终用蒸馏水 定容至4 l 。配得0 0 2 m o l l 氢氧化钠溶液，作为滴定剂。 3 2 2 硝酸钠溶液的配制 第3 章实验部分 用托盘天平称取8 9 9 硝酸钠固体至l o o m l 烧杯中，加入蒸馏水使其逐渐溶 解。将溶解后的溶液转移到1 l 的试剂瓶中，润洗烧杯数次，最终用蒸馏水稀释 至1 l 。配得1 0 0 0 m o l l 硝酸钠溶液，作为离子强度调节剂。 3 2 3 盐酸溶液的配制 用量简称取2 m l 浓度为3 7 的盐酸，转移至1 l 的容量瓶中，并用蒸馏水稀 释至l l 。配得1 0 0 0 x1 0 - 2m o l l 盐酸，可用于调节氨基酸溶液的酸度。 3 。2 4 各待测氨基酸溶液的配制 用电子天平准确称取一定质量的各待测氨基酸固体至l o o m l 烧杯中，加入 蒸馏水使其逐渐溶解。将溶解后的溶液转移至2 5 0 m l 容量瓶中，润洗烧杯数次， 容量瓶用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。配得i 0 0 0 x 1 0 2 m o i l 的氨基酸溶液。以此 溶液作为氨基酸溶液的母液，根据需要配制成其它浓度的氨基酸溶液。各待测氨 基酸固体具体称取质量见表3 1 。 表3 1 备待测氨墓酸同体的称取质量 3 2 5 单组分氨基酸标准溶液和待测溶液的配制 分别配制四种单组分氨基酸标准溶液和待测溶液。每种氨基酸标准溶液的浓 度分别为1 0 0 0 x1 0 - 3m o i l ，1 2 0 0 x1 0 - jm o l l ，1 4 0 0 xl o - 3m o l l ，1 6 0 0 ) p i 相差也较大。 4 2 滴定曲线分析 对氢氧化钠和各氨基酸溶液作用过程的研究中。了解氨基酸在水溶液中的存 在形式十分重要。而氨基酸的存在形式又与溶液的p h 值密切相关。因此对各作 用过程分析之前，首先确定电位与溶液p h 值之间的关系。 4 2 1p h 与电位之间的换算关系 根据能斯特方程，溶液的电位与氢离子浓度有如下关系： e - k + 印h ( 1 4 ) 其中，e 为该氨基酸溶液的电位；k 和s 均为常数。 通过测定缓冲溶液电位的方法，确定实验所用氢离子选择性复合电极的k 和s 。 经计算可得该氢离子选择性复合电极的k 和s 值分别为3 9 2 0 和5 9 6 ( 电位值的 单位为m y ) 。其中，缓冲溶液电位与p h 的对应值见表4 3 。 表4 ，3 氢离子选择性复合电极测定缓冲溶液电位的结果 在获得了该电极k 和s 值之后，可将