（分析化学专业论文）固相微萃取—毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究.pdf

周相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究中文摘要 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 中文摘要 摘要：研究了固相微萃取和加压毛细管电色谱( p c e c ) 联用的分析方法测定水 中及食品中痕量丙烯酰胺，水产品中氯霉素残留。方法：以活性炭吸附、浓集样品中 的丙烯酰胺，用甲醇洗脱。洗脱液用配有紫外检测器( u v ) 的加压毛细管电色谱仪 测定，测定的色谱条件为：流动相为甲醇：水( 5 - 9 5 ) ，流速0 0 7 5m l m i n ，检测波 长2 0 0n m ，加压1 0k v ，标准曲线法定量。结果：方法的最低检出浓度为5 n g m l ， 在0 5 - - 2 0 0 a g m l 浓度范围内，线性关系良好，相关系数严0 9 9 9 ，回收率为5 9 。 在上述优化的实验条件下，对不同品牌的薯条、薯片中丙烯酰胺进行测定，测定结果 平均值为1 9 2 p g g 。实验操作简单，检验快速，所需仪器也不昂贵，基本上能满足痕 量物质测定的需要。 关键词：固相微萃取；加压毛细管电色谱( p c e c ) ；活性炭；丙烯酰胺 作者：张颖 指导教师：屠一锋 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究英文摘要 d e t e r m i n a t i o no ft r a c ep o i s o n o u ss u b s t a n c eb ys o l i d p h a s em e t r oe x t r a c t i o n - - - p r e s s u r i z e dc a p i l l a r y e l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y a b s t r a c t a b s t r a c t ：t os t u d yam e t h o dd e t e r m i n a t i o no ft r a c ea c r y l a m i d ei nw a t e ra n df o o d ， c h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) r e s i d u e s i n f i s h e r yp r o d u c t sb y s o l i dm e t r o p h a s e e x t r a c t i o n - p r e s s u r i z e dc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ( s p e 一p c e c ) m e t h o d s ：t h e a c r y l a m i d ew a se x t r a c t e da n da d s o r b e df r o ms a m p l eb ya c t i v ec a r b o n w a s hd o w nt h e a c r y l a m i d ew i t hm e t h y la l c o h o l ，t h es a m p l es o l u t i o nw a sa n a l y z e db yu v p r e s s u r i z e d c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h yu s i n gs t a n d a r d c r r v eq u a n t i t a t i o n w i t ham o b i l ep h a s eo f m e t h a n o la n dw a t e r ( 5 ：9 5 ，v v ) a tt h er a t eo f0 0 7 5m l m i na n dd e t e c t e da t2 0 0n m ， p r e s s u r eo f - 1 0 k v r e s u l t s ：t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h i sm e t h o dw a s5 n g g t h er e s u l t s s h o w e dag o o dl i n e a r ( r = 0 9 9 9 ) i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo fo 5 2 0 0 鹏m l ，t h e r e c o v e r yw a s5 9 t h ea m o u n ta c r y l a m i d ei nt h ep o t a t ow i ld i f f e r e n tb r a n dc o u l dd e d e t e r m i n e di nt h es e l e c tc o n d i t i o n s t h ea v e r a g ec o n t a n to fa c r y l a m i d ei np o t a t oc h i p si s 1 9 2 p g 儋，t h em e t h o da l s op r o v i d e saf a s t , s i m p l e ，p r a c t i c a lw a yt o d e t e r m i n a t et r a c e a e r y l a m i d ei ns a m p l e k e y w o r d s ：s o l i dp h a s em e t r oe x t r a c t i o n ；p r e s s u r i z e dc a p i l l a r y e l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ；a c t i v ec a r b o n ；a c r y l a m i d e i i w r i t t e n b yy i n gz h a n g s u p e r v i s e db yp r o f y i f e n gt u 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体己经发 表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用 过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承担本声明的法律责任。 研究生签名：啦日 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、 中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文 档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以 公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大 学学位办办理。 研究生签名： 导师签名： 期：狃! ! ：塑 期：竺互! ! ：竺 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第一章引言 第一章引言 1 1 毛细管电色谱简介 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 是一种新型的高效微分离 技术。它是在毛细管电泳( c e ) 技术的不断发展和液相色谱理论的日益完善的基础 上逐步兴起的，是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动相移动的一种微柱液相色 谱分离法。由于它在毛细管中填充或在毛细管内壁涂布、键合或交联了色谱固定相， 因此它克服了毛细管电泳( c e ) 对电中性物质难分离的缺点，同时大大提高了液相色 谱的分离效率，并且结合了液相色谱固定相和流动相选择性多的优点，形成了自己独 特的高效、微量、快捷的特点【n 。c e c 主要依靠电渗流驱动流动相，所以它具有c e 塞 式流的优点，从而具有与c e 相似的高效性。物质在c e c 中根据它们在固定相与流 动相中分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得以分离，正是由于结合了这两种分离 机理，因此不管是中性物质，还是带电物质都可以用c e c 达到理想的分离效果【2 5 】。 c e c 既不同于毛细管电泳，又有别于h p l c ，而是毛细管电泳技术的高效和h p l c 的 选择性的有机结合，开辟了高效的微分离技术新途。 1 9 5 2 年m o u l d 和s y n g e 首次在色谱分析上使用了电渗流，他们在薄层色谱上利 用电场分离了胶棉中的多糖化合物。之后，直到1 9 7 4 年p r e t o r i u s 才首次成功地实现 了在填充毛细管液相色谱中用电渗流取代泵，并获得了比传统液相色谱高的柱效能。 但是由于p r e t o r i u s 当时所用的柱子管径较大，因此c e c 的优越性没有得到充分展 示，所以在7 0 年代后期，此法没有得到充分重视。直到1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s 用c e c 分离了两种毛细管区带电泳难以分离的电中性芳香化合物后，逐渐引起人们 的重视。关于c e c 的文章陆续得到了报道。特别是1 9 8 7 年k n o x 和g r a n t 从理论上 阐述了c e c 高效性的特点以后c e c 逐渐受到重视。 进入九十年代，随着c e 的日益成熟和c e c 毛细管柱制备技术的提高，c e c 得 到了迅猛的发展，1 9 9 1 年，v e r h e i j等首次实现了c e c 和质谱的联用。1 9 9 4 年， b a y e r 等利用高压液相色谱泵首次实现了毛细管电色谱的梯度洗脱，并用此方法成功 分离了寡聚核苷酸。1 9 9 5 年，y a h 发明了毛细管电色谱柱的电动填充技术，为毛细 管电色谱柱的商品化生产奠定了基础 6 - 1 0 】。 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第一章引言 1 2 毛细管电色谱的特点 毛细管电色谱( c e c ) 是毛细管电泳技术的高效和h p l c 的选择性的有机结合。主 要具有以下特点： 1 2 1 高柱效 c e c 以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分( 各粒子) 之间的迁移速度的差异而实现分离( 见图1 ) ，这里组分的迁移速度是指电渗和淌度 两个速度的矢量和。由于各组分迁移速度不同，因而经过一定时间后，各组分按其速 度的大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳谱图，根据谱峰的保 留时间和峰面积或峰高即可进行定性和定量分析【1 1 1 4 1 。 c a o i n a l ye l e c t l o p k o m a s s _ - - h _ _ _ - _ 。- _ _ - _ _ _ _ - 一 c a p i u a , y c a b b ye ) e c t r o c h r o m a t o g r a p h y 图ic e c 结合了两种高效的分离技术c e 和m i c r o h p l c i - i p l c 是用压力驱动流动相，流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。流体在 柱管中呈抛物线轮廓( 见图2 ) ，因而造成了色谱峰谱带的展宽，降低了柱效。而 c e c 采用了电场推动流动相，其线速度与柱管直径和填充微粒的大小无关，流体在 毛细管中呈塞状( 见图2 ) ，因此在c e c 中几乎没有流速梯度，谱带展宽效应相应 的就十分小。正是基于上述原因，c e c 的分离效率明显高于h p l c 1 5 】。 2 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第一章引言 + e l e c t r o o s m o t i cf l o w - - - p l u gf l o w h y d r o d y n a m i cf l o w 胛 赢o t l cp l o w _ ? b 一 图2 在c e c 和m i c r o - h p l c 中流体的轮廓比较 1 2 2 检测方法多样 c e c 有许多潜在的检测方法，例如光吸收法、电化学法、电导法以及化学发光、 磷光、荧光、质谱技术等。其中紫外吸收已经非常成熟，是绝大多数商品仪器的主力 检测手段。有少数商品仪器采用荧光检测方法，荧光技术可以提高检测的灵敏度，但 属于非普适性方法。如果将激光替代普通荧光光源，即成为激光诱导荧光( l i f ) ， 能达到单分子检测水平。质谱作为检测手段已渐趋成熟，可以采用联用的方式实现柱 后检测。电导法适用于无机离子等的检测。电化学检测的灵敏度也较高，但重现性不 够理性，不同的人或不同的系统，其结果可能有很大的出入。化学发光也是一种极灵 敏的检测方法，不过发光的试剂系统不稳定，检测需要混合过程，使用不太方便【1 6 1 9 】 o 检测方法按检测方式可分为柱上检测和柱后检测。采用柱上检测，死体积小，有 利于提高柱效和检测的灵敏度。柱后检测适合于进行柱后衍生才能检测的样品或特殊 的检测器。 1 2 3 适用范围广 毛细管电色谱( c e c ) 是在毛细管中填充或在毛细管内壁涂布、键合或交联了色谱 固定相，因此它克服了毛细管电泳( c e ) 对电中性物质难分离的缺点，可以同时分离 中性和离子性化合物而不需要添加表面活性剂。在蛋白质组学、药物研究、环境保护、 食品安全等领域有着广阔的应用前景。 1 3 加压毛细管电色谱( p c e c ) 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第一章引言 加压毛细管电色谱( p r e s s u r i z e dc a p i l l a r ye l e e t r o c h r o m a t o g r a p h y ，p c e c ) 是一种新 型的毛细管电色谱分析方法，通过在柱的两端施加高压电场，从而实现电渗流和压力 共同驱动流动相移动。 加压毛细管电色谱( p c e c ) 相比于毛细管电色谱( c e c ) ，更具有以下些优越 性。 首先由于通过泵旌加了高压，有效地抑制了柱中形成的气泡，增加了稳定性，否 则一旦出现气泡，不但基线噪音变大，峰型变坏，甚至使电流中断。其次给体系加压 后，使分析速度大大提高，p c e c 还可以不改变流动相的组成，通过压力和电场强度 的改变来改变溶质的保留，进而提高其分离的选择性，尤其针对一些带电物质。由于 p c e c 使用的进样系统以及泵同h p l c 相同，因此它可以实现流动相的梯度洗脱，对 于保留行为相差很大或很相近的复杂样品，同样可以得到满意的分离效果，其结果的 重现性也较好。 1 4 固相微萃取技术及原理 固相微萃取法是在固相萃取的基础上发展起来的，固相微萃取利用了固相萃取吸 附的几何效应，而装置结构进一步表现为超微化，这样它能在经典固相萃取的基础上 扬长避短。 固相微萃取技术多在一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为 萃取介质( 萃取头) ，再将萃取头直接浸入样品溶液( 直接浸没一固相微萃取方法，简称 d i - - s p m e ) 或采用顶空一固相微萃取方法( h s - - s p m e ) 采样。由于聚合物涂层的种类 很多，因而可对样品组分进行选择性富集和采集。固相微萃取的原理是一个基于待测 物质在样品及萃取涂层中分配平衡的萃取过程。 固相微萃取利用表面未涂渍或涂渍吸附剂的熔融石英纤维或其它纤维材料作为 固定相，当涂渍纤维暴露于样品时，根据“相似相溶”原理，水中或溶液中的有机物 以及挥发性物质，从试样基质中扩散吸附在萃取纤维上逐渐浓缩富集。萃取时，被测 物的分布受其在样品基质和萃取介质中的分配平衡所控制，被萃取量( n ) 与其他因素 的关系可以用下式描述：1 2 0 1 n = k v f c o v s ( k v d - v s ) 式中：k 为被测物在基质和涂层间的分配系数，v f 和v s 分别为涂层和样品的体积， c o 为被测物在样品中的浓度。 4 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第一章引言 如果样品体积很大时( v s k v f ) 上式可以简化成： n = k v d 2 0 萃取的被测物量与样品的体积无关，而与其浓度呈线性关系，因而从分析结果中 得到的萃取纤维表面的吸附量，就能算出被萃取物在样品中的含量，从而可进行定量 分析。 1 5 影响固相微萃取萃取率的因素 1 5 1 萃取头的种类及膜厚 固相微萃取的核心是萃取头的材料特性以及涂层的种类和厚度，这对萃取效率的 影响最为关键，因此，对其选择就显得最为重要。 目前，世界上已有商品萃取头问世。固定相可分为非键合型、键合型、部分交联 型以及交联型四种。非键合型固定相对于某些水溶性有机溶剂是稳定的，但是当使用 非极性有机溶剂时会引起轻度溶胀现象。对于键合型固定相，除了某些非极性溶剂以 外，对所有的有机溶剂均很稳定。部分交联型固定相在大多数水溶性有机溶剂和某些 非极性有机溶剂中很稳定。高度交联固定相类似于部分交联固定相，只不过在同一交 联中心产生了多个交联键。 最常用的也是最早使用的高分子涂层材料为聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 和聚甲基丙 烯酸甲酯( p a ) 。其中，1 0 0 p r o 的p d m s 适用于分析低沸点、低极性物质，7 岬的p d m s 适用于分析中沸点及高沸点物质，p a 适用于分析强极性物质。以后，又陆续出现了 聚酰亚胺、聚乙二醇等涂层材料。混合固定相应用也较广泛，如聚乙二醇一膜板树脂， 聚乙二醇一二乙烯基苯，聚二甲基硅氧烷一模板树脂以及环糊精等。近几年来，化学 工作者又先后研制了石墨碳黑f 2 、活性炭【2 2 】、键合硅胶f 2 3 】、高分子冠醚、溶胶一 凝胶1 2 4 2 7 1 等新型涂层。最近，还发展了许多特殊材料的聚合物涂层。例如：离子交 换涂层可用于去除水溶液中的金属离子和蛋白质，液晶膜可用于萃取平面分子，金属 涂层可用于电沉积待测物，n a t i o n 涂层可以从非极性基体中吸附极性化合物。为了开 发聚合物的导电性质，一些科学家还尝试用聚砒咯涂层来萃取极性甚至离子型待测 物。此外，还开发了纤维双液相涂层1 2 8 ，它可以克服单一液相涂层萃取有机化合物 范围狭窄的缺点，萃取范围更广，是目前研究和发展的趋势和方向。 萃取头涂层越厚，对待测物吸附量越大，可降低最低检出限。但涂层越厚，所需 平衡萃取时间越长，使分析速度减慢。因此，应综合考虑各方面因素，以求达到最佳 效果。 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第一章引言 1 5 2 萃取时间 萃取时间即萃取达到平衡所需的时间。由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、 样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定【2 9 】。一般萃取过程均在刚开始时吸附量 迅速增加，出现一转折点后上升就很缓慢。因此，可根据实际样品的需求，选取适当 的萃取时间。 1 5 3 搅拌和加热 在萃取过程中对样品进行搅拌和加热有助于样品均一化，缩短平衡时间【姗。对顶 空固相微萃取( h s - - s p m e ) 力i 热可提高液面上易挥发有机化合物的浓度，而提高萃取 效率。 1 5 4 无机盐 向样品中加入( n h 4 h s 0 4 ，n a 2 s 0 4 ，n a c i 和k 2 c 0 3 等无机盐可降低有机化合物与 基质的亲和力而提高萃取效率【3 1 1 。 1 5 5p h 缓冲溶液 萃取酸性或碱性物质时，可以通过加入不同的缓冲溶液调节样品的p h 值，从而 改善组分的亲脂性，进一步提高萃取效率。 1 6 固相微萃取操作模式 根据被分析样品的物理性质和状态，进行固相微萃取时可以采取不同的操作方 式，常见的操作方式有如下三种。 1 6 1 直接萃取法 将固相微萃取的纤维头直接浸入水相或暴露于气体中进行萃取的方法称为s p m e 直接法，对于气体样品或较干净的水样，能在1 m i n 内迅速达到萃取平衡，因而常使 用直接固相微萃取模式。 1 6 2 顶空固相微萃取法 把萃取头置于待分析物样品的上部空间进行萃取的方法叫做固相微萃取项空法。 这种方法只适于被分析物容易逸出样品进入上部空间的挥发性分析物，对黏度大的废 水、体液、泥浆或固体样品，则只能采用上空取样的顶空固相微萃取模式，萃取从基 质中释放到样品上空的化合物。 1 6 3 衍生化固相微萃取法 6 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第一章引言 通过衍生化作用来降低极性化合物的极性后进行固相微萃取的方法叫做衍生化 固相微萃取法，极性化合物通过在其水溶液基质中加入衍生剂或将纤维涂层浸入适当 的衍生化试剂被衍生后进行萃取，衍生化后极性分析物极性降低，萃取后更适于色谱 分析。 1 7 丙烯酰胺和氯霉素 1 7 1 丙烯酰胺 丙烯酰胺是白色或无色透明片状结晶，无味有毒，易溶于极性溶剂，在稀酸性溶 液中稳定，在碱性性条件下分解，光照和受热易聚合。丙烯酰胺是生产聚丙烯酰胺的 原料。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食 品在高温( 1 2 0 ) 烹调下容易产生丙烯酰胺。 研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺，饮 水是其中的一条重要接触途径。2 0 0 2 年4 月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学 研究人员率先报道，在一些油炸和烧烤的淀粉类食品，如炸薯条、炸土豆片等中检出 丙烯酰胺，而且含量超过饮水中允许最大限量的5 0 0 多倍。之后挪威、英国、瑞士和 美国等国家也相继报道了类似结果【3 2 】o 此外，人体还可能通过吸烟等途径接触丙烯酰 胺。 丙烯酰胺进入体内可通过多种途径被人体吸收，其中经消化道吸收最快。进入人 体内的丙烯酰胺约9 0 被代谢，仅少量以原形经尿液排出。丙烯酰胺进入体内后，会 在体内与d n a 上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致遗传物质损伤和基因突变。是一种 公认的神经毒素和准致癌物，动物实验和体外细胞实验都证明丙烯酰胺可导致遗传物 质的改变和癌症的发生现已被w h o 国际癌症中心( i r a c ) 列为可能致癌物质 3 3 3 4 1 。 按照经典有机分析，丙烯酰胺分子中有几个特征官能团：烯键，羰基和氨基，分 析方法大多数从这些官能团入手。酰胺类物质的经典分析方法比较少，目前，国际上 丙烯酰胺测定方法主要从色谱良好的分离性能和光谱高度的定性准确性出发，采用气 相色谱质谱联用法和高效液相色谱质谱联用法两种方法，对仪器设备要求较高。 1 7 2 氯霉素 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c 0 1 ) 又名左旋霉素，是一类广谱抗生素，我国上世纪8 0 年 代在水产养殖中得到广泛应用。其结构如图3 所示。常用于动物各种传染性疾病的治 疗，对多种病原菌有较强的抑制作用，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了 7 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第一章引言 水产品中氯霉素残留的严重问题。氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血 功能，引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿、早产儿灰色综合症 等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性，因此动物食品中的氯霉素残留 对人类的健康构成了巨大威胁【3 5 1 。 擎酗p c h l - h e ho 。 i h 严 o h c h l o r a m p h e n i c o l 图3 氯霉素结构图 氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美 国等均在法规中规定c a p 残留限量标准为“零容许量”( z e r ot o l e r a n c e ) 3 6 】，即不得检 出。我国出口水产品频频被进口国检出氯霉素残留，药物残留已成为扩大水产品国际 贸易的主要障碍。针对这种情况，农业部已将氯霉素从2 0 0 0 年中国兽药典中删除， 此药重新进入安全评价体系，在动物性食品兽药残留规定中规定可食部分不得检 出。 对于氯霉素残留，由于存在多种检测方法，因此各种方法的检出限问题已成为关 注的焦点。 霉素溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮，稍溶于水、乙醚和氯仿，不溶于苯和石 油醚。目前国内外的实验室几乎都采用乙酸乙酯提取。现在通常氯霉素的检测方法 h p l c - u v 、h p l c m s 、g c e c d 、g c m s 、h p t l c 、e l i s a 和r i a 等。从方法的灵 敏度而言，砌姨( 放射免疫法) 的检测限最低，但一般实验室无此条件，用加压毛细管 电色谱( p c e c ) 测定，通过有效的预富集方法能满足现在的低限量检测要求。 固相微萃取毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第二章 第二章本论文研究的目的、对象及实施步骤 2 1 研究目的 本论文的研究目的是研究固相微萃取和加压毛细管电色谱( p c e c ) 联用( s p m e - - p c e c ) 测定地表水、食品中痕量丙烯酰胺、氯霉素有毒有害物质的方法。p c e c 是 一种新型的高效微分离技术，能够有效的实现对丙烯酰胺和氯霉素的检测，借助有效 的样品预富集手段，可以提高分析灵敏度，固相微萃取则是很有效的预富集手段，通 过与固相微萃取联用，加压毛细管电色谱( p c e c ) 测定丙烯酰胺和氯霉素的灵敏度 可望获得较大提高。 2 2 研究对象 本文以地表水、食品等为对象，探讨固相微萃取和加压毛细管电色谱联用( s p m e - - p c e c ) 测定地表水、食品中痕量丙烯酰胺，水产品中残留氯霉素等有毒有害物质 的最优化条件，对地表水，油炸食品中痕量丙烯酰胺进行测定，对水产品中残留氯霉 素进行测定。 2 3 实施步骤 本论文的研究分为三个阶段： 一、以水溶液中痕量丙烯酰胺为对象，探讨固相微萃取和加压毛细管电色谱联用 ( s p m e p c e c ) 测定地表水中丙烯酰胺的最优化条件，并以自来水加入适量丙烯酰 胺作为模拟水样，采用s p m e - - p c e c 进行测定。 二、以固相微萃取和加压毛细管电色谱联用( s p m e - - p c e c ) 作为测定技术，探 讨此方法测定天然水、工业废水及不同品牌的油炸薯条、薯片中痕量丙烯酰胺的性能。 a 、天然水中痕量丙烯酰胺的测定 b 、工业废水中痕量丙烯酰胺的测定 c 、油炸薯条、薯片痕量丙烯酰胺的测定 三、探讨固相微萃取和加压毛细管电色谱联用( s p m e - - p c e c ) 测定水产品中氯 霉素残留量，并对常见的养殖水产品中氯霉素的残留量进行测定。 9 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第三章 第三章 固相微萃取一加压毛细管电色谱( p c e c ) 测定痕量丙烯酰胺 3 1 前言 近年来随着我国经济的高速发展，工业化水平的提高，人类活动范围的扩大，排 放废水中的有机化合物逐年增加，许多污染成分严重影响人类的健康，存在现实和潜 在的危害性，为监控这些有机物可能产生的环境污染，要求建立起相应的检测方法。 丙烯酰胺是一种具有潜在致癌作用的有毒有机化合物。表现为白色或无色透明片 状结晶，无味有毒，易溶于水、醇、丙酮和三氯甲烷，微溶于苯和庚烷【3 7 1 ，在稀酸 性溶液中稳定，在碱性性条件下分解，光照和受热易聚合。 有关企业排放废水中可 能含有痕量该化合物，但若得不到足够的重视，可能经长时间的积累而导致疾病，为 此，需要研究一种灵敏的分析方法。 p c e c 能够有效的实现对丙烯酰胺的检测，但灵敏度有限，如要实现上述目的， 需借助更为有效的样品预富集手段以提高分析灵敏度，固相微萃取则是很有效的预富 集手段，通过与固相微萃取联用，p c e c 测定丙烯酰胺的灵敏度可获得很大提高。本 文研究结果表明，用活性炭从水溶液中萃取丙烯酰胺，用甲醇超声洗脱并进行加压毛 细管电色谱分析，可将p c e c 澳o 定丙烯酰胺的检测下限降低一个数量级以上，且该固 相微萃取过程对设备要求低、操作简单、时间效率较高，提供了一种测定痕量丙烯酰 胺的有效方法。 3 2 仪器与试剂 3 2 1 仪器 表1 实验仪器表 仪器型号厂家 加压电色谱仪( p c e c )t r i s e p t m 210 0上海通微分析技术有限公司 超声波清洗器k q 2 1 8昆山市超声仪器有限公司 针筒式微孔滤膜过滤器 0 2 2 t m天津恒奥科技发展有限公司 石英亚沸高纯水蒸馏器 s y z b 江苏勤华石英玻璃仪器厂 电子分析天平 b $ 2 1 0 北京赛多利斯天平有限公司 紫外可见分光光度计 u t - 1 8 1 0北京普析通用仪器有限公司 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第三章 3 2 2 试剂 表2 实验试剂表 药品规格厂家 丙烯酰胺 9 9 苏州亚科化学试剂有限公司 甲醇色谱纯 国药集团化学试剂有限公司 一承k t 月l a r 国药集团化学试剂有限公司 盐酸 a r 国药集团化学试剂有限公司 活性炭 a r 金龙碳素厂 亚沸水 实验室自制 3 3 研究方法和过程 3 3 i t r i s e p 瑚一2 1 0 0 加压电色谱系统结构原理 t r i s e p t m - 2 1 0 0 加压电色谱仪器的原理如图4 所示，高压泵的吸入端通过吸管通入 流动相中，其输出端与混合阀相连。混合阀通过连接管与六通进样阀相连，流通进样 阀上连接有进样器和定量环。流动相推动样品通过定量环后到达四通，在此处流动相 与样品得到分流。四通分别连接分流器、分离毛细管色谱柱、电极和与进样阀相连的 连接管。另一根电极与毛细管色谱柱尾端通入装有少量流动相的小瓶中，小瓶必须绝 缘，以免旌加高压电时漏电对操作者造成伤害。高压电源通过四通处电极和色谱柱尾 端电极在毛细管色谱柱两端施加电场，实现电场和压力对流动相和样品的双重驱动。 注；1 ) 为防止大颗粒杂质造成系统管路堵塞，样品、流动相使用前要经过0 2 2 9 r a 滤 膜，水溶性的用水膜( 醋酸纤维素膜) ，脂溶性的用油膜( 尼龙膜) 。本实验 中样品、流动相属于水溶性，用水膜。 2 ) 流动相抽滤之后，还要进行超声波脱气，防止在高压下使流动相里的气体析 出而产生气泡造成系统基线漂移或造成监测器灵敏度降低，同时，流动相溶 解的氧气还可能使样品氧化。 3 ) 进样量根据所使用的定量环体积来确定，定量环为1m ，连接管为l o p 1 ，同一 样品第一次进样大于4 0 1 a l ，以保证定量环中充满待测样品。每次进样前须对进样针和 进样口进行彻底的清洗。 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第三章 漉动籀 分流嚣 图4t r i s e p t m - 2 1 0 0 加压电色谱系统结构图 3 3 2 色谱条件 3 3 2 1 流动相的选择 甲醇和乙腈是p c e c 常用的流动相，有报道指出用乙腈代替流动相中的甲醇会增 强信号强度【3 8 1 。经过查阅文献，本实验采用甲醇、水溶液作为流动相。研究了流动相 组成对分离效果的影响，采用不同配比的水一甲醇混合溶液为流动相，两者的配比对 待测物的保留时间、色谱峰型有一定的影响，结果研究表明在甲醇：水= 5 ：9 5 时，基 线平稳，丙烯酰胺与样品中的干扰物能较好分离。 3 3 2 2 高压电源电压的选择 高压电源通过四通处电极和色谱柱尾端电极在毛细管色谱柱两端施加电场，实现 电场和压力对流动相和样品的双重驱动。样品各组分的迁移速度由电渗和淌度两个速 度的矢量和决定。 电压的大小决定了各组分的保留时间以及分离效果。在一定流速下( o 0 7 5 m l m i n ) 改变电压值，可以看到丙烯酰胺的保留时间与峰面积发生了相应改变，其中高压加至 1 0 k v 以上时，峰面积变化不大。 表3 不同电压下丙烯酰胺保留时间与峰面积 电压( k v )丙烯酰胺保留时间( m i n )丙烯酰胺峰面积( p v s ) 0 7 2 5 l8 8 6 55 7 9 09 0 6 一1 04 7 5 9 1 11 0 一1 54 0 8 2 1 0 1 5 2 02 9 9 01 0 8 3 2 52 6 9 31 1 0 0 经过比较峰高和半峰宽以及保留时间，优选电压为1 0 k v 。 1 2 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第三章 3 3 2 3 流速的选择 在泵流速分别为0 0 2 5 m l m i n 、0 0 5 0 m l m i n 、0 0 7 5 m l m i n 、0 1 0 0 m l m i n 时，进 行丙烯酰胺标准溶液的测定，结果如表4 。( 注：加一1 0 k v 电压) 表4 不同流速下泵压及丙烯酰胺保留时间 流速泵压( m p a ) 丙烯酰胺保留时间 ( m u m m ) ( m i n ) 0 0 2 5 5 71 9 5 7 9 0 0 5 0 1 0 31 0 5 1 8 0 0 7 5 1 3 84 7 5 9 0 1 0 0 1 8 32 8 5 7 0 1 2 5超限 由于p c e c 以毛细管为分离通道，毛细管采用1 5 1 t m 超细颗粒填料，毛细管长度、 内径仅为2 1 0 m m 7 5 1 u n ，与h p l c 相比柱子流通面积大大减小，故如表4 所示，当 流速大于0 1 m l m i n 时泵压己超限，仪器达预警状态( 仪器生产商建议水系物作为流 动相时，一般泵压设定值不超过2 0 m p a ) 。比较出峰情况，经大量实验，选择较佳的 流速为0 0 7 5 m l m i n ，此时泵压为1 3 8 m p a 。但是在不同的时间下，即使使用相同的 流动相以及相同的流速，泵压也会上下波动，只要仪器状态正常，通常波动的幅度不 大。 3 3 2 4 检测器波长的选择 对丙烯酰胺标准溶液用紫外光谱仪扫描见下图： 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第三章 2 5 2 0 言1 5 a 日 = 1 0 0 。5 0 0 2 0 02 5 03 0 0 w a v e l e n 时l ( 舳) 图5 丙烯酰胺标准溶液的紫外扫描光谱图 由上图知，紫外波长为2 0 3n i i l 时，丙烯酰胺标准溶液有最大吸光度值。检测器 波长一般选在最大吸收波长处，考虑干扰物的吸收影响，检测器波长选在2 0 0 n m 。 综合考虑，确定测定的色谱条件为：流动相为甲醇：水( 5 - 9 5 ) ，流速o 0 7 5m l m i n ， 检测波长2 0 0n m ，加压1 0k v ，进样量4 0p l 结果比较好( 实际进样量为l 皿，其 余冲洗进样管路) ，保留时间也比较理想。在上述条件下，测定结果令人满意。丙烯 酰胺标准色谱图如下： 3 3 3 萃取材料的选择 图6 丙烯酰胺标准溶液色谱图( 2 0 “g m 1 ) 1 4 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第三章 经查阅资料，有报道石墨碳黑、碳纤维、活性炭、键合硅胶等新型聚合物涂层均 可用于萃取丙烯酰胺，n a t i o n 是一种全氟磺酸型离子交换剂，有优异的离子交换功能， 本身具有强极性，所以对极性物质有较强的吸洲3 9 1 。本实验选择了三种活性炭( 粉末 状活性炭、颗粒状活性炭以及柱状活性炭) ，n a t i o n 和粉末状活性炭交替涂层，作为 固相微萃取材料，分别探讨了它们的萃取效果。 固相微萃取材料，使用前需先进行预处理，处理方法如下所述。活性炭的处理： 活性碳在浓盐酸中煮沸3 0 m i n ，水洗到中性，1 2 0 c 下烘干，干燥器中备用。 用5 的n a t i o n 溶液和活性炭粉末交替涂布在一根不锈钢丝上，此不锈钢丝预先 用浓氢氟酸溶液腐蚀，使其表面粗糙不平，有利于n a t i o n 溶液和活性炭粉末的涂布。 由涂布的次数来控制涂层厚度，一般3 5 层。将此不锈钢丝制成萃取头。 经多次实验证明三种活性炭中颗粒状活性炭的萃取效率最好，粉末状活性炭的 吸附率高但洗脱率较低，且粒径太小不易过滤，容易堵塞管路。柱状活性炭由于比表 面积小，吸附能力相对较小。 n a t i o n 和粉末状活性炭交替涂层制成的萃取头，萃取效率同颗粒状活性炭相差不 大，但是在进行超声震荡洗脱时，有时会发生涂层从不锈钢丝上脱落的现象，使实验 结果无法精准。此方面的实验还有待于进一步探索。 综合考虑，本实验选择颗粒状活性炭作为萃取材料。在不同浓度的模拟水样中， 进行加标回收率测定实验，其回收率在5 4 0 - - , 6 3 3 之间，平均回收率为5 9 。其中 活性炭的萃取效率平均为8 2 ，甲醇的洗脱回收率平均为7 2 。 表5 ：模拟水样中丙烯酰胺的测定 序号 理论值( p g m 1 )测量值( 肛g m i ) 回收率( ) l 0 50 2 75 4 0 21 o 0 6 l6 1 0 3 5 02 7 35 4 6 41 0 o 6 0 56 0 5 52 0 0 1 2 6 66 3 3 6 5 0 03 0 7 l6 1 4 平均回收率( ) 5 9 3 3 4 萃取条件的优化 3 3 4 1 洗脱剂的选择 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第三章 用三氯甲烷和甲醇洗脱丙烯酰胺，分别进行洗脱试验。用5 m l l p p m 丙烯酰胺水 溶液，经活性炭在常温下超声萃取l o m i n ，用0 1 m l 三氯甲烷超声洗脱3 m i n ，洗脱 液在仪器上检测不到丙烯酰胺，用o 1 m l 甲醇超声洗脱3 r a i n ，洗脱液中丙烯酰胺的 浓度为2 9 8 p p m ，回收率为5 9 6 ，多次重复实验的结果见表6 ，因此我们选择0 1 m l 甲醇作为洗脱液。 表6 ：0 1 m l 甲醇作为洗脱液的测定结果 序号理论值( p p m ) 测得值( p p m ) 回收率( ) 1 5 0 03 0 36 0 6 25 0 o2 9 75 9 4 35 0 02 8 05 6 0 45 0 0 2 9 1 5 8 2 5 5 0 03 1 5 6 3 0 65 0 03 0 26 0 4 平均测得值( p p m ) 2 9 8 平均回收率 5 9 6 3 3 4 2 萃取时间影响 萃取时间即萃取达到平衡所需的时间由待分析物的分配系数，物质的扩散速率， 样品基质，样品体积等因素决定。一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加，出现 一转折点后上升就很缓慢。采用活性炭富集lo m l l p p m 水溶液中的丙烯酰胺，得到 色谱峰面积和萃取时间的关系如图，从表7 可以看出，本实验中超过1 0 分钟后丙烯 酰胺吸附量变化不明显，说明已基本达到平衡，故选择l o m i n 为萃取时间。 表7 固相微萃取的吸附量一萃取时间关系 萃取时间( m i n ) 2351 01 52 0 峰面积( g v s ) 5 9 79 1 82 0 5 53 1 0 82 9 9 23 0 7 6 3 3 4 3 洗脱时问的影响 在相同萃取条件下是否洗脱完全，与解吸时间直接相关。经上述步骤固相萃取的 丙烯酰胺用0 2 m l 甲醇超声洗脱，并进行色谱分析，得到峰面积和洗脱时间的关系如 1 6 固相微摹取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究第三章 表8 ，从图可以看出，洗脱3 m i n 时待测物已达最大洗脱效率，故本实验选择洗脱时间 为3 m i n 。 表8 固相微萃取的吸附量一洗脱时间关系 洗脱时间( m i n ) 123456 峰面积( p v s ) 9 9 72 0 3 63 0 5 53 1 0 82 9 9 23 0 7 6 3 3 4 4 超声与搅拌 在萃取过程中对样品进行搅拌和加热有助于样品均一化，缩短平衡时间【4 0 1 ，本实 验中采用超声震荡而提高萃取效率。有报道称采用超声波提取时，容易产生微粒，造 成柱子的堵塞，所以我们要求用孔径为0 2 2 t t m 的微孔滤膜过滤，以达到兼顾。 3 4 实验方法 3 4 1 标准溶液的配制 准确称量0 0 5 0 0 9 丙烯酰胺固体溶解，用1 0 0m l 容量瓶定容，配得浓度为5 0 0 “g m l 的标准溶液，用微量注射器在具塞试管中分别移取此标准溶液1 0 皿、2 0 止，、 4 0 皿、8 0i t l 、1 0 0i t l 、2 0 0 此，用移液管在具塞试管中分别移, k - 次蒸馏超纯水至 1 0 m l ，制得浓度为0 5 1 x g m l 、li ，t # m l 、2 p g m l 、3 1 , t g m l 、4i _ t g m l 、5i 上g m l 、1 0i t g m l 的丙烯酰胺标准水溶液。 注意：丙烯酰胺标准溶液应临用时新配，其贮备液用甲醇作溶剂，保存于冰箱中 可放置一周左右。 3 4 2 萃取及洗脱操作 用移液管在具塞试管中移入不同浓度的丙烯酰胺各2 0m l ，分别加入活性炭颗粒 约o 0 2 克，进行超声震荡1 0m i n ，静置过滤，然后将活性炭颗粒用o 2m l 甲醇超声 洗脱3m i n 。将洗脱液经0 2 2 1 m a 尼龙滤膜过滤后，上机测定。 3 4 3 色谱测定 按照优选出的色谱条件，使用甲醇：水( 5 - 9 5 ) 的溶液作为流动相，调流速为 0 0 7 5m l m i n ，检测波长为2 0 0n m ，加压- 1 0k v ，迸样量4 0 l ，在t r i s e p t m - 2 1 0 0 加压电色谱仪上进行测定。 3 4 4 计算 采用标准物质的保留时间进行定性，由于天然样品中成分复杂，干扰物多，因此 1 7 固相微萃取一毛细管电色谱测定痕量有毒物质研究 第三章 在特征波长处同时作紫外光谱扫描以确认为丙烯酰胺。按标准曲线法定量：把不同浓 度的丙烯酰胺标准溶液进样分析，以质量浓度( p g m 1 ) 为横坐标，以峰面积( “v s ) 为纵