（生理学专业论文）人lrg基因的表达分布及功能的初步分析.pdf

黧麓嚣一鼍 r 6 1 5 4 5 5 秉承学校严疆帕学风与优良的科学道售。本人声啊所呈交的论文是魏 个人在导- 指导下进行帕研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特累加以标注和致谢的地方外，论文串不包含其他 已经发表或撰写过 的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用造使用过的成果。与 我一胃工作帕胃志对本研究所徽的任何贡献均已在论文中作了舅爵的说骧 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签各：j 幽麦日期：幽：塑 l 爹曩羹产收曩 本 完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定。目：研究生在校 玖读学位期问论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本 保证毕业离 较岳。发表论文或使用论文工作成果时署各单位仍然为第四军医大学。学 校可以公布论文的全部或部分内容( 含电子版。保密内窖除外) ，可以采 用影印。缩印或其他复嗣手段保存论文。学校有权允许论文棱查硼和借两。 并在校园网上提供论文内容的澍览和下载服务。 jz 论文作者签各：翅丕导- 签各：型! 挝堑日期：碰麴 a g e a m p b l a s t b p b s a c d c d n a d a b d e p c d i c e r d i g d m s 0 1 ) n a s e d s r n a d t t e b e c o l i e d t a e l i s a a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s is a m p i c i l l i n b a s i cl o c a la i i g n m e n ts e a r c h t o o l b a s ep a i r b o y i n es e r u ma i b u m i n c l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o n c o m p l e m e n t a r yd n a 3 3 一d i 8 疆j 打o b e n z i d i n e d i e t h y p y r oc a r b o n a t e d s r n as p e c i f i ce n d o n u c l e a s e d i g o x i g e n i n d i m e t h y s u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e a s e d o u b l es t r a n dr n a d i t h i o t h r e t 0 1 e t h i d u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n e d i h m i n e t e t r a e e t i ca c i d e n z y m e1i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y 琼脂糖凝胶电泳 氨苄青霉素 局部相似性查询 软件 碱基对 牛血清白蛋白 白细胞分化抗原 互补d n a 3 ，3 一二氨基 联苯胺 焦碳酸二乙酯 d s r n a 特异性核 酸内切酶 地高辛 二甲基亚砜 d n a 酶 双链r n a 二硫苏糖醇 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附试 验 e s t e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 表达序列标签 摹日军医土学博士学位论文 f c m f l o w c y t o m e t e r 流式细胞仪 f i t c g 4 1 8 g f p g s t h l r g h r p i r e s i s h i s h i p t g k b k d l l p s l r g m o d s o d 0 1 i g o ( d t ) o r f p a g e f 1 0 u r e s c e i nis o t h i o c y a n a t e g e n e t jc i n g r e e nf l u o r e s c e i n tp r o t e i n 9 1 u t a t h i o n es - - t r a n s f e r a s e h u m a nl p sr e s p o n dg e n e h o r s e r a d is hp e r o x i d a s e i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e i ns i t uh y b r i d i z a t i o h p c r b a s e dl m p r o v e ds u b t r a c t i v e h y b r i d iz a t i o n i s o p r o p y l t h i 0 一b d g a l a c t o s i d e k i l 0 b a s e k i1 01 ) a l t o n l e u ，l e u c i n e 1i p o p 0 1 y s a c c h a r i d e l p sr e p o n dg e n e m u l t i d l e o r g a nd y s f u n c t i o n s y n d r o m e o p t i c a ld e n s i t y o l i g o d e o x y t h y m i d y l i ca c i d o p e nr e a d i n gf r a m e p 0 1 y a c r y l a m i n e g e le 1e c t r o p h o r e s is 异硫氰酸荧光素 新霉素类似物 绿色荧光蛋白 谷胱甘肽s 一转 移酶 人l r g 基因 辣根过氧化物酶 内部核糖体进入 位点 原位杂交 基于p c r 的改良 消减杂交 异丙基硫代 一b 1 ) - 半乳糖苷 千碱基对 千道尔顿 亮氨酸 脂多糖 脂多糖应答基因 多器官功能不全 综合征 光密度值 寡聚脱氧胸苷酸 开放读框 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 2 第日军医土学博士学位论文 _ = = = = = = = = 罱= = 高= = = = = = = = = = 皇i 自宙目目号= = = = = = = = = = = = = 宣= p b s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p c r p 工 r d r p p 0 1 y m e r a s ec h a inr e a c t i o i l p r o p i d i n ejo d id e r n ad e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e r i s cr n ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p e s r n a i r n a s e r 口m r r n a r t - p c r 3 s d s s h r n a s i r n a s 工r s t e m t n f t r is x - g a l r n ai n t e r f e r e n c e r i b o n l l c l e a s e r o u n dp e rm i f i l l t e r i b o s o m a lr i b o n u c 】e ica c i d r e v e r s et r a n s e e i p t i o np c r s e r ，s e r i n e s o d i u n d o d e c y ls u l f a t e s m a l lh a i r p i nr n a s m a li i n t e r f e r e i n gr n a s y s t e m icin f l a m m a t o r yr e s p o n s e s y n d r o m e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm ic r o s c o d e t u m o rb e c r o s i sf a c t o r n t ris ( h y d r o x y m e t h a n e ) a m in o f i l e t h a n e 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d 0 1 y l b d - g a l c a t o s i d e 聚合酶链式反应 碘化丙啶 r n a 依赖性r n a 多聚酶 r n a 诱导的沉默 复合体 r n a 干扰 r n a 酶 每分钟转速 核糖体r n a 逆转录一聚合酶 链反应 丝氨酸 十二烷基硫酸钠 小发夹r n a 小干涉r n a 系统炎症反应综 合征 透射电镜 肿瘤坏死因子 n 一羟甲基氨基甲 烷 5 一溴一4 一氯一3 叼i 哚一b - d - 半乳糖 苷 苇口军医土学博士学位论文 人l r g 基因的表达分布及功能的初步分析 博士研究生：杜可军 导 师：林树新教授陈苏民教授 辅导教师：柴玉波博士陈南春高级实验师 病理生理学教研室生物化学和分子生物学教研室 中国人民解放军第四军医大学话安7 1 0 0 3 3 摘要 脂多糖( l p s ) 与某些炎症的发生密切相关。宿主细胞识别l p s 主要依靠细胞膜上的模式识别受体( p r r ) 。p r r 是启动l p s 反应的 首要环节。现已发现多种膜蛋白参与清除l p s 或激活细胞的作 用。l p s 信号传导途径非常复杂，多个p r r 通过多条途径传递信号， 单凭现有的信号传导分子很难解释其中的一些通路。研究l p s 的致 病机理，迫切需要寻找新的信号传导分子。 为此，课题组致力于探讨l p s 刺激后应答基因的功能，尤其是 一些新发现基因的功能。l r g 是一种l p s 应答基因。系本课题组柴 玉波博士采用基于p c r 的改良消减杂交技术，构建l p s 刺激后人牙 髓细胞差异表达基因文库，从中筛选出的新基因，g e n b a n k 录入号 为a f l 4 3 7 4 0 等。 在国家自然科学基金( n o 3 0 17 0 3 6 1 ) 的资助下，课题组对人 ，憎基因的功能展开了一系列研究，获得了初步结果。 本实验重新克隆了人l r g 基因、测序证明无误：并对人l r g 基 因的功能作了生物信息学的初步分析。生物信息学分析表明，人 4 第口军区大学博士学位论文 l r g 基因的开放读框为5 5 8 b p ，编码蛋白质包含1 8 6 个氨基酸；编 码序列中包含2 个相互重叠的亮氨酸拉链结构和1 个螺旋一转角一 螺旋结构，而亮氨酸拉链结构是d n a 结合蛋白的特征性结构。因 此，对人l r g 基因的研究既有线索可寻，又可以采用一些较新的方 法，来加快研究进度。 本研究工作中，首先在原核表达系统中表达人l r g 基因编码 的蛋白质。采用p c r 扩增人l r gc d n a 编码区，克隆入表达载体 p c t a t 中，构建成融合6 h i s 的表达载体p c t a t l r g ，转化e c o l i b l 2 l ( d e 3 ) ，以i p t g 诱导表达。表达出相对分子质量( m r ) 约 2 50 0 0 的蛋白，占菌体总蛋白的5 1 。表达产物为可溶性的，用 n i n t a 亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。 随后制备鉴定了人l r g 免疫血清。采用纯化后6 h i s n 盯一h l r g 蛋白作为免疫抗原，对新西兰大白兔实施多次免疫；获得了兔抗 人l r g 免疫血清。经过e l i s a 和w e s t e r nb l o t 检测，效价在1 ： 1 0 0 0 以上。制备得到兔抗人l r g 免疫血清，为l r g 的功能研究打 下基础。 随之对人l r g 的表达分布规律进行了探索。1 人l r g 蛋白的 表达分布规律：用制备的兔抗人l r g 免疫血清对几种正常胎儿组 织进行免疫组织化学染色，结果表明人l r g 蛋白分布于绝大多数 所检测的组织，表达由强到弱依次为：胃、睾丸、食道、小肠、 肝、肾、心、肺等；2 人l r g m r n a 的表达分布规律：以人l r g 基因为探针，用r o c h e 公司的原位杂交试剂盒进行杂交检测，结 果表明人l r g m r n a 在睾丸、小肠等组织内有相当高的表达。 为分析人l r g 蛋白在真核细胞内的亚细胞定位，构建了人l r g 与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体p l r e s 2 e g f p l r g ，瞬时转 染n i h 3 t 3 细胞，发现带荧光的融合蛋白主要位于胞浆中：进一 步用兔抗人l r g 免疫血清对培养的牙乳头细胞进行间接免疫荧光 分析，结果同样表明人l r g 的细胞内定位以胞浆为主。 摹口军医土学博士学位论文 人l r g 基因究竟对肝癌细胞系h e p g 2 有何影响? 为解决上述 问题，构建了人l r g 基因的真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) 垤，并稳 定转染到肝癌细胞系h e p g 2 。w e s t e r n b l o t 和间接免疫荧光法等实 验表明人l r g 基因已经成功转染。透射电镜的研究发现稳定过表 达人l r g 基因的h e p g 2 细胞发生微绒毛的减少，说明过量表达的 人l r g 蛋白抑制了l e p g 2 细胞的生长；流式细胞仪检测表明稳定 过表达人l r g 基因的h e p g 2 细胞产生细胞g l 期的阻滞，说明过量 表达的人l r g 蛋白抑制了h e p g 2 细胞的增殖。 为深入研究人l r g 基因的功能，课题组设计了人l r g 基因的突 变引物，利用p c r 法将亮氨酸拉链的第二个l e u 突变为s e r ( 从 2 7 3b p 起c g g t t a 突变为a g a t c t ) ，构建了人l r g 基因的定点突变 体。将带突变型人l r g 的真核表达载体转染肝癌细胞系h e p g 2 ， 经g 4 1 8 筛选得到稳定表达的细胞株。透射电镜显示实验组细胞出 现微绒毛减少、溶酶体增加，直至出现凋亡特征细胞核固缩、边 移：同时流式细胞仪检测到凋亡峰。说明定点突变的人l r g 基因 通过其编码的蛋白质对肝癌细胞系h e p g 2 产生促凋亡作用。 r n ai 是当今分子生物学领域最引人注目的技术之一。目前 r n ai 技术在哺乳动物细胞中也得到了广泛的应用。本课题运用 r n ai 技术对人l r g 基因开展了初步研究。课题组针对人l r g 基因 设计了r n a 干涉核营酸片段，并克隆到s h r n a 表达载体p a v u 6 + 2 7 中。将p a v u 6 + 2 7 一h l r g 稳定转染入h e p g 2 一p c l ) n a 3 1 ( + ) 一l r g 细胞， r t p c r 检测结果表明，对人l r g 实施r n a 干涉的实验组细胞人l r g m r n a 明显降解； w e s t e r n1 3 l o t 表明r n a 干涉后l r g 蛋白水平下 降；用兔抗人l r g 免疫血清进行的间接免疫荧光法显示，r n a 干 涉后的细胞胞浆内的绿色荧光比对照组明显减弱。以上实验表明 r n a 干涉是成功的。进一步的研究发现：从形态上讲，对人l r g 实施r n a 干涉的实验组细胞多呈条索状生长，细胞突起增加，侵 6 第日军区土学博士学位论文 袭性增强； 从细胞周期上讲，对人l r g 实施r n a 干涉的实验组 细胞g 1 期明显缩短、g 2 期延长，表明细胞的分裂前期增加，增 殖作用增强。 综上所述，课题组认为： l 稳定过表达的人l r g 可产生h e p g 2 细胞g 1 期阻滞；r n a 干涉之后阻滞作用明显减弱。表明人l r g 可能是一种调节细胞周 期的新分子。 2l r g 影响细胞周期的作用与l p s 相似，表明该蛋白可能在 l p s 影响细胞周期的过程中发挥作用，有可能是l p s 信号传导途 径中的新分子。 3 稳定过表达的人l r g 可使h e p g 2 细胞增殖作用减弱；r n a 干涉之后增殖作用增强。表明人l r g 可能影响细胞增殖。 4 稳定过表达的突变型人l r g 可产生h e p g 2 细胞凋亡，表明 突变的人l r g 基因编码的蛋白可能与细胞凋亡有关。 5 人l r g 可能是人体一种广泛存在并且功能重要的新基因。 关键词：人l r g 基因；原核表达；组织表达；细胞定位；真核表 达：r n a 干涉 摹口军医土学博士学位论文 t h ee x p r e s s i o na n df u n c t i o np r e l i m i n a r ya n a l y s i s o f h u m a n i r g c a n d i d a t ef o rp h d ：d uk e - j u n m e n t o r ：p r o f l i ns h u x i na n dc h e ns u m i n c o - s u p e r v i s o r ：d r c h a iy u b oa n dc h e nn a n c h u n d e p a r t m e n to fp a t h o p h y s i o l o g y d e p a r t m e n to fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y f o u r t hm i l i t a r ym e d i c a lu n i v e r s i t y ，x i a n7 1 0 0 3 3 ，p r c h i n a a b s t r a c t l i p o p o l y s a c c h ar i d e ( l p s ) a r en o to n l y t h e m a j o rc o n s t i t u e n t s o ft h eo u t e rm e m b r a n eo fg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ，b u ta l s ot h et o x i c d e t e r m i n a n t sf o rg r a m n e g a t i v eb a c t e r i ai n f e c t i o n ，w h i c hi sc l o s e l y r e l a t e dt oh u m a nh e a l t ha n dt h ed e v e l o p m e n to fi n f l a m m a t i o n p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ( p r r ) h a v eb e e nc o n s i d e r e dt ob et h e i m p o r t a n t i n i t i a ls t e p sf o rc e l l u l a r r e c o g n i t i o n o fl p sa n d c o n s e q u e n ti n i t i a t i o no fl p sr e s p o n s e s p r rm a yb eac o m p l e xo f m u l t i p l ec o m p o n e n t s s c a v e n g e rr e c e p t o r ，c d 14 ，t o l l l i k e r e c e p t o r s ，1 32 - i n t e g r i n sa n dl s e l e c t i nh a v e b e e ns h o w nt o b e i n v o l v e di nt h ec l e a r a n c eo fl p so rl p sa c t i v a t i o n d i f f e r e n tp r r t r a n s d u c tl p ss i g n a l st h r o u g hd i f f e r e n tp a t h w a y s t h ep r o c e s sa r es o c o m p l i c a t e dt h a ts o m en e ww a y sm u s tb ed e t e c t e dt oe x p l a i nt h e l p s i n f l a m m a t i o nc o u r s e s 1 r gm e a n sl i p o p o l y s a c c h a r i d er e s p o n dg e n e d rc h a i y u b o c a r r i e do u tp c r b a s e d i m p r o v e d s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ， r 苇口军医文学博士学位论文 c o n s t r u c t e dl p s s t i m u l a t e dh u m a nd e n t a l p u l p c e l l ，a n do b t a i n e d n e wg e n e ( g e n b a n k ：a f l 4 3 7 4 0 ，e t c ) t h ea i mo ft h i ss t u d yi st o i d e n t i f yt h ee x p r e s s i v ea n dc o n t r i b u t i v er u l eo fh u m a nl r ga n dt h e f u n c t i o no ft h i sp r o t e i nonc e l lm o r p h o l o g ya n dc e l lc y c l e s u p p o r t e db yt h en a t i o n a ln a t u r a l s c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( n o 3 0 1 7 0 3 6 1 ) ，w eh a v ec o m p l e t e ds o m ee x p e r i m e n t sa n dg o t r e s u l t s h e r ew er e p o r tt h ea n a l y s i so ft h ee x p r e s s i o np a t t e r na n d f u n c t i o no fh u m a nl r g i nt h i s s t u d y ，t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fh u m a nl r gh a sb e e n a n a l y z e d a tf i r s t ，h u m a nl r gw a sc l o n e da g a i na n dp r o v e dc o r r e c t l y b i o i n f o r m a t i c sd e m o n s t r a t dt h a t l r gh a s5 5 8b a s ep a i r si no p e n r e a d i n gf r a m e a n dl x ( 6 ) 一l x ( 6 ) 一l x ( 6 ) 一lc a nb ef o u n di nh u m a n l r gs e q u e n c e inordert oe x p r e s st h er e c o m b i n a n th u m a nl r gp r o t e i ni ne c o l i ，t h ee n c o d i n gr e g i o no fh u m a nl r ge d n aw a sa m p l i f i e db yp e r ， a n dt h e ns u b c l o n e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp c t a tt o c o n s t r u c tp c t a t h l r g 6 h i s - t a tw a sf u s e dw i t hc o d i n gs e q u e n c eo f h l r ge d n ai n - f r a m ew i t he c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a n d6 h i s t a t h l r g w a se x p r e s s e du n d e ri p t gi n d u c t i o n ，a n dt h ee x p r e s s e dp r o d u c t s a c c o u n t e df o r51 o ft h et o t a lp r o t e i n a n di tw a ss o l u b l e t h e 6 h i s - t a t h l r g p u r i f i e dt h r o u g hn i - n t aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y c o l u m nr e a c h e de l e c t r o p h o r e t i c a lp u r e i no t h e rw o r d s ，h u m a nl r g f u s i o n p r o t e i nw a se x p r e s s e d i ne c o l i s u c c e s s f u l l y w i t h h i g h e f f i c i e n c y ，a n dl r gw a sp r e l i m i n a r yp u r i f i e dt h r o u g hn i n t a c o l u m n ，w h i c hl a y st h ef o u n d a t i o no fh u m a nl r gf u n c t i o n t oo b t a i na na n t i - l r gi m m u n es e r u m ，t h ef u s i o np r o t e i n sw e r e e x p r e s s e di n e c o l ia n dt h e n p u r i f i e db y n i n t ac o l u m na n d 9 摹口军正点学博士学位论文 s d s - p a g e r a b b i t sw e r ei m m u n i z e dw i t hp r e l i m i n a r yp u r i f i e dl r g p r o t e i n ，a n dr e i n f o r c e dt h r e et i m e s i m m u n es e r u mw a sc o l l e c t e d a t l a s t ，i m m u n es e r u ma g a i n s th u m a nl r gw a so b t a i n e di ni m m u n i z e d r a b b i t s ，a n di t st i t e rw a sm o r et h a n1 ：10 0 0 t h ef o r m a t i o no fr a b b i t a n t i l r gi m m u n es e r u mw a sc o n f o r m e db ye l i s aa n dw e s t e r nb l o t t h ep u r i f i e dp r o t e i nc o u l dg e ta c r o s sm e m b r a n e so fd e n t a lp a p i l l a c e i l sw i t h i n3 0m i n u t e s t oa n a l y z et h ee x p r e s s i o nl e v e lo fh u m a nl r gp r o t e i n ，t h er a b b i t a n t i - l r gi m m u n o ls e r u mh a sb e e nu s e da st h ef i r s ta n t i b o d y t h e e x p r e s s i o nl e v e lo fh u m a nl r gi ns e v e r a ln o r m a lf e t a lt i s s u e sw a s t h e ni d e n t i f i e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h i sa s s a ys h o w e dt h a t h u m a nl r gw a se x p r e s s e di na l m o s ta l lt i s s u e sd e t e c t e d t h eo r d e ro f p o s i t i v e s i g n a ls t r e n g t hw a ss t o m a c h 、t e s t i c l e 、e s o p h a g u s 、 s m a l l i n t e s t i n e 、l i v e r 、k i d n e y 、h e a r ta n dl u n g ；t h ec o d i n gr e g i o no fh u m a n l r ge d n aw a sl a b e l e da n du s e dt op r o b eh u m a nt is s u e st od e t e c tt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fh u m a nl r g - m r n a i ns i t uh y b r i d i z a t i o nr e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a th u m a nl r g m r n aw a se x p r e s s e dh i g h l yi nt e s t i c l e a n ds m a l li n t e s t i n e t oa n a l y z et h ei n t e r c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n o fh u m a nl r g ，w e c o n s t r u c t e de u k a r y o t i c e x p r e s s i v ev e c t o ro fe g f p h l r gf u s i o n p r o t e i nn a m e dp i r e s 2 一e g f p - h l r g t h i sv e c t o rw a st r a n s f e c t e di n t o m o u s e f i b r o b l a s tc e l ll i n en i h 3 t 3b yw a yo f l i p o f e c t i n f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a th u m a nl r gl o c a l i z e d i nc y t o p l a s mm a i n l y t h e nt h ei n t e r c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fh u m a n l r gw a sf u r t h e ra n a l y z e db yi n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n e et e c h n i q u e t h er e s u l t sa l s od e m o n s t r a t e dt h a th u m a nl r gl o c a l i z e dm a i n l yi n c y t o p l a s mo fd e n t a lp a p i l l ac e l l s 0 第口军医土学博士学位论文 t oe x p r e s sh u m a nl r gi ne u k a r y o t i cc e l l s ，w ec o n s t r u c t e d e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r p c d n a 3 1 ( 十) 一h l r g ，a n dt h e nt h e p l a s m i dw a st r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l ll i n eu s i n gl i p o f e c t a m i n t r a n s f e c t i o nr e a g e n t a n dh l r go v e re x p r e s s e di nh e p g 2c o n f o r m e d b yw e s t e r nb l o ta n ds a b c - f i t c a n a l y s i sc e l l c y c l eb y f l o w c y t o m e t e rr e v e a l e dt h en u m b e ro fg 1d r a m a t i c a ll yi n c r e a s e d ，t h e s a m er e s u l t sa l s oo b s e r v e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，i t d i s p l a y e dt h a ts t a b l eo v e re x p r e s s i o no fw i l dt y p eh u m a nl r gc o u l d i n h i b i tc e l lg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o n t os t u d yt h ee f f e c to fh u m a nl r go nc e l lm o r p h o l o g ya n dc e l l c y c l e ，d i r e c t e dm u t a n to fh u m a nl r gw a sc o n s t r u c t e db yp c r a n d l e u c i n ew a sr e p l a c e db ys e r i n e ( c g g t t a = = a g a t c t ) t h ee u k a r y o t i c e x p r e s s i v e v e c t o r so fh l r gm u t a n t sp r o t e i nw a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l l ，s t a b l eo v e re x p r e s s i o nc e l ll i n ew e r e s e l e c t e db yg 418 a p o p t o s i sc e l l sc a nb ed e t e c t e db yf l o w c y t o m e t e r a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e i nad i v e r s eg r o u po fo r g a n i s m s ，d o u b l e s t r a n dr n a ( d s r n a ) i s a p o t e n tt r i g g e r o f g e n es i l e n c i n g d s r n ac a n m a t c hw i t h h o m o l o g o u sm r n ab yb a s ep a i r st om a k es p e c i f i cg e n ei n a c t i v a t i o n t h i sp h e n o m e n o nc a l l e dr n ai n t e r f e r e n c e ( r n ai ) l a t e s ts t u d y s h o w e dt h a ts i r n a sm e d i a t e ds p e c i f i cg e n es i l e n c i n gi nm a m m a l c e l l s b e i n ge f f e c t i v ea n dh i g h l ys p e c i f i c ，r n aip r o b a b l yb e c o m e sa n o v e lt e c h n i q u ei nk n o c k i n gg e n ed o w na n dp l a y si m p o r t a n tr o l e si n g e n ef u n c t i o ns t u d ya n dg e n et h e r a p yo fd i s e a s e s o u rr e s e a r c ht e a md e s i g n e dr n ai n t e r f e r e n c eb a s ep a i r s ，a n d s u b c l o n e di n t os h r n av e c t o rp a v u 6 + 2 7 t h e nt h ep a v u 6 + 2 7 一h l r g p l a s m i dw a st r a n s f e c t e di n t oh e p g 2 一p c d n h 3 1 ( 十) 一l r gc e l ll i n eb y 苇目军医太学博士学位论文 w a y o ft r a n s f e c t i o nr e a g e n t a n dl r gm r n ad e c r e a s e dd i s t i n c t l yi n r n a ig r o u p ，a n dl r gp r o t e i nt o o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y r e v e a l e dt h a tg r e e nf l u o r e s c e i n td e s c e n dc l e a r l yi nr n a ic e l l s i td e m o n s t r a t e dt h a tt h en u m b e ro fg 1p h a g ed r a m a t i c a l l yd e c r e a s e d i nh u m a nl r gc e l ll i n eh e p g 2 一p c d n a 3 1 ( + ) 一l r gb yf c m ，t h es a m e r e s u l t sc o u l db eo b s e r v e db yt e m i ts h o w e dt h a ts t a b l ee x p r e s s i o n o fr n a it y p eh u m a nl r gc o u l dp r o m o t ec e l lg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o n s u mu pe x p e r i m e n t s ，w ec a nd r a wac o n c l u s i o n ：h u m a nl r g m a y b ean e wp r o t e i nw h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gc e l l c y c l e ；h u m a nl r gm a yi n v o l v ei nl p ss i g n a lt r a n s d u c tp a t h w a y s ； h u m a nl r gp r o p e r b l yh a v er e l a t i o n sw i t hc e l lp r o l i f e r a t i o n