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克拉霉素合成新方法和杂质分析 摘要 本论文主要介绍第二代大环内酯类抗生素克拉霉素，因为其在药学 药理和人体代谢等方面的优越性在临床上得到广泛应用，主要用于治疗 呼吸道、泌尿系统、皮肤和软组织等各种感染。随着近年来的不断发 展研究，本文对各种红霉素类抗生素的应用和现状进行总结概括。白克 拉霉素首次被合成以来，合成工艺从实验室合成到第一个工业化生产得 到了不断的发展，特别是在合成中为实现选择性甲基化，应用的各种保 护基不断得到发展。 用2 一乙氧基丙烯和三甲基氯硅烷作保护剂，阐述合成克拉霉素的新 方法，并对合成新工艺的优越性进行总结。通过对合成的克拉霉素进行 质谱，红外吸收光谱，核磁共振，元素分析及熔点等物性数据测定，对 照标准品来确认合成的克拉霉素。 通过对合成克拉霉素的液相色谱图对照欧洲药典克拉霉素杂质，对 几种主要杂质克拉霉素肟，二甲基化物，克拉霉素肟甲化物等进行分析， 及影响这些杂质在合成过程中产生的原因，并通过化学合成和母液中提 取方法获取几种主要杂质。 【关键词】大环内酯抗生素克拉霉素合成杂质分析 浙江大学硕_ = 学位论文 a b s t r a c t c l a r i t h r o m y c i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm a c r o l i d e sa n t i b i o t i c s a s t h es e c o n dg e n e r a t i o no fe r y t h r o m y c i n ，i ti sab r o a ds p e c t r u ma n t i b i o t i c s w i t h s t r o n g a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a n dm o r ef a v o r a b l e p h a r m a c o k i n e t i c b e h a v i o r i th a sb e e na t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o na n ds h o w sab r i g h tf u r u r eo n t h ec l i n i c a la p p l i c a t i o n i ti sg r e a t l y e f f i c i e n c y i nt r e a t i n gt h er e s p i r a t o r y t r a c t ，t h eu n i n a r ys y s t e m ，t h es k i na n dt h es o f tt i s s u ei n f e c t i o na n ds oo n a l o n gw i t hr e c e n ty e a r st h ed e v e l o p m e n tr e s e a r c h ，t h ep r e s e n t r e v i e w d e s c r i b e se a c hk i n do fe r y t h r o m y c i nc l a s sa n t i b i o t i ca p p l i c a t i o na n dt h e p r e s e n ts i t u a t i o n f r o mt h el a b o r a t o r yt ot h ef i r s ti n d u s t r i a l i z a t i o np r o d u c t i o n ， t h es y n t h e s i sc r a f to fc l a r i t h r o m y c i no b t a i n e dt h eu n c e a s i n gd e v e l o p m e n t s p e c i a l l yt h ea p p l i c a t i o nk i n d so fp r o t e c t i v eg r o u p s w i t h2 - e t h o x y p r o p e n ea n dc h l o r o t r i m e t h y l s i l a n em a k e dt h ep r o t e c t i n g a g e n t ，c l a r i t h r o m y c i ni sc o m p o u n d e d t h es u p e r i o r i t yo f s y n t h e s i sc r a f t c a r r yo nt h es u m m a r y t h r o u g ht h em a s ss p e c t r u m ，t h ei n f r a r e da b s o r p t i o n s p e c t r u m ，t h en u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，u l t i m a t ea n a l y s i sa n dm e l t i n g p o i n ta n ds oo nd a t ad e t e r m i n a t i o n s ，c o n f i r m st h es y n t h e s i sc l a r i t h r o m y c i n t ot h el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc h a r to ft h es y n t h e s i z e sc l a r i t h r o m y c i n c o m p a r et h ee u r o p e a np h a r m a c o p o e i ai m p u r i t y t os e v e r a lm a i ni m p u r i t i e s c l a r i t h r o m y c i no x i m e ，d i o m e t h y l e r y t h r o m y c i na ，c l a r i t h r o m y c i n 一9 一( o - m e t h y l o x i m e ) a n ds oo nc a r r i e so nt h ea n a l y s i s ，t h er e a s o nw h i c hp r o d u c e s 2 浙江火学顾上学位论文3 i nt h ec o m b i n e ds e q u e n c ea f f e c t st h e s e i m p u r i t i e s i nt h ec h e m i c a l s y n t h e s i sm e t h o da n dw i t h d r a w i n gi nt h em o t h e rl i q u o rt og a i ns e v e r a lm a i n i m p u r i t i e s k e yw o r d m a c r o l i d e s a n t i b i o t i c c l a r i t h r o m y c i ns y n t h e s i s a n a l y s i so fi m p u r i t y 浙江大学硕上学位论文 1 1 前言 第一章文献综述 克拉霉素( c l a r i t h r o m y c i n ，简称c a m ) ，化学名称( ) 2 r ，3 s ，4 s ，5 r ，6 r ，8 r ，1 0 r ，1 1 r ，1 2 s ，1 3 r3 ( 2 ，6 一二去氧3 一c 一甲基3 - o 甲基- q l 一吡喃核 糖基) 氧卜1 3 一乙基一1 1 ，1 2 一二羟基一6 一甲氧基一2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 一六甲基 ( 3 , 4 ，6 一三去氧一3 一 二甲氨基一1 3 一d - i i l l l l 南木糖基) 氧 - 1 4 - 氧环十四烷一l ，9 一二酮。是由日本大正制药株式 会社( t a i s h op h a r m a c e u t i c a lc o l t d ) 在1 9 8 0 年发现后由美国雅培公司( a b b o t t l a b o r a t o r i e s ) 开发成功19 9 0 年2 月以商品名k l a c i d 首次在爱尔兰继而 在意大利上市，并在1 9 9 1 年1 0 月由美国f d a 批准在美国上市的一种新型红霉 素药物。克拉霉素因有其优越的抗菌性能被列入未来2 0 年世界50 种畅销 药物之一【1 】。克拉霉素的其他名称有甲红霉素，6 一甲基红霉素，6 一甲氧基红霉 素，克拉仙等，分子式：c 3 8 h 6 9 n 0 1 3 ，分子量：7 4 7 4 。克拉霉素分子结构如下： o c l a r i t h r o m y c i n 浙江人学顾l 学位论文 1 2 功效及药理 克拉霉素具有高效、口服易于吸收，对酸稳定性好的特点，该药对革兰 氏阳性菌的活性强，对酶稳定，在血清和肺组织中浓度高。临床证明体内活性 是红霉素的6 1 0 倍，是交沙霉素的1 4 - - 3 5 倍 2 】【7 】。并以改善生物利用度为特 征，组织和细胞内分布极好、半衰期长，其不良反应发生率仅为3 ，是用于 治疗呼吸道、泌尿生殖系统、皮肤和软组织感染，已成为取代红霉素的大环内 酯类抗生素品种；与阿莫西林，奥美拉唑合用的“三联疗法 也作为幽门螺旋 杆菌( h p ) 引起的胃及十二指肠溃疡的治疗药物。成人使用剂量，0 2 5 9 次，2 次，日【3 】。贮藏：密封，在阴凉干燥处保存；有效期：二年。 克拉霉素药理作用机制是通过穿透细菌的细胞壁，与细菌核糖 蛋白体的5 0s 亚基相结合，抑制肽酰基转移酶，阻滞转肽和易位作 用，阻止肽链增长，抑制细菌的r n a 依赖性蛋白质合成，从而实 现抑制细菌的生长，繁殖【6 】【8 】【13 1 。 克拉霉素口服后经胃肠道迅速吸收，生物利用度( f ) 为5 5 。，食物可稍延 缓其吸收，但不影响生物利用度。单剂口服4 0 0 m g 后2 7 小时达血药峰浓度 ( c m a x ) 2 2 m g l ；每1 2 小时口服2 5 0 m g ，在2 3 天内达到稳态血浓度约为 1 m g l ，其代谢物( 1 4 一羟基克拉霉素) 为0 6 m g l ，每1 2 小时1 2 1 服5 0 0 m g ， 药物在稳定峰值状态的血浆浓度平均为2 7 2 9m g l ，其代谢物为0 8 3 o 8 8 m g l 。其主要代谢产物是具有大环内酯类活性作用的1 4 一羟基克拉霉素。单 剂给药后血消除半衰期为4 4 小时【1 5 】。 克拉霉素的不良反应发生率很低，在3 左右，主要表现为恶 心、腹痛、腹泻等轻度胃肠道反应和转氨酶升高，停药可恢复【6 】。 1 3 合成工艺进展 克拉霉素是以红霉素a ( e r y t h r o m y c i na ，e m ) 为原料，通过分子结构修饰得 到的新型红霉素。红霉素a 化学名3 ( 2 ，6 二去氧3 c 甲基3 o 甲基一q l 一吡哺核糖基) 氧卜1 3 一乙基一6 ，11 ，1 2 一三羟基一2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 - 六甲基 ( 3 , 4 ，6 三去氧一3 一二甲氨基一9 一 浙江大学顺上学位论文 d 一吡喃木糖基) 氧卜1 4 一氧杂环十四烷- 1 ，9 - - - 酮。是大环内酯类抗生素中最典型也是 最重要的药物。长期以来，红霉素为患者提供了一种高效而安全的用药途径，特别 是对1 3 内酰胺抗生素类( 如青霉素和头孢菌素) 药物耐药，治疗无效或有过敏反应的 病例特别有效。第一个大环内酯类抗生素红霉素是美国e l il i l l y 公司在1 9 5 2 年首先开 发的，是从红色链丝菌( s t r e p t o m y c e se r y t h r u s ) 中产生的，己分离到六种异构体， 分别为a ，b ，c ，d ，e ，f ，其中红霉素a 是主要活性成分。由于使用的菌种不同， 副产物的含量也不同。 红霉素具有大环内酯抗生素的各种优越性能，但是在酸性条件下会分解，迅速 失去活性，因此口服时很容易被胃酸破坏，失去作用造成生物利用率低。红霉素在 酸性条件下降解主要经历了一个分子内的环合水解反应，在氢离子作用下，红霉素6 位羟基与9 位羟基的酮基形成6 ，9 半缩酮，再与8 位上的氢脱水形成8 ，9 脱水6 ，9 半缩酮 衍生物。然后1 2 位羟基与c 8 ，c 9 双键加成，进行分子内环合，生成6 ，9 ，9 ，1 2 螺缩酮 ( s p i r o k e t a l ) ，进行不可逆反应。最后1 1 位羟基与1 0 位氢脱去一分子水并水解生成 红霉素胺和克拉定糖，这种降解反应使红霉素失去抗菌活性【i i 】。分解反应历程如下： h + 加成 n n + 为克服红霉素在酸性环境下分解的缺点，研究者对红霉素的分子结构进行改进。 由于红霉素结构复杂，对红霉素的改进研究是项非常困难的工作。根据红霉素酸性 分解机理，要提高红霉素稳定性和抗菌活性关键问题是对红霉素分子内环合降解作 用的抑制，红霉素在酸催化的水解反应中参与的基团有c 9 羰基，c 6 羟基，c 8 氢【1 3 】， 浙江大学硕j 上学位论文 4 因此对红霉素的结构改造主要在这些部位进行。 1 3 1 新型红霉素类药物发展 由于c 9 羰基是红霉素分子中唯一的一个酮基，是活性最强的基团，也是阻 断酸性水解的最好的部位。利用这个羰基进行了大量的研究工作，将c 9 羰基和羟胺 反应生成红霉素肟是人们最感兴趣的 ，】，因为通过肟可以实现红霉素分子糖苷配基 的一系列转化，其中包括烷基肟，烷氧基肟，氨基，氨基衍生物，亚氨基，羟基和 b a c h h a m a n n 重排扩环等。 1 3 2 几种新型红霉素药物 红霉素肟是d j o k i c 在1 9 6 6 年首先合成的，研究发现红霉素肟较好地改善了红 霉素的酸性稳定性，但生物活性只有红霉素本身的6 0 左右。但经过科学家四十多 年的不懈努力，最终找到了许多比红霉素更为优越的新型红霉素类药物 1 5 】。除了克 拉霉素外，还有其他一些新型红霉素药物。 罗红霉素( r o x i t h r o m y c i n ) 由法国r o u s s e l u c l a f 公司研制，1 9 8 7 年在法国首次上市，罗红霉素， 保留了红霉素原有的抗菌活性和杀菌机制，并提高了化学稳定性和 亲脂性。罗红霉素的主要适应症是呼吸道感染，也可用于治疗牙科、 皮肤软组织以及泌尿生殖道感染。罗红霉素的副反应少，不良反应主 要表现为胃肠道反应，如胃痛、恶心、呕吐、腹泻；少数人也可引起皮肤 过敏反应。该药半衰期长达12 小时，每天只需服用2 次。分子式 c 1 4 h 7 6 n 2 0 1 5 ，分子量8 3 7 0 3 ，分子结构 c i - 1 3 r o x i t h r o m c i n 4 c h 3 浙江大学顺j j 学位论文 阿奇霉素( a z i t h r o m y c i n ) 由南斯拉夫p l i v a 公司研制，19 88 年在南斯拉夫首次上市，后全球 权益转让给p f i z e r 公司。阿奇霉素具有15 元氮杂大环内酯新型的化学 结构，其抗菌谱有所扩大，除保留红霉素原有的对革兰阳性菌的作用 外，还对革兰阴性球菌、阴性杆菌以及厌氧菌有较强的作用，药物在 血中和组织中的浓度均高，半衰期长达l2 14 小时。其用法为一天1 次50 0 m g ，通常仅以3 天为一疗程。主要的不良反应为腹痛、恶心、呕吐和 腹泻等胃肠道症状，发生率约9 6 ，其次有皮疹等，多数属轻度和中度，不 必停药。分子式c 3 8h 7 2n 2 0 12 ，分子量7 4 9 0 0 ，分子结构 h 3 e l l 3 a z i t h r o m y c i c h 3 地红霉素( d i r i t h r o m y c i n ) 由b o e h r i n g e ri n g e l h e i m 公司研制，后全球权益转让给l i l l y 公司。 19 9 3 年在西班牙首次上市，本品是具有l4 元内酯环的第二代大环内酯 类抗生素。地红霉素的体外抗菌活性不如红霉素，但它对几种幽门螺 旋杆菌却有较强的活性。地红霉素在组织中的药物浓度较其血药浓度 高2 0 4 0 倍，且组织中药物半衰期大于2 0 小时，可一天1 次给药，分子 式c 4 2 h 7 8 n 2 0 1 4 ，分子量8 3 5 1 ，分子结构 浙江大学顺卜学位论文 除了这几种较为常见的二代红霉素抗生素，还包括有琥乙红霉素，氟红霉素等。 琥乙红霉素( e r y t h r o m y c i ne t h y l s u c c i n a t e ) 分子式c 4 3 h 7 5 n 0 1 6 ，分子量8 6 2 0 7 ，分子结构 o e r y t h r o m y c i ne t h y l s u c c i n a t e 6 o 浙江大学坝i j 学位论文 氟红霉素( f l ur i t h r o m y c i n ) ， 分子式c 3 7 h 6 6 f n o 分子量7 51 9 3 ，分子结构 f l u r i t h r o m y c i n 这些新型红霉素的抗菌谱及抗菌活性与红霉素相似，但具有较好的药物代谢 动力学特点：血药清除半衰期为红霉素的数倍，这样就可以达到较高的组织药物浓 度和血药浓度【1 5 】，新型红霉素的出现及他们的优越性能激起了药物化学家和医药界 对大环内酯类药物的重视和研究热潮。 在上述的新型红霉素中，克拉霉素对卡那莫拉菌军团的活性是红霉素的2 - 4 倍，对革兰氏阴性菌及厌氧菌的活性强于红霉素，对砂眼衣原的活性是红霉素的1 0 倍。并能抑制非典型分支菌，对传统大环内酯敏感菌的活性显著增强，克拉霉素对 治疗非淋球菌性尿道炎和衣原体及未知病原的宫颈炎有特效，由于它本身渗透性强， 感染部位药物浓度高，对急慢性上呼吸道感染的临床诊愈率高于9 0 【l6 】。而且安全 方便。克拉霉素的不良反应极为轻微，发生率低。主要的不良反应是胃肠道反应， 另外克拉霉素能抑制幽门螺旋杆菌，对治疗胃溃疡有特效。克拉霉素的另一特点是 它在体内的新陈代谢产物( 1 4 r ) 1 4 羟基一6 甲氧基红霉素a 的抗菌活性比克拉霉 素还要强，治疗效果进一步提高【17 】。 1 3 3克拉霉素的研制历程 克拉霉素自1 9 8 0 年发现以后的研制经历了一个漫长的历程，其中基团保护和 浙江大学倾上学位论文 选择性合成是克拉霉素的研究的关键，因此克拉霉素的研究在有机化学上成为一个 保护基团的利用和立体选择性合成的典型1 9 】。 2 0 世纪9 0 年代，在药物化学方面科学家对药物分子的构效关系已经有了较为 深入的研究，对红霉素及其衍生物的构效关系研究，发现具有以下的规律性： ( 1 )德糖胺上的二甲氨基是抗菌活性的药效团，任何改变将导致活性下降或 消失； ( 2 )克拉定糖的3 ”甲氧基和4 羟基对抗菌活性影响较大； ( 3 )红霉素的内酯环是抗菌活性的必要结构，内酯环打开，抗菌活性大幅度 下降； ( 4 ) 9 位羰基抗菌活性影响较大，还原时可使活性消失，而形成肟或以氨基 取代则可保留抗菌活性。肟羟基的醚化或酯化可增强对酸的稳定性； ( 5 ) 6 位羟基或4 羟基的烷基化合增强化合物的耐酸性，甲氧基的活性最 强，随着碳链增长，或氧烷基数目增加，抗菌活性下降。 这些规律性是在红霉素衍生物的研究中发现的，也贯穿在整个克拉霉素的研究 过程中。通过对红霉素分子结构各种修饰，在大量红霉素的衍生物中发现了6 位羟 基烷基化衍生物具有相当好的抗菌活性和酸稳定性【2 l 】。克拉霉素是在红霉素a 的6 位羟基甲基化后产物，6 位羟基的甲基化阻断了红霉素的内部环合而防止了红霉素 的降解失效，而更重要的是克拉霉素的抗菌谱，抗菌活性和药物动力学性能均有提 高，但是在红霉素分子五个羟基中的6 位羟基专属甲基化并不容易。 克拉霉素的早期合成，克拉霉素在1 9 8 0 年首次由日本的w a t a n a b e 合成，在1 9 8 2 年的日本大正制药公司申请的专利中w a t a n a b e 采用的是2 7 0 ，3 7 n 二( 苄氧羰基) n 去甲基红霉素a 一甲基化一还原甲基化一克拉霉烈l l 】。 浙江大学硕上学位论文 9 c b z = b e n z y l o x y c a r b o n y l 在这个甲基化反应中，1 1 位仲羟基的甲基化总是优于6 位叔羟基，反应的1 1 位甲 基化物是主产物，且产品中含有6 ，11 和6 ，1 2 双甲基化产物。 红霉素6 位羟基甲基化产物克拉霉素的优异性能引起了科学家们的高度重视，于 是系统地合成和比较各种红霉素的羟基烷基化衍生物，6 ，1 2 双甲基红霉素体外活性 可与克拉霉素相比，11 0 甲基红霉素活性较差，4 ”一0 甲基红霉素的抗菌活性下降。 由于红霉素分子中存在五个羟基，其中11 ，27 和4 ”位的羟基是仲羟基，而6 位和1 2 位的羟基则是叔羟基，反应活性要比仲羟基差，1 2 位羟基的反应活性最差。 因此c b z 合成路线中甲基化的方法不是选择性的，实现6 位羟基的选择性甲基化是合 成克拉霉素的关键。但这是项困难的工作，科学家进行了八年的研究才解决这个难 题。为了阻断1 1 位羟基的甲基化反应，试探将1 1 ，1 2 位羟基用碳酸乙烯酯保护起来， 这个化合物有好的体内活性，但会引起肝中毒，也尝试将11 位羟基用三甲基硅烷基 或甲氧基乙氧基甲基保护，这些保护化合物甲基化时得到的唯一产品则是6 ，9 半缩 酮 1 0 】。 于此同时，对克拉霉素中间体红霉素肟及其衍生物也进行研究 n o r c h o h 3 红霉素肟衍生物 9 浙江大学坝j j 学位论文 当用分子中没有1 2 位羟基的2 7 0 ，37 = ( 苄氧羰基) n 去甲基红霉素b 进行 甲基化时发现，6 羟基的甲基化达到8 7 的得率，6 位羟基与“位羟基甲基化的选择 性发生了逆转，得出红霉素糖菅配基的构象可能会影响甲基化的选择性。经过长期 大量的研究，科学家们终于找到了用肟的衍生物作为关键的中间体，来达到6 位羟基 选择性甲基化的途径，同时也引起对红霉素肟醚的深入研究，这些研究导致了罗红 霉素的发现。 多年的努力虽然找到了6 位羟基选择性甲基化的途径，但是用c b z 保护的2 7 d 3 7 n z ( 苄氧羰基) 去甲基红霉素a 作为原料时，存在诸多问题： ( 1 ) 在红霉素a 中大量使用氯甲酸苄酯来引入c b z 保护基，生产操作上是有一 定困难； ( 2 ) 氯甲酸苄酯刺激性强，并有毒性； ( 3 ) 引入时产生的h c i 会导致红霉素分解； ( 4 ) 脱除时产生的苯甲醇又不易除去，如不脱除但分子中37 二甲氨基和27 羟 基对抗菌活性又是必不可少的活性基团； ( 5 ) 在除去c b z 保护基后需要进行再生，比较麻烦。 经过研究，在1 9 8 7 年f a u b l 和s t e i n 用三甲基硅烷基保护红霉素肟的不同羟基 取得成功。从而为彻底解决二甲氨基的保护问题打下了基础。通过用2 氯苄基保 护肟和用三甲基硅烷基保护2 位和4 ”位羟基逐步开发成功了第一个可以工业 化生产的克拉霉素选择性合成法_ 2 氯苄基法【1 1 】。 红霉素a 1 0 c h 3 红霉素a 9 肟 浙江大学硕l 学位论文 肟醚化物 甲化物 占h 3 肟醚化硅烷化物 c h 3 克拉霉素肟 c h 3 克拉霉素 2 氯苄基法合成克拉霉素工艺路线 通过这个工艺，产品收率高，纯度好，中间体容易结晶，便于纯化。然而这个 工艺的缺点是要在p d c 的催化下氢化脱掉2 氯苄基，需要一套催化氢化装置，并使 用贵重的催化剂，成本较高，另外2 氯苄基也是对人体和环境有害的化合物 1 】。 浙江大学顺上学位论文 1 4 合成克拉霉素新方法 1 4 1 合成工艺路线 随着对红霉素a 肟醚化剂进行进一步筛选，采用了2 乙氧基丙烯来保护肟基 的羟基，同时用三甲基氯硅烷保护27 位和4 ”位羟基在生产中效果较好。并且在脱 保护基时，在酸性条件下t m s 基团很容易脱离，在乙醇溶液的回流温度下，回流l 小时乙氧基丙基可完全脱离，再用还原剂亚硫酸氢钠在酸性溶液中还原肟基。这样 在同一溶液中一次性脱除了t m s 基团和乙氧基丙基，并且同时还原了肟基，这就是 “一锅煮”脱保护法 7 】o 合成路线如下。 红霉素a 肟醚化物 肟醚化硅烷化物 浙江大学坝1 j 学位论文 甲化物 1 4 2 新合成工艺意义和研究内容 脱保护基 还原 g h 3 克拉霉素 这条克拉霉素合成方法与前面的合成路线相比具有一定优越性： ( 1 ) 2 乙氧基丙烯保护基引入和去除容易； ( 2 ) 27 和4 位引入t m s 阻断了27 和4 ”位的副反应，也防止了二甲氨基 的季胺化； ( 3 ) 6 位羟基的甲基化区域选择性高； ( 4 ) 与c b z 法相比，无需氢化再生37 二甲氨基的甲基； ( 5 ) 2 乙氧基丙烯生产工艺简单，成本较低，适合工业化生产要求。 另外，采用硫氰酸红霉素代替红霉素a 直接进行反应合成，节省了从硫氰酸红 霉素制备红霉素a 的过程，减少过程损耗。还有，在甲基化时用溴甲烷代替碘甲烷， 溴甲烷价格更低生产成本降低，并且溴甲烷分子量更小，投料量也可降低，符合绿 色化工合成要求。 在第二章中对新合成工艺过程进行介绍，并通过质谱，核磁氢谱，核磁碳谱， 红外光谱，熔点和单晶结构等数据检测，来确认合成的克拉霉素。 在第三章中对新合成工艺合成的克拉霉素的主要杂质进行分析，用合成或提取 的方法获得几种杂质，并用液质联用方法来确认杂质。 浙江大学颐：e 学位论文 第二章克拉霉素合成及数据检测 2 1 试剂与原料 表一：试剂与原料 试剂与原料规格生产厂家 硫氰酸红霉素 三乙胺 盐酸羟胺 甲醇 二氯甲烷 盐酸吡啶 2 乙氧基丙稀 咪唑 三甲基氯硅烷 d m s 0 甲基叔丁基醚 溴甲烷 冰醋酸 氢氧化钾 亚硫酸氢钠 氨水 乙醇 药用级 分析纯 工业级 分析纯 分析纯 工业级 工业级 工业级 工业级 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 工业级 分析纯 分析纯 河南天方药业 上海实验试剂有限公司 淄博中川化工有限公司 杭州化学试剂有限公司 杭州化学试剂有限公司 江苏力达宁化工有限公司 上海卓锐化工有限公司 盐城永利化工有限公司 吉林新亚强生物化工公司 上海化学试剂公司 杭州化学试剂有限公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 杭州化学试剂有限公司 宜兴卫星化工有限公司 杭州化学试剂有限公司 杭州化学试剂有限公司 2 2 实验步骤 2 2 1 肟化： 在5 0 0 m l 的玻璃反应瓶中加入1 0 0 9 硫氰酸红霉素，l o o g 甲醇，4 8 9 三乙胺， 1 4 浙江大学倾 ：学位论文 开搅拌溶清，力h 4 7 9 盐酸羟胺。用水浴缓慢升温，用8 10 小时升温至u j 6 0 6 5o c ， 在6 0 6 5 保温3 0 d , 时。水浴降温n 2 0 2 5 ，放进冰箱冷冻到( - 7 ) ( 1 0 ) 保持5 8 d , 时，用真空抽滤，滤饼用2 0g 甲醇漂洗。将滤饼加入1 0 0 0 m l 的玻璃 反应瓶中， j 1 6 0 0 9 - 二氯甲烷，j j 1 8 8 9 氨水，搅拌1 0 分钟，分出有机层，加1 7 0 m l 2 水洗两次，分层。力h 2 5 0 m l 水，开搅拌用水浴缓慢升温加热浓缩二氯甲烷， 当有白色物料析出，且内温在6 0 。c 时，用真空蒸干剩余二氯甲烷。降温至2 5 3 0 ，抽真空过滤，滤饼用1 0 0 m l 水漂洗。在真空( 一0 8 b a r ) 下控制温度不大 于9 0 。c ，烘干滤饼，要求控制水分0 3 。得7 5 3 9 红霉素肟，含量9 0 8 0 ， 收率7 5 3 。h p l c 谱图见图一。 图一：红肟h p l c 谱图 肟化反应时温度要缓慢升温，使反应缓慢进行，副反应有明显减少。在浓缩 二氯甲烷时，要控制好温度，温度偏高对物料有破坏，而温度偏低，由于二氯甲 烷残留较多，抽真空时容易引起爆沸。烘干时温度也不易过高，否则对物料有破 坏作用。 浙江大学顺l 学位论文 2 2 2 醚化硅烷化： 取3 0g 制得的红霉素肟，d i ：i3 , 5 0 0 m 1 1 拘玻璃反应瓶中，加1 5 0 9 _ 二氯甲烷，8 3 9 盐酸吡啶搅拌溶清，用冷盐水浴降温到1 3 ， j 1 1 2 乙氧基丙烯1 1 5 9 ，在1 3 1 7 保温半小时，用t l c 检测，使反应完全。继续降温到0 ，加1 1 3g 咪唑，控 制内温在0 。c 以下滴j j n l 3 7 9 = 甲基氯硅烷，加完后保温1 0 分钟。加1 0 0 m l 水，搅 拌分层，有机层加1 0 0m l 水，搅拌用1 0 n a o h 溶液调p h 值在9 1 1 ，分出有机 层。加1 0 0m l 水洗，分层，力i ：1 5 0 m l 饱和盐水分层，有机层用水浴加热浓缩二氯 甲烷，当固体析出后用真空抽干剩余二氯甲烷。控制物料水分在o 2 。 在醚化反应时，温度不能低于1 0 ，否则反应速度很慢，而又不能高于2 5 ，副反应会明显增加。硅烷化时，温度不能超过7 ，否则反应生成的热量 使温度继续升高，副反应增加。物料水分不能超过0 5 ，否则影响下一步的甲 基化反应。 2 2 3 甲基化： 加入1 4 0 9 甲基叔丁基醚，开搅拌使溶液溶清，；0 n - 甲基亚砜1 8 0 9 ，用冰 水浴降温至1 5 ，加入1 8 9 含溴甲烷3 1 7 的甲基叔丁基醚溶液。加入3 8 9 氢氧 化钾，在小于1 5 下保温3 0 分钟。) b l ：1 5 0 m l 水，分出有机层，) ) h 8 0 m l x 2 水洗两 次，用水浴加热浓缩甲基叔丁基醚，当溶液变稠状时用真空抽干甲基叔丁基醚。 温度不能超过2 0 。c ，否则反应生成的热量使温度继续升高，副反应增加。 保温时间不能超过5 0 分钟，否则副产物增加并且物料会发红。 2 2 4 脱保护还原： d i ：1 1 2 0 9 l 醇，9 9 乙酸开搅拌使物料溶解， j f l l 0 0 m l 水，2 5 9 i ! 硫酸氢钠， 用水浴加热升温在6 8 7 0 。c 保温4 d , 时。开真空减压蒸馏乙醇至有白色固体析 出。) ) 1 1 2 0 0 m l ? , 酸乙酯，4 2 9 氨水分层，力h 8 0 m l 2 7 9 洗两次。用水浴加热浓缩 乙酸乙酯，有固体析出后加1 5 0 m 1 乙醇，加热溶解，过滤。缓慢降温，室温下 抽滤，滤饼用1 0r o l e , 醇漂洗。 1 6 浙江大学顺l 学位论文 在还原反应中，反应温度偏低或反应时间不够时，肟基还原反应不完全。 反应时p h 值要控制在4 耻6 0 间，酸性偏低脱保护反应不完全，偏高对结构产生 破坏，副产物增加。 在5 0 0 m l 玻璃瓶中加入滤饼，加1 0 0 9 乙醇，加热溶解，溶清后缓慢降温， 室温下描滤，滤饼用i om l 乙醇漂洗。在真空温度8 0 下烘干滤饼。得产品 1 7 2 9 ，含量9 4 ，3 2 ，收率5 7 7 ( 叭) 。h p l c 谱图见图二。 图二：克拉霉素h p l c 谱图 其q b r t ：5 1 3 2 分峰是主峰克拉霉素。 浙江大学倾1 1 ：学位论文 2 3 克拉霉素数据检测 2 3 1 结构式 克拉霉素碳原子编号结构式 o 2 h 3 2 3 2 红外吸收光谱( i r ) 三 = c h 3 6 ” 6 c h 3 ( 1 ) 仪器型号：美国n i c o l e t 公司n e x u s 6 7 0 型f t i r 红外光潜仪 ( 2 ) 仪器校正和检定：按中国药典傅立叶变换红外光谱仪检定方法校正 ( 3 ) 样品制备方法： k b r 压片法 ( 4 ) 标准品的红外图谱见附图1 ，样品红外图谱见附图2 ，测定数据见表二 表二：红外吸收波长表 浙江大学硕，l 学位论文 ( 5 ) 样品的红外谱图与标准品的红外谱图一致，样品的红外吸收特征表明样 品分子中含有羟基，甲基，亚甲基，酮基，酯基，糖环等基团。 2 3 3 质谱( m s ) ( 1 ) 仪器型号： e s q u i r e 3 0 0 0p l u s - 0 1 0 7 3 质谱仪 ( 2 ) 测定条件：p o s i t i v ee s i ( 3 ) 样品p o s i t i v ee s i 见附图3 ( 4 ) 解析：样品的质谱图中m z = 7 4 8 4 为样品的 m + h 】+ 离子峰，质谱特征表 明该样品分子量为7 4 7 4 。与克拉霉素相符合。 2 3 4 元素分析 ( 1 ) 仪器型号：e a g e r2 0 0 ( 2 ) 测定元素：c ，h ，n ( 3 ) 测试数据见附图4 ，分析结果见表三 表三：元素分析测定表 ( 4 ) 解析：检测数据与克拉霉素相符合。 2 3 5 磁共振谱 2 3 5 1 共振氢谱 ( 1 )仪器型号：b r u k e r 公司5 0 0 兆n m r 仪 ( 2 ) 测试条件：c d c l 3 ，t m s 作内标 ( 3 ) 标准品的共振氢谱见附图3 ，样品共振氢谱见附图4 ，化学位移见表四 浙江大学硕f l | 学位论文 2 0 表四：质子核磁共振化学位移 2 0 浙江大学硕上学位论文 ( 4 ) 解析：克拉霉素样品与标准品的核磁共振氢谱相致，质子的化学位移值 与文献值一致。 2 3 5 2 共振碳谱 ( 1 ) 仪器型号：b r u k e r 公司5 0 0 兆n m r 仪； ( 2 ) 测试条件：c d c l 3 ，t m s 作内标； ( 3 ) 标准品的共振碳谱见附图5 ，样品共振碳谱见附图6 ，化学位移见表五 表五：核磁共振碳谱的化学位移 浙江大学顺t 学位论文 ( 4 ) 解析：克拉霉素样品与标准品的核磁共振碳谱相一致，碳的化学位移值 与文献值一致。 2 3 6 差热扫描量热分析( d s c ) ( 1 ) 仪器型号：d e l t as e r i e sd s c 7 ( 2 ) 检测依据：日本工业标准j i s 7 1 2 1 1 9 8 7 ( 3 ) 样品的差热扫描量热分析( d s c ) 见附图7 ( 4 ) 解析及结论： 由差热扫描量热分析( d s c ) 图谱可知样品的熔融起始温度t j m = 2 2 6 5 6 ，熔融峰温t 。= 2 2 8 3 7 。 2 3 7 克拉霉素单晶的制备及谱图 2 3 7 1 托品酮单晶制备 称取托品酮样品o 5 9 ，加入干净的5 0 m l 三角瓶中，) x 1 4 0 m le o 醇，搅拌使之 完全溶解。用盖子盖上，仅留一点小缝，在常温下放置1 5 天，当甲醇自然缓慢挥 发快干时，有大颗晶粒析出，得到托品酮单晶。 2 3 7 2 克拉霉素单晶制备 用同样方法制各克拉霉素单晶，将0 5 9 克拉霉素d n a 干- 净的5 0 m l 的三角瓶 浙江大学顺。 ：学位论文 中，力h 5 0 m l 乙腈使之完全溶解，经缓慢挥发溶剂，在常温下放置1 8 天制得克拉霉 素单晶。 2 3 7 3 克拉霉素单晶谱图 用x 射线衍射法解析单晶结构，谱图见图三。 图三：克拉霉素单晶谱图 0 3 浙江大学顺一l 学位论文 2 4 第三章克拉霉素杂质分析 3 1 红霉素肟杂质 从红霉素肟的谱图中可以发现，主峰是红霉素a ( e ) 一9 肟，分子式：c 3 7 h 6 8 n 2 0 1 3 ， 分子量：7 4 8 。结构式 n o h 谱图中的另三个主要杂质峰，其中在主峰前面的r t 3 0 8 分钟处，有一个最大 的杂质峰是红霉素a ( e ) 一9 肟的异构体红霉素a ( z ) 一9 肟，分子式：c 3 7 h 6 s n 2 0 1 3 ，分子 量：7 4 8 。结构式 h o 、 、n 在r t ：2 8 6 5 分钟处是未反应完全的红霉素a ，r t ：4 2 6 5 分钟处是红霉素f 肟， 由红霉素f 肟化产生。 2 4 浙江大学硕士学位论文2 5 3 2 克拉霉素杂质 从上面的克拉霉素图谱中可以看出，通过该合成工艺方法合成的克拉霉素主要 包括有6 个杂质，克拉霉素肟( r t ：2 6 4 6 ) ，克拉霉素肟甲化物( r t ：1 2 3 4 3 ) 及异构体 ( r t ：6 4 3 8 ) ，二甲基化物( r t ：7 7 8 9 ，r t ：8 5 9 4 ) ，克拉霉素f ( r t ：i 8 3 9 ) 。n 去甲基 克拉霉素( i h ：4 5 1 6 ) 3 2 1 克拉霉素肟： 3 2 1 1 克拉霉素肟生成及结构式 在还原反应过程中，因反应温度偏低或反应时间不够等原因引起部分克拉 霉素肟未能完全进行还原反应，使部分克拉霉素肟没有把肟基还原成羰基。在 欧洲药典的克拉霉素杂质谱中的代号杂质c ，分子式：c 3 8 h 7 0 n 2 0 1 3 ，分子量： 7 6 2 4 。结构式 n o h 3 2 1 2 克拉霉素肟合成 在5 0 0 m l 的玻璃反应瓶中加入5 0 9 克拉霉素，5 0 9 甲醇，1 2 9 = 7 , 胺，开搅拌 溶清，力h 2 6 9 盐酸羟胺，用水浴缓慢升温，用8 - 1 0 d , 时升温到6 0 6 5 。在6 0 6 5 保温3 0 d , 时。降温n 2 0 一2 5 。c ，放进冰箱冷冻到( 一7 ) 一( 1 0 ) 保持5 8 小 时，抽真空过滤。将滤饼加入5 0 0 m 1 的玻璃反应瓶中，加3 0 0 9 二氯甲烷，力a 4 0 9 浙江人学倾， ：学位论文 氨水，搅拌1 0 分钟，分层，加1 0 0 2 m l 水洗两次，分层。加1 0 0 r n l 水，开搅拌用 水浴缓慢升温加热浓缩二氯甲烷，当有白色物料析出，且内温在6 0 。c 时，开真 空蒸干二氯甲烷。降温至2 5 - - - 3 0 ，过滤，滤饼用1 0 0 m l 水漂洗。在真空下控制 温度不大于9 0 。c ，烘干滤饼，得干品3 6 7 9 ，含量8 1 7 。取1 0g 干品用丙酮：甲 醇比1 ：3 的混合液作流动相，在5 0 c m 的硅胶柱做层析分离，得克拉霉素肟4 9g ， 含量9 5 3 。 3 2 2 克拉霉素肟甲化物： 3 2 2 1 克拉霉素肟甲化物生成及结构式 在第二步用2 乙氧基丙烯保护红霉素肟基时反应不完全，有部分红霉素肟 没有进行肟基的醚化保护反应，使在接下来的第三步甲基化反应时，在红霉素 肟基上进行甲基化而得产物。在上面对红霉素肟进行杂质分析时，有个红霉素 a 一9 ( e ) 肟异构体，因此在甲基化后也有异构体，他们在欧洲药典的克拉霉素杂 质谱中的代号分别为杂质g ，杂质o 。分子式：c 3 9 h 7 2 n 2 0 1 3 ，分子量：7 7 6 5 。 结构式 o c h 3 n 杂质g 2 6 浙江大学硕l 学位论文 h 3 c o 、 n 杂质0 在肟基醚化保护时，当醚化反应不够完全时，g 杂质含量会明显增加。见图四， 可以发现g 杂质增加。 图四：g 杂质h p l c 谱图 浙江大学硕上学位论文 3 2 2 2 克拉霉素肟甲化物合成 取2 0g 。c f _ 霉素肟，加入5 0 0 m l 的玻璃反应瓶中，1 0 0 9 _ 二氯甲烷，降温n o ，加7g 咪唑，控制内温在0 。c 以下滴加7 5 9 - - - 甲基氯硅烷，加完后保温1 0 分 钟。加1 0 0 m l 水，搅拌分层，有机层加1 0 0m l 水，搅拌用1 0 n a o h 溶液调p h 值 在9 1 l ，分层。加1 0 0m l 水洗，分层，；0 h 5 0 m l 饱和盐水分层，有机层用水浴加 热浓缩二氯甲烷，当固体析出后用真空抽干二氯甲烷。控制水分在0 2 。 加入9 0 9 甲基叔丁基醚，开搅拌溶清，加二甲基亚砜1 2 0 9 ，用冰水浴降温 至1 50 c ，加入1 2 9 含溴甲烷3 1 7 的甲基叔丁基醚溶液。3 h x 2 1 9 氢氧化钾，在 小于1 5 下保温3 0 分钟。办l ：1 5 0 m l 水，分层，力h 5 0 m l 2 水洗两次，用水浴加热 浓缩甲基叔丁基醚，当溶液变稠状时用真空抽干甲基叔丁基醚。 加8 0 9 乙醇，6 9 l 酸开搅拌溶解，j j l 5 0 m l 水，1 6 9 n 硫酸氢钠，用水浴加热 升温在6 8 7 0 保温4 d , 时。开真空减压蒸馏乙醇至有白色固体析出。j j h 2 0 0 m l 乙酸乙酯，3 0 9 氨水分层，力h 5 0 m l x 2 水洗两次。用水浴加热浓缩乙酸乙酯，有 固体析出后抽干乙酸乙酯。用丙酮：乙醇比1 ：5 的混合液作流动相，在5 0 c m 的 硅胶柱做层析分离，得克拉霉素肟甲化物5 3 9 ，杂质g 含量9 1 5 ，杂质o 含量 4 5 。杂质g 质谱图见图五，杂质o 质谱图见图六。 图五：杂质g 质谱图 i，譬。 |i； | 4