（茶学专业论文）几种食源性多酚对消化道主要酶活性影响的研究.pdf

摘要 几种食源性多酚对消化道主要酶活性影响的研究 专业茶学硕士研究生 王昕 指导教师肖纯副研究员 摘要 茶多酚、单宁酸和没食子酸是人类食物结构中最广泛和典型的多酚类化合物。尽管此类 多酚类化合物已被证明对人体具有特殊的功能性，但其作用机理还有待探索。 由于食源成分须经人体消化道吸收后才能发挥作用，因此，从多酚与消化道酶的关系为 基础研究多酚类化合物对人体的作用是最基本、最重要的前提。 由于多酚化合物具有非常活泼的化学性质，受酸、碱和氧等因素的作用，在碱性溶液或 氧化酶存在的条件下氧化很快，氧化后的产物化学性质活泼，参与很多反应；因此，除特殊 的分析条件和显色剂外，很多测定方法，尤其是分光光度法测定对实验结果存在相当大的干 扰。本文经摸索、试验和验证建立了与研究目标相对应的简单、适用、重现性好且准确的消 化道蛋白酶酶活性测定方法，进而对食源多酚与消化道酶活性之间的关系进行了研究，探讨 以茶多酚、单宁酸和没食子酸为代表的食源多酚与以胰蛋白酶和胃蛋白酶为代表的消化道蛋 白酶活性的关系，及以脂肪酶为代表的消化道脂肪活性之间的关系。实验结果同时表明： ( 1 ) 基准校正的酸度计指示甲醛滴定法是一种测定游离氨基酸含量的可靠方法；通过改 变和设定特殊的试验条件，甲醛滴定法是测定消化道蛋白酶活性的高重现性、可靠性的便捷 方法之一。该方法测定家猪胰蛋白酶( t r ”s i l l ) 酶活的最适p h 为7 5 、最适反应时间为3 0 r 血、 最适反应温度为3 7 ，在该条件下，t r y p s i i l 的酶活为9 1 0 u m g 的酶活强度，通过双倒数作 图法，求得t d ，p s i i l 的米氏常数k 棚值为1 4m 0 1 几；该方法测定胃蛋白酶( p 印s i l l ) 酶活的最 适p h 为2 0 、最适反应时间为3 0 r n i n 、最适反应温度为3 7 ，在这一条件下，p 印s i l l 的酶活 为2 1 7 嘶n g 的酶活强度，通过双倒数作图法，求得p 印s 访的米氏常数k m 值为0 4 2m o l l 。 ( 2 ) 基准校正的酸度计指示酸碱滴定法是测定脂肪酶( l i p 笛e ) 的高可靠、高重现性测 定方法；测定l i p a 酶活的最适p h 为6 9 、最适反应时间为3 0 i 血、最适反应温度为3 7 ， 在该条件下，l i p 觞e 的酶活为1 0 0 4 u i n g 的酶活强度，通过双倒数作图法，求得【，i p 弱e 的米 氏常数k 。值为o 0 2 8 m 0 1 l 。 ( 3 ) t p 对t r y p s i n 的活性具有抑制作用，当添加浓度为l 加g m l 的t p1 m l 时，相对酶 活下降到5 3 7 ，其抑制率达到4 6 3 ，t p 对t r y p s i i l 酶活性抑制类型为竞争性抑制，抑制常 数k 为0 0 7 m g ，m i ，：t a 对t r y p s i l l 的活性同样具有抑制作用，当添加浓度为1 m 咖l 的t a l n l l 时，相对酶活下降到7 6 7 ，其抑制率达到2 3 3 ，t a 对t r y p s i n 酶活性抑制类型也为竞争性 西南大学硕士学位论文 抑制，抑制常数l ( i 为0 0 9 m g m l ：( 认对t r ) ，p s i n 的活性具有抑制作用，当g a 的浓度为 o 0 0 5 3 m 咖l 时，相对酶活下降到1 6 3 ，其抑制率达到8 3 7 g a 对t r y p s m 酶活性抑制类 型也为竞争性抑制，抑制常数k i 为1 0 3 1 0 一m 幽n l 。 ( 4 ) t p 对p 印s i r i 的活性具有抑制作用，当添加浓度为l m 欧i l l 的t p l m l 时，相对酶活 下降到6 1 2 ，其抑制率达到3 8 3 ，1 1 p 对p e p s i l l 酶活性抑制类型为竞争性抑制，抑制常数 k i 为0 0 5 m g ，h l l ：t a 对p e p s i i l 的活性同样具有抑制作用，当添加浓度为l m 酌n l 的1 al m l 时，相对酶活下降到7 2 4 ，其抑制率达到2 7 6 ，1 a 对p e p s i n 酶活性抑制类型也为竞争性 抑制，抑制常数k 为0 0 1 2 m g n l l ；g a 对p e p s i n 的活性具有抑制作用，当g a 的浓度为 o 0 0 5 3 m 幽n l 时，相对酶活下降到4 3 3 ，其抑制率达到5 6 7 ，g a 对p 印s i n 酶活性抑制类 型也为竞争性抑制i 抑制常数k i 为o 0 6 5 m 幽n l ： ( 5 ) t p 对l i p a s e 的活性具有抑制作用，当添加浓度为1 m 鲈n l 的t p l l l l l 时，相对酶活 下降到5 7 2 ，其抑制率达到4 2 8 。t p 对t r y p s i i l 酶活性抑制类型为竞争性抑制，抑制常数 k i 为o 1 7 m 鲈n l ；1 a 对l i p 鹳e 的活性同样具有抑制作用，当添加浓度为1 m 酌l 的1 al i l l l 时，相对酶活下降到4 7 5 ，其抑制率达到5 2 5 ，1 a 对“p a s e 酶活性抑制类型也为竞争性 抑制，抑制常数k i 为0 1 0 7 m g 瑚【l ；g a 对l i p 雒e 的活性具有抑制作用。当g a 的浓度为 o 。0 0 5 3 m g m i ，时，相对酶活下降到4 7 5 ，其抑制率达到5 2 5 ，g a 对l i p a s e 酶活性抑制类 型也为竞争性抑制，抑制常数k 为o 0 3 6 m 幽n l 。 ( 6 ) 本文的研究结果与相同方向的工作有一定差异，或不一致，经重复试验，结果表明 多为这些研究报告未排除干扰所致。 ( 7 ) 限于研究条件，尤其是时间等客观特殊情况，本文的获得的研究结果与预期工作尚 有一定差距而有待探索和完善。 ( 8 ) 结果表明，饮茶对人体摄入蛋白质的消化吸收有一定的抑制作用，与人们的期望有 一定距离，但为阐述饮茶，尤其是饮绿茶对高蛋白饮食的调节作用：牧区喜好砖茶和部分发 达国家喜好红茶加奶的民俗提供了直接的科学依据。 ( 9 ) 1 1 p 对脂酶的活性具有抑制作用，结果表明，饮茶对人体摄入脂肪的消化吸收有一定 的抑制作用，与人们的期望有一定距离，但为阐述饮茶，尤其是饮绿茶对高脂肪饮食的调节 作用提供了直接的科学依据。 关键词：食源性多酚消化道酶抑制抑制动力学 i l a b s t r a c t t h es t u d yo fs e v e r a lf 0 0 d b o r n e p o l y p h e n o l s0 n t h e j 一 1 a c t l v l t y0 is o m ed l g e s t l v ee n z y m e s m a j o r ：t e as c i e n c e c a n d i d a t e ：w a n gx i n s u p e r v i s o r ：x i a oc h u n a b s t r a c t t p ，t a n m c i d 锄dg a l l i ca c i da r ct h er n o s te x t e i l s i v e 锄dt y p i c a lp o l y p h e 芏l o l so fh l n a nf o o d a tp r e s e n t ，m e s ep o l y p h e n o l sh a v eb e e i lp r o v e dt 0b eh a v e 锄u l t i p l ef 眦c t i 伽i a lr o l eo nh u m 孤 b e i l l g s b u t 1 0m e c h a i l i s mo f p o l y p h e n o l sh a v e tb e e nc l e a l l ye x p l a m e d a 5t l l ef 的d b o m ep o l y p h e i l o l ss h o u l db ed i g e s tm r o u 曲g a s 仃0 i 1 1 t e s t i m lb e f o 托a b s o r b e d ， m o s ti m p o r t 卸tp r e m i s ei st 0s t u d yt h ep o l y p h e n o l so n 吐l er 0 i eo ft l l eh l m 觚b o d yt l l r o u 曲 r e s e 锄- c h m gm er e l a t i o n s h i pb e t w e e np o l y p h e n o l sa n dd i g e s t i v ee n z y m e s t h ed i g e s t i v e 一缸a c tl l 乏击i t a t sa c o l t l p l e x ，a n dp o l y p t i e n 0 1 sh 懿av e r yl i v e l yc h e i i l i c a lp r o p e r t i e s t l l a ti tc a r ib ea 位c t e db ya c i d ，a l l 【a l i ，o x y g e na i l do t l l e rf a c t o r s ，u n d e r 舸c hc o n d i t i o 璐0 x i d a t e r a p i d l y t h eo 妇d a t i o np r o d u c t sc a np a r t i c i p a t ei nal o tr e a c t i o nb e c a u s et l l e r cc h a i i l i c a lp r o p 戒e s 眦 l i v e l y t l l e r e f o r c ， t l l e 聆i sas i g n j 丘c 姐t d i s l l l p t i o nb ym a n y d e t e r m i i l a t i o n p e r t i c u l a r l y s p e c t r l ) p h o t o r i l e 缸y ，e x c e p ts p e c i a l 锄山y s i sc o n d i t i o n s 锄dr e a g e m t 1 1 i sa n i c l ee x p l o r e das i i l l p l e ，c u f a t ea n dw e l lr e p m d u c i b l em e 幽u r e m e n to ft l l e t i v i t ) ro f g a s t r o i n t e s t i l l a lp r o t e a s e ，i i lo r d e rt os t u d ym er e l a t i o n s l l i pb e t w e e nt 1 1 ep o l y p h e n o l sa n d t i v i 哆o f d i g e s t i v ee n 2 y i l l e f 硼l e rm o r et oe x p l o r et l l e 托l a t i o l l s k pb e 锕e e nf o o d b o m ep o l y p h e r l o l s ，w i l i c h t a k et e 枷c i d 锄d 髓1 l i ca c i d 嬲t i l er 印陀s e l l t a t i v e 觚dt l l ed i g e s t i v e 位i c tp r o t e 弱ea c t i v i 妙s u c h 鼬匈伊s i i l 锄dp 印s i n 锄dm ed i g e s t i v e 仃a c t t i v i t yo fl i p 觞e ，s u c h 弱p a n c r e a t i cl i p 弱e t h e 心s u l t s s h o u e dt l l a t ： ( 1 ) f o m l a l d e h y d ei n s 价l c t e db yb e n c l l l n a f kc o r 陀c t e d i d i m e t e ri saa 佗l i a _ b l ew a yt 0m e 弱眦 m ec 彻t e n to f 船ea l l l i n oa c i d q 姗g i i l gt 1 1 et e s tc 册d i t i 蚰s ，f 0 彻a l d e h y d ec 觚b c 璐e dt o 腓鼬u 豫o f t 帅s i n 孤dp e p s i na c t i v i 吼t l l eb e s td e t e m l i n a t i o nc d i t i o 璐w e r e 弱f o l l o w s ：p h7 5 ，r e a c t3 0l i l i n ， 3 7 ，t h ea c t i v 时o f 奶，p s i i lw 私9 1 0u i n g ，l em i c h l i sc o i l s t a n tk mo f 幻p s i i l s1 4m 0 1 l u s i n gm ed o u b l ec o u n t d 0 、j i ，i lm a p p i i l gm e t l l o d w i l i l em eb c s td e t e 姗i i n a t i o l lc o n d i t i o 璐o f 廿l ep 印s i i i a c t i v 时w e 他舔f o l i o 、s ：p h2 o ，陀t3 0m i i l ，3 7 ，t i l ea c 嘶锣o f p e p s i l lw 豳2 1 7u m g ，t l 托k m w 勰0 4 2m 0 1 l ( 2 ) f o l 瑚l d e h y d ci 璐咄锄b yb e n d 吼破c o r r e c t c da c i d i m e t e ri saa 托l i a b l e 勰dw c u r e p r o d u c i b l ew a yt om e 鹬u t h e d 、，i t yo fl i p 私e ，t l l eb e s td e t e m i n a t i o nc o n d i t i o r 略w e ：p h6 9 ， r e t3 0i n i i i 3 7 ，t h e t i 、，i 哆o f l 啦睇w 鹬1 0 0 4u n l g ，n l ek mw 私0 0 2 8 m o l l i 西南大学硕士学位论文 ( 3 ) t pc a ni n h i b i tt h ea c t i v i 够o f1 狮s i i i ，w h e na d d e d1m g n 1 lo ft plm l ，m er e l a t i v ea c t i v i 秒 f e l lt o5 3 7p e r c e n t ，t l l ei 1 1 l l i b i t i o nm t eu pt o4 6 3 i n l l i b i tt ) p ew 舔c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n ，i n i t i o n c o n s t a n tw 2 l so 0 7m g r i l l ；t ac 孤a i s oi n l l i b i tt t l et r y p s i l la c t i v 时，、沛e na d d e dlm g r i 儿o f t a 1 札，t h er e l a t i v ea c t i v 毋f e l lt o7 6 7p e r c e n t ，i t si n 硒b i t i o nm t eu pt o2 3 3 ，i i l l l i b i tt ) ，p ew 蕊 c o i n p e t i t i v ei n k b i t i o n ，i n 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t i v em l l i b i t i o n ，i r t h i b i t i o nc o n s t a n tw a s0 0 1 2m 咖l l ；( 认a l s oi r l h i b i tt h ea c t i v 时o fp 印s i i l ， w h e nm ec o n c e n 缸a t i o no f ( aw 雒0 0 0 5 3m g n l l ，m er e l 撕v ea c t i 、r i t ) ，f e l it 04 3 3 p e r c e n t ，i t s i n l l i b i t i o nr a t ew a s5 6 7 ，t 1 1 em 1 1 i b i t 卯ew 觞c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n ，i n l l i b i t i o nc o n s t a n tw 笛0 0 6 5 m g n l l ( 5 ) t pc a ni n l l i b i tt h ca c t i v i 移o fl i p a s e ，、h e na d d c d1m g l n lo ft p1m l ，t 1 1 er c l a t i v ca c t i v i i ) r f e l lt o5 7 2p e r c e n t ，i t si n h i b i t i o n 豫t eu pt o4 2 8 ，m ei 1 1 1 1 i b i tt ) r p ew 弱c o i n p e t i t i v ei n l l i b i t i o n ， i n l l i b i t i o nc o l l s t a l l t 麟0 17m g m l ；t ac a na l s oi 1 1 1 1 i b i tt l l ea c t i v i t ) ，o fl i p a s e ，w h e na d d e d1 m g n 1 lo ft p1 m l ，t 1 1 er e l a t i v ea c t i v i t yf e nt 04 7 5p e r c e n t ，i t si n l l i b i t i o nr a t eu pt o5 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di m p r 0 v e d ( 8 ) t h er e s u l t ss h o w c d 吐l a t ：d r i n k 血gt e a1 1 a v eac e r t a i l li 1 1 l 曲i te 疏c to nt l l eh u m 卸b o d y si i l t a k e o fp r o t e i n d i g e s t i o na n da b s o r 蛳o n ，t h i s h a v eac e 概nd i s t a i l c e b c 柳c h u m 雒b e 沁g s e x p e c t a t i o n s b u t “ss t i l d yp r 0 v i d et l l ed 打e c ts c i e n t i f i cb 觞i sf i o ri n t e 甲r e t a t i o no f “m d n gt e a e s p e c i a l l yg r e e nt e ao nt l l er e g u l 撕0 no f1 1 i 9 1 1 - p r o t e i i ld i e ta n dt l l ef i o l l 【o fp 私t o m la r c 雒p r e f hb r i c k t e a 锄ds o m ed e v e l o p e dc o u 碱e s p r e f - e r c e so f 出湖d n gb l 孔kt e aw i mn l i l l c ( 9 ) t pc 锄i r l l l i b i tt 1 1 ea c t i 、r i t yo ft r ) ，p s i i l ，t h er c s u l t ss 1 1 0 w e d l a t ：d i 证k i i l gt c ai 肌ac 硎栅 i z l l l i b i te 妇溉t 硷h u m 觚b o d y si n 切k eo ff a td i g e s t i o n 柚da b s o r p 石o n 也i sh a v eac e r t a i l ld i s t a l l c e b e t 、e e nh l l f 啪b e i i l g sa 【p e c 蜥s b u t l i ss t l l d yp r o 、r i d el h cd i r e c ts c i e n t i 6 cb 鹞i s 细 i i l t e r p l l e 伽o no f 舒i l l i i l gt e ae s p e c i a l l y 伊e 锄t e a0 i l 抢1 1 e g u l 撕0 no f l l i g h - 缸d i c t 1 【e y w o r d s ：f o o d b o m ep o l ，p h e n o i ，d i g 豁t i v ee n 缸m 姻，i n h m 也i n h i b i t o r yl ( i n e t i 伪 i v 独创性声明 学位论文题目：一且盘盒塑性垒睑盘消焦道圭墨堕适丝整堕煎珏究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中引用他 人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做 出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 口可 签字日期： 沙孕年 6 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学 研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： l ；矿 签字日期：硼鬈年石月够日 导师签名：钐弘窆 签字日期：力形召年乡月 第一章文献综述 第一章文献综述勇；一早义陬琢尬 人类植物性食物中，多酚类化合物占有非常高的比重。随着食物加工和食物资源植物的 人工栽培、引种和驯化，近代以来的现代育种和栽培技术的应用尤其是生物工程和设施农 业的出现，人类植物性食物中多酚类化合物占的比重越来越低，食源多酚类化合物与人类健 康的关系成为人们共同关心的重大问题。 除以茶为代表的传统饮料和特殊生境中生存的人群的特殊饮食外，人类摄食不以摄取的 多酚类为主要目的。来自于食物的多酚类主要以伴随成分的形式存在，但我国西、北部牧民 的“宁可三日无米，不可一日无茶”和国外高脂肪、高蛋白民族对茶和富含多酚类的苔癣等 植物性食物资源的依赖性，表明食源多酚类对人体健康和机能有不可替代的作用。 1 1 植物多酚类化合物的研究进展 1 1 1 多酚类化合物的概述 植物多酚( p l a i l tp o l y p h e n 0 1 ) 又称植物单宁，是植物体内的复杂酚类次生代谢产物，具有 多元酚结构，主要存在于植物体的皮、根、叶、壳和果肉中。植物多酚在自然界中的储量非 常丰富。人类对植物多酚的认识和利用可以追溯到远古时代，当时的人们就已经有意识地将 植物多酚用于鞣制皮革。植物多酚的研究始于1 8 世纪末，1 7 9 6 年s e g i i i i l 首次将植物水浸提 物中可使生皮转变为革的多酚类化合物合称为“植物单宁”。w 1 1 j t e 和b a t e s i i l i t l l 定义植物单 宁为相对分子量在5 0 0 3 0 0 0 范围内的具有鞣性的多元酚。而“植物多酚这一术语是由h a s l a l t l 在1 9 8 1 年根据单宁的分子结构及分子量提出的，涵盖了所有单宁以及与单宁的衍生物质。由 于具有独特的功能活性，目前植物多酚己广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等相关领 域，并发挥着不可替代的作用。同时，随着天然产物开发利用的逐渐兴起，植物多酚类物质 已成为天然产物和有机化学研究的热点，国内外科研工作者纷纷从各个领域和角度对植物多 酚开展了广泛深入的研究工作【。 ( 1 ) 植物多酚的结构6 k f 咒u d e n b e 篷在1 9 2 0 年提出植物多酚的科学分类法。按照单宁的化学结构特征，可将其 分为水解单宁( 1 1 y d r o l y s a b l et a n i l i l l s ) 和缩合单宁( c o n d e n s e dt a n n j n s ) 两大类。水解单宁主要是聚 桔酸酯类多酚，即桔酸及其衍生物与多元醇以酯键连接而成，可以分为桔酸单宁和鞣花单宁 两类：缩合单宁则主要由聚黄烷醇类多酚或原花色素。即羟基黄烷酵类单体的组合物，单体 间以c c 键相连【2 1 。水解单宁和缩合单宁在结构组成上完全不同，因此它们在化学性质和应 用范围上的差异显著。如水解单宁在酸、碱、酶的作用下不稳定，易于水解；而缩合单宁则 相对稳定，但在强酸作用下会缩合成不溶于水的物质【3 】。水解单宁和缩合单宁在分子结构上仍 具有一些共性，如二者的酚羟基数目多，并以邻位酚羟基最为典型：分子量都较大，且分布 较宽【4 1 。正是这种化学结构，赋予了多酚独特的化学性质。 西南大学硕士学位论文 ( 2 ) 植物多酚的化学性质 植物多酚可通过疏水键和多点氢键与蛋白质发生结合反应是其最重要的化学特征。植物 多酚与其他生物大分子，如生物碱、多糖等的分子复合反应也与此相似。植物多酚中多个邻 位酚羟基可与金属离子发生络合反应，该反应是其多种应用的化学基础【5 l 。抗氧化性也是植物 多酚的一个重要性质。由于植物多酚的酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自 由基有较强的捕捉能力，使植物多酚具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力。另外，植物 多酚在2 0 0 一3 0 0 1 1 m 之间还有着较强的吸收紫外光能力。随着植物多酚结构和化学性质研究工 作的不断深入，人们对植物多酚的认识了解逐步加深，同时也为植物多酚在多领域中的应用 奠定了理论基础。p h 对植物多酚的稳定性有影响，如茶多酚在p h 值2 8 之内稳定。p h 8 和光照下易氧化聚合【6 】。 ( 3 ) 多酚化合物在人体消化道中的吸收和代谢 对于大部分的多酚类化合物来说，肝脏和消化道是其代谢的主要场所。大部分口服的多 酚类化合物，在胃肠道内即发生代谢、吸收进入体内的成分是其代谢产物而不是其原形成分； 对于静脉给药，主要在肝脏里发生生物转化反应【7 1 。黄酮苷在肠道中容易发生水解反应，而黄 酮苷元在肝脏中易发生转化反应。肠道中的细菌酶把糖基从苷配基释放出来后，约1 5 黄酮 苷和胆汁一起被吸收到上皮细胞中，然后进入淋巴。决定从肠道吸收黄酮苷效率的一个重要 因素是糖基部分【8 】。 肠内腔淋巴血液 一 一o ，3 1 ，4 一 一 j一 血液 尿 图1 1 高等动物黄酮类代谢的微模型 f i g 1 1m i c r o - m o d e lo fn a v o n o i dm e t a b o u s m l nh i g h e ra n i m a l s 黄酮类的通道从肠上皮细胞l ；经过血液和淋巴到肝细胞2 ：高尔基体或过氧化物酶3 ；又经过血液到肾 小球细胞4 1 1 2 植物多酚类与蛋白质作用的研究进展 ( 1 ) 多酚类一蛋白质反应机理 植物多酚类具有许多活泼位点赋予它一系列独特的化学性质，其中植物多酚类与蛋白质 的结合是其最重要的特性之一。早在1 8 0 3 年，d a 、，y 就发现多酚类与蛋白质的可逆反应现象。 但是直到2 0 世纪8 0 年代，多酚类的分离技术发展后，才有可能从分子结构水平上进行研究。 早期研究认为，多酚类与蛋白质结合的主要形式为氢键。多酚类的大量酚羟基与蛋白质主链 的肽基n h c o ，侧链上的o h 、n h 2 以及c o o h 以氢键的形式多点结合。然而深入研究表明， 虽然多酚类对于蛋白质都有结合能力，但是仍然具有选择性体现在不同的多酚类对于不同 的蛋质的亲和力差异上。a s q u i m 认为对多酚类亲和性高的蛋白质特征为：分子量较大，结构 开放松散，脯氨酸或其它疏水性氨基酸含量较高。这表明多酚类一蛋白质结合形式不只是氢 键形式石碧在考察了甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸等一系列氨基酸对水解类 2 第一章文献综述 单宁亲水性的影响后，证实了氨基酸脂肪基越大，疏水性越强，与单宁的结合越好，从而说 明了多酚类与蛋白质的结合中疏水键也是一种重要的形式。另外也有研究表明，多酚类的分 子量及结构不同对多酚类与蛋白质的结合强度有影响。对水解单宁而言，只有分子中含有4 个以上的倍酰基时，才具备沉淀蛋白质的能力。迸一步研究表明多酚类一蛋白质结合是分子 识别的典型例子。要考虑作为供体的多酚类和作为受体的蛋白质的分子组成、结构和构型， 也要考虑到它们的协同作用。h 觞l 姗等认为，可用“手一手套”( h a i l d _ 1 r r 电l o v e ) 模型来 说明此反应。蛋白质分子中疏水基团较集中的部位构成“疏水袋”，多酚类分子进入“疏水袋” 中并通过氢键加强结合【9 】。 ( 2 ) 多酚类一蛋白质络合反应的影响因素 黄惠华等根据游离蛋白质含量的变化，以其在5 9 5 锄的波长下的吸光度为指标，研究多 酚类物质与蛋白质的络合起混反应。在研究影响多酚类一蛋白质反应的各种因素中，发现温 度，体系的p h 值，有机溶剂乙醇，反应中多酚类一蛋白质的比例等都对多酚类一蛋白质络合 物的生成量有一定的影响。在4 0 ，p h 值为3 5 ，乙醇浓度为6 ，明胶与单宁酸的质量比例 为5 ：1 时，产生的多酚类一蛋白质络合物的量最大【1 0 1 。 ( 3 ) 多酚类化合物与酶活性的关系 多酚对酶促反应的抑制作用可能是几方面因素共同作用的结果：首先，作为生物催化剂 的酶其化学本质是蛋白质，与一般的蛋白质( 例如明胶) 一样。酶也可以与多酚类结合生成 可溶或不可溶的结合物。结合物较酶的构形有所改变，酶的催化活性降低或丧失；其次，对 于以蛋白质、多糖等生物大分子为底物的酶促反应，黄酮也可同时与底物结合，剥夺蛋白酶、 果胶酶的催化反应底物，或生成对酶反应活性降低的底物：此外，金属离子如m 9 2 + 、z i l 2 + 、m n 2 + 对某些酶起到激活作用，有的还作为酶的辅基构成酶催化活性部位，多酚类对这些金属离子 的络合也可对酶产生抑制作用。一般认为，黄酮对酶的抑制作用主要是由于黄酮对蛋白质的 结合性【9 1 。 何强等f 1 1 】研究了茶多酚类对a 淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂酶活性的影响，实验证 实，茶多酚对这几种消化酶具有抑制作用，当添加茶多酚的量为o 0 5 m g ，r n l 时，茶多酚对a - 淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂酶的抑制率分别为6 l ，3 2 ，3 8 和5 4 。雷芳1 1 2 】考察 了葛根素对胃蛋白酶的抑制作用，并通过紫外光谱法和荧光光谱法研究葛根素与胃蛋白酶的 结合方式。葛根素是一种黄酮苷，对胃蛋白酶具有抑制作用，其抑制类型为非竞争性抑制。 葛根素与胃蛋白酶分子结合形成稳定缔合物。从而改变后者分子构象，使胃蛋白酶的紫外吸 收差谱迅速增强，特征荧光峰产生静态淬灭。杨娟【1 3 l 利用紫外分光光度法和荧光光度分析法 研究芦丁对a - 淀粉酶的作用，芦丁对a - 淀粉酶具有抑制作用，是由于芦丁与a - 淀粉酶形成了 稳定的络合物，阻止了酶与底物的反应。 1 2 人体消化酶与多酚类化合物关系的研究概况 1 2 1 人体消化酶的研究概况 人体消化酶包括唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等。 3 西南大学硕士学位论文 表1 1 人体消化道酶【1 4 】 t h b 1 1d i 2 e s t i v ee n z y m e so fh u m a nb e i n 2 s 产生部位种类分解对象消化产物作用部位 p r o d u c es i t ek i n d d e c o m p o s i t i o nt a r g e td j g e s t i o np r o d u c t l o c a t i o nr 0 1 e 涎腺唾液淀粉酶碳水化合物单糖口腔 胃腺胃蛋白酶 肝脏胆汁 小肠 麦芽糖胸、薹糖腾乳糖 胰腺 胰淀粉气蓄墨肪酶、胰 蛋白质 脂肪脂质 碳水化合物 碳水化合物、脂肪朋旨质、 蛋白质 氨基酸 甘油朋旨肪酸 单糖 氨基酸、甘油脂肪酸、 单糖 胃 小肠 小肠 小肠 ( 1 ) a 淀粉酶 a 淀粉酶( a a m y l 勰e ) 为l ，4 伍d 葡萄糖苷水解酶，能催化淀粉、糖原和其它寡糖中的a 1 ， 4 糖苷键断裂，生成麦芽糖、少量葡萄糖及一系列分子量不等的低聚糖和糊精州。因为所产生 的还原糖在光学结构上是口型的，故称此酶a 淀粉酶。a 淀粉酶不能切开支链淀粉分支点的 a 1 ，6 键，也不能切开a 1 ，6 键附近的a 1 ，4 键，只能切开内部的a 1 ，4 键【1 4 】。 a 一淀粉酶通常在p h 5 5 8 o 之间较为稳定【1 5 ，1 6 】，大多数一淀粉酶的最适温度为5 0 到6 0 ，分子量通常为4 5 0 0 0 一6 0 0 0 0 d a 。仅一淀粉酶的活性和稳定性依赖于氯离子和钙离子的存在【1 7 】。 a 一淀粉酶被广泛应用于粮食加工、食品、发酵、纺织、医药等多个行业，在制造葡萄糖、啤 酒液化、酱油和醋的原料处理、织物退浆、生产助消化药物、改善面包的质量与风味、香料 加工、造纸等方面显示出广泛的应用价值【1 8 】。 ( 2 ) 胃蛋白酶 胃蛋白酶是由泌酸腺的主细胞分泌的胃蛋白酶原经胃酸或已被激活的胃蛋白酶激活而 成，其最适p h 为2 0 ，在p h1 3 时具最大的分解蛋白质活性，p h 为6 o 时则几乎完全失活， 它是一种肽链内切酶，裂解芳香族氨基酸( 苯丙氨酸和酪氨酸) 的肽链，在强酸环境里将蛋 白质水解为胨，以及少量的多肽和氨基酸。胃蛋白酶是胃液内几种消化酶中最重要的一种， 其含量代表胃液的消化能力但胃蛋白酶对机体消化蛋白质并不重要【1 9 1 。 ( 3 ) 胰蛋白酶 胰蛋白酶是由胰腺腺泡细胞分泌的消化酶，它以非活性的胰蛋白酶原的形式被分泌出来， 在十二指肠部位接受肠激酶的激活作用，其n 端第1 6 _ _ 2 3 位序列为a p f d d d d k 的活化肽口a p ) 被切除，成为具有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶能高度特异地水解精氨酸或赖氨酸羧基参与形 成的肽键、酰胺键和酯键，是对底物选择性最高的蛋白酶之一其高度专一性表现为对碱性 氨基酸一端的选择，属于族专一性( 基团专一性) ，水解活性敏感度为酯键 酰胺键 肽键【2 。胰 蛋白酶由2 2 3 个氨基酸残基组成，其单一肽链含有六对二硫键【2 2 1 4 第一章文献综述 ( 4 ) 脂肪酶 脂肪酶( l i p a s e ，e c3 1 1 3 ) 又称脂肪细胞内激素敏感性甘油三酯脂肪酶，或三酰基甘 油酰基水解酶。只有当胰高血糖素等激素作用于脂肪细胞膜表面受体，激活腺苷酸环化酶， 促进c a 胛合成，激活依赖c a 肝的蛋白激酶，是细胞内的脂肪酶磷酸化而活化后，才能使脂 肪的主要成分甘油三酯水解成甘油及游离脂肪酸。即脂肪酶只有在磷酸化后才会具有活性， 才能加速脂肪动员。普遍存在于动、植物和微生物中，是一种专一、高效的生物催化剂。它 可催化油脂的选择性水解及其它酯类的转酯、氨解反应，是一种重要的工业用酶，被广泛应 用于油脂水解、食品风味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性等【1 4 1 。 1 2 2 人体消化道的生化环境 唾液是无色无味近中性液体如人腮腺在无刺激情况下所分泌的唾液p h 为5 4 6 6 0 6 当受刺激时，腮腺唾液的p h 升高，最大值达p h 7 8 。唾液中水分占9 9 以上，还有唾液淀粉 酶、黏蛋白、溶菌酶、蛋白质、舌脂肪酶、免疫球蛋白、腮腺激素、神经生长因子、血管舒 缓素、血型物质、游离氨基酸及少量的电解质，如n a + 、k + 、c l 。、碳酸氢盐、