（分析化学专业论文）基于酶催化放大的高灵敏电化学免疫传感技术研究.pdf

湖南大学硕十学位论文 摘要 对于我们来说，探索开发一些简便、廉价、定量准确且易于操作推广的免疫 分析方法是一件非常有意义的工作。因为就目前来说，尽管免疫分析技术被应用 于临床医学、食品工业、环境监测等各个领域中，但其方法普遍存在着检测速度 慢、灵敏度低、操作繁琐费时、仪器昂贵且需要专业技能，只能在少数实验室应 用等缺点。因此，当务之急，应当建立一些准确、快速、灵敏度高、方便携带、 成本低廉、易于时实监测的检测方法。 生物免疫传感器以其所具有的特异的生物识别功能、极高的选择性，以及它 可与现代的电化学分析方法相结合的优点，能产生一些简单、结果精确、灵敏、 专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，是当前各学科领域既新颖又极具吸引 力的热门研究课题之一。电化学酶联免疫传感器是一种将抗原、抗体的免疫反应 和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的融合性技术。它的基本原理是通过化 学或生物方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物或通过免疫学的方法将 酶与抗酶体结合起来，形成免疫复合物，这些酶标记物或免疫复合物仍保持其免 疫活性，然后它与相应的抗原或抗体反应，形成酶标记的或含酶的免疫复合物。 结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，催化其发生水解、氧化或还原反应， 或形成共价键结合点，通过电化学分析方法进行定性、定量测定。由于电化学酶 联免疫传感器既具有免疫反应的特异性又具有电化学分析的灵敏性，因此其本身 具有检测设备相对简单，使用方便，构制酶电极方法灵活，检测下限低，体系容 易集成化，微型化等优点，实现了对目标物自动化、高灵敏的传感测定。本论文 基于此做了一些相关的工作，具体内容包括： ( 1 ) 建立了一种基于纳米金上生物沉积铂而催化氢还原的电化学免疫分析新 方法( 第二章) 。近年来，由于各种金属标记物广泛应用于分析领域，使得以金 属为标记物的金属免疫分析有了很大发展。以胶体金属颗粒为标记的电化学免疫 分析因实验所需样品体积小、实验设备成本低且灵敏度高、分析速度快等优点成 为金属免疫分析中最常用的一种方法。胶体金属颗粒作为标记物应用于金属免疫 分析，一方面是直接利用金属纳米颗粒自身优异的光、电化学性质来进行免疫分 析，另一方面，通过在纳米颗粒上沉积其它金属，使分析信号得到增强。铂作为 一种优异的催化剂，已广泛应用于工业生产。而在化学分析领域中，主要是基于 铂复合物等【43 】为标记物及以纳米铂1 4 4 】为标记物来进行蛋白质检测和d n a 分析。而 我们利用在纳米金上生物沉积铂应用于电化学免疫分析则是首次报道。在本实验 中，我们将纳米金标记的碱性磷酸酶标记抗体通过和目标分析物的央心反应固定 在聚苯乙烯微孔内，催化抗坏血酸磷酸酯水解产生抗坏血酸，使p t ( i v ) 还原并沉 湖南大学硕十学位论文 积在纳米金表面，沉积的铂在强酸中溶解释放并富集到玻碳电极上，能催化酸性 溶液中的h + 还原成h 2 ，用线性扫描法可检测出该催化电流大小，该电流大小与在 纳米金上沉积的铂的量成线性关系。因此根据铂催化氢还原的电流大小可间接实 现对目标分析物hi g g 的检测。 ( 2 ) 建立了一种基于生物沉积铜，并利用铂催化氢电化学还原的电化学免疫 分析新方法( 第三章) 。在前一章的研究基础上，我们发展了另一种新型的电化 学免疫分析方法。当铂沉积在玻碳电极上后，由于铂的催化作用，能减小h + 在玻 碳电极上的过电位，使h + 在较正的电位下还原，产生一还原电流，通常称之为催 化氢波。通过把铜沉积在镀有铂的玻碳电极上，由于铜附着在铂上后，降低了铂 的催化催化氢还原的能力，使h + 的还原电位向负方向产生位移。我们将碱性磷酸 酶标记的抗体通过和目标分析物hi g g 之间的夹心反应固定在聚苯乙烯微孔内 后，利用碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯水解后产生的抗坏血酸将c u ”催化沉积 在具有铂覆盖的玻碳电极表面，通过电化学检测，根据铂催化氢还原的电势大小 可间接实现对目标分析物h i g g 的检测。 ( 3 ) 建立了一种基于无需标记的聚合酶放大的电化学方法来检测人血清中的 p d g f ( 第四章) 。在人血小板中发现的血小板衍生生长因子( p d g f ) 作为一种 有丝分裂原，能刺激成纤维细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的 分裂增殖，以及诱导成纤维细胞、血管平滑肌细胞、单核细胞和中性粒细胞趋化 4 9 - 5 3 1 。p d g f 的生物功能包括促进胚胎发育，伤口的愈合以及引起炎症。尽管在 临床上p d g f 没有用于疾病诊断，但有大量的研究工作表明在许多疾病的形成过 程中，p d g f p d g f 受体形成的配合物起了很大的作用。例如癌症，过去二十多年 的研究清楚地表明p d g f 在肿瘤的发展过程中扮演了很重要的角色。p d g f 除了与 癌症有关以外，还与人类的许多疾病有联系。如动脉硬化症，肝硬化，血管球性 肾炎等等。基于上述p d g f 的重要性，在本论文中，我们设计了一种灵敏的且无 需标记的电化学生物传感器，来实现对p d g f 简便而快速的检测。首先将兔抗人 p d g f b 抗体固定在电极上，然后通过该抗体将分析物p d g f b b 捕获到电极上。 p d g f 适配体在与模板d n a 分子杂交后，在聚合酶作用下沿模板分子延伸并与模 板d n a 分子形成双链d n a 结构，形成的双链d n a 通过p d g f 与其适配体形成的一 种蛋白质d n a 复合物固定到电极表面，再将电活性物质亚甲基兰嵌入到双链 d n a 分子的沟槽结构中。通过方波脉冲伏安法可以检测到亚甲基兰的氧化峰电 流，并可作为对p d g f b b 进行定量分析的依据。该方法具有灵敏度高，响应快， 分析时问短以及分析成本低等优点。有助于将该方法应用于临床诊断分析。 关键词：生物沉积；电化学免疫分析：催化氢还原；聚合酶放大； 湖南火学硕十学仲论文 a b s t r a c t i m m u n o a s s a yp l a y s a ni m p o r t a n tr o l ei nv a r i o u sa r e a si n c l u d i n gc l i n i c a l m e d i c i n e ，f o o di n d u s t r ya n de n v i r o n m e n t a ls u p e r v i s i o n t r a d i t i o n a li m m u n o a s s a y m e t h o d sa r ef r e q u e n t l yc r i t i c i z e dt o w a r df o rt h e i rl o n ga s s a yt i m e ，l o wd e t e c t i o n s e n s i t i v i t y ，c o m p l i c a t e dp r o c e d u r e sa n de x p e n s i v ei n s t r u m e n t a t i o n t h ed e v e l o p m e n t o fn e ws t r a t e g i e sw i t hh i g hs e n s i t i v i t y , l o wc o s t ，a n dr a p i do u t c o m ei so fc o n s i d e r a b l e s i g n i f i c a n c e f o r p r a c t i c a lp r o b l e ms o l v i n g i nb i o m e d i c a ls t u d i e sa n dc l i n i c a l d i a g n o s i s i m m u n o s e n s o r si sat r a n s d u c e rt h a tc o u l ds p e c i f i c a l l yt r a n s f o r mt h ei m m u n o - r e c o g n i t i o ne v e n t si n t oe l e c t r o n i ca n do p t i cs i g n a l s d u et oi t sp o r t a b i l i t y ，l o wc o s t a n d h i g hs e n s i t i v i t y , i m m u n u s e n s o r s h a v eb e c o m ea na t t r a c t i v e s u b j e c t i n b i o a n a l y t i c a lc h e m i s t r y a m o n gt h e m ，e l e c t r o c h e m i c a le n z y m e l i n k e di m m u n o s e n s o r s a r eo fp a r t i c u l a rs i g n i f i c a n c eb e c a u s eo ft h ep o s s i b i l i t yo fh y p h e n a t i o nw i t hs i m p l e i n s t r u m e n t a t i o na se l e c t r o c h e m i c a ls y s t e m sa n dc o m b i n a t i o nw i t hh i g he f f i c i e n c yo f e n z y m ei ns i g n a la m p l i f i c a t i o n t h eb a s i cs c h e m ei ne l e c t r o c h e m i c a le n z y m e - l i n k e d i m m u n o s e n s o r si n c l u d e st h ec o n j u g a t i o no fac e r t a i ne n z y m ew i t ha n t i b o d yo ra n t i g e n ， t h ef o r m a t i o no fa n t i b o d y a n t i g e ni m m u n o c o m p e l xa n dt h e e n z y m e m e d i a t e d r e a c t i o nt h a tg e n e r a t e sa ne l e c t r o c h e m i c a l l ym e a s u r a b l ep r o d u c t ，f u r n i s h i n gar e d o x s i g n a lc o r r e l a t e dt ot h ea n a l y t e t h i st e c h n i q u ei sr e c o g n i z e df o rv e r yh i g hs e n s i t i v i t y , e a s ei nm i n i a t u r i z a t i o na n di m p l e m e n t a t i o n ，t h e r e f o r e ，h a sp r o v i d e da p r o m i s i n gt o o l f o rb i o m e d i c a lr e s e a r c h e sa n dc l i n i c a ld i a g n o s i s b a s e do nt h i sc o n s i d e r a t i o n ，t h e p r e s e n t t h e s i si sd i r e c t e dt o w a r dt ot h e d e v e l o p m e n to fn o v e le l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s i n gt e c h n i q u e s t h em a i ns t u d i e si n c l u d et h ef o l l o w i n ga s p e c t s ： f i r s t ，an o v e ls e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a ym e t h o dw a sp r o p o s e d b a s e do ng o l dn a n o p a r t i c l em e d i a t e db i o c a t a l y t i cd e p o s i t i o no fp l a t i n u mf o l l o w e db y s t r i p p i n g v o l t a m m e t r i cd e t e r m i n a t i o n t h e f e a s i b i l i t y o ft h e a p p r o a c h w a s i n v e s t i g a t e du s i n ga s a n d w i c h i m m u n o a s s a yf o r m a tw i t hh u m a ni m m u n o g l o b u l i ng ( hi g g ) a st h ea n a l y t e hl g gw a sf i r s t l yc a p t u r e db yp r i m a r yg o a ta n t i hi g g p o l y c l o n a la n t i b o d y ( hi g ga b ) i m m o b i l i z e do np o l y s t y r e n em i c r o w e l l s g o l d n a n o p a r t c i l e l a b e l e da l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) - hl g ga bw a st h e nb o u n dt ot h e m i c r o w e l l s t h r o u g h s a n d w i c h e dhl g g t h es u r f a c e b o u n da l k a l i n e p h o s p h a t e c a t a l y z e dt h eg e n e r a t i o no fa s c o r b i ca c i d ，w h i c h ，i nt u r n ，r e d u c e dp l a t i n u mi o n si n t o i t sm e t a lf o r mi nt h ep r e s e n c eo fg o l dn a n o p a r t i c l e s t h ed e p o s i t e dm e t a lw a sr e l e a s e d i n a q u ar e g i a ( t h r e ep a r t sh c i ，o n ep a r th n 0 3 ) ，a n dr e d u c e do ng l a s s y - c a r b o n l 湖南大学硕+ 学何论文 e l e c t r o d e ， w h i c h g e n e r a t e d a s i g n i f i c a n t c a t h o d i cc u r r e n td u et ot h e p l a t i n u m - c a t a l y z e dh y d r o g e ne v o l u t i o n t h ec a t h o d i cc u r r e n tw a so b s e r v e dt os h o w l i n e a rc o r r e l a t i o nt ol o g a r i t h m i chi g gc o n c e n t r a t i o no v e rt h er a n g ef r o m10 0 n g m lt o 2 g m la n df r o m10 0 p g m lt oi0 0 n g m lr e s p e c t i v e l y ，t h ed e t e c t i o nl i m i tw a sa sl o w a s2 2 p g m 1 t h eh i g hp e r f o r m a n c eo ft h em e t h o di sa t t r i b u t e dt ot h es e n s i t i v e d e t e r m i n a t i o no f p l a t i n u m a n dt h e c a t a l y t i cp r e c i p i t a t i o n - b a s e da m p l i f i c a t i o n m e d i a t e db yg o l dn a n o p a r t c i l e l a b e l e da l p hi g ga b s e c o n d ，an e w ，s e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a yh a sb e e ne s t a b l i s h e d b a s e do nt h ep r e c i p i t a t i o no fc o p p e ro n t op l a t i n u mn a n o p a r t i c l e so nt h es u r f a c eo f g l a s s - c a r b o ne l e c t r o d e t oi n h i b i tt h ee l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yo fp l a t i n u m ，w h i c h c a t a l y t i c a l l yr e d u c e st h ep r o t o n st oh y d r o g e ni na c i d i cm e d i u m an e g a t i v es h i f to f h y d r o g e ne v o l u t i o np o t e n t i a lc a nb eo b t a i n e da f t e rd e t e r m i n a t i o nu s i n gl i n e a rs w e e p v o l t a m m e t r y ( l s v ) i n0 1m h c is o l u t i o n t h em e t h o dw a se v a l u a t e df o ras a n d w i c h h e t e r o g e n e o u si m m u n o a s s a yo fi m m u n o g l o b u l i ng ( i g g ) a sam o d e lt a r g e t t h e i n f l u e n c eo fr e l e v a n te x p e r i m e n t a lv a r i a b l e s ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 p t c l 6 ， c u ”a n da s c o r b i ca i d2 - - p h o s p h a t a s e ，a n dt h er e a c t i o nt i m eo fe n z y m e sc a t a l y t i c c o p p e rd e p o s i t i o n o nt h es h i f to fp o t e n t i a lw a se x a m i n e da n do p t i m i z e d t h e a n a l y t i c a ls i g n a lw a so b s e r v e dt ob ed e p e n d e n tl i n e a r l yu p o nt h el g gc o n c e m t r a t i o n o v e rt h er a n g eo f0 i n g m lt o1 0 a g m li nal o g a r i t h m i cp l o t t h i sm e t h o dc a nb e e x t e n d e dt ot h ea p p l i c a t i o no fe n v i r o n m e n t a la n df o o dm o n i t o r i n ga sw e l la sc l i n i c a l d i a g n o s i sb e c a u s eo ft h ea d v a n t a g e ss u c ha st h es i m p l eo p e r a t i o n ，i n e x p e n s i v e a p p a r a t u s ，a n dt h eh i g hs e n s i t i v i t y t h i r d ，p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ( p d g f ) h a sb e e nc o r r e l a t e dw i t hm a n y d i s e a s e s w ea t t e m p t e dt oe s t a b l i s han e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp d g fi n h u m a ns e r u m u s i n g al a b e l - f r e ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r t h er a b b i t a n t i h u m a np d g f bp o l y e l o n a la n t i b o d yw a su s e da sc a p t u r ea n t i b o d ya n dt h e a n a l y t ew a sc a p t u r e do n t oe l e c t r o d e ，t h ep d g fa p t a m e r ，a m p l i f i e db yp o l y m e r a s ea n d t h e nf o r m e dad s d n aw i t ht e m p l a t em o l e c u l a ，b i n dt oe l e c t r o d es u r f a c eb yf o r m i n g t h ep r o t e i n d n ac o m p l e xw i t hp d g f - b b e l e c t r o a c t i v em a r km bi n t e r c a l a t i n gi n t o t h ed s - d n a ，t h u st h eo x i d a t i o np e a kc u r r e n to fs q u a r ew a v ev o l t a m m e t r yw a s o b t a i n e da n du s e da sq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp d g f - b b t h e r eh a sag o o dl i n e a r r e s p o n s ew i t h i nt h er a n g eo fp d g f b bc o n c e n t r a t i o nf r o m5 0 p g m l t o5 0 0 n g m l 。 a n dt h er e s u l t i n ge q u a t i o nw a sy2 4 4 6 7 x 3 1 9 1w i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tr 2 = 0 9 9 0 4 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a sr e a c h e da t18p gm l t h em e t h o ds t a t e di nt h i s a r t i c l ee x h i b i t e dav a r i e t yo fg o o dp e r f o r m a n c ec h a r a c t e r i s t i c si n c l u d i n gh i g h i v 湖南大学硕十学位论文 s e n s i t i v i t y ，f a s tr e s p o n s e ，m o r e o v e r , t h es h o r tt i m eo fa s s a ya n dl o wt h ec o s t ，i tm a y b eb e n e f i tf o ra p p l y i n gt h i sm e t h o di nc l i n i cm e a s u r e m e n t k e yw o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c e s ；e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y ； c a t a l y t i c h y d r o g e ne l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o n ；p o l y m e r a s ea m p l i f i c a t i o n v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 耋渤 嘴砖每7 乒t 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：交易 日期：勿巧车，月卯日 聊签名。翮好日期：毋月巧日 湖南人学硕十学位论文 第一章绪论 随着人们生活水平的同新月异，临床诊断、环境保护、食品和医药等领域的 科技发展，在分析过程中越来越多地需要对被分析物进行快速、在线、痕量的分 析和监测。免疫传感器以其所具有的特异的生物识别功能、极高的选择性，以及 它可与现代的物理化学方法相结合的优点，能产生一些简单、结果精确、灵敏、 专一、微量和快速、成本低廉的检测方法。因此而广泛的应用于各个领域的监控、 分析和检测。 1 1 免疫传感器 1 1 1免疫传感器的结构 免疫传感器( 1 m m u n o s e n s o r ) 是将免疫测定技术与传感技术相结合的一类新型 生物传感器，与传统生物传感器一样，在结构上免疫传感器可分为生物敏感元件、 换能器和信号数据处理器三部分【l 】。( 见图1 1 ) 生 物 敏 感 膜 1 1 2 免疫传感器的原理 图1 1 生物敏感元件是固定抗原或抗体的分子层；换能器是将识别分子膜上进行的 生化反应转变成光、电信号；信号数据处理器则将电信号放大、处理、显示或记 录下来。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物通过信号转换 器转变成可以输出的电信号、光信号，从而达到分析检测的目的 2 1 o 抗体与相应的抗原具有识别和结合的双重功能，再选择性地与抗原结合上， 选择性强，灵敏度高。由于蛋白质分子( 抗原或抗体) 携带有大量电荷、发色基 因等，当抗原抗体结合时会产生电学、化学、光学等变化，其大小与分析物含量 荩丁酶什化放人的高灵敏i u 化学免疫传感技术研究 或浓度存在定量关系，从而实现对待测物质的定量检测。传感器在保持敏感膜的 生物敏感组分有效活性的情况下，可对同底物反复多次检测 3 1 。 1 2 免疫传感器的分类 免疫传感器可分为无标记( 直接测定) 型和标记( 间接测定) 型f 4 】。标记型 免疫传感器是在检测前对被分析物进行标记通过检测标记物的量变监控免疫分 析反应。这类的传感器非特异性响应小，但检测过程较复杂。无标记型免疫传感 器通过直接测定抗原抗体复合物形成时的物理、化学变化，简化了制备和操作过 程。根据检测原理，免疫传感器可分为电化学免疫传感器、酶免疫传感器、压电 免疫传感器以及光学免疫传感器等。 1 2 1电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是一种将特异性抗原抗体免疫结合( 或借助某些标记物， 如酶等) ，产生相应的电信号的检测换能装置，在免疫传感器的研究中，电化学免 疫传感器是研究得较早、种类较多的一个分支。它将免疫技术和各种电化学技术 耦联，显著提高了免疫传感器的灵敏度。根据测量信号的不同，大致可分为：电 流型、电容型和电位型。 1 2 1 1电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是研究比较活跃的一个领域【5 l 。但由于抗原抗体本身不 具备电活性，所以对于电流型免疫传感器，必须借助于抗原或抗体的酶标来反映 电极上的抗原抗体的结合反应，从而达到阃接测定待测物的目的。这样一来，测 量过程相对复杂，同时由于绝缘性的抗体或抗原蛋白在电极表面的结合，也减弱 了电极的导电性，限制了电流型免疫传感器灵敏度的提高。 2 0 0 4 年z o n gd a i t 等研制了基于玻碳电极的电流型免疫传感器，以硫堇分子的 电化学信号作为检测的依据，成功地检测了c e a ( 癌胚抗原) 。同期，y a n x i ah o u 等将双亲性十八烷基胺和二十二烷酸制成的l b 膜沉积到由l 一十八烷基硫醇修饰 的银表面，制成的免疫传感器灵敏度高，特异性好，其线性范往2 0 0n m l 一1 0 0 0 n g m l ，用于检测人血清中i g g 得到满意结果。 2 0 0 5 年，y i n gz h u o 等 。s j 用研制出利用纳米金和辣根过氧物酶修饰金表面的 电流型免疫传感器，用于乙肝表面抗原的检测。他们首次利用辣根过氧化物酶代 替小牛血清( b s a ) ，封闭纳米金颗粒层上可能存红的活性位点，阻止非特异性结 合，同时可以放大抗原抗体反应信号。通过检测可知，其线性范围2 5 6 n g m l 5 6 3 2 n g m l ，最低检测限为0 8 5n g m l 。通过比较可以看出，该传感器比用b s a 封闭的 湖南人学硕十学位论文 传感器灵敏度更高，线性范围更宽。 1 2 1 2电位型免疫传感器 随着酶联技术的发展，电位型免疫传感器也逐渐兴起【l0 1 。这类传感器通常以 离子选择电极、气敏电极作为基础电极，酶作为标记物来催化底物反应，使底物 释放出离子或气体，待测抗体( 或抗原) 的浓度与酶催化产物在基体电极上的响 应相关。5 1 。 2 0 0 4 年，袁若等利用吸附在铂电极表面n a t i o n 膜中负电性的磺酸基与乙型肝 炎表面抗体( h b s a b ) 分子中的氨基阳离子之间的静电作用实现抗体的结合，同时 通过纳米金( a u ) 增加抗体的固定量，以及聚乙烯醇缩丁醛( p v b ) 薄膜的笼效应把乙 型肝炎表面抗体和纳米金固定在铂电极上从而制得高灵敏、高稳定电位型免疫传 感器( p v b a u h b s a b no n p t ) 。通过循环伏安法和交流阻抗技术考察了电极表面 的电化学特性，并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究。该免疫传感器具有 制备简单、灵敏度高、线性范围宽、响应时间快( 4 个月) 、选择性高等特点。同期，唐点平等研制了纳米金修饰玻碳电极固载抗体电 位型免疫传感器用于检测白喉类毒索，其结果令人满意。2 0 0 5 年，y i n g z if u 等【l “5 j 将巯基乙胺( a e t ) 固定到金电极表面，进而化学吸附附纳米金颗粒，再将免疫球 蛋白抗体( a n t i - - l g g ) 吸附在纳米金颗粒表面，从而制得高灵敏电位型免疫传感器。 通过循环伏安法和交流阻抗技术考察表明，裸金电极和纳米金组装电极存在很大 差异，其检出限为1 2n g m l ，实验结果与e l i s a 实验结果相近。同样有效的解决了 电位型免疫传感器灵敏度低，线性范围窄的特点。 1 2 1 3电容型免疫传盛器 电容型免疫传感器是以测定界面电容变化作为分析和研究的手段【9 】。当电极 插入溶液中，电极溶液界面的行为近似为一平行板电容器，在给定的电势下其双 重电容c 表示：c = 。o a d ( e 平板电容器中介质的介电常数；8o 真空介电常数； a 平板的面积：d 平板间距) 。在免疫分析中，当e 、e0 、a 视为恒定的前提下， 由于在传感器界面上形成了抗原抗体复合物，相应的生物敏感膜厚度d 值增大，导 致被测定的膜电容下降，由此可以建立目标物的定量检测方法。电容型免疫传感 器，由于无需标记，检测限低，制作简单，近些年来得到较快的发展；但是，响 应电容易受到非特异性吸附的影响，其重现性不如法拉第阻抗法与伏安法。 1 2 2 酶免疫传感器 荩丁酶储化放人的高灵敏i 乜化学免疫传感 支术研究 酶是一类有生物催化活性的蛋白质，对相应底物具有催化转化能力。酶不仅 具有催化反应、加快反应速度的作用，而且具有高度的专一性( 特异性选择) 。正 是由于这些特点和能力，使得它被非常广泛的应用于各类化学分析上。酶免疫传 感器是一类研究最早的生物传感器1 7 】，酶免疫传感器按换能方式主要可分为电 化学酶免疫传器感和光化学酶免疫传感器两类。 按测量信号不同，电化学酶免疫传器感可分为：电流型、电位型、电导型三 类。电流型酶免疫传感器的原理是利用固定在电极表面上的酶对酶底物的催化氧 化或还原，产生可在电极上还原或氧化的组分，获得电流信号【i8 j ；电位型酶免疫 传感器是基于离子选择性电极原理而发展起柬的，固定到电极表面的酶对底物催 化，产生离子型物质，能引起指示电极电位改变，电位变化关系遵循n e r n s t 方程 【1 9 l ；电导型酶免疫传感器是利用酶催化底物反应，导致反应体系中离子种类及浓 度的变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液导电率为响应信号。 光化学酶免疫传感器利用酶的高选择性，待测物质从样品溶液中扩散到生物 催化层，在固定化酶的催化下生成一种待测物质，当底物扩散速度与催化产物生 成速度达到平衡时，即可获得一个稳定的光信号，信号大小与底物浓度呈正比。 1 2 3 压电免疫传感器 压电免疫传感器又称为晶振生物传感器。在振荡晶体表面固定极薄的涂层， 该涂层能与待测物质发生反应，生成的复合物使其谐振频率发生变化，出现石英 振子的晶体频率是表面沉积物的函数，符合s a u e r b r e y 2 1 1 提出的质量和频率的平 衡方程：a f = k f 2 a m a 式中：f 一一晶体吸附外来物质后振动频率的变化( h z ) k 一一常数 a 一一被吸附物所覆盖的面积 f 一一压电晶体的基本频率( 由晶体性质和切割方向所决定，单位： m 1 4 z ) m 一一被吸附物质的质量 由方程可知，a f 与m 之间成负相关系。如果设法让晶体选择性地吸附外 源性物质，便能制成压电传感器。 压电免疫传感器是由免疫物质包被过的石英晶体、振荡器和频率计等几部分 组成。石英晶体片夹在两片金电极中间，成为夹心形，在石英晶体表面涂有生物 分子识别物质。压电检测系统有两个振荡回路，个晶体检测振荡器，一个晶体 参比振荡器。参比振荡器不包被生物识别物质，只是为了校正温度、湿度、被动 和其他干扰的影响，消除一些误差。 4 湖南人学硕十学忙论文 压电材料己广泛用于微重量分析，应用较多的是a t 2 c u t 石英晶体。抗原、抗 体( 或其标记物) 都有较大的分子质量，因此，伴随着免疫反应的进行，固定在石 英晶体表面的物质重量增加，从而引起晶体在电路中振荡频率f 的改变。 m u r a m a t s u 等报道了微生物重量法检测的白色念珠菌。裴仁军等采用在石英晶体 表面涂附一层h b s a g 抗体溶液制成的压电免疫传感器来检测h b s a g 。b u n d 等将单 克隆抗体固化在晶体表面上，可对泡疹病毒进行分型。在压电石英晶体表面固定 特异的生物大分子，通过抗体与抗原、抗体与生物以及核酸杂交的特异性生化反 应，促使晶体表面质量增加，频移改变，从而可对生物大分子进行定性定量检测。 y o k o y a m a 等人将莠去津的抗体吸附固定在包被有一层聚苯乙烯( p o l y s t y r e n e ) 的 9m h z a t 2 c u t 的石英晶体上制成压电免疫传感器( p i e z o e l e c tr i ei m m u n o s e n s o r ) ，再 将一定浓度的蛋白质标记的莠去滓和待测样品混合。竞争结合到晶体表面，由于 蛋白质标记的莠去津分子量远大于莠去津的分子量，引起晶体振荡频率的响应， 间接测定样品浓度，检测范围为o 1 0 0 1 1 1 0 0 0n g m l 。 1 2 4光学免疫传感器 由于很多光学性质如荧光、化学发光及反射、折射、散射、干涉、偏振等都 可以作为换能器设计的依据，故由此发展起来了很多光学传感器，在免疫测定方 面用的比较多的有消失波免疫传感器、光纤免疫传感器( f i b e ro p t i c m u n o s e n s o r ) 、 表面等离子体共振免疫传感器消失波免疫传感器是依据“消失波”现象设计的。 内反射光在反射点产生能穿入低密度反射介质的。消失波”，后者随穿入低密度 反射介质的距离呈指数衰减。 1 3免疫传感器的发展趋势和前景 1 3 1发展趋势 前面介绍了电化学免疫传感器、酶免疫传感器、压电免疫传感器和光学免疫 传感器等的原理和应用，但是随着科研的深入发展，学科与学科之间、各项技术 与技术之间的交叉渗透也越来越深入。 电化学酶联免疫传感器是近年来发展起来的一项新技术，它是将酶电极的化 学放大作用与免疫电极的特异性相结合，具有免疫反应的特异性和电化学分析的 灵敏性。电化学酶联免疫传感器具有检测设备相对简单，使用方便，构制酶电极 方法灵活，体系容易集成化，微型化等优点。发展新型电化学酶联免疫传感器是 目前较活跃的研究领域。 荩丁- 酶倚化放人的高灵敏b 化学免疫传感技术研究 1 3 2电化学酶联免疫传感器的概念与基本原理 电化学酶联免疫传感器是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机 结合而发展起来的一种融合性技术。它的基本原理是通过化学或生物方法将酶与 抗体或抗原结合起来，形成酶标记物或通过免疫学的方法将酶与抗酶体结合起来， 形成免疫复合物，这些酶标记物或免疫复合物仍保持其免疫活性，然后它与相应 的抗原或抗体反应，形成酶标记的或含酶的免疫复合物。结合在免疫复合物上的 酶遇到相应的底物时。催化其发生水解、氧化或还原反应，或形成共价键结合点 通过电化学分析方法进行定性、定量测定。可用作电化学免疫分析的生物酶及反 应体系必须满足以下条件： ( 1 ) 酶具有高活性； ( 2 ) 容易与抗体或抗原结合，而不降低活性； ( 3 ) 在检测和保存条件下稳定； ( 4 ) 在测定条件下体系底物非活性； ( 5 ) 酶催化反应产物具有电化学活性。 1 4 本论文工作 本论文基于生物酶反应的优点，结合电化学免疫分析方法进行了一些生物免 疫分析方法的改进、研究和讨论工作： ( 1 ) 、建立了一种基于纳米金介导生物沉积铂并以铂催化氢还原伏安法进行 检测的高灵敏电化学免疫分析新方法。该方法采用夹心免疫分析模式，实现了入 免疫球蛋白( hl g g ) 的测定。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗人i g g 捕获抗 体，hi g g 捕获后，碱性磷酸酶标记的hi g g 抗体修饰的纳米金探针通过与hl g g 形成夹心复合物而结合在微孔板上。结合的碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯底物 水解产生抗坏血酸，后者在纳米金的介导下还原铂离子沉积于纳米金表面。沉积 的铂用王水溶解、电沉积在玻碳电极上后，由于铂的催化作用，能降低h + 在玻碳 电极上的过电位，使h + 在较正的电位下还原，产生一还原电流，通常称之为催化 氢波。由于铂催化氢还原的高灵敏度及纳米金介导的生物沉积放大反应，该法具 有较高的分析灵敏度，且免疫分析微孔板模式使得该法可同时用于大量样品的分 析。通过测定铂催化氢还原产生的阴极电流，可实现hi g g 的高灵敏分析。 ( 2 ) 、建立了一种基于生物沉积铜，并利用铂催化氢电化学还原的电化学免 疫分析新方法。铂作为一种优异的催化剂，已广泛应用于工业生产。而在化学分 析领域中，主要是基于铂复合物等为标记物及以纳米铂