（分析化学专业论文）单细胞中氨基酸及γ干扰素的分析.pdf

山东大学博士学位论文 中文摘要 本文第一章首先对毛细管电泳( c e ) 的基本原理进行了简单的介绍。其次 对c e 激光诱导荧光( l i f ) 检测单细胞分析进行了详细的综述。这一部分涉及到 c e - l i f 检测中激光器的构成及选择原则、天然荧光单细胞分析、化学标记荧光法 单细胞分析、间接荧光法单细胞分析、催化荧光法单细胞分析。并对单细胞分析 中涉及的其它检测的手段进行了简单介绍。本章共引用文献9 l 篇。 第二章中我们采用了细胞电穿孔的方法强制将衍生试剂异硫氰酸盐( f i t c ) 导入血红细胞中，进行细胞内的衍生反应，以减少氨基酸在测定过程中的稀释。 同时采用高分离效率的c e 和高灵敏度的l i f 检测方法，解决了单个人m 红细胞 ( 8i x m ，人最小细胞) 中氨基酸( 含量1 0 1 7m o l 以下) 的检测这个难度较大的问 题。我们共检测到了单个细胞中的a r g 、l y s 、t r p 、a s h 、s e r 、a l a 、c y s 、g l y 和 g l u 九种氨基酸，其含量为3 8 4 3 2 4 x1 0 1 。t o o l 。 第三章中我们采用非竞争免疫方式的毛细管电泳免疫分析( c e i a ) l i f 检测 测定了细胞因予：三种形式的重组人类7 干扰素( i f n 丫) 。实验中以过量的f i t c 标记的抗i f n _ 丫单可隆抗体( a b * ) 与待测物i f n o y ( a g ) 反应，反应后的混合 物经毛细管电泳分离后可以检测到三个复合物a b * a g 的峰。质量检测限为：2 , 4 x t 0 - 2 1 3 2 1 0 2 1m o l 。相对标准偏差分别为：1 4 - 1 6 。应用该方法对n k 细胞 提取液进行了检测，回收率在9 5 1 0 3 之间。所得结果与临床酶联免疫 ( e l l s a ) 的检测结果一致。 第四章和第五章中我们提出了一种新的测定单细胞中抗原的方法，即毛细管 电泳柱上免疫或细胞内免疫l 1 f 检测单细胞方法。在柱上免疫反应中，我们将用 毛地黄皂苷预穿孔后的啦个n k 细胞采用电渗的方式导入到分离毛细管的前端， 然后采用压力进样向毛细管前端导入f i t c 标记的抗i f n y 的单克隆抗体的p b s 溶液，使其包围在单细胞周围，再用超声波将单细胞溶膜，进行免疫反应。在细 胞内免疫反应中，我们采用电穿孔技术将f i t c 标记的抗i f n y 的单克隆抗体导 入到n k 细胞中，进行免疫反应。再用毛地黄皂苷对n k 细胞预穿孔及超声波将 单细胞溶膜后。用c e 分离和l i f 检测实现了单个n k 细胞中两种糖基化形式i f n y 的分离检测。 第六章中研究出了一种细胞表面免疫反应连续测定单细胞中抗原的方法，克 服了常用的单细胞分析中的缺陷( 如：人工单细胞进样、溶膜、检测的费时和复 山东大学博士学位论文 杂流程，低的分析速度。) 。我们提出的方法是用毛地黄皂苷对n k 细胞膜穿孔2 5 r a i n ，使细胞内i f n - y 的活性段伸出细胞外，与f i t c 标记的抗i f n y 的单可隆抗 体反应，在细胞表面形成抗体抗原复合物。然后将这些细胞连续迁移导入毛细管 中并用l i f 检测。在细胞不溶膜的情况下，实现了单个n k 细胞内全部i f n - 7 的 连续检测。在4 0 分钟内共检测了3 7 个细胞。该方法不仅简化和加速了细胞内超 痕量组分的检测，而且易于实现自动化，有利于将单细胞分析用于生命科学及医 学的实际应用。 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t i nt h ec h a p t e roneo ft h i sd i s s e r t a t i o n ，f i r s to fa l l ，t h ep r i n c i p l eo fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) w a si n t r o d u c e db r i e f l y s e c o n d l y ，t h ed e t m lr e v i e wo fa n a l y s i so f s i n g l ec e l lu s i n gc ew i t hl a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sd e l i v e r e d t h e s t r u c t u r ea n ds e l e c t i o nr u l eo ft h el a s e re q u i p m e n t ，a n a l y s i so fs i n g l ec e l lw i t hn a t i v e f l u o r e s c e n c e ，d i r e c ta n di n d i r e c tl i fd e t e c t i o nw e r ei n v o l v e d o t h e r st e c h n i q u e si nt h e s i n g l e c e l la n a l y s i sw e r ea l s oi n t r o d u c e d i nt h i sc h a p t e r , 9 1r e f e r e n c e sh a v eb e e n r e f e r r e d i nt h ec h a p t e rt w o ，w ed e v e l o p e dan o v e lm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fa m i n oa c i d s ( a a s ) i na l li n d i v i d u a lh u m a ne r y t h r o c y t ew i t hc e l i fd e t e c t i o n i nt h i sm e t h o d ， f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) w a si n t r o d u c e di n t ot h eh u m a ne r y t h r o c y t e sb y e l e c t r o p o r a t i o ni n o r d e rt od e r i v a t i z ea a s t h e n ，a a si n s i n g l ee r y t h r o c y t e sw a s d e t e r m i n e dw i t hc ea n dl i fd e t e c t i o n n i n ea a s ( a r g ，l y s ，t r p ，a s n ，s e r , a l a ，c y s ， g l ya n dg l u ) a sl o wa s3 8 4 - 3 2 4a l n o lw e r eq u a n t i t a t e d i nt h ec h a p t e rt h r e e ，am e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no ft h r e ef o r m so fr e c o m b i n a n t h u m a ni n t e r f e r o n - ) , ( i f n - ) , ) w e r ed e v e l o p e db a s e do nan o n c o m p e t i t i v ef o r m a tw i 山 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e t i ci m m u n o a s s a y ( c e i a ) a n dl i fd e t e c t i o n a ne x c e s sa m o u n to f a n t i i f n ym o n o c l o n a la n t i b o d yl a b e l e dw i t hf l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) ( a b + ) r e a c t e dw i t hi f n y ( a g ) a f t e rt h ec o m p l e t i o no ft h ei m m u n o r e a c t i o n ，t h ec o m p l e x ( a b * - a g ) a n df r e ea b + w e r es e p a r a t e db y ( c e ) t h r e ep e a k so fa b + 一a g ( c o r r e s p o n d i n g t ot h r e ef o r m so fi f n - ) , ) a n donep e a ko ff r e ea b + w e r eo b t a i n e d t h el i n e a rr a n g e sf o r t h et h r e ef 0 1 t n so fi f n vw e r ef r o m3 5 1 0 。1 3t o1 1 1 0 一m o l l f r o m2 9 l o 3t o 3 8 1 0 一”m o l la n df r o m2 5 1 0 1 3t o6 0 x1 0 一“m o l l r e s p e c t i v e l y , a n dt h em a s s l i m i t so f d e t e c t i o n w e r e3 2 1 0 。2 1 m 0 1 2 7 1 0 。2 1 m o la n d2 4 1 0 。 m 0 1 r e s p e c t i v e l y t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no ft h em e t h o dw a sb e t w e e n1 4 1 6 a n dt h er e s u l tf o r a n a l y s i so f e x t r a c t i o no f n kc e l lw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ev a l u ed e t e r m i n e dw i t he l l s a i nt h ec h a p t e rf o u ra n df i v e ，an o v e lm e t h o df o ra n a l y s i so ft h ea n t i g e n si ns i n g l e c e l l sw a sp r e s e n t e d ，t h a ti st h em e t h o do fo n - c o l u n mi m m u n o r e a c t i o no ri n t r a c e l l u l a r i m m u n o r e a c t i o nw i t hc e l i fd e t e c t i o n f o ro n c o l u m ni m m u n o r e a c t i o nf o r m a t ，a s i n g l en kc e l lp r e - p e r f o r a t e dw i t hd i g i t o n i nw a se l e c t r o o s m o t i c a l l yi n t r o d u c e di n t ot h e f r o n te n do ft h ec a p i l l a r y , t h e nt h ep b ss o l u t i o nc o n t a i n i n ga n t i i f n ym o n o c l o n a l 山东大学博士学位论文 a n t i b o d yl a b e l e dw i t hf i t cw a si n t r o d u c e di n t ot h ec a p i l l a r ye n dd y n a m i c a l l ya r o u n d t h ec e l l a f t e rt h ee e l lw a sl y s e db ys o n i c a t i o n ，i m m u n o - r e a c t i o np r o c e e d e do n c o l u m n f o ri n t r a c e l l u l a ri m m u n o r e a c t i o nf o r m a t ，a n t i i f n 叫m o n o c l o n a la n t i b o d y1 a b e l e dw i t h f i t cw a si n t r o d u c e dj n t ot h en kc e l l sb ye l e e t r o p o r a t i o nf o rj m m u n o r e a c t i o nt h e na s i n g l en kc e l lw a se l e c t r o o s m o t i c a l l yi n t r o d u c e di n t ot h ec a p i l l a r ya f t e rt h ec e l lw a s p r e p e r f o r a t e dw i t hd i g i t o n i n ，t h ec e l lw a sl y s e db ys o n i c a t i o n t w og l y c o f o r m so fi f n yi ns i n g l en kc e l l sw e r ed e t e r m i n e dw i t hc es e p a r a t i o na n d l i fd e t e c t i o n i nt h ec h a p t e rs i x ，c o n t i n u o u sc e l li n t r o d u c t i o nt oa n a l y z ei n t r a c e l l u l a ra n t i g e n sb y c e l i fd e t e c t i o na f t e ri m l l u n o r e a c t i o no nt h ec e l ls u r f a c ew a si n v e s t i g a t e d n kc e l l s w e r ep r e p e r f o r a t e dw i t hd i g i t o n i nf o r2 5m i n t h ea c t i v es e g m e n t so fi f n vm o l e c u l e s i n s i d et h ec e l l sr e a c ho u t s i d e sa n dr e a c tw i t ht h ea n t i i f n vm o n o c l o n a la n t i b o d i e s l a b e l e dw i t hf i t ct of o r mt h ea n t i b o d y a n t i g e nc o m p l e x e so nt h ec e l ls u r f a c e t h e n ，t h e c e l l sw i t ht h ec o m p l e x e so nt h es i l l f a c ew e r ec o n t i n u o u s l yi n t r o d u c e di n t ot h ec a p i l l a r y a n da n a l y z e dw i t hc e - 【。i fd e t e c t i o n 3 7n kc e l l sw e r ea n a l y z e dw i t h i n4 0m i n k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a m i n oa c i d s ，f l n o r e s c e i nl s o t h i o c y a n a t e c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e t i ch n n a u n o a s s a y , i n t e r f e r o n 吖，n kc e l l s ，s i n g l e c e l la n a l y s i s 原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何j c 他个人或集体已经发表或撰写过的利研成果。剥本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：鲞垒日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影e 1 j 、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：j 盘霉一导师签名：堡鳖h期：至丝羔与生 山东大学博士学位论文 a b ：抗体 a g ：抗原 a l a ：丙氨酸 a r g ：精氨酸 a s n ：天冬酰胺 a s p ：天冬氨酸 c e ：毛细管电泳 c e i a ：毛细管电泳免疫分析 c y s ：半胱氨酸 c z e ：毛细管区带电泳 f i t c ：荧光素异硫氰酸盐 g i n ：谷氨酰胺 g l u ：谷氨酸 g l y ：甘氨酸 h i s ：组氨酸 i f n y ：y 干扰素 l i e ：异亮氨酸 l e u ：亮氨酸 l i f ：激光诱导荧光 l o d ：检测限 l y s ：赖氨酸 m e t ：蛋氨酸 p b s ：生理缓冲液 p h e ：苯丙氨酸 p r o ：脯氨酸 s e r ：丝氨酸 t h r ：苏氨酸 t r p ：色氨酸 符号与缩写 t r y ：酪氨酸 v a l ：缬氨酸 山东大学博士学位论文 第一章单细胞的毛细管电泳分析 毛细管电泳概况 电泳( e l e c t r o p h o r e s i s ) 是指溶解在或悬浮在电解液中的带电粒子，在外加电 场的作用下带正电的粒子向阴极迁移，带负电的粒子向阳极迁移这一现象。电泳 作为一种分离技术，在2 0 世纪3 0 - - 4 0 年代得到较快发展。但是传统的电泳技术 受焦耳热限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，分离效率低， 分离度也受到严重制约。毛细管电泳的出现改变了这种状况。毛细管电泳( c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 的发展可以追溯到2 0 世纪6 0 年代。为了克服传统电泳技术 的焦耳热效应，h j e r t e n 【1 】于1 9 6 7 年采用窄孔径管在高电场下进行自由溶液电泳 分离，这可谓c e 的前身。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 2 - 4 】采用区带电泳技术， 用7 5l a m 的熔硅毛细管分离月酰化氨基酸，理论塔板数超过4 0 0 0 0 0 m ，获得前所 未有的极高的理论塔板数( 柱效) 和十分快速的分离，开辟了窄孔径c e 技术发 展的新途径。 c e 技术是离子或荷电粒子在电场作用下，在毛细管中按其淌度和分配系数 不同进行高效、快速分离的一种电泳技术。在毛细管和电极槽内充有相同组分和 相同浓度的电泳缓冲溶液，在电场驱动下，根据离子或荷电粒子荷质比的不同以 达到分离的作用。这就是应用广泛的毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) ，也称为自由溶液电泳( f r e es o l u t i o nc a p i l l a r y e l e e t r o p h o r e s i s ，f s c e ) 。样品从毛细管进样端导入，当毛细管两端加上一定的电 压后，荷电溶质便朝与电荷极性相反的电极方向移动。同时，在毛细管内壁与缓 冲液接触的界面上由于毛细管内壁硅羟基的电离形成双电层，导致毛细管内的溶 液在外加电场的作用下整体朝一个方向运动，即电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w e o f ) 现象。通常情况下，电渗流的速度比电泳的速度大5 。7 倍，因而在c e 中 利用电渗流可推动正、负离子和中性分子一起朝一个方向移动，而正、负离子的 迁移速度是电泳和电渗速度的矢量和。由于样品组分阃的淌度不同，它们的迁移 速度不同，因而经过定时间后，各组分将按其速度大小顺序，依次到达检测器 被检出，得到按时间分布的电泳谱图。用谱峰的迁移时间( ，。) 作定性分析，按 其谱峰的高度( ) 或峰面积( 彳) 作定量分析。毛细管电泳的进样体积非常小， 一般在n l 级，样品用量少。而且毛细管电泳具有高效、快速等优异的特点。另 外，毛细管电泳还有分离模式多样，分析样品对象可从无机离子到生物大分子， 容易自动化，操作简便，溶剂消耗少，环境污染小等优点。矿因为c e 技术具有 其特有的优点，使它在短短几十年中，特别是在最近十几年，受到了分离分析科 i l i 东人学博，i ：学位论史 学家的极大关注成为生物化学和分析化学中最受瞩目、发展最伙的一种分离分 析新技术。 1 2 毛细管电泳单细胞分析 一切有机体都由细胞构成，细胞是生命活动的基本单位。细胞具有独立的、 有序的自控代谢体系，是代谢与功能的基本单位，它能提供生命信息非常多。过 去由于很难获得单个细胞中的化学信息而仪限于组织或细胞群体的水平，这使生 命科学的发展受到限制。有关单个细胞的化学组分的信息研究将使人们能更好地 了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，更深入地认识细胞差异、细j 胞问通讯、神 经递质及药物或毒物刺激的生理影响。单细胞内组分十分复杂，细胞极小( 直径 7u m 2 0 0 u m ，体积在几n l 之间) ，细胞内组分均为超痕量( z m o l n 1 1 0 1 ) 的。 因而单细胞水平的研究极具有挑战性。直到上世纪9 0 年代单细胞的研究j 取得 较大的发展。在这一过程中，人们一直在改进和完善这一技术，以达到同时测定 多种化合物，并能给出良好的定性定量结果。 在毛细管电泳出现之前，已有其它一些技术用于单细胞分析，包括伏安微电 极法 5 】，荧光图象技术【6 】，微型凝胶电泳 7 】，微型薄层色谱法 8 】，微型玻 管电极法f 9 】，光电显微技术 1 0 】。虽然这些分析技术已能进行单细胞分析，但 多少存在定的缺陷，比如灵敏度不高、定量不准或很难测定样品中多种成分。 8 0 年代发展起来的开管液相色谱和c e 分离方法因需样品量少并有高分离度等优 点，特别适用于多种组分测定和定量，并已成功地用于单细胞多组分的定量检测。 其中，c e 技术自身因具有如下独特优点很适宜单细胞分析： ( 1 ) 非常小的进样体积。动物细胞直径约l o 3 0l l i n ，体积约0 5 1 4p l ( 按球 形估算) ，胞内物质的含量一般在f i a o l - z m o l 水平。只有降低操作中胞内物质的稀 释才能达到检测的目的。气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h ，g c ) 和液相色谱( l i q u i d c h r o m a t o g r a p h ，l c ) ，对单细胞进样操作将导致至少10 6 倍的稀释，这种浓度稀释 任何灵敏的检测器也弥补不了。对于开管液相色谱中内径3 0 0t x m 的液相色谱柱， 与c e 中5 2 5i - t m 内径的石英毛细管相比，前者的稀释将是后者的1 0 0 0 t 0 0 0 0 倍。 毛细管电泳的进样体积一般在n l 级或更少，可以降低操作中胞内物质的稀释， 这对于单细胞的分析是至关重要的一点。 ( 2 ) 高分离效率。在典型的c e 中，不需要特别的努力，就可获得理论塔板 数1 0 0 0 0 0 的高分离效率。这对于胞内组分复杂、种类众多的单细胞分析是非常 重要的。 2 坐奎叁竺竖主兰垒迨塞 ( 3 ) 高分离速度。毛细管比表面积大，散热效果好，在电泳分离时可旌加极 高的电压，通常只需几十秒至几十分钟完成分离。快速分离意味着商流通量、高 效率。 ( 4 ) 生物适应性环境。在c e 中常用的以水溶液为主的缓冲体系，p h 值的 变化范围较宽，这与生物环境相适应。尽管在c e 中，p h 值是分离的一个重要参 数，通过精心设计，c e 将有可用于活体细胞的在体分析和在生物环境中的在线 分析。 ( 5 ) 可操作性强。目前，用于单细胞分析的常是自制的设备，这种设备在细 胞的进样过程中表现出非常好的灵活性和操作性。尽管目前已商品化毛细管电泳 仪在单细胞分析中还存在一定的不足。一旦开发出单细胞进样装雹，单细胞的分 析就能做到象目前用于d n a 的分析的毛细管阵列电泳一样，多通道，连续的毛 细管阵列电泳用于单细胞分析，同时分析大量单细胞，这也是优于g c 或l c 的 地方。 ( 6 ) 低成本，低消耗。在c e 中，对于缓冲液、添加剂、待测样品、标话试 剂的需要量极少，石英毛细管柱也相应便宜得多。这是g c 、l c 无法比拟的。目 前发展的毛细管芯j 电泳技术使c e 正向着微型化、规模化发展。这也是其它色 谱技术无法做到的。 毛细管电泳的上述特点，决定了其在单细胞分析中的独特优势。单细胞的分 析是一项挑战性的工作，自从它出现以来，给人们提出了许多问题，比如单细胞 胞内物质的衍生、电泳分离后的检测、胞内物质的定量等等。在单细胞的分析研 究过程中，人们一直在解决新闯题，探索新方法，完善已有的分静亍技术。目前， 对毛细管电泳单细胞分析已有几篇综述报道【1 1 1 6 1 ，其涉及的问题各有偏重。 从单细胞分析检测技术上来看，由于单细胞内组分的含量非常少，一般在f m o l 至z f l l o 的范围内，这就要求用于c e 的检测器的灵敏度至少能达到f m o l ，因此高 灵敏度的检测器是c e 进行单细胞分析的关键。c e 单细胞分析的检测技术很多， 紫外检测【1 7 】、放射化学检测【1 8 】、质谱检测【1 9 】虽已有报道，但常用于单细 胞多组分分离剐定犀检测的丰要宵电化学检测( e d ) 承l 激光诱导荧光( l i f ) 检 测。对c e e d 的单细胞分析状况，在董谦和翁前锋的博士论文中已有详细的介 绍，本章只对c e - l i f 检测的单细胞分析进行阐述。并列毛细管电泳单细胞分析 中涉及的问题以及单细胞分析的最新进展进行综述。 山东大学博士学位论文 1 2 1 单细胞分析的激光诱导荧光检测 近年来，激光诱导荧光( l i f ) 检测器作为一种高灵敏度的高效液相色谱和 高效毛细管电泳检测器在测定生物体中超痕量生物活性物质得到广泛的应用 冽。与其它现有的检测方法相比激光诱导荧光检测器具有最高的灵敏度( 表1 - 1 ) 2 l 】。它主要由激光器( 光源) 、光学系统( 光学透镜、滤光片) 、检测池及光检测 器件组成，现分别加以说明。 ( 1 ) 激光器。激光器的选择原则有：激光发射波长必须与所分析的组分 的吸收波长相适应。激光器要有良好的空间模式和空间指向性。激光器要 有稳定的功率。目前，激光诱导荧光检测器主要有：h e c d 激光器、a r 离子激光 器、融离子激光器、h e n e 激光器、半导体激光器等。a r 离子激光器输出功率 稳定、价格合理，其主要输出波长为4 9 9 n m 和5 1 4 n m 。半导体激光器的输出也较 稳定，使用寿命长，但是商品半导体激光器发射波长多在远红外区，在此范围内， 很难找到与其相适应的衍生试剂。 ( 2 ) 光学透镜。l i f 检测中所用透镜分为激光透镜和荧光采集透镜。激光透 镜的作用是将激光束准确地聚焦到检测窗口上。荧光采集透镜的作用是采集荧 光，它对检测的灵敏度影响较大。透镜的孔径越大其采光效率越高，然而孔径大 的透镜其焦距很小，给检测器设计带来一定的空间阻碍。 ( 3 ) 滤光片。其作用是消除散射光对荧光检测的干扰，其位置一般置于采 集透镜之后。 ( 4 ) 测光元器件。可采用光电倍增管、二极阵列检测器和电耦合器件，其 中以光电倍增管的应用最为普遍。 l i f 检测是通过将激光光束在毛细管内聚焦成很小的光斑作为检测笛l 一实小 的( 图1 - 1 ) 。l i f 检测具有很高的灵敏度，检出限已达到分子水平y m o l ( 1 0 。2 4 m 0 1 ) ， 但通常其检出限在a m o l z m o l 范围内，并已用于检测单个乳酸脱氢酶分子 2 2 】 和单个藻红素分子2 3 。c e 与l i f 检测相结合，兼有高分辨和高灵敏度的特点。 波长分辨激光诱导荧光法可以同时检测分析物区带的荧光发射光谱，因而可以对 迁移时间相近的谱带具有定性的能力【2 4 】。激光诱导荧光法又可分为天然荧光 法，化学标记荧光法，问接荧光法和催化荧光法。 1 2 1 1 天然荧光法单细胞分析 激光诱导荧光法可以直接应用于具有天然荧光的物质。具有天然荧光的物质 4 山东大学博士学位论文 主要包括一些蛋白质和儿茶酚胺类物质。到目前为止，c e 天然荧光法单细胞分 析的研究共涉及到四种细胞( 人类血红细胞、胰腺p 细胞、肾上腺嗜铬细胞和肥 大细胞) 。 表1 - 1 各种毛细管电泳检测器浓度检测灵敏度 检测方式 检测灵敏度( t o o l l ) 检测方式 检测灵敏度( m o i ，l ) 直接吸收法1 0 l 1 0 4 电导检测 1 0 一l o 7 间接吸收法 i o 。一l o 电化学检测 1 0 - 8 一1 0 一 普通荧光 1 0 。l l o 8 放射化学法 l o 。9 _ 1 0 m 激光诱导荧光 1 0 。9 一1 0 “ 化学发光 l o 。乙1 0 - s 问接荧光l o 6 _ l o 一7 光电倍增管i 图1 - 1 双波长激光诱导荧光检测示意图 管2 1 2 1 1 1 人类瓶红细胞中的蛋白质 人类而红细胞中含有1 0 0 多种蛋白质【2 5 】。其中血红蛋白a 。( h b a 。) 和碳 酸脱氢酶( c a h ) 的含量较高，分别为4 5 0a m o l c e l l 和7a m o l c e l l 。l e e 等2 6 1 采 用l i f 检测天然荧光技术测得h b a o 和c a h 的电泳图示予图1 2 。采用内径2 0p s n ， 有效长度6 4c r n 的毛细管，5 0m m o l l 的硼砂( p h9 1 ) 缓冲液，激光波长为2 7 5 4 n m ，检测h b a o 和c a h 的检测限( 剐n = 2 ) 分别为8a m o l 和o 2a m o l ， 山东大学博士学位论文 测得单个血红细胞中的平均含量分别为o 4 7f m o l 和5a m o l 。图中峰b 为高铁血 红蛋白的峰。高铁血红蛋白的存在是由于红细胞在存放过程中，亚铁血红素中的 f e 2 + 被空气中的氧氧化成f c 3 + 而产生的。细胞中h b a 。和c a h 含量的高低与细胞 的活性有直接的关系。 星 量 童 t i m e ( r a i n ) 图l - 2 人类血红细胞中血红蛋白a o 和碳酸脱氢酶电泳幽。 峰a 和c 分别为血红蛋白a o 和碳酸脱氢酶的峰。 人类血红蛋白的分子量大约为6 55 0 0 。成年人的h b a 。由两个旺f j 二聚体构成 ( c t ：p ，) ，并占总血红蛋白成分的9 0 2 7 】。然而基因的变异会导致二聚体中一个 或两个血球链中的蛋白质氨基酸序列中一个或多个氨基酸的不同。其它的变异体 如：h ba 。就是由后转录变异而产生的【2 7 】。事实上，h b a 。占正常m 红细胞中 总血红蛋白的大约5 ，其与h b a 。的不同在于h b a 。中的每个p 链中n 术端缬 氨酸上联有一个葡萄糖分子 2 7 】。有许多血红蛋白病就是通过检测血红蛋白变异 体来诊断的，例如贫血症的血红细胞中存在h b s 【2 8 】；i s - 地中海贫血症的血红细 胞中h b a ：的量升高 2 9 】；h b a ，。中在未经治疗的糖尿病症的血红细胞中含量高于 正常值的二到三倍，它的检测有助于长期的血糖控制【3 0 ! 。另外，h ba 。的检测 还可以测定细胞年龄。l , i l l a r d 等【3 l 】采用内径为2 0 1 1 1 1 ，订效k 艘为6 4c n l ，碳 氟化合物修饰的毛细管，5 0m m o l l 的磷酸盐和0 0 5 ( w v ) 的碳氟化合物表面 活性剂( p h2 7 ) 为缓冲液，激光波长为2 7 5 4n m ，采用天然荧光技术测得人类 正常血红蛋白变异体的电泳图示于图1 3 。采用碳氟化合物修饰的毛细管可有效 6 山东大学博士学位论文 地降低蛋白质在毛细管内壁上的吸附，d 链和a - 链的半峰宽分别为o 0 9m i n 和o 0 6 m i n 。分离缓冲液中表面活性剂的存在可使血红细胞溶膜并使蛋白质变性，多肽 链解离。同时分离缓冲液可将亚铁血红素中的f e 2 + 氧化成f e ”。图1 3 中峰1 为b 一 链：峰2 为糖基化的b 链；峰3 为a 一链；峰4 糖基化的0 【一链。采用相同的技术检 测糖尿病人单个血红细胞中h b ( a = a l a + a ，b + a 1 c ，这些变异体的p 链n 端均是糖 基化的) 的电泳图示于图1 4 。与图1 3 相比，峰2 和4 明显增大。并可确定6 - 年口 仳的糖基化部分分别占3 0 和1 2 。 l i m e ( m l n ) 图1 - 3 人类正常血红细胞中血红蛋白的电泳图。 峰：l = b - 链：2 = 糖基化的1 3 链：3 = g t - 链；4 = 糖基化的c t 链。 t i m e ( m i n ) 图1 - 4 糖尿病人单个血红细胞中血红蛋白的电泳图。 峰：1 _ b - 链；2 = 糖基化的1 3 - 链；3 = 值- 链：4 = 糖基化的o 【链。 e。景iog虻篆一叱 83u8蜜g匠蔷一卓m l u 东大学博士学位论文 毛细管电泳等点聚焦( c i e f ) 是一种具有高效分离的c e 模式。采用c l e f 模式，可根据两性物质( 例如：蛋白质) 的等电点( ) 进行分离。这一分离技 术的非常适合血红蛋白( h b ) 变异体的检测。l i l l a r d 等 3 2 】采用改进的c l e f 技术和天然荧光检测测得单个血红细胞中的血红蛋白变异体的电泳图示于图1 5 。由于采用了阳极液、阴极液和载体两性介质( 甲基纤维素) ，基线的波动减小， 检测灵敏度得到提高；并且聚焦带的运动是通过电渗流来带动的，分离和检测可 以一步完成。毛细管先充入两性溶液，细胞( 或标准品) 进样到毛身i l 管中，单细 胞的进样体积为9 0f t 。分别检测了成人( f 常的和a 增高的) 、病人( 杂合的) 和胎儿的血红细胞，对其中的h b a 。、h b a l c 、h b s 和h b f 进行了定量。p i i 梯度 的线性相关系数为o 9 9 8 4 ，这足可以尝试分离h b f ，如果变异体的p ，有0 0 2 5 的微小差别就可通过c l e f 技术进行分离。 t i m o r a i n ) 图1 - 5 胎儿单个血红细胞中血红蛋白的电淋图。 峰：l = h b f ；2 = h b a o 。 1 2 1 1 2 胰腺细胞中的胰岛素 胰岛素是胰j l l a l 3 - 细胞中的重要荷尔蒙，其作用是调节葡萄糖的代谢。m 液中 葡萄糖浓度的升高会刺激胰腺d - 细胞分泌胰岛素。为了保持m 液l i _ _ i 葡萄糖的l f 常 水平，分泌的胰岛素通过血液循环被转移到肝脏当中，并通过肝脏将葡萄糖转化 为糖原。细胞- 中缺乏腴岛素不仅影响到葡萄糖的浓度而且影, q ；j n 胞j e 常活动的内 oc由。sijoni蛰蒜一o 山东大学博士学位论文 分泌区域【3 3 】。几乎完全缺乏胰岛素( i 型) 或1 3 细胞胰岛素分泌异常( i i 型) 是自发糖尿病的特征。在单细胞水平上检测胰岛素能够提供胰岛素成分的变化和 分泌行为以及细胞间关系的特有信息，使我们能够更加了解糖尿病，为糖尿病的 更好治疗提供可能。t a o 【3 4 】等采用在线竞争免疫分析l i f 检测，分析了胰腺p - 细胞胰岛中的胰岛素，由于灵敏度不够而没有进行单细胞分析。 采用c e 分离蛋白质过程中一个主要的问题是蛋白质在毛细管内壁上的吸附。 蛋白质吸附会造成峰的展宽和电渗流的改变。非键合的聚乙烯基氧化物( p e o ) 修饰的毛细管可用于蛋白质的分离【3 5 1 ，并用于胰岛素的分离检测【3 6 ，检测限 可达到7 3a m o l ( s n = i o ) 。t o n g 等 3 6 】采用p e o 修饰的毛细管和未经修饰的毛 细管，天然荧光技术分析检测了单个r i n m 5 f 和1 3 t c 3 细胞。然而采用p e o 修饰 的毛细管分析单细胞存在许多问题。第一，r i n m 5 f 细胞和1 3 t c 3 细胞非常坚硬， 不能通过渗透压的方式川分离缓冲液将细胞溶膜并释放f f ；j 地内们胰岛索；第= ， 出于修饰的毛细管的内壁是中性的，进样的细胞不能吸附到毛细管的内壁上，因 而采用溶膜溶液或其它的方式进行溶膜不容易实施。由以上所述可以看出，虽然 p e o 修饰的毛细管有利于胰岛素的分离，但未经修饰的毛细管更有利于分析检测 了单个细胞。当细胞被导入到未经修饰的毛细管后，将毛细管的进样端移入到含 有o 0 5 s d s 和分离缓冲液池中，s d s 通过电渗的方式进入到毛细管的进样端溶 解细胞。细胞溶膜后，将毛细管的进样端移回到分离缓冲液中进行分离检测。图 1 - 6 是单个l y r e 3 细胞的电泳图。图中的最大的峰是由于s d s 的进样时间较长( 2 7 m i n ) 造成的，但该峰与胰岛素的峰( 箭头所指) 能够很好地分离。 图1 - 6 单个l y r c 3 细胞的电泳图。 9 t 1 i 东人学博士学位论文 虽然能够将单细胞内组分完全定量非常重要，但是在某些情况下，能够监测 单个细胞的化学物质改变的动力学过程( 例如：胞外分泌、细胞内吞作用、细胞 代谢过程和离子调节作用) ，更有利于了解细胞与其所处环境的相互作用。因此， 能够同时监测细胞分泌物的量和释放后胞内剩余的该组分的量，将为药物代谢的 研究提供相关的信息。c e 的定量特性使其在研究单细胞的分泌过程中成为有效 的分析检测手段。t o n g 等 3 7 采用天然荧光在柱检测技术，同时测定了单个i t c 3 细胞分泌的胰岛素的量以及该细胞胞内剩余的胰岛素的量( 图1 7 ) 。之所以选择 t i m e ( m i n ) 图l 一7 在朴检测单个 1 t c 3 细胞释放胰岛素的l b 泳酬。 峰：1 = 毛地黄皂甘刺激细胞分泌的胰岛素；2 = 细胞内剩余的肤岛索。 胰岛素作为被监测的对象是由于i i 型糖尿病的特征是细胞胰岛索从胰腺b 细胞中 分泌异常，而其原因尚未清楚。在单细胞研究过程中，用毛地黄皂苷与细胞膜上 的胆固醇作用，在细胞膜上穿孔导致胰岛素从细胞内释放出来，其方法如图1 8 所示。将单细胞导入到毛细管的进样端，当细胞贴壁后( 图1 - 8 a ) ，将2 0 儿i n o l l 的毛地黄皂苷溶液( 溶解在平衡好的盐溶液中) 采用动力学方式导入到毛细管的 进样端，包围细胞的周围。然后将毛细管的进样端移入到分离缓冲液中孵育1 5r a i n ( 图i - 8 b ) ，在这一过程中毛地黄皂苷与细胞膜上的胆固醇作用，在细胞膜上穿 孔导致胰岛素包含的颗粒穿过细胞膜上的微孔，释放出胰岛素，并用c e 天然荧 光分析在柱检测技术，分离电压为3k v 检测细胞释放出米的胰岛素区一胎( 图1 1 0 moz叫om芷03一玑 山东大学博士学位论文 8 c ) 。最后将分离电压提高为3 0k v ，在该电压作用下细胞将完全溶解，并释放出 剩余的胰岛素j 这样将有两个胰岛素区带在电渗流的驱动下经过检测窗口( 图l 一 8 d ) 。通过峰面积可以测定胰岛素的量。由于是相对检测，因而不需要另外校正 就可以计算出细胞释放h ；胰岛素的百分比。 b c d i g i l o n i ni n i e 幽n i n c u b a t e f o r1 5 r a i n l 誓剖。r 胁h y d 一呲s m i c 呐 lc e