药理学进展受体.ppt

药理学进展,第一章受体第二章神经药理学研究进展第三章心血管药理学研究进展第四章呼吸药理学研究进展第五章免疫药理学研究进展第六章肿瘤药理学研究进展,内容,第一章受体,第一节受体动力学第二节受体及其结构第三节受体跨膜信号转导机制,参考书,1、孙瑞元等.数学药理学新论.人卫出版社，2004年2、孙瑞元.定量药理学.人卫出版社，1987年3、徐淑云等.药理实验方法学（第三版）.人卫出版社，2002年,第一节受体动力学,药效动力学,整体药效动力学,效应器官动力学,受体动力学,一、概述,受体动力学，即靶体动力学或受体配体反应动力学。是药物与受体间相互关系的研究，即药物与受体的结合、解离、内在活性等方面的研究。,靶体：受体、酶、生物膜、生物代谢环、血浆蛋白、DNA等。,意义：1、有助于靶向药物设计；2、有助于设计有效结构物；3、有助于寻找天然配体。,二、受体动力学研究理论基础,1.1Clark占领学说：（1）受体与配体之间的相互作用是可逆的；（2）受体都是等价的：相同受体与同一配体间具有相同亲和力，一个受体被占领不影响其他游离受体的亲和力；（3）生物效应与被占领的受体数量成正比，结合与效应呈线性关系；（4）受体全部被占领时会产生最大效应。,1、占领学说,1.2Ariens与Stephenson占领学说：1.2.1Ariens提出：药物的最大效应与内在活性（）有关，完全激动的为1，完全拮抗的为0，而在01之间的为部分激动剂（又称为“有内在活性的拮抗剂”）。,1.2.2Stephenson提出：只有一部分受体被占领即可产生最大反应，其余受体称为备用受体；被占领的受体与效应间并不一定是简单的线性关系，用函数关系表示更为合理；不同药物在诱发同一反应的能力方面有很大差异，此称为药物的“效能”。,其中：KD=k2/k1（平衡解离常数）KA=k1/k2=1/KD（平衡结合常数即亲和力常数）RT=R+RL,根据质量作用定律：k1RL=k2RL（2）,（3）,1.3数学模型,将R=RTRL代入式（3）得Clark方程式：,（4）,根据Clark学说，效应E与RL成正比，最大效应Emax与RT成正比，所以,（5）,式（5）反映了药效强度与配体浓度之间的关系。,（6）,（7）,讨论：（1）当L=0时，RL=0，E=0,表明受体全体占领可达最大效应:即RL=RT,E=Emax。,（2）当LKD时,（8）,（9）,（3）当RL/RT=50%时，E/Emax=50%,E=1/2Emax,整理得：KD=L50,KD:为引起最大效应一半时所需的配体浓度。,由于KA=1/KD,所以KD反映配体与受体的亲和力，KD越小，亲和力越大。,二、受体动力学研究理论基础,认为激动剂所引起反应的大小并非正比于占领受体的数目，而是正比于单位时间内配体与受体结合的数目，每当一配体分子结合到一受体上时，该受体就暂时被活化，然后返回其基础活性水平。,2、Paton速率学说：,3、受体的变构学说：,药物与受体的关系由“锁钥”式“诱导契合”,3.1浮动组装说：受体是由几个同质和异质亚基组成的，药物可诱导、吸引受体的组装。受体的空间结构是多态的，受体的组装是浮动的，受体的数目也是可变的。,3、受体的变构学说：,3.2受体高速机制和超敏、脱敏现象：3.2.1受体高速机制表现为：受体数目的变化：受体；受体亲和力的变化：受体、Ins；受体内在反应性的变化：如AC；突触前调节受体。3.2.2脱敏现象：受体过度向下调整3.2.3超敏现象：受体过度向上调整,3.3受体间的正合作效应与负合作效应：受体不是独立的，也不是等价的。受体与第一个药物分子结合后，周围的受体或亚基的亲和力增强了正合作效应，反之，亲和力下降了负合作效应。,3、受体的变构学说：,3.4同步变构与序贯变构：多数受体是亚基的多聚结构。同步变构适用于同种亚基或等效亚基，主要是正合作效应；序贯变构适用于异种亚基或异效亚基，有正合作效应也有负合作效应。,三、受体动力学定量分析,1、定量分析内容：主要是根据受体结合实验的数据，经数学处理，估算各种参数：如亲和力常数KA、解离速率常数KD、各种速率常数、50抑制率（IC50）、Hill系数（n）、受体密度(Bmax)等。,2、定量分析实验2.1放射配体受体结合实验2.2生物测定方法：豚鼠离体回肠实验,2.1放射配体受体结合实验,将用放射性元素（3H,125I,35S）标记的配体(L)与含有受体（R）的细胞膜悬浮液在一定缓冲液中进行孵育，待配体受体结合反应达平衡后，分离除去游离的标记配体（Lf），测定标记配体与受体特异性结合物（RL）的比活度B(或用标记配体总结合比活度BT非特异性结合比活度BNS)。,BT:放射标记配体总结合量（比活度）B:与受体特异性结合量L:加入配体的浓度Lf:游离放射性配体浓度Bmax：与受体最大特异性结合量BNS：非特异性结合量,比活度：单位量的标记物内所含的放射性强度（Ci/mmol）,（10）,2.1.1饱和实验,加入系列浓度L,在反应达到平衡时测定B，得到实际饱和曲线计算饱和函数得到L与RL间定量关系。,Clark方程：为一个受体只有一个位点与配体结合的模型。,2.2.1.1饱和曲线,（12）,Hill方程：为一个受体有多个位点与配体结合的饱和分析。,n:Hill系数，表示一个受体有n个结合位点，或一个受体与n个配体结合。,O,2.2.1.2饱和函数分析,直接作图法:以B-L作图，为双曲线的一支(饱和曲线),半对数作图法（滴定曲线）：以B-logL作图，为一S型曲线。,双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图）：以1/B-1/L作图，为一直线，斜率bKD/Bmax,横截距-1/KD，纵截距a1/Bmax。误差大。,即对Clark方程作不同的处理，然后作图。,（10）,（13）,（14）,（15）,式中：bKD/Bmax,a=1/Bmax,故Bmax1/a,KD=b/a,L-B作图,Lineweaver-Burk双倒数作图法,Scott作图法：药理学中常用以（L/B）L作图为一直线,（13）,（16）,（17）,式中：b1/Bmax，aKD/Bmax故Bmax1/b,KD=a/b,Scott作图法,Scatchart作图法：常用以（B/L）B作图若为一直线,（13）,（18）,（19）,式中：b-1/KD，aBmax/KD故KD=1/b,Bmaxa/b,若为曲线，则提示有两种不同亲和力的位点曲线下凹，为负协同；曲线上凸，为正协同,Scatchart作图法,Hill作图法：分析是否有协同作用好以log(B/(Bmax-B)-logL作图，为一直线,（12）,（20）,（21）,式中：bn，a-logKD故KD=log-1(-a),（22）,Hill对数作图法,以（B/Bmax）L作图时，n=1，为直线，表示无协同效应；n1，为S型曲线，表示正协同效应。,正协同：一配体结合后，使另一配体与受体的亲和力有所增强；负协同则有所减弱。,Hill作图法,2.1.2动力学实验,用来分析平衡结合实验所需的培育时间，判断配体受体反应的可逆性等，通过回归分析可得到k1和k2。,方法：使总加入的配体浓度L保持不变，在不同时间测定特异性结合的量RL。描述反应速度的方程为：,dRL/dt=k1RL-k2RL,用来测定非标记配体与标记配体竞争性结合同一受体的能力，用IC50和Ki表示。IC50：抑制50结合的非标记配体浓度；Ki：指在标记配体存在和平衡时，非标记配体与受体部位结合的平衡解离常数。,2.1.3竞争性抑制实验,2.1.3竞争性抑制实验：,原理：在该实验中，非标记配体(竞争性抑制剂)与标记配体可共同竞争结合部位。当受体总浓度RT和标记配体总浓度LT固定不变时，随着非标记配体浓度I的增加，RI将随之增加，由于R降低，RL也必然降低。,根据质量作用定律推导得到：,（23）,（24）,Ki与IC50关系：,IC50测定：固定标记配体浓度，选择非标记配体67个浓度，测定不同浓度下对标记配体与受体结合的抑制百分率（I）：,（25）,以I%为纵坐标，非标记配体浓度对数（logI）为横坐标绘图，从图中可求得IC50。,放射配体,抑制,2.2生物测定方法：豚鼠离体回肠实验,设：D：药物；R：受体；E：效应；Emax：最大效应：,（27）,方法：给与不同浓度药物，测定回肠张力，同前法对数据进行线性回归，求出药物的KD和Emax。,四、举例：M胆碱受体配体结合实验,标记配体：3H-QNB（二苯羟乙酸奎宁酯）组织：大鼠全脑（去小脑）膜蛋白制备,1、饱和曲线：每个反应管中加入固定浓度的膜蛋白(0.2mg/ml)和不同浓度的3H-QNB（0.16nmol/L）。在非特异结合管中另加入总浓度为10-6mol/L的阿托品，补充Tris缓冲液至总体积1ml,具体操作见表。,将反应管置37水浴温孵30分钟，用5ml冰冷的0.05mol/LTris缓冲液终止反应，立即倒入铺有玻璃纤维膜片的滤器中，减压抽滤，再冲洗23次（5ml/次）以洗去游离的3H-QNB。滤片在80、30分钟烘干后置5ml甲苯闪烁液中，用液体闪烁计数器测定滤片上的放射量（cpm）特异性结合BSBTBNS,表.M胆碱受体饱和实验,结果,DPM：衰变数/分钟,结果,结果：平衡解离常数为1.19nmol/L，受体密度为502fmol/mg蛋白,结果,Hill系数n1.013，说明受体与配体的结合关系为1：1,3H-QNB与M胆碱受体结合的Hill图,结果,四、举例：M胆碱受体配体结合实验,2、竞争曲线：固定3H-QNB浓度，加不同未标记化合物和一定量膜蛋白。,IC507.510-8mol/L已知L=0.42nmol/L，KD1.19nmol/L,55.43nmol/L(阿托品),-,习题,某次离体输精管实验，实测结果如下：,试用L-B法、Scott法、Scatchart法和Hill法计算回归方程式，并求出KD、Emax值，D50及pD2。,第一章受体,第一节受体动力学第二节受体及其结构第三节受体跨膜信号转导机制,参考书,1、库宝善.神经精神药理学.北京大学医学出版社，2006年2、张庆柱.基础神经药理学.人民卫生出版社，2009年3、刘景生.细胞信息与调控.北医和协和医科大联合出版社，1998年4、冯作化.医学分子生物学.人卫出版社，2001年,第二节受体及其结构,一、受体及其亚型,1、肾上腺素能受体：1，2，1，22、多巴胺能受体：D1,，D23、5-羟色胺能受体：5HT1A,5HT1B,5HT1C,5HT1D,5HT2,5HT34、胆碱能受体：毒蕈碱型：M1，M2，M3，M4,M5烟碱型：N1，N25、阿片受体：，6、GABA能受体：GABAA，GABAB7、兴奋性氨基酸受体：NMDA，AMPA，Kainic8、组胺能受体：H1，H2,1门控离子通道型受体：如N-AchR，GABA-R、Gly-R,Glu-R，Asp-R。2G蛋白偶联受体：M-R，-R，-R，D-R，5-HT-R,阿片R，P物质R，嘌呤R，PG-R，多肽激素R。3细胞内受体：如甾体激素受体，甲状腺素受体。4有酪氨酸激酶活性的受体：受体本身有激酶活性。如表皮生长因子，胰岛素受体，胰岛素样生长因子，血小板生长因子，某些淋巴因子等。,二、受体分类,1、门控离子通道型受体结构：特征：5个亚基，围成一个中央通道；每个亚基：N、C末端均在细胞膜外侧；有4个跨膜区域M1、M2、M3、M4；500个氨基酸，MW220350kDa以N2-AchR为例：25个亚基,三、受体结构,2、G蛋白偶联受体结构：特征：有7个跨膜区段，N末端在外、C末端在内，350500AA残基；每个区段：2030AA,螺旋，MW4555kDa,G蛋白结合位点：连接第五、六区段的环上及C末端配体结合位点：小分子生物胺、小肽：跨膜螺旋构成的结合袋（pocket）中,4、有酪氨酸激酶活性的受体：为单次跨膜受体（图）,3、细胞内受体,均属于转录因子，并具有锌指结构作为其DNA结合区。,锌指结构：指在结合DNA的结构域中含有较多的半胱氨酸和组氨酸的区域，借肽链弯曲使它们与锌离子络合成的指状结构。（图）,三种膜受体的特点,第一章受体,第一节受体动力学第二节受体及其结构第三节受体跨膜信号转导机制,第三节受体跨膜信号转导机制,一、信号转导分子基础,外源信号,受体,小分子信使浓度或分布变化,大分子信使构象变化,化学修饰,蛋白质相互作用,效应分子构像变化,效应,小分子信使变构效应,1、信号转导的基本路线和方式,蛋白质分子胞内定位改变,蛋白质分子胞内水平调节,胞内信使变化,2、胞内关键信号转导分子,2.1蛋白激酶起磷酸化作用,是能够将-磷酸基团从磷酸供体（如ATP）分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。,2.1.2重要的蛋白激酶：,五大类：蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶；蛋白酪氨酸激酶；蛋白组/赖/精氨酸激酶；蛋白半胱氨酸激酶；蛋白天冬氨酸/谷氨酸激酶,2.1.1分类：,蛋白激酶A(PKA)；蛋白激酶G(PKG)；蛋白激酶C(PKC)；钙调素依赖蛋白激酶；蛋白酪氨酸激酶；有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）,2.1.2.1MAPK:,属于蛋白丝/苏氨酸激酶，参与多种细胞功能的调控，尤其是在细胞增殖、分化及凋亡过程中，似乎是多种信号转导途径的共同作用部位。,有5个亚家族：ERK、JNK、P38亚家族等,2.1.2.2蛋白酪氨酸激酶:,使蛋白质分子中的酪氨酸残基磷酸化，大多具有正向调节作用。如细胞的增殖、T、B、肥大细胞活化等,蛋白酪氨酸激酶受体：为跨膜蛋白,胞浆内的蛋白酪氨酸激酶：是受体和最终效应分子之间的中间介导分子,核内蛋白酪氨酸激酶：Ab1、Wee,Src家族：Src、Fyn、Lck、Lyn等,ZAP70家族：ZAP70、Syk等,Tec家族：Btk、Itk、Tec等,JAK家族：JAK1、JAK2、JAK3等,2.2蛋白磷酸酶去磷酸化作用,包括：蛋白丝/苏氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶,2.3GTP结合蛋白（G蛋白）开关作用,2.3.1GTP结合蛋白三聚体：是与七次跨膜受体相结合的G蛋白,3个亚基：亚基-GDP(无活性)，亚基-GTP（有活性），本身有GTP酶活性。分类：由不同的亚基与较恒定的亚基组成,Gs:激活AC，百日咳毒素抑制Gi：抑制AC，霍乱毒素抑制Gt：介导视紫质激活cGMP磷酸二脂酶，百日咳、霍乱毒素均抑制Gq：激活磷脂酶,2.3.2低分子量G蛋白（21kD)：位于MAPK系统上游，非活化状态时结合GDP，结合GTP即被活化，进而使位于下游的MAPK系统活化。本身也具有GTP酶活性。,Ras超家族成员：50多个,2.4蛋白质相互作用的调控结合元件,调控结合元件是指蛋白质分子中的特殊结构域。SH2结构域:与含磷酸酪氨酸的蛋白分子结合SH3结构域：与富含脯氨酸的蛋白分子结合PH结构域：与磷脂类（PIP2、PIP3）分子结合PTB结构域：同SH2结构域,特点:1、一个信号转导分子可以含有两种以上的结合元件（如蛋白酪氨酸激酶Btk）；2、同一类调控结合元件可存在于多种不同的信号转导分子中（如PH结构域存在于100余种蛋白激酶中、低分子量G蛋白调节分子、细胞骨架蛋白等）。,二、离子通道型受体信号转导机制,受体组成的离子通道与受电位控制的离子通道不同，其开、关直接受化学配体的控制，如神经递质。离子通道型受体信号转导的最终作用是导致细胞膜电位改变，即该类受体是通过将化学信号转变成为电信号而调节细胞功能的。,三、细胞内受体信号转导机制,在没有激素作用时，受体与热休克蛋白（Hsps）形成复合物，因此阻滞了受体向细胞核的移动及其与DNA的结合。当激素与受体结合时，受体构象发生变化，导致热休克蛋白与其解离，暴露出受体核内转移部位及DNA结合部位，激素-受体复合物向核内转移，并结合于DNA上的激素反应元件（HRE）上，不同的激素-受体复合物结合于不同的HRE。结合于HRE的激素-受体复合物与位于启动子区域的基本转录因子及其它的转录调节分子作用，从而开放或关闭其下游基因，进而改变细胞的基因表达谱，并发生细胞功能改变。,四、G蛋白偶联受体的信号转导机制,1、信号传递过程：配体与受体结合；受体激活G蛋白；G蛋白激活或抑制细胞中的效应分子；效应分子改变细胞内第二信使的含量与分布；第二信使作用于相应靶分子，使之构象改变，从而改变细胞的代谢过程及基因表达等功能。,L+(M,)-RL-R复合物G蛋白活化效应分子(AC,PLC)第二信使靶分子E,2、G蛋白：三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白3