（发育生物学专业论文）sfrp3表达下调对小鼠牙齿发育的影响.pdf

摘要 摘要 器官发育的形态发生过程中，w n t 家族信号是调节上皮和间充质之间相互作用的 重要生长因子之一，在果蝇( d r o s o p h i l a ) 和秀丽隐杆线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 的巡化，学删究恻，h 蜘蜍( x e n o p u s ) 的h 1 化圳期表达研究和小鼠的基因敲除实验中 都证明了w n t 家族与胚胎的分节，中枢神经系统的图示形成( c n sp a t t e r n i n g ) 和细 胞不对称分化的调控有关。w n t 信号系统也是调节牙齿发育的四大类生长因子之 一s f r p ( s e c f e t e df i z z l e d r e l a t e dp r o t e i n ) 是w n t 信号的调控因子，本论文通过抑制 s f r p 3 的表达，研究w n t 信号在牙齿发育过程中所起的作用。利用r n a i 技术和慢病 毒转基因技术，设计针对s f r p 3 的s i r n a ，构建表达s h r n a 的p n l - e g f p u 6 一s h s f r p 3 - i 和口n l e g f p ，u 6 s h s f r p 3 i i 质粒，使它们分别和p v s v g , p h e l p e r 组成慢病毒三质粒 转染系统，再共转染2 9 3 t 细胞，生产e g f p - s h s f r p 3 一i 病毒和e g f p s p 3 - i i 病毒。 用e g f p s h p 3 i 病毒和e g f p 。s h s f r p 3 。i i 病毒分别感染牙间充质细胞，通过 r e a r i m er t - p c r 方法检测各个组织的s f r p 3 的相对表达量，筛选出抑制效率为6 3 的e g f p s h s f r p 3 一i i 病毒应用于研究牙齿发育。实验结果是：感染e g f p - s t u j p 3 - 1 1 病 毒的重组牙j 垤( e l3 5 牙叫充质+ e i o 5 牙上皮) 的成牙率降低。感染e g f p - s h s f r p 3 - i i 病毒的e 1 1 5 整牙的早期发育过程会被促进。这些结果都证明了w m 家族信号系统 在牙齿早期发育中具有重要的作用。 关键词g o t 、s f r p 3 、 r n a l 、r e a l t i m er t p c r 、转基因技术、慢病毒载体系统、 牙齿发育 a b s t r a c t a b s t r a c t w r i te x t r a c e l l u l a rs i g n a l i n gm o l e c u l e sh a v ee s s e n t i a lr o l e si ne p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l i n t e r a c t i o n si n v o l v e di nt i s s u em o r p h o g e n e s i s g e n e t i cs t u d i e si n d r o s o p h i l aa n d c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s , e c t o p i cg e n ee x p r e s s i o ni nx e n o p u s ，a n dg e n ek n o c k o u t si nt h e m o u s eh a v ed e m o n s t r a t e dt h ei n v o l v e m e mo fw n r ai n p r o c e s s e s a sd i v e r s ea s s e g m e n t a t i o n , c n sp a t t e r n i n g , a n dc o n t r o lo fa s y m m e t r i cc e l ld i v i s i o n s w n t ss i g r l a li s o n eo ft h ef o u rg r o w t hf a c t o r st h a tr e g u l a t et h et o o t hd e v e l o p m e m t s f r p s ( s e c r e t e d f i z z l e d r e l a t e dp r o t e i n s ) a r er e c e p t o r st h a td i r e c t l yb i n dt ow n t s i nt h i sr e s e a r c h ，w e i n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fw n t ss i g n a lo nt o o t hd e v e l o p m e n t ，a n dw ef o c u so nt h es f r p 3 w h i c hi so n eo ft h es p , f a m i l ym e m b e r s w eu s er n a ia n dl e n t i v i r a ig e n et r a n s f e r t e c h n i q u et ok n o c kd o w nt h ee x p r e s s i o no fs f r p 3i nt o o t hm c s c n c h y m e p l a s m i d so f p n l - e g f p - u 6 - s h 茸，p 了- ia n d1 1w h i c he x p r e s s e ds h r n a w e r ec o n s t r u c t e da n dc o m b i n e d w i t hp v s v ga n dp h e l p e r , r e s p c e c t i v e l y , t oc o n s t i t u t el e n t i v i r a lv e c t o rs y s t e mo ft h r e e p l a s m i d s t h el e n t i v i r a lv e c t o rs y s t e mw a st r a m f e e t e di n t o2 9 3 tc e l lt op r o d u c ee g f p - s h s f r p 3 - ia n de c 求p - s h s f r p 3 一i il e n t i v i r u s t o o t hm e s e n c h y m a lc e l l sw e t e i n f e c t e db yb o t h l e n t i v i r u s e sa n di d e n t i f i e db yr e a h i m er t - p c rt oe x a m i n ei n h i b i t o r ye f f i c e n c y n l c e g f p s 叼印孓i il e n t i v i r n sw h i c hc a ni n h i b i t6 3 o f t h ee x p r e s s i o no f s f r p 3w a ss e l e c t e d f i n a l l yf o rk n o c k i n gd o w ns f r p 3 e x p e r i m e n t a lr e s u l t sd e m o n s t r a t e dk n o c k i n gd o w no f s f r p 3i nr e c o m b i n a n tt o o t hg e r m s ( t h em e s e n c h y m eo f e l 3 5 + t h eo r a le p i t h e l i u mo f e l o 。5 ) w i l lr e d u c et h ep e r c e n t a g eo ft o o t hf o r m a t i o n i n h i b i t i o no ft h ee x p r e s s i o no fs f r p 3i n i n t a c te li 5m a l o rt o o t hg e r mw i l le n h a n c et o o t hd e v e l o p m e n t t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a t w n ts i g n a l i n gp l a y sn i li m p o r t a n tr o l ei ne a r l yt o o t hd e v e l o p m e m t k e y w o r d sw r i t 、s f r p 3 、r n a i 、r e a l t i m er t - p c r 、g e n et r a n s f e rt e c h n i q u e 、 l e n t i v i r a lv e c t o rs y s t e m 、t o o t hd e v e l o p m e n t n ， ， 中文文摘 中文文摘 牙齿是一种组织结构和发育分化过程相对简单的器官，是在上皮和间充质之间 的相互作用下形成的，它是研究器官发育中分子机制的最好模型。 哺乳动物早期牙齿的发育经历了牙板期、蕾状期、帽状期和钟状期牙齿的发 育和哺乳动物的其它器官的发育一样，从发育启动，形态发生到终末分化，都依赖于 构成器官的各组织间的相互诱导作用。牙齿是以牙上皮和牙间充质之间相互诱导发 育形成的诱导作用是各生长因子和转录因子有时问和空问次序的表达，形成复杂的 信号网络 牙齿发生过程中，在上皮一间充质问传递诱导信号的生长因子主要有四大类：骨 形成蛋白( b m p ) ，成纤维细胞生长因子( f g f ) ，刺猬蛋自家族( h h s ) 和w n t 信号系统 e 1 0 5 小鼠e l 腔上皮中有b m p 4 和f g t s 的表达。两者的拮抗作用决定了牙齿形成 的部位。未来牙上皮中强烈的f 趸店的表达持续到蕾状早期，f g f 通过诱导下方间充 质中p a x g , p i t x i 和p i t x 2 的表达，确定牙齿形成的部位。牙上皮中$ h h 通过促进上皮 细胞增殖来使牙上皮增厚并下陷形成牙蕾。牙蕾期，b m p 4 的表达转移到间充质，诱导 牙问充质表达m s x l ，m a x 2 ，l e f t 和e g r l 等转录因子并发生形态变化。蕾状未期和帽 状早期的原发性釉结节中，尼憎的表达被上调而后舟的表达由w r t t 信号通路激活 帽状期时，s h h 局限在釉结节内表达，但随后的周围内釉上皮和星网层内也开始表达 原位杂交显示，在牙齿发育的过程中，许多转录因子与生长因子的表达区域重叠， 提示在这两类基因阃可能存在潜在的相互诱导。基因敲除模型的构建使研究转录因 子在牙齿发育中作用成为现实到目前为止m s x l - - 。l e f t - ，p a x 9 - ，- 和p i t x 2 - - 等基因 敲除小鼠的牙齿发育大都停滞在蕾状期。 w n t 信号系统是早期牙齿发育的四大类生长因子之一，通过分析z e f l 基因敲除 小鼠，第一次证实w n t 信号在牙齿发育中的作用。作为w n t 信号途径中的关键成份， l e f t 基因的突变会导致牙齿发育停止在蕾状期。s f r p 3 是w n t s 信号的调控因子，且 在早期的牙间充质中有大量的表达，参与调控w n t s 信号，并最终影响牙齿发育。已有 实验表明：当将外源的s f r p 3 蛋白加到e 1 1 5 的磨牙牙胚附近，牙齿的发育会比对照组 的牙齿发育大约推迟2 天。当将过表达s f r p 3 蛋白的磨牙牙胚移植到肾囊膜下生长， 最终也能发育成牙，但是牙齿比对照组的小说明在牙齿发育早期，过量表达s f r p 3 蛋 白。会推迟牙齿的发育i “。 1 1 1 福建师范大学硕士学位论文 本实验利用慢病毒介导r n a 干扰作用的目的是抑制妒筇基因在牙齿间充质中 的表达，来研究牙齿发育的形态变化首先，根据s i r n a 设计的原则，设计两个针对 s f r p 3 基因的s i r n a ，然后构建p n l - e g f p - u 6 - s b f r p 3 - i 和p n l - e g f p - u 6 一s h s f r p 3 - 质 粒，使它们分别和p v s v g ，p h e l p e r 组成三质粒慢病毒系统 其次，将p n l _ e g f p p n 卜e g f p - u 6 一s h s f r p 3 - 1 p n 卜e g f p - u 6 一s h s f r p 3 - i i ，p v s v g 。 p h e l p e r 三质粒共转染2 9 3 t 细胞，生产e g f p 病毒、e g f 卜s h s f r p 3 - i 病毒和e g f p - s h s f r p 3 - i i 病毒。利用收集到的e g f p 病毒感染牙问充质细胞，经过统计。感染效率 为8 3 3 。收集到较高滴度的病毒，有助于实现s f r p 3 的抑制。 再次，检测r n a i 抑制s f r p 3 表达的效率应用已经收集的e g f p 病毒， e g f p - s i 咖3 一i 病毒和e g f p - s 脚印3 i i 病毒分别感染牙甸充质细胞，再通过 r e a l t i m er t - p c r 方法检测各个组织的s f r p 3 的相对表达量，最后得到r n a i 抑制 s f r p 3 表达的效率。其中e g f p - s 岣印3 1 l 病毒抑制牙阿充质细胞s f r p 3 表达的效率 较高。达到6 3 3 。 最后用e g f p - s h s f i p 3 一i i 病毒感染牙间充质。抑制牙间充质中s f r p 3 的表达来研 究牙齿的发育。被e o f p 病毒感染的e 1 3 5 的牙间充质与e 1 0 5 牙上皮重组，将植块 移植到肾囊膜下生长1 6 2 8 天，取出植块发现8 1 8 ( 9 1 1 ) 的植块成牙被 e g f p - s h s f i - p 3 i i 病毒感染的e 1 3 5 的牙间充质与e 1 0 5 上皮重组，将植块移植到肾囊 膜下生长1 6 2 8 天，取出植块发现5 0 ( 6 1 2 ) 的植块成牙抑制s f r p 3 在问充质中的 表达，降低了重组组织块的成牙率 用e g f p 病毒和e g f p - s h s a q p 3 一i i 病毒分别感染e 1 1 5 的完整磨牙牙胚，4 小时后 将实验组牙胚和对照组牙胚分别移植到肾囊膜下生长。生长4 天后，观察实验组和对 照组的组织切片，实验组的牙胚发育到了帽状晚期，而对照组的牙胚发育仅发育到帽 状早期。生长7 天后，观察实验组和对照组的组织切片。实验组的牙胚发育到了钟状 期，而对照组的牙胚仅发育到帽状晚期。生长1 6 天后，观察实验组和对照组的组织切 片。发现实验组的牙长得形态较好。各牙都出现了明显而舰整的牙尖，且从最大切面 看实验组牙总体比对照组的略大，试验组可数到7 个牙尖而对照组只能数到4 个牙 尖实验组早期牙齿的发育比对照组的牙齿发育快，约快i - 2 天，但是发育到最后并 未发现牙齿的大小有明显差异。证明w r i t 信号通路在牙齿早期发育中具有重要作用， 抑制了s f r p 3 的表达，在一定程度上加强了w n t 的经典通路和w n t 的平行细胞极性通 路促进细胞的增殖，加速早期的牙上皮下陷，加快牙上皮细胞的极化，使牙上皮细胞 l 中文文摘 更快发育成柱状细胞，即内釉上皮或成釉细胞 v 第l 帝前者 第1 章前言 1 1 研究的目的 研究牙齿发育的分子机制不单有助于牙齿再生的实现，还可作为其它器官研究 的参考。牙齿是一种组织结构和发育分化过程相对简单的器官，是在上皮和间充质之 间的相互作用下形成的，它是研究器官发育中分子机制的最好模型 2 1 器官发育的分 子机制是生长因子和转录因子的表达有时问和空间次序的变化人们在了解早期牙 齿发育形态变化后，应用原位杂交、免疫组化等方法检测了牙齿发育各个时期生长因 子和转录因子的表达情况。通过m s x l - - 。工，了4 - ，p a x 9 - - 。聊徊，奢归d - 等基因敲 除鼠研究各基因在牙齿发育中的作用。在体外培养牙间充质的实验中，重组b m p 4 可 以部分的替代牙蕾上皮的诱导成牙潜能，诱导牙问充质表达m s x l , m s x 2 , l e f l 和e g r l 等转录因子并发生形态变化故通常认为在e 1 3 5 天后，b m p 4 在牙间充质所具有 的诱导牙齿发育的能力中起主导作用然而有实验证明，m s x l 基因敲除小鼠的磨牙 间充质不能表达b m p 4 ，但组织重组实验证实其仍具有诱导牙齿发生的能力，表明 b m p 4 可能不是牙间充质细胞具有牙齿发育能力所必须的关键因子那么牙齿发育 的四大类生长因子：骨形成蛋白( b m p ) 【羽。成纤维细胞生长因子( f g f ) 【4 1 ，刺猬蛋白 家族( h h s ) 【5 川和w m 信号系统0 1 哪个是诱导牙齿发育的关键因子呢? w n t 信号系统已被证实在胚胎的发育中起指导分化和图式形成的重要作用，同 时新近的研究也证明了w n t 信号通路对成体的干细胞也具有重要的调控作用。 s f r p ( s e c r e t e df i z z l e d r e l a t e dp r o t e i n ) 是w n t 信号的调控因子，通过调节s f r p s 在细胞中 的表达量，可以实现对w n t 信号系统的调节s f r p s 的成员之一 p 3 在e 1 1 5 e 1 3 5 的磨 牙和切牙问充质中有表达( 附录一) ，已有实验表明：当将外源的s f 啼3 蛋白加至e j e l l 5 的 磨牙牙胚附近，牙齿的发育会比对照组的牙齿发育大约推迟2 天当将过表达s f r p 3 蛋 白的磨牙牙胚移植到肾囊膜下生长，最终也能发育成牙。但是牙齿比对照组的小说 明在牙齿发育早期，过量表达s 邱3 蛋白，会推迟牙齿的发育，只是推迟并不会使牙齿 的发育停滞【i i 要从功能性获得和功能性缺失两方面展开基因的研究，s a r k a r 等通过 在牙胚中过表达 朋研究t s f r p 3 基因与牙齿发育的关系本论文将降低s f r p s 的表达 研究咖3 基因与早期牙齿发育的关系，初步研究w n t 信号系统在牙齿发育中的作用 捅建师范大学硕士学位论文 1 2 牙齿发育概述 1 2 1 晡乳动物早期牙齿的发育模式( 图1 - 1 ) 一 以胚胎时期小鼠的磨牙发育为例e 8 5 时胚胎中脑和后脑神经嵴细胞迁移到原 口，形成未来的牙问充质0 1 - , 3 1 牙齿发生的部位在e 1 0 5 时就已经被决定，但此时还 未出现形态学上的变化【1 4 1 到e 1 1 5 时，未来成牙部位的上皮开始增厚，这是牙齿发 育过程中第一个可见的形态变化，成牙部位的上皮细胞由立方状伸长为高柱状( 沿其 游离面一基底面轴伸长) 发生极化并形成牙原基，此时被称为牙板期( 1 a m i n a rs t a g e ) 。 e 1 2 5 和e 1 3 5 期间，增厚的牙上皮因为持续的增殖，已向下突入由神经嵴衍生而来的 间充质中，形成营状的结构，此时称之为蕾状期( b u ds t a g e ) 在此期间，蕾状上皮的 基底层细胞维持柱状形态。这一由柱状细胞构成的基底层上皮结构是牙齿发育中的 标志性形态结构随后将发生一系列的细胞分裂和形态变化，牙间充质细胞围绕牙蕾 聚集。e 1 4 5 和e 1 s 5 时，持续增殖的牙上皮开始在周边发生卷曲，而在中心则生成 控制牙尖形成的临时性结构釉结节，并表达一系列的生长因子。如s h h ，b m p 2 。 b m p 4 , b m p 7 ，f g f 4 和f g f 9 【l ”。由于釉结节内的细胞发生凋亡，而周边上皮依1 日增 殖，导致整个牙上皮不均匀生长，使得牙上皮的整体形态由蕾状变为帽状，因而称此 期为帽状期( c a ps t a g e ) 。e 1 6 5 以后，牙胚进入钟状期( b e l ls t a g e ) ，此时的牙上皮开 始分化为前成釉质细胞，而间充质细胞分化为前成牙本质细胞。两类细胞均呈现出相 同的变化细胞由高柱状进一步加长，细胞核迁移到远离基底膜的一端，开始分泌 形成牙釉质和牙本质的基质。由神经嵴衍生而来的间充质不但形成分泌前牙本质的 成牙本质细胞，还形成未来的牙槽骨l 】5 】。 1 2 2 牙齿发育的分子机制简述 牙齿的发育和哺乳动物的其它器官的发育一样，从发育启动，形态发生到终末 分化，都依赖于构成器官的各组织间的相互诱导作用，即诱导者和反应者之间的相互 作用。就牙齿发育而言，作为诱导者，是能诱导相邻组织表达特定基因，并指导牙齿发 生的组织，该组织具有诱导牙齿发育的潜能；反之，能对具有诱导牙齿发育潜能的组 织的发育信号起反应，而被诱导进入牙齿发生过程的组织，则该组织具有牙齿发育的 被诱导潜能。只有具有诱导牙齿发育潜能的组织和具有牙齿发育的被诱导潜能的组 织同时存在，牙齿的发育才能得以进行。 牙齿发育时各胚层之间连续的相互诱导作用【2 i 是通过可溶性的蛋白质生长因子 在细胞和组织间的扩散实现的。器官发育中的组织者产生一种生长因子，并释放到细 2 气 ， 胞外，作用于邻近的细胞或另一组织而受到生长园子作用的细胞或组织则产生一种 转录因子，激活相应的基因表达，从而生成并释放另外一种新的生长因子，反作用于 组织者，使其产生新的诱导信号这种有时问和空闯次序的生长因子和转录因子的表 达变化，构成了器官发育中的连续和相互的诱导作用1 16 1 7 1 ，即我们要研究的牙齿发育 的分子机制。 i 2 2 1 介导牙齿发生的生长因子 生长因子在牙齿发生中介导诱导作用，它是一类通过与特异的、高亲和的细胞 膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能效应的多肽类物质。在分泌特点上，生长 因子主要属于自分泌和旁分泌。有些生长因子作用于多种类型的细胞，有些则只对特 定的细胞起作用。生长因子有多种，如血小板类生长因子( 血小板来源生长因子，骨肉 瘤来源生长因子o d g f ) ，表皮生长因子类( 表皮生长因子，e g f , 转化生长因子。t g f a 和t g f p ) 、成纤维细胞生长因子( a f g f , 1 3 f g f ) 、类胰岛素生长因予( i g f i ，i g f i i ) 、 神经生长因子( n g f ) 、自细胞介素类生长因子( i k l ，i l - l ，i l 3 等) 、红细胞生长素 ( e p o ) 、集落刺激因子( c s f ) 等 牙齿发生过程中，在上皮一间充质阃传递诱导信号的生长因子主要有四大类： 骨形成蛋白( b m p ) 【3 1 ，成纤维细胞生长因子( f g f ) 4 1 ，刺猬蛋白家族( h h s ) 【5 - 7 】和w n t 信 号系统 8 - 1 0 1 。 e 1 0 5 小鼠口腔上皮中有b m p 4 和f g f 8 的表达，两者的拮抗作用决定了牙齿形成 的部位【堋。未来牙上皮中强烈的f f f 8 的表达持续到蕾状早期。f g f 通过诱导下方问 充质中p a x g , p i t x l 和p i t x 2 的表达，确定牙齿形成的部位i 墙- 9 1 牙上皮中s h h 通过促 进上皮细胞增殖来使牙上皮增厚并下陷形成牙蕾i s , 2 0 1 牙蕾期，b m p 4 的表达转移到 间充质，诱导牙间充质表达m s x l , m s x 2 , l e f l 和e g r l 等转录因子并发生形态变化1 2 i ， 埘蓿状末期和帽状早期的原发性釉结节中。f g f 3 的表达被上调而f g f 4 的表达由 w n t 信号通路激活2 3 州。帽状期时，s h h 局限在釉结节内表达，但随后的周围内釉上 皮和堕网层内也丌始表达( 巧- 2 7 1 ( 图卜1 ) 1 2 2 2 转录因子在牙齿发生中的作用 生长因子最终将信息传递给转录因子，由转录因子调控发育中各种蛋白质的表 达。所谓转录因子是通过与基因启动子结合，使r n a 聚合酶完成转录过程的因子的 总称f 分为与t a t a 盒结合的基本转录因子和与增强子结合的d n a 结合性转录因子 通过这些转录因子的作用，基因表达受到了细胞特异性调节 原位杂交显示，在牙齿发育的过程中，许多转录因子与生长因子的表达区域重 桶建师范大学硕士学位论文 叠，提示在这两类基因间可能存在潜在的相互诱导f l s l 基因敲除模型的构建使研究 转录因子在牙齿发育中作用成为现实到目前为止，m s x l - - , l e f l - - , p a x g - - 和p i t x 2 - - 等基因敲除小鼠的牙齿发育大都停滞在蕾状期澄3 3 l ( 图卜1 ) ： 转录因子在牙齿发育中的一般作用是调节生长因子的表达。可以推断转录因子 是通过对诱导信号的反应来调节其他信号分子的表达，以此将各层组织的信号反馈 网络连接起来，从而实现了上皮一间充质间的相互作用 要想解读各层组织形成的复杂的信号网络，就得先了解其中每个主要因子的信 号通路最后再由局部到整体，彻底读懂整个信号网络，明白器官发育的奥秘，以便最 终实现器官再生 o o 晤f m | n = , h e n 0 4 协r m n o l l o n o i 均栅if a l o l ，o il l hl d e n t j t y 嬲裂翟裟删i ；：黑蒜。一静u p l ，o n 啼 | 玺| 卜1 早删磨牙发百模式幽( 引臼h t t p ：b i t e i t h e l s i n k i f m ) f i gl 一1t h ee a r l ym o l a rd e v e l o p m e n t 1 3w n t s w r i t s 控制细胞的命运，如细胞的附着，细胞的迁移，细胞的极性和细胞的增殖它 们在果蝇，线虫，斑马鱼，蟾蜍和小鼠发育中具有重要的作用已经被证实。发育过程 中，w n t s 是调节上皮和间充质之问相互作用的重要生长因子之一，w r i t 信号与肾、肢 芽和中脑的发育都密切相关【s 1 通过分析聊基因敲除小鼠，第一次证实w n t 信号在 牙齿发育中的作用。作为w n t 信号途径中的关键成份，上印基因的突变会导致牙齿发 育停止在蕾状期【2 8 m 3 5 1 。 4 ) -， ，j | ， 第l 章前育 w r i t s 是牙齿发育中的四大类生长因子之一，研究w n t s 在牙齿发育中的作用，将 迸一步了解牙齿发育的分子机制。 1 3 1w n t s 的属性 w n t 基因编码一富含半胱氨酸的分泌型蛋自家族，这些蛋白在水螅、昆虫和脊 椎动物中都能发现。它们从细胞分泌出来后，与自身或邻近细胞的膜受体结合，激发 细胞内的信号通路，调节核内的基因表达，决定细胞的分化命运，在动物发育中起着 广泛的作用，它们异常的时空表达或异常的激活往往与肿瘤的发生有关 w n t s 家族的蛋白是发育中细胞间重要的信号分子之一在果蝇( d r o s o p h i l a ) 和 秀丽隐杆线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n $ ) 的遗传学研究，非洲蟾蜍( x e n o l m s ) 的异 位基因表达研究和小鼠的基因敲除实验中都证明了w r i t s 基因与胚胎的分节，中枢神 经系统的图示发育( c n sp a t t e r n i n g ) 和不对称细胞分化的调控有关t 3 6 1 与其他的分泌因子如f o f ，t g f - b c t a 和h e d g e h o gp r o t e i n s 相类比。w n t 蛋白蕴藏一 个广泛的生物学过程。1 9 8 2 年小鼠身上发现第一个w m 基因，是在乳房肿瘤中整合小 鼠乳腺瘤病毒( m t v ) 时能被激活的原癌基因1 3 7 1 这种基因刚被克隆出来时，称为i n t 基因：后来的研究发现i m - l 基因与果蝇的w i n g l e s s ( w g ) 基因属于同源基因，因而将 二者合称为w n t 。随后w n t 基因在癌症中的潜在作用成为了二十世纪八十年代的研 究的热点1 3 6 1 对w n t - 1 突变小鼠表型的分析可以得知w m 基因是发育的重要调节因子 之一( 3 s 4 0 从人到线虫已有约1 0 0 个w r i t 基因被分离并克隆所有这些基因编码的蛋 白都含有一个信号序列和一个由2 3 个半胱氨酸组成的相似的结构可推测所有的 w n t 蛋白都由细胞分泌出来，然后通过与细胞膜上的受体( 自身或邻近细胞) 结合 决定细胞的命运和其它分化参数 1 3 垒w r i t 信号的四条传导通路 大量的研究表明w n t 的作用和许多蛋白质有关，它们之问形成了级联的网络现 在认为在细胞内w n t 至少有4 条通路：( 1 ) 经典的w n t b e t a - 连环蛋白( b c t a - c a t e n i n ) 信号通路( c a n o n i c a lw n t b e t a c a t c n i np a t h w a y ) ，调节核内目的基因表达；( 2 ) 平行 细胞极性通路( p l a n a r c e l lp o l a r i t yp a t h w a y ) ，j n k 激酶被激活后指导不对称的细胞骨 架重排和协调上皮层的细胞极性在这条通路上涉及到相关性钙粘跨膜蛋白f m i ，蛋 白多糖k n y ，p d z 分子s t b m ，d s h ：( 3 ) w 州c a + 通路，与胞内c a + 的增加以及蛋白 激酶g ( p l c ) 和磷脂酶c ( p k c ) 的激活有关；在非洲爪蟾胚胎的研究中，w n v c d 通路使n f - a t 脱磷酸化并在细胞核中积累。抑匍j w n t 经典通路对胚胎体轴形成的调 ， 福建师范大学硕士学位论文 节；“) 调节纺锤体定向和不对称细胞分裂的通路【4 1 埘1 对w n t 经典通路的研究最为透彻，当w n t 分泌后能与细胞表面基质及其特异性 受体f r i z z l e d 蛋白相互作用，通过其下游的一系列诸如d s h ( d i s h e v e l l e d ) 、b 环形蛋 白、g s k 3 ( g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e3 ) 、a p c ( a d e n o m a t o u sp o l y p o s i sc o l i ) 等蛋白质的 磷酸化与去磷酸化的过程来完成w n t 信号的传导，在脊椎动物至原虫的生物发育及 肿瘤发生中具有重要作用d 7 1 w n t 经典通路具体过程是w n t 与两类受体结合形蒯三 聚体，即w n t 信号分子同时与f r i z z l e d 受体和l r p s 6 结合队4 5 ，形成配体一受体i 复 合物嗣再经f z 将信号转导给一个胞质蛋白d i s h e v e l l e d s h ) 经过w m 的 上游激活，d s h 抑制了糖原合酶激酶( g s k ) - 3 p 的活性，从而阻止了后对 1 - c a t e n i n 的 磷酸化，使得p c a t e n i n 在细胞质中集聚，然后转运到核中，与t 细胞因子( t c f l e f ) 家族转录因子相互作用。最终调节了靶基因的表达。 1 3 3w n t 信号通路的分泌型拮抗物 w n t 信号通路的胞外拮抗物都是通过阻止w n t 和受体之间的相互作用来阻断 w n t 信号通路这类拮抗物根据不同的作用机制可以分为两大类：第一类包括s f r p 家 族蛋白( 分泌型的相关性卷曲蛋白) ，w i f 1 ( w n t 抑制因子) 和c e r b e r u s ，它们都是通过 与w n t 蛋白结合而使w n t 蛋白无法和细胞膜上受体复合物结合：阻断w n t 的经典通 路和平面的细胞极性通路。第二类包括d i c k k o p f 家族( d k g ) ，它是l r p 5 6 的抑制 性配体 她4 5 1 。通过与w r i t 受体复合物的亚基l r p s 6 结合，阻止w r i t - f r i z z l e d 和 l r p s 6 间的相互作用，阻断经典的w n u l ；c a t e n i n 途径，却不影响w n t 信号传导的平 面的细胞极性通路t 4 6 】。另外还有其它蛋白的相互作用也同样具有阻断w n t 信号通路 的功能1 4 6 - 4 9 。 1 3 3 1s f r p ( s e c r e t e df i z z i e d - r e i a t e dp r o t e i n s ) 家族蛋白 s f r p 是直接和w n t s 结合的拮抗物，由于它们同时由不同方法发现，起始时被命予 不同名字1 5 0 l ，如s f r p 3 当时被命名为f r z b ( f o rf r i z z l e dm o t i fa s s o c i a t e dw i t hb o n e d e v e l o p m e n t ) 。由序列的同源性差异，s f r p 被分为三个不同的亚群。发现了众多的 s f r p 分子。却未在无脊椎动物身上发现s f r p 蛋白存在。尽管如此，很多的s f r p 分子已 被证明可以抑制果蝇的w i n g l e s s ( w g 是与w m 同源的基因) s f r p 3 首先在软骨组织中被纯化出来。被认为是软骨形成因子。与此同时在非洲 蟾蜍也发现了s f r p 3 。s f r p 3 有一个特征就是和f z 一样含有富于半胱氨酸的配体结合 区( c i ) ，此结构区域可以与w r i t 信号结合s p e m a n n 等在非洲蟾蜍原肠胚的实验证 6 ，毒i童r 5 ； 第l 审前苦 明s f 碴3 可以与x w n t 8 和w n t 1 结合眦蜘，可以抑制异位表达x w n t - 8功能，抑制 w n t - 1 诱导的b e a t e n i n 在细胞内的积累【s 3 ts 4 1 。 f r i 划e d 受体都含有个n 端的信号肽，一个富于半胱氨酸的配体结合区( c r d ) ， 一个7 次跨膜的区域和一个胞内o h 端。f r p s 蛋白属分泌型蛋白，结构上有一个与 f r i z z l e d 蛋白相似的c r d 区域，与f z 蛋白具有3 0 到5 0 的相似性序列【5 5 】另外， f r p s 都含有一个与神经生长因子( n e t r i n ) 相似的结构。神经生长因子的特征是含六 个半胱氨酸残基和保守的疏水区域【钏( 图卜2 ) f r j z z l e d sf r p s x 2v h 图l - 2f r i z z l e d s 和s f r p s 的结构图( a n d m sw o d m z r o e ln u d e 1 9 9 8 ) f i g1 - 2 s t r u c t u r eo f f r i z z l c d sa n df r p s f r i z z l e d 受体的特征是有一个n 端的信号肤。一个富于半胱氨酸的配体结合区( c r d ) 。一个7 次 跨膜的区域和一个胞内0 i i 端。f r p s 蛋白属分泌型蛋白，结构上有一个与f r i z z l e d 蛋白相似的 c r d 区域。另外，f r p s 都含有一个与神经生长因子( n e t r i n ) 相似的结构 1 3 3 2 发育中s f r p 的表达模式 一些s 钾圆s 的表达模式在发育中的鸡胚，鼠胚和非洲蟾蜍中已经有所研究 s 0 1 在 某些情况下f r p s 具有拮抗w n t 的功能实际上已经提出s f r p s 有利于限定在某器官 e p w n t 的活性对发育调控的范围。当懈达一致的时候，s f r p 的梯度表达将有可能 使w r i t 产生梯度活性 另一个可能是s f r p s 的表达是重叠性表达，是w n t s 蛋白调控s f r p s 的表达。如 对早期肾的发育很重要的j 删在间充质中的表达是由w n t - 4 诱导的【5 6 1 在小鼠 端脑的发育中。s f r p l 和s f r p 3 的梯度表达也可以支持这种表达模式岱7 1 1 3 3 3s f r p s 可以赋予w n t 活性 、 当考虑到s f r p 在发育中的功能时，必须考虑到s f r p s 并不一定总是充当w n t 的拮 福建师范大学硕士学位论文 抗物组织培养的实验表明，在s f r p i 浓度较低时，它可以赋予w n t 活性胜过抑制w n t 的活性【5 耵这些和其它的观察都认为s f i 冲1 为w g 提供了高亲和结合位点和低亲和结 合位点，当w g 和高亲和位点结合时，将会促进w g 信号，当w g 和低亲和位点结合时。将 会抑$ o w g 信号但以上的说法都是针对w g ，而非针对脊椎动物的w n t 虽然w g 和 w n t 存在高度的保守性，但在s f r p i w g 之间的反应不一定会发生在s f r p l w n t 。另一 种假说是，当s f r p l 在高浓度的时候会与受体f z 结合，形成一个失去功能的受体复合 物：在s f r p l 和h f z 6 之间就发生了这种反应 5 9 1 可能s f r p s 最初的功能是将w n t s 转运 到有高浓度受体的细胞表面，再将w n t s 释放使与受体结合。只有在受体浓度较低时 候，s f r p s j 。扮演拮抗物的角色 还有更让人费解的发现，同等浓度的s f r p i 和s f r p 2 会使细胞产生不同的反应。 例如，它们对m c f - 7 乳腺癌细胞的1 3 - c a t e n i n 的稳定性和细胞毒性刺激的敏感性起着 完全不同的影响【”i 。另外，虽然s f r p l 和幼? 都在后肾中表达，但是s f r p l 可以阻断 肾小管的形成，而s f r p 2 却没有这作用。实际是s 卸1 2 阻断了s 邱l 的作用 6 0 l 。与此相 关的主要w n t 成员是w n t - 4 ，w r i t - 4 的活性受到s 卸1 和s f r p 2 的调节这差别可能来 自s f r p s 对在肾中表达的w n t s 亲和力不同。分析s f r p 家族的各成员对w n t s 的相 对亲和力，将有助于解释实验结果。 1 3 3 4s f r p s 和细胞生长的调节 在发育中，w n t 通路对组织中细胞的增殖，分化和死亡起重要作用。w n t 信号通路 的异位激活常与i i l j 自的发，上有关s f r p s 在癌症中的迅速下降和在退型性疾病中的上 调都说明s f r p s 在正常组织中对w n t 活性的调控起重要作用。 s f r p i 在乳腺癌1 ，卵巢癌和肾癌中表达下降 6 2 6 3 1 ，而且s 邱l 启动子在早期直 肠结肠癌中常会发生甲基化 6 4 1 。肿瘤细胞会关闭s f r p s 的表达，因为这些蛋白会促 使细胞程序性死亡。例如，s 邱1 使m c f - 7 乳腺癌细胞易受肿瘤坏死因子的诱导发生 细胞凋亡 s 4 1 s f r p s 在某些疾病中起促进作用例如，s f r p 2 在有视网膜炎的病人 中表达上调【6 5 】。 1 3 4 发育中的牙齿表达一系列的肠亡基因 1 3 4 1 牙齿发育的起始阶段( e 1 1 5 ) 在牙齿发育的起始阶段( e 1 1 - e 1 2 ) ，牙齿被定位于口腔上皮的增厚区域。辟锄心 和w n t - 7 b 在口腔上皮中表达，除未来牙上皮哪1 w n t 7 b 在未来牙上皮内的异位表达会 抑制s 肭的表达导致牙齿无法形成，但反之则不然脚】w n t 7 b 可能是通过与s h h 的相 8 ， ；， ，j， 1 ji、 l ， 第l 帝前育 互作用来确定牙上皮和1 3 腔上皮问的界限而定位牙齿形成的区域1 6 6 1 w n t - l o b 在磨牙 增厚上皮的中间区域表达w n t - 6 的转录产物在口腔上皮和增厚的牙上皮中均有发 现w n t - 4 和w n t 受体m f z 6 都一致在口，牙，头上皮中表达。以上这些基因都未发现在 口或牙间充质中表达。 w n t 的拮抗物s f r p 2 在上颌突中强烈的表达，及在下颚磨牙的阃充质中有集中的 表达 w n t 的拮抗物s f r p 3 在e 1 1 5 时集中表达在增厚的牙上皮下间充质区域，w n t - s a 的 表达部位和表达方式与s f r p 3