二氢黄酮醇4还原酶基因.ppt

二氢黄酮醇4还原酶基因,学生：焦淑珍导师：刘雅莉2012-12-29,1二氢黄酮醇4还原酶基因的结构和作用机制二氢黄酮醇4还原酶（dihydroflavonol4reductase，DFR）属于NADPH依赖性短链还原酶家族，为单基因编码。最近鉴定了葡萄（Vitisvinifera）DFR的晶体结构，发现其是由3个亚基组成的复合物，具有专门的NADPH结合域。DFR是花青素生物合成途径的关键酶，分别催化二氢堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氢栎皮黄酮（dihydroquercetin，DHQ）和二氢杨梅黄酮（dihydromyricetin，DHM）生成无色花葵素（leucopelargonidin）、无色花青素（leucocyanidin）和无色翠雀素（leucodelphinidin），然后这些无色花青素在花色素苷合成酶（anthocyaninsynthase，ANS）和类黄酮3O糖基转移酶（flavonoid3Oglucosyltransferase，3GT）的作用下合成各种花青素。由于DFR对底物的特异性和表达水平的不同，使植物呈现出各异的花色和果色,DFR属于NADPH依赖性的短链DFR还原酶超家族，最早于1985年由OReilly等从玉米(Zeamays)和金鱼草(Antirrhinumm“s)中分离出来。随后，Beld等在1989年又以部分金鱼草DFR表型突变基因为探针分离了矮牵牛(Petuniahybrida)DFR基因。至今，通过同源克隆等方法，已经在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、兰花(Bromheadiafinlaysoniana)、山茶(Camelliasinensis)、番茄(Lycopersiconesculentum)和水稻(Oryzasativa)等植物中分离了DFR基因。2003年Nakatsuka等分析了亚洲百合品种DFR基因的时空表达模式，表明DFR基因仅在花色素苷着色器官中表达，并且控制花器官的显色模式。,2DFR基因的分离,2000年Aida等通过农杆菌介导的基因转染法将DFR基因转移到蓝猪耳中，结果显示转化了反义基因的株系花冠变成浅蓝色，而转化了正义基因的株系冠檐中的花色减少程度比冠筒的大。2004年Fukusaki等成功利用针对CHS基因的RNA干扰技术修饰了矮牵牛的花色，这项技术也可能适用于DFR基因。,3DFR同源基因的结构不同物种中编码DFR基因的核苷酸序列也存在种属特异性，其功能可能发生在转录和翻译阶段。据GenBank上登录的资料，裂叶牵牛(Inil)与圆叶牵牛(Ipurpurea)基因组序列都包含3个DFR基因:DFR-A、DFR-B与DFR-C，它们呈串联排列，并且都是由6个外显子组成，具有相同的内含子剪切位点，DFR-B基因比DFR-A、DFR-C有更长的内含子序列;矮牵牛基因组中含有3个DFR基因，分别定位在2、4、6号染色体上;金鱼草、拟南芥的DFR基因由6个外显子组成，内含子剪切位点与牵牛花的是一致的;高梁基因组中含有2个DFR基因，呈串联排列;蔓越橘的基因组含有2个DFR基因，代表2个不同的座位，在编码的氨基酸序列中，24个氨基酸有差异。由此可以看出，不同种属的DFR氨基酸序列或核苷酸序列存在一定的差异，分析DFR同源基因的结构对研究其种属间的功能至关重。,4DFR基因底物的特异性DFR对底物的特异性和表达水平不同，使植物呈现出各异的花色和果色。不同来源的DFR对3种底物的亲和性有差别，如矮牵牛DFR主要催化DHM，其次是DHQ，而对DHK则无作用。在矮牵牛和兰花(Cymbidiumhybrida)中，DFR能有效催化DHQ和DHM并在花瓣中积累矢车菊素和飞燕草素，但是不能有效地还原DHK。在非洲菊(Gerberahybrida)中，DFR能利用全部3种二氢黄酮醇作为催化底物，是橙色的天竺葵素存在于非洲菊但不存在于矮牵牛中的原因。通过矮牵牛、玉米和金鱼草等植物DFR基因序列的比对，发现DFR的底物结合特性是由一段保守序列决定的，其中134位氨基酸是控制DFR底物结合特性最为保守的氨基酸残基;Johnson等也鉴定了DFR与底物专一性结合有关的区域，并通过改变该区域的一个氨基酸使DFR优先催化DHK。由此可见，DFR的底物催化选择性是决定花色的主要原因。,5DFR基因底物特异性的分子基础不同物种的DFR与底物的结合区域是高度保守的，DFR的氨基酸序列决定其底物的种类。研究发现，其第134位的氨基酸残基直接决定底物的特异性。根据DFR的第134位氨基酸残基的种类可分为3种:其134位上有一个天冬酰胺残基(Asn)，因此被称为Asn型DFR。其134位上有一个天冬氨酸残基(Asp)，不能有效地把DHK还原为无色花葵素，这一类DFR被称为Asp型DFR。矮牵牛和兰花(Bromheadiafinlaysoniana)的DFR属于这类;其第134位氨基酸残基既不是天冬酰胺也不是天冬氨酸，因此被称为非Asn/Asp型DFR。植物中Asn型DFR分布广泛，单子叶植物中都是Asn型DFR，Asp型DFR只分布在部分双子叶植物中。此外,只有少数植物含有非AsnAsp型DFR.有些同种植物中的不同DFR也分成不同的组,如豆科植物百脉根的DFR1属于非AsnAsp型;DFR2和DFR3则属于Asp型;而DFR4和DFR5属于Asn型;苜蓿的DFR1属于Asn型,而DFR2则属于Asp型等在比较几种重要植物的DFR时发现植物界中的大多数DFR都是Asn型Asp型和非AsnAsp型DFR数量有限并且在进化上分布较远由此推测Asp型和非AsnAsp型DFR有可能是由Asn型进化来的。,6DFR基因的时空表达特性不同物种的DFR基因在不同发育期与不同部位的时空表达特性也有所不同。亚洲百合的2个植株中粉红色被片带有斑点的“Montreux”DFR基因在着色的被片花药、花丝、雌蕊和红色的鳞片中大量表达，其表达量随着花的生长发育而增加开花期间达到最高。而黄色被片无斑“ConnecticutKing”的DFR基因仅在着色的花药与红色的鳞片中表达，在2个植株的未着色的叶子、茎与白色的鳞片中都没有检测到DF基因的表达。可见，DFR基因仅在花色素苷着色的器官中表达，并且此种基因的表达与花色素苷的产生相协调。百脉根(Lotusjaponicus)的基因组中存在着5个DFR因，能产生6个具有功能的mRNA，具有不同的组织特异性。Shimada等检测了百脉根的果实(种子和豆荚)、花、茎、叶、根和根瘤中的DFR基因的表达效果，发现DFR1存在于所有器官里，DFR2主要积累在除了叶的其他器官中，而DFR3只在茎和叶中特异表达，DFR4和DFR5除了根中微量表达外主要在地上部分。这些研究结果表明DFR基因表达主要伴随着花瓣组织着色的进行，它的时空表达特性与种属特异性有关。研究显示，不同物种的DFR基因表达特性研究对该基因的转基因遗传操作具有重要意义。,7DFR结构基因的启动子植物基因启动子是重要的顺式作用元件，位于结构基因5端上游区，指导全酶与模板的正确结合。活化RNA聚合酶，决定转录的方向和效率，直接影响基因的表达。六倍体小麦有3种DFR基因TaDFRATaDFRBTaDFRC分别位于染色体3A，3B和3D上，都有3个内含子。在3种DFR基因启动子序列中存在Myb类转录因子P的结合位点，它和Gbox的核心元件共同调控DFR基因的表达，这一结构可能调控小麦DFR基因的组织特异性表达，在TaDFRB中有3个这种元件。而TaDFRA和TaDFRC只有2个，因此TaDFRB的表达量要比其他2种DFR基因在小麦的子叶根和种皮等器官中的表达量高。葡萄DFR基因的启动子含有Gbox类元件bZIP和Myb类转录因子的结合位点，同时葡萄的启动子和uidA葡糖苷酶融合构成融合体，共同调节DFR基因的表达3种调控因子共同作用使葡萄DFR基因在根，茎和叶等几乎所用组织中都有表达。将葡萄DFR基因的启动子与GUS基因融合后转化红色苹果细胞悬浮体系，能够检测到GUS和uidA基因的表达，同时DFR基因的表达量增加。,8DFR基因的转录调控迄今发现的花青素合成调节因子主要包括Myb转录因子，Myc家族的bHLH转录因子和WD40蛋白。其中Myb转录因子含有保守的DNA结合结构域，每个Myb结构域约含5152个氨基酸残基，包含一系列高度保守的残基和间隔序列，并含有特异的DNA序列识别区和启动子结合区。如玉米的C1P1和P基因；bHLH家族蛋白都有一个螺旋环螺旋结构区域和4个保守功能区域bHLH转录因子可以结合到特异的DNA序列上。某些bHLH转录因子在花青素途径调控中需要与Myb类转录因子共同作用，如金鱼草Delila基因。WD40重复蛋白是一种螺旋蛋白，核心区域由40个氨基酸残基组成，可以促进蛋白与蛋白之间的相互作用。它发挥作用时必须与Myb转录因子，bHLH转录因子形成蛋白复合体，如拟南芥的TTG1编码WD40蛋白基因。,花青素途径的转录调节并不是单纯的激活转录，也有抑制转录的作用。起抑制作用的主要是Myb家族类的调控因子。草莓中分离出的FaMYB1基因编码一个相对较短的Myb蛋白。该基因在转色成熟和过熟的果实中表达转入烟草过量表达后，