（分析化学专业论文）微流控芯片上原位聚合固相萃取样品预处理.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 微型全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ，p t a s ) 是近年来发展起 来的分析化学研究新领域，箕最终目标是在几厘米大小的芯片上实现化学全分析 过程。目前的研究主要集中在微芯片上的混合、反应、检测等方面，微芯片上样 品的分离富集等预处理过程涉及较少。本文提出采用原位聚合技术，在毛细管玻 璃微管道内原位制各出阴离子交换型的固相萃取( s p e ) 微柱，将其与微流控芯片 接台起来，形成带有s p e 微柱的复合式微流拉芯片。利用相应分析测试手段验证 了原位聚合s p e 微柱分离富集的性能，在复合式微流控芯片上实现样品的分离富 集、混合、反应、检测等过程。 本论文主要考察了热引发、密闭条件、反应时间等聚合反应影响因素，分析 了聚合反应各组分对s p e 微柱性能的影响，制备出原位聚合阴离子交换型s p e 微 柱。通过s e m 表征了原位聚合法制备的s p e 微柱具有多孔网状结构，显微观察法 与s e m 表征法结合起来，证实在有致孔荆存在的条件下有利于原位聚合反应形成 多孔网状结构的s p e 微柱。用k b r 0 3 - 溴百里酚蓝一n 0 2 一催化光度法分析了 0 4 m m 、柱长2 e r a 的常规s p e 柱对n 0 2 - 阴离子的吸附作用，吸附效率为6 5 1 。 紫外( u v ) 法测试了常规s p e 柱对n 0 2 一的富集作用，富集倍数为3 0 3 ；缩微化的 0 4 0 0t tm ，柱长2 c m 的s p e 微柱对n 0 2 - 的富集倍数为2 9 0 ：用s p e 微柱对n 0 2 一进行在线富集，在线富集倍数为7 7 9 。在复合式微流控芯片上，利用氨基酸一h 2 0 2 l u m i n 0 1 化学发光体系，验证了s p e 微柱对p h = 9 6 0 的l 精氨酸和l 一苯丙氨 酸具有不同的选择性，可利用s p e 微柱分离保留性质相差很大的两种组分。针对 n a n o r - k i - - l u m i n o l 化学发光体系构建了复合式微流控芯片体系，讨论了进样方 式、流速、检测窗口等的选择，分析了复合式微流控芯片上s p e 微柱对n 0 2 - 的有 效理论塔板数为1 0 2 ，通过漏出曲线法和漏出容量估算法分析了s p e 微柱的柱容 量。 在自制的复合式微流控芯片上，利用n a n 0 2 - - k i - - l u m i n o l 发光体系，实现 了午餐肉和自来水中痕量n 0 2 - - 的在线分离富集、混合反应和检测，测得午餐肉中 n 0 2 - 的含量为1 4 6 3 m g k g ，自来水中n 0 2 - 的含量为o 0 5 2 m g k g 。 关键词：原位聚合，s p e 微柱，分离与富集，复合式微流控芯片 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ( b t t a s ) i sad e v e l o p i n gn e wf i e l do fa n a l y t i c a l c h e m i s t r yr e c e n t l y 1 t sf i n a l l yg o a li s t h a ta l lp r o c e s so f a n a l 舛c a lc h e m i s t r yc o u l db e p u t i n t oa n dc a r r i e do u to nm i c r o e h i p m o s tr e s e a r c h e r s p a i d m c i ra t t e n t i o no n m i c r o - m i x e r s ，m i c r o r e a c t o r sa n dd e t e c t i o n , w h i l es a m p l ep r e t r e a t m e n tp r o c e s sw a s s o m e h o w n e g l e c t e d s u c ha sm i c r o s e p a r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o no n m i c r o f l u i d i cc h i p i nt h i sp a p e r ，t h ei n s i r ep o l y m e r i z e dm o n o l i t h i cp o r o u sp o l y m e rw h i c hi st h e r m a l l y i n i t i a t e dw i t h i nag l a s sm i c r o c o l u m nw a sp r o p o s e dt o a p p l i e d f o rs o l i d p h a s e e x t r a c t i o n ( s p e ) a n dp r e c o n c e n t r a t i o n i n t e g r a t i n gs p e m i c r o - c o l u m na n dm i c r o f l u i d i c c h i pt o g e t h e r , ac o m b i n a t i o n m i c r o f l u i d i cc h i pw i t hs p em i c r o c o h m mw a se s t a b l i s h e d t h ec a p a b i l i t yo fs p em i c r o - c o l u m nw a se s t i m a t e db ys e l e c t e da n a l ) r t i c a lm e t h o d s , h a l y t i c a lp r o c e s s ，i n c l u d i n gp e r c o n c e n t r a t i o n ，m i x i n g , r e a c t i o na n dd e t e c t i o n ，w e r e r e a l i z e do nt h ec o m b i n a t i o nm i c r o f l u i d i cc h i pa t 】a s t i nt h i sp a p e r ，t h ef a c t o r so f t e m p e r a t u r e ，o x y g e n - f r e ec o n d i t i o na n d p o l y m e r i z a t i o n r e a c t i o nt i m ew e r ei n t e r p r e t e d e f f e c t so ft h ea m o l m to fe a c hm o n o m e ro nt h es p e m i c r o c o l u m np r o p e r t i e sw e r ed i s c u s s e d s p em i c r o c o l u m nw i ma n i o n - e x c h a n g e s o r b e n tw a sp r e p a r e di n - s i t ua tg l a s sc a p i l l a r y t h es t r u c t u r ei m a g eo fp o l y m e r sw e r e o b s e r v e db ym i c r o s c o p ya n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h ( s e m ) p o m g e n i cs o l v e n t m i x t u r ew a so f a d v a n t a g e si nt h ep r o c o s so ff o r m i n gp o r o u ss t r u c t u r ep o l y m e r sd u r i n g i t sp o l y m e r i z a t i o n a b s o r p t i o nc h a r a t e r i s t i co fc o n v e n t i o n a ls p ec o l u m nw a s p r o v e db y c a t a l y t i c - k i n e t i cs p e c t r o p h o t o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fn i t r i t e ，w h i c hw a sas y s t e mo f n i t r i t r e - p o t a s s i u mb m m a t e - b r o m o t h y m 0 1b u i e t h er e s u l t s s h o w nt h a t a b s o r p t i o n e f f i c i e n c yo f t h ec o n v e n t i o n a ls p ec o l u m nw a s6 5 1 a n de n r i c h m e n te f f i c i e n ti s3 0 3 t i m e s s p em i c r o - c o l u m ns t i l lw a so fe n r i c h m e n tc a p a c i t y , i e e n r i c h m e n te f f i c i e n tw a s 2 9 0t i m e s f u r t h e r m o r e ，e n r i c h m e n tt i m e sc o u l da c h i e v e7 7 9t i m e sw i t ho n - l i n e s a m p l et r e a t m e n tb ys p em i c r o c o l u m n a l le n r i c h m e n te f f i c i e n tf o ro n - l i n ep r o c e s s w e r eo b t a i n e db yu v d e t e r m i n a t i o n a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tr e t e n t i o np r o p e r t yo f l p h e n y l a l a n i n e a n dl a r g i n i n ei n p h = 9 6 0 s o l u t i o n t h e s e l e c t i v i t y o fs p e m i c r o c o l u m nw a sd i s c u s s e db yt h ea m i n oa c i d - h y d r o x i d e l u m i n o l s y s t e m i tw a s f e a s i b l et o s e p a r a t ec o m p o n e n t sw i t hs i g n i f i c a n t l yp r o p e r t i e so nt h es e l f - d e s i g n e d c o m b i n a t i o nm i c r o - f l u i d i c c h i p f o rn a n 0 2 一一l u l i n 0 1 t h ef r a m e w o r ko fa m i c r o f l u i d i cc h i pw a sd e s i g n e d s a m p l i n gm o d e ，v e l o c i t yo f f l o w , d e t e c t i o np o i n to f 重壅查兰堡主兰垡笙壅 茎茎塑茎 c h e m i l u m i n e s c e n c ew e r ed i s c u s s e d e f f e c t i v ep l a t en u m b e ro f s p em i c r o c o l u m nf o r n 0 2 一w a sc a l c u l a t e d b r e a k t h r o u g hv o l u m e so fs p em i c r o - c o l u m n f o rn 0 2 w e r e s y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e db y b r e a k t h r o u g h c i , l r v ea n d p r e d i c t i n g m e t h o d s s a m p l eo ft r a c en i t r i t e i nf o o da n dw a r e l w e r ec o n c e n t r a t e do nac o m b i n a t i o n m i c r o f l u i d i c c h i p w i t hs p em i c r o - c o i u m n ，a n de x a m i n e d0 1 1 一l i n eb yas y s t e mo f n a n 0 2 - - k 卜l 啪i n 0 1 t h ec o n t e n t so f n i t r i t ei nl l m c h e o nm e a ta n dt a pw a t e rw e r e 1 4 6 3 m g k ga n d0 0 5 2 m g k gr e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：i n s i t up o l y m e r i z a t i o n , s p em i c r o c o l u m n , s e p a r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o n ， c o m b i n a t i o nm i c r o - f l u i d i cc h i p i i i 重庆大学硕士学位论文 1 前言 1前言 1 1 微流控芯片上微分离发展概况 微型全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ，p t a s ) 是一个跨学科的 新领域，它涉及到分析化学、微电机加工( m e m s ) 、计算机、电子学、材料学、 生物学及医学等学科”，其最终目标是在几厘米大小的芯片上实现化学全分析过 程，成为近年来分析化学研究热点。 近几十年来，随着岬a s 迅猛发展和应用前景不断扩大，以a s 在临床检验、 新药合成与筛选、生物医学中人类基因与疾病关系研究、食品和商品检验、环境 检测、刑事科学、军事科学及航天科学等领域发挥巨大潜力，其应用领域将逐步 扩大到涉及化学成分分析的所有方面【1 ) 。但是在实际分析测试中，特别是对环境 科学、生命科学、生物医学等学科中的样品分析，经常要求检测“g 、n g g 、p g g 甚至更低含量的组分【2 】，目前虽然有许多灵敏度很高的分析方法，但由于存在基体 效应以及其它各种干扰而难以得到准确的分析结果。而采用适当的分离富集技术， 有可能获得选择性更高且准确可靠的分析结果，所以对样品进行分离富集等预处 理显得尤为重要。 在以a s 中，为了降低检出限，消除干扰组分，得到准确可靠的分析结果，样 品的分离富集也是必不可少的一步。目前除了电泳芯片外，其它系统中样品的分 离富集等预处理过程都是在微芯片外实现的，这难免会引起样品的损失和污染等 问题，同时也不利于微型分析系统集成化。因此发展微芯片上样品的分离与富集 技术成为b t t a s 迫在眉睫的任务，这也是“t a s 发展的必然趋势。这种技术的实现必 将朋1 a s 的发展推向一个更新、更高的台阶。 林炳承【3 】曾以电泳芯片为基础，提出电泳芯片微分离学的平台特征，即微芯片 材料和微小尺寸效应对微分离的影响。指出微芯片上的微分离在材质上较毛细管 电泳有更多的选择余地，不同材料影响分离通道加工工艺，同时也影响分离通道 中的电渗流、表面吸附、杂质种类和含量，可以借助传递理论，从理论上比较微 小尺寸效应对分离的影响。j a n k o w s k i 等1 4 】将毛细管电泳、m u r r i h y 等【5 】将微芯片上 离子色谱都称作微分离( m i o r o s e p a r a t i o n ) ，我国学者陆豪杰等【6 】称毛细管电色谱 分离为微分离技术，这些都是微分离技术的雏形。迄今为止，人们对微分离技术 还没有一个统一的界定，这里我们将这种在“t a s 基础上提出来的，具有上述微分 离学平台特征的，在几厘米大小微芯片上实现样品分离与富集等预处理过程，以 取代常规分析实验中的分离方法，使整个分析过程实现真正意义上的微型化、自 动化、集成化和便携化的技术称为微分离技术【7 。 重庆大学硕士学位论文 i 前言 1 2 微流控芯片上的微分离技术 九十年代至今，国内外学者在胛八s 方面做了大量研究，其中多数研究主要集 中在混合、反应、检测等方面。现阶段微分离方面研究又主要集中在毛细管电泳 芯片，而微流控芯片上其它微分离技术涉及较少，目前也只是一些初步研究，发 展相对比较薄弱。 1 2 1 电泳芯片技术 电泳芯片( e c ) 微分离技术是当今研究热点。从1 9 9 1 年至今，在其制作工艺 方面的进展与在生化快速分析的应用充分表明了其微型化的潜力和可行性。微芯 片上毛细管电泳( c e ) 是在常规c e 原理和技术基础上，利用微型制造技术在几 平方厘米大小的芯片上刻蚀出扁平管道和其它功能单元，通过不同管道网络设计 和布局，实现样品分离，是一种快速、高效、低耗的微分离技术【8 】。由于e c 属于 电场驱动微管道分离，进样能够通过电场驱动实现，因此相应技术和装置较易微 型化，微型化后实验条件变化不大，容易移植。王辉【9 】、金亚【8 】等已对微芯片上的 毛细管电泳技术进行了相关综述，这里不再赘述。 目前，电泳芯片的研究主要以电渗流泵为驱动力，以激光诱导荧光( l i f ) 、 紫外或电化学检测器为检测技术。但是电渗流泵只适于离子性液体，l i f 只能检测 荧光标记化合物，而且整个系统需高压电源，这就局限了电泳芯片在样品选择、 进样和检测等方面的进一步发展和应用；而且光学检测方法，特别是l i f 目前难 于微型化，这些不足之处为e c 的发展带来诸多不便。因此国外学者在微芯片上其 它微分离技术方面开展了研究，以取长补短，共同促进微分离技术和微分析系统 整体的发展，诸如：固相萃取、液液萃取、膜分离、色谱分离、磁场分离以及利 用扩散速度差异进行的微分离技术等等。 1 2 2 萃取技术 微流控芯片上萃取技术包括固相萃取( s p e ) 和液液萃取( l l e ) 。s p e 是一 种用固相吸附剂将液体样品中目标化台物吸附，与样品基体和干扰化合物分离， 然后再用洗脱液洗脱或加热解析，达到分离富集目标化合物的目的。s p e 不仅可 以富集待测组分，而且可以分离干扰组分，无需使用超纯溶剂，有机溶剂消耗低， 无相分离操作，容易收集分析物，操作简单。o l e s c h u k 等【1 0 】在微流控芯片上采用 电渗流泵，将直径为1 5 4 岫的十八烷基硅烷( o d s ) 颗粒从管道一端引入特意 设计的空穴中，空穴由两个梯形堰构成，填充满o d s 后的空穴作为分离床，对荧 光素和非极性b o d i p y 进行s p e 分离富集，富集后样品浓缩5 0 0 倍，而且填充颗 粒可以更换。b r c l y l e g 等【1 l 】将c 1 8 固定相涂覆在深5 岫、宽2 5 i _ t m 、长3 0 m m 微管 道内，与开管电色谱( o c e c ) 联用，分离富集多环芳香烃。c o n g y u 等f l 2 】在微流 控芯片管道中，利用紫外( u v ) 激发原位聚合反应，在管道中形成多孔状聚合物 2 重庆大学硕士学位论文 1 前言 作为s p e 固定相，并通过改变正己烷和甲醇混合液的比例，实现对聚合物孔的性 质和管道流动阻力的控制，分离富集了疏水四肽和绿色荧光蛋白质。 微流控芯片上s p e 不同于e c ，它不受液流驱动方式和检测技术限制，而且避 免微芯片外分离富集样品时引起样品损失和污染问题。通常将s p e 接到微流控芯 片上，会降低检出限，改善样品处理范围。但由于微流控芯片体积比较小，所以 在其上制作s p e 比较困难。这里o l e s c h u k 巧妙的微芯片结构设计和c o n g y u 分子 印迹技术引入为微流控芯片s p e 的制作提供了新的思路。 u 正是一种利用物质在互不混溶的两相中不同分配特性进行分离的方法。利用 与水不混溶的有机溶剂，借助萃取剂的作用，使一种或几种组分进入有机相，而 另外一些组分仍留在水相中，从而达到分离和富集的目的。l l e 是一种常用的分 离富集方法，具有选择性好、回收率高、设备简单、操作简便、快速，以及易实 现自动控制等特点。这种分离方式适用于所有液体，包括水溶液和有机溶剂。 h i s a m o t o 等【1 3 “4 垤3 0 6 0 m m 微流控芯片上采用多种有机相分段注射法，根据不 同有机相含不同离子选择性中性离子载体，中性离子载体只能萃取特定离子，有 机相和水相在管道中形成层流，随着液流在管道中流动，不同有机相萃取不同离 子后到达热透显微镜检测器( t l m ) ，该系统可同时萃取分离多种离子，因此 h i s a m o t o 等将其称为多离子传感仪。微流控芯片管道宽2 5 0 岫n 、深1 0 0 i t m ，所需 最小试剂量1 2 5 n l ，大大降低试剂消耗量。因微管道扩散距离短、有机溶剂流速低， 所以信号响快，一般为8 s 。采用的t l m 检测器可检测荧光物质和非荧光物质。方 群等【” 利用停流液滴萃取技术原理的基础之，在微流控芯片上实现捕陷液滴萃取 和微芯片停流萃取系统，萃取浓缩倍率达到1 0 0 0 倍，而其操纵的有机相( 液滴) 体积为n l 级，试样用量( 1 0 i t l ) 仅为传统萃取系统的千分之- - n 万分之一，但 是这种方法需要相对较长的萃取时间( 1 0 4 0 m i n ) 。 对于微流控芯片上l l e ，虽然分离管道缩微化了，但液液接触面增大，分子 扩散距离减小，反而有利于萃取效率的提高。而且试剂消耗量少，降低了萃取成 本，减少环境污染，无需机械振动和多级萃取等繁琐过程。但是微流控芯片上l l e 的基材必须采用耐有机溶剂的玻璃或石英，有机聚合物基材在这里不太适用。 1 2 3 膜分离技术 膜分离是以选择性透过膜为分离介质。当膜两侧存在压力差、浓度差、电位 差等不同的推动力时，所需组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的 1 。膜 分离可以通过控制膜孔径、膜表面修饰等方法分离所需组分，且分离过程中大多 无相变化，常温操作，有高效、节能、简便等特点。k h a n d u r i n a 等 1 7 】在深8 - 1 0 啪， 半深宽6 0 6 5 i t m 的电泳芯片上，将硅酸钠低温键合到盖片上，硅酸钠聚缩后，在 相邻主管道与侧管道之间形成3 - 1 2 p m 宽的硅酸钠多孔膜，当样品流经膜时，离子 3 重庆大学硕士学位论文 1 前言 可以透过该膜，而大分子的d n a 被截留富集，富集后的d n a 进入分离管道，用 l i f 进行检测，d n a 浓度提高了2 个数量级。这种膜只能对大分子和小离子的混 合物进行初步的筛分，而对于粒径相近的物质就显的无能为力了。c a n n o n 等”州和 s p e n c e r 掣” 在三维( 3 - d ) 微芯片上，用核径迹刻蚀( n u c l e a rt r a c k - e t c h e d ) 聚碳酸 酯膜，形成圆柱形孔径，孔径1 5 n m _ d _ 2 2 0 n m ，孔密度l 1 0 8 e n l 。剑p 4 0 p r o ) 要比h p l c 填料( 3 1 0 哪) 大；由于s p e 有不同的柱构 型，所以柱内径的选择范围较大4 9 0 m m ，远大于h p l c ( 4 6 m m ) ；一般s p e 柱长只有几厘米比h p l c ( 1 0 2 5 c m ) 短。由于短的柱床和大的粒径，s p e 柱效 比h p l c 色谱柱低得多，一个高效h p l c 柱能产生1 0 0 0 0 以上的塔板数，而一个 s p e 柱仅能获得1 0 5 0 塔板。因此用常规s p e 只能分开保留性质有很大差别的化 合物【3 13 2 1 。 表2 1 常规s p e 与现代h p l c 的区别 t a b l e 2 1t h ed i f f e r e n c eo f c o n v e n t i o n a l i t ys p ea n dh p l c 分离效率低的s p e 技术主要应用于试样的预处理。借助s p e 所要达到的目的是： ( 1 ) 试样中除去对后续分析有干扰的物质；( 2 ) 富集痕量组分，提高分析灵敏度； ( 3 ) 变换试样溶剂，使之与分析方法相匹配：( 4 ) 原位衍生；( 5 ) 试样脱盐；( 6 ) 便于试样的储存和运送。 原位聚合s p e 微柱同与常规填充式s p e 柱最大的区别就是，原位聚合s p e 微 柱是在微管道内采用原位聚合方法制各出s p e 微柱的固定相。s p e 微柱的分离原 理、目的和作用与常规填充式s p e 柱都是类同的，是利用s p e 微柱材料上键合的 功能团与待测分离化合物之间的作用力将目标化合物保留在柱上与基体分离，然 后选择溶剂洗脱出分析物，从而达到分离富集或样品净化的目的。 2 1 3 原位聚合阴离子交换型s p e 微柱的制备 通常原位聚合是将功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂按一定比例溶解在溶 剂中，将反应物密封于微管道中，在一定温度下加热发生聚合反应，形成高度交 联的空间网状构型聚合物。然后采用合适的溶剂并由机械泵或电渗流驱动除去致 孔剂和柱内残余的单体。 实验所用的功能单体是2 甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵 ( 2 ( m e t h a c r y l o y l o x y ) e t h y l 研m c 廿1 y 1 咖0 1 1 i u mc h l o r i d e , m e t a ) ，交联剂是二乙烯基 苯( d i v i n y l b e n z e n e ，d v b ) ，引发剂是偶氮二异丁腈( 2 ，2 a z o i s o b u t y l o n i t r i l e ，a i b n ) ， 致孔剂是甲醇和正己烷按一定比例混合而成，甲基丙烯酸2 羟基乙酯 ( 2 - h y d r o x y e t h y lm e t h a c r y l a t e ，h e m a ) 是非功能单体，其反应式见图2 1 ： 8 重庆大学硕士学位论文 2 理论部分 职y 满 黼 。+ 。 笊 f辛壮学 爪 o - 图2 1 由2 甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸2 斑基乙酯、二乙烯苯原位聚合反应 形成强阴离子交换型的整体柱。 f i g 2 1p r e p a r a t i o n o f s t r o n g a n i o n - e x c h a n g e m o n o l i t h s b y c o p o l y m e r i z a t i o no f ( 1 ) 2 - ( m e t h a c r y l o y l o x y ) e t h y l t r i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ( 2 ) 2 - h y d r o x y c t h y lm e t h a c r y l a t ea n d0 ) d i v i n y l b e n z e n e ， 功能单体决定s p e 微柱的类型，m e t a 是一种强碱性的季铵盐离子交换剂， 因此制备的s p e 微柱固定相属于强阴离子交换型的，m e t a 是可以提供离子交换 位置的功能基团的单体。 交联剂d v b 可以将聚合物交联成一种多孔状结构，提高聚合物的机械性能。 改变交联剂的用量可以控制聚合物和最终的s p e 柱的溶胀程度，共聚物中交联剂 含量百分数称为交联度。 引发剂a i b n 在聚合反应中能引起单体分子活化而产生游离基的物质，可促 使引发聚合反应的发生。 有致孔剂存在的条件下有助于原位聚合反应生成的s p e 微柱材料具有多孔网 状结构，调节致孔剂甲醇和正己烷的比例可以控制s p e 柱网状结构孔的大小。 原位聚合法制备的s p e 微柱，可直接在微管内形成的整体、连续的微柱体，而 不需细粒径的填料去填装。这种柱具有优异的通透性、柱空间利用率高，并避免了 塞子制作，而且可以控制s p e 柱长。 2 2 原位聚合阴离子交换型s p e 微柱 2 2 1 离子交换原理 原位聚合阴离子交换型s p e 微柱的交换原理与离子色谱相似。常用的阴离子 交换固定相一般含有季铵功能基，为了简单起见，只讨论具有相等电荷数的离子 在强碱性固定相上的离子交换行为。例如将水溶液的c 广型固定相与含有n 0 2 一的 水溶液接触，将发生离子交换，n 0 2 - - 进到固定相，等摩尔c 广离开固定相进入水 相。溶液中与n c l 2 - 伴随的阳离子，如n a 十不与固定相上的c 1 - 反应，经足够长的 时问后，离子交换将达到平衡状态n 0 2 一和c 广分别部分停留在固定相和溶液相， 将上述反映简单地表示如下式： 9 卜 当 ；譬厂s。 重庆大学硕士学位论文2 理论部分 r l - n r 3 + c 1 +n a n 0 2 ：苎r l 圳r 3 + n 0 2 一+ n a c l式( 2 1 ) 该反应为可逆反应。当溶液中的阳离子如n a + 浓度较低，如小于o 1 m m o l 时， 溶液中的阳离子进入固定相的量非常少。因此阳离子除了与系统中的一种或多种 阴离子反应或络合，以及保持溶液电中性之外，在普通的应用中，可将这种伴随 的“非牵连”离子略去，因此上式可简化为： r ，一n r 3 十c l 一+ sn 0 2 一；套r l n r 3 n o 厂+sc 1 - 式( 2 2 ) 用下式表示( 2 2 ) 的质量作用关系： f 崛一 何】s 暇一】r “ c l 一 。 何】。 式中，k 是反应式( 2 2 ) 的平衡常数，下标s 和r 分别表示固定相和溶液相， 两相中离子的浓度可用下述任何一种方式表示：物质的量浓度( t o o l l ) ，质量摩 尔浓度( m o l g ) 或摩尔分数。 若离子交换系统在完全理想状态，各种离子独立的以等量电荷相互作用，平 衡状态只由n 0 2 - 和c 1 的相应浓度来决定，墨应为1 。但离子交换系统一般都 是在非理想状态，则墨不为1 ，也就是说，离子交换剂对不同的离子的“偏爱” ( 亲和力) 不同，用芷表示，并称之为选择性系数。 选择性系数不仅与被分离的离子和树脂的交联度有关，而且与树脂的组成有 关f 3 3 。 2 2 2 阴离子交换型s p e 微柱选择性分析 一般为酸性化合物，如有机酸、无机阴离子、酸性蛋白质等可用阴离子交换 型s p e 微柱进行分离。在离子交换进行的过程中，流动相连续提供与固定相离子 交换位置的平衡离子相同电荷的离子，这种平衡离子( 淋洗液淋洗离子) 与固定 相离子交换位置的相反内电荷以库仑力结合，并保持电荷平衡。进样之后，样品 离子与淋洗离子竞争固定相上的电荷位置。当固定相上的离子交换位置被样品离 子置换时，由于样品离子与固定相电荷之间的库仑力，样品离子将暂时被固定相 保留。样品中不同离子与固定相电荷之间内的库仑力不同，即亲和力不同，因此 被固定相保留的程度不同。 一般地说离子的电价越高，与树脂的亲和力越大，在柱上的保留时间就长。 但也有例外情况，s c n - - 虽是价阴离子。但它的半径较大成为可极化离子，与树 腊有较大的亲和力，所以s c n - - 的洗脱顺序却在s 0 4 卜之后。 对电价相同的离子，半径大的容易极化，亲和力大，保留时间长，不易分离。 阴离子亲和力强度和保留时间顺序：f - c h 3 c o o - h c o o - - c 1 - n c l 厂 b r - n 0 3 一 s 0 4 2 - c 0 0 - - - c o o - p 0 4 卜。另外，洗脱液的酸、碱度可影响 重庆大学硕士学位论文 2 理论部分 水合离子的稳定性，有可能因此引起个别离子位置的变化。 2 2 3 淋洗液选择 离子色谱中可由选择性系数来评价淋洗离子的效率，阴离子交换型s p e 微柱 也同样。具有高选择性系数的离子是优先选择的淋洗离子，因为他们在较低的浓 度也有较强的淋洗能力，若样品离子洗脱太快，则应用较低的浓度或改用选择性 系数较小的淋洗离子。但淋洗离子的选择性系数和样品离子的选择性系数应相差 不大 3 3 】。 选择适当的淋洗液 离子交换型s p e 微柱是基于淋洗离子和样品离子之间对固定相有效交换容量 的竞争，为了得到有效的竞争，样品离予和淋洗离子应有相近的亲合力。 一价淋洗离子洗脱一价待测离子，二价淋洗离子洗脱二价待测离子，淋洗液 浓度的改变对二价和多价待测离子保留时间的影响大于一价待测离子。若多价离 子的保留时间太长，增加淋洗液的浓度是较好的方法。 淋洗液满足条件 微流控芯片上s p e 微柱样品在线分离富集与离子交抉色谱一样，一般用含盐 的水溶液作为流动相，选择离子交换型s p e 微柱的淋洗液应满足以下几个条件： ( 1 ) 淋洗液纯度一般采用分析纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去有干扰的 杂质。因为在整个使用期间，流过柱的溶剂是大量的，如溶剂不纯，则长期积累 杂质而导致检测器噪声增加，同时也影响收集的馏分纯度。 ( 2 ) 应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。s p e 微柱的淋洗液应 与固定相不互溶( 不互溶是相对的) 。否则，造成固定相流失，使柱的保留特性变 更。 ( 3 ) 对试样要有适宜的溶解度，否则，在s p e 微柱头易产生部分沉淀。 ( 4 ) 溶剂的粘度小些为好，否则会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓 慢，柱效下降。同时，在同一温度下，柱压随溶剂粘度增加而增加。 ( 5 ) 能够充分溶解各种盐并提供离子交换必需的缓冲液： ( 6 ) 有合适的离子强度以便控制样品的保留值； ( 7 ) 对被分离的对象有选择性； ( 8 ) 与检测器相匹配，例如对紫外光度检测器而言，不能用对紫外光有吸收的 溶剂。 2 3 微流控芯片微尺寸效应 在微尺度流动中，当特征尺寸小到与流体粒子平均自由程在同一量级时，基于 连续介质的一些宏观概念和规律就不再适用，使原来的各种影响因素的相对重要 重庆大学硕士学位论文2 理论部分 性发生了变化，从而导致流动规律的变化1 。在流体微流动中，因尺寸微小，不仅可 能出现不同于宏观流动的规律，而且许多在宏观流动中被忽略的因素，将成为主 要的影响因素3 6 3 ”。如微流控芯片管道内比表面积的变化、微管道内相对表面 粗糙度、气泡的影响等。 2 3 1 微管道的比表面积 由物理现象中表征作用力类型的基本特征量长度尺度可知，作用于流体 上的力主要为体积力和表面力，其中体积力依赖于特征尺度的三次幂，表面力则依 赖于特征尺度的一次或二次幂。随着尺度的减小，表面力的作用不断加强，在比 毫米更小的尺度中，表面力将起主要作用。此外，由于尺度微小，表面积与体积 之比值也很大，可达百万倍之大，这更加强化和突出了表面力和其他表面效应的 作用。微流控芯片上s p e 微柱比表面积变化主要有以下两个方面： 微管道内表面积 比表面积( s u f a c e t o v o l u m e ) 即表面积与体积之比，表示多相分散体系的分 散程度，即单位体积( 也有单位质量者) 的物质所具有的表面积。微管道内流动 特征尺度大大缩小，其比表面积发生如下变化：假设微管道为圆柱型管道，对于 同体积的样品，微管道表面积可表示为a = 2 a r h ，微管道体积为v = 尉2 h ，则微 管道表面积与体积之比为： a2 力琅2 v 2 h ， 即随着微管道半径的缩小，比表面积增大。当微流控芯片上当流动的特征尺度由 c l r l r f l 量级减小到v x n m m 量级，比表面积由量级1 0 2 m 。变成量级1 0 6 m ，这对 与表面有关的微流控芯片上s p e 微柱进行样品预处理时的传热、传质过程有很大 影响。 多孔填料 比表面积数值随分散离子的变小而迅速增加。填料粒径越小，填料的比表面 积就越大，微管道内液固接触面就越多，分离富集效率就越高。但是在微管道内， 柱压降随填料粒径的减小而急剧上升。而多孔性填料，即可极大地增加填料比表 面积，也可避免微管道内柱压降的问题，可大大提高微管道内柱分离富集效率。 如：对于无孔的小球，其外表面积可按下式推算： s c = 者 式中，s c 为无孔微球外比表面积，d ，为微球直径，p ，为球密度。设j ，为5 o n ，p 。 为2 9 c m 3 。则s 。= 0 3 m z g ，可见，若仅是无孔球，则其比表面积是很小的。但是 一旦具有多孔性，则多孔微球的比表面积为球外比表面积与孔内表面积之和。填 1 2 重庆大学硕士学位论文2 理论部分 料的孔径与比表面积可有如下关系： d p = 丽4 v r ( c m 3 g ) x ，矿 式中，d 。为平均孔直径；v p 为微球表观密度；s ，为比表面积。因制造方法的差 异及孔径的不同，比表面积在很大的范围内变化。由上式可知填料的平均孔直径d 。 与比表面积s 。成反比，即填料的平均孔直径越小，填料的比表面积就越大。如对 于小孔硅胶d = 6 8 n m ，比表面积约为2 0 0 5 0 0 m 2 g ，其比表面积比无孔微球外 比表面积s 。；0 3 m 2 g 大大增加【2 9 1 。 原位聚合法制备的s p e 微柱的固定相是多孔网状结构，固定相大孔中带有小 孔，液体不仅与固定相孔外表面有接触，而且与固定相孔内表面有接触，这样更 是大大的增加液固接触面，所以在芯片微管道内，即使s p e 微柱很短，由于比表 面积大大增加，s p e 微柱对样品还是有一定的分离富集效率的。 2 3 2 相对表面粗糙度 在常规流动中，管壁的表面形状对层流流动无影响，仅对紊流流动及由层流向 紊流的过渡区有一定的影响。而在微流动中，虽然管内流动几乎为层流，但由于尺寸 微小，使得相对表面粗糙度勃( 管壁粗糙度4 与管径d 之比) 增加，从而对微流动产生 不可忽视的影响。在微小管道内，即使粗糙度较小，但由此引起的微小扰动也能渗入 主流区而影响整个通道内的流动，从而造成提前转捩，而且表面粗糙度还可使流体 的流动阻力增加。在微流动中，不仅粗糙度单元的大小对流动有影响，单元的分布情 况也对流动有定的影响。 当s p e 微柱管道内存在多孔网状结构的材料时，微管道内粗糙度大大增大，液 流提前转捩，有利于液流与固定相之间充分接触，提高s p e 微柱萃取效率。但是另 一方面，由于微管道内多孔网状材料的出现，会导致微流控芯片上微管道内液流 流动阻力急剧增加。所以对于带有s p e 微柱的复合式微流控芯片即要保证s p e 微柱 具有一定的萃取效率，又要避免微管道内流动阻力太大。因此柱材料的孔径、孔 分布、柱长等因素都需要考虑。 2 3 3 气泡的影响 存在于微管道中的气泡对液体微流动具有显著的影响。微管道中气泡或浸没 于液体中或附着在管壁上，其对微流动的影响也不同。当气泡浸没于液体中时， 由于表面张力产生的表面压差相互抵消，不产生附加压力而影响液体的流动。但 由于气泡跟随液体一起流动，所以随着压力的变化，气泡的体积将发生变化，同 时也使液体的流速发生变化且该变化与截面位置有关；当气泡附着于管壁时，由 于表面张力的作用，气泡将保持不动，但会使流道截面积减小、流动阻力增加，而 1 3 重庆大学硕士学位论文 2 理论部分 且附着于管壁的气泡随流动状态的变化，时而沿管壁移动，时而破灭，导致流动 的不稳定。气泡对液体微流动产生影响的过程中，上述两种情况可能同时出现， 在流动过程中，浸没于液体中的气泡很容易附着于管壁，而附着于管壁的气泡也 可能浸没于液体中，这都将导致流动规律发生变化而引起流动的不稳定，所以在 液体微流动中，排除气泡的影响就显得尤为重要。 2 4s p e 柱性能评价 自制原位聚合阴离子交换型s p e 微柱性能可通过s p e 微桂吸附效率、富集倍 数、柱容量、理论塔板数等进行性能评价。 2 4 1 富集倍数与吸附效率 s p e 微柱富集倍数是指一定浓度c 0 、体积v 0 的样品流经s p e 柱后，被保留组 分被s p e 微柱吸附保留，再用小体积v l 的淋洗液洗脱吸附在s p e 微柱上的保留组 分，则淋洗液收集液中被保留组分浓度c l 与原样品中被保留组分浓度之比称为 s p e 微柱对被保