（化学工艺专业论文）姜黄素和黄豆苷与核酸G四链体相互作用的研究.pdf

摘要 端粒是真核染色体的天然末端，富含鸟嘌呤。在体细胞分裂过程中，端 粒发生进行性缩短。当端粒长度缩短到某一极限时，染色体不能保持稳定， 导致细胞最终退出细胞周期，进入衰亡过程。而癌细胞内的端粒在端粒酶的 作用下保持一定的长度，使其不能检测到凋亡信号而永生化。富含鸟嘌呤的 寡核苷酸在一定较高浓度的钾离子或钠离子溶液中能够形成g 四链体结构。 端粒酶的复制模板只能对单链的端粒识别而对其进行合成，而g 四链体的形 成则阻碍端粒酶对端粒的识别，从而抑制端粒酶的活性。因此g 四链体己成 为当前抗癌药物设计的一个潜在靶点。 本论文主要运用圆二色谱仪，紫外分光光谱仪以及质谱仪等仪器研究了 在不同条件下，姜黄素对由纤毛虫端粒序列5 g 4 t 4 g 4 3 形成的g 四链体及其 与互补序列形成的双链d n a 的结构和稳定性的影响，以及在拥挤环境下，姜 黄素与该序列形成的g 四链体的作用。进而，运用分子模拟软件分析了姜黄 素和黄豆苷与g 四链体的相互作用；研究了黄豆苷与序列5 g 4 t 4 g 4 。3 形成的 g 四链体作用的情况。最后，考察了姜黄素和黄豆苷与人端粒序列5 - a g g g ( t t a g g g ) 3 3 所形成的g 四链体在稀溶液中和拥挤状况下的作用规律。 研究结果表明：在稀溶液中，无论是在n a + ，k + ，m 9 2 十等离子环境中， 姜黄素都不能够与g 四链体和双链d n a 作用。而在拥挤环境中，姜黄素能 够与序列5 - g 4 t 4 g 。3 形成的g 四链体作用，并且作用后增加了g 四链体的 稳定性。计算机模拟结果表明，黄豆苷更容易与序列5 - g 4 t 4 g 4 3 所形成的g 四链体结合。黄豆苷能够与序列5 1 g 4 t 4 g 4 3 。形成的g 四链体以2 ：1 或1 ：1 的化学计量比结合，并且作用后能够增加g 四链体的稳定性。对于姜黄素， 无论是在稀溶液中还是拥挤状况下，都不能与人端粒序列5 - a g g g ( t r a g g g ) 3 3 所形成的g 四链体结合，而黄豆苷能够与人端粒序列所形成 的g 四链体按1 ：1 的化学计量比结合，并且结合后提高了g 一四链体的稳定； 而在大分子拥挤状况下，黄豆苷与人端粒序列5 1 - a g g g ( t t a g g g ) 3 3 所形 成g 四链体结合和后显著提高了g 四链体的稳定性。 关键词：端粒；g 四链体；姜黄素；黄豆营；圆二色谱；电喷雾质谱 a b s t r a c t t e l o m c r e s t h ee n do fe u k a r y o t ec h r o m o s o m e s c o n t a i ng u a n i n e - r i c hd n a s e q u e n c e s r e i o m e r ee r o s i o no c c u r sn a t u r a l l yd u r i n gr e p l i c a t i o no fs o m a t i cc e l l s t h e s ec e l l sc o n t i n u et of u n c t i o na n dd i v i d eu n t i lac r i t i c a l l ys h o r tl e n g t ho f t e l o m e r i cd n ai sr e a c h e d w h e nc e l l se n t e ras t a g eo fi r r e v e r s i b l eg r o w t ha r r e s t r e p l i c a t i v es e n e s c e n c e ，f o l l o w e db yc e l l c r i s i s a n da p o p t o s i s t u m o tc e l l s t e l o m e r e sa r em a i n t a i n e di n l e n g t hs ot h a tt h e y a r ee f f e c t i v e l yi m m o r t a l i z e d g u a n i n e r i c hd n as e q u e n c e sh a v et h ea b i l i t yt of o r n lf o a rs t r a n d e di n t e r - a n d i n t r a m o l e c u l a rg u a n i n eq u a d r u p l e xs t r u c t u r e su n d e rc o n d i t i o n so fh i g hs o d i u mo r p o t a s s i u mi o n i cs t r e n g t h s i n c et h er n at e m p l a t eo ft e l o m e r a s er e q u i r e san o f o l d e dt e l o m e r i cd n ap r i m e ri no r d e rt oa f f e c tt e l o m e r es y n t h e s i s t h ef o r m a t i o no f t e l o m e r i cg q u a r t e ts t r u c t u r ea th i g hp o t a s s i u mi o nl e v e l sr e s u l t si nt h ei n h i b i t i o n o ft e l o m e r a s ef u n c t i o n an u m b e ro fs m a l lm o l e c u l e sh a v eb e e nd i s c o v e r e dt o i n h i b i tt h ef u n c t i o no ft e l o m e r a s e s og - q u a d r u p l e xi sap o t e n t i a l t a r g e tf o r a n t i c a n c e r b yu s i n gu l t r a v i o l e t ( u a n dc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r o s c o p ya n d e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( e s i m s 、w es t u d yt h ec u r c u m i na f f o c t t h es t r u c t u r ea n ds t a b i l i t yo fg - q u a d r u p l e xf o r m e df r o m5 - g 4 t 4 g 4 - 3a n dd o u b l e s t r a n d sd n af o r m e df r o m5 一g 4 t 4 g 4 3a n di t sc o m p l e m e n ti nd i f f e r e n tb u f i e r s w es t u d yt h ec u r c u m i ni n t e r a c tg - q u a d m p l e xf o r m e df r o m5 g 4 t 4 g 4 3i nt h e c r o w d i n gc o n d i t i o nt o o t h e l w eu s es y b y l 6 9 0s o f t w a r et os t u d yc u r c u m i na n d d a i d z i ni n t e r a c tg q u a d r u p l e x i na d d i t i o n ，w es t u d yc u r c u m i na n dd a i d z i ni n t e r a c t g q u a d m p l e xf o r m e df r o m5 a g g g ( t l g g g ) 3 3i nm ew e a ks o l u t i o na n d c r o w d i n gc o n d i t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec u r c u m i nc a l l tc o m b i n ew i t l lg q u a d r u p l e x f o r m e df r o m5 g 4 t 4 g 4 。3a n d5 a g g g ( t i a g g g ) 3 - 3i nw e a ks o l u t i o n i n c r o w d i n gc o n d i t i o n ，c u r c u m i nc a n tc o m b i n ew i t hg q u a d m p l e xf o r m e df r o m 5 a g g g ( t i a g g g ) r 3b u tc a nc o m b i n ew i t hg q u a d m p l e xf o r m e df r o m 5 一g 4 t 4 g 4 3a n di m p r o v et h eg - q u a d r u p l e xs t a b i l i t y t h ed a i d z i nc a nc o m b i n e w i t hg q u a d r u p l e xf o r m e df r o m5 一g 4 t 4 g 4 - 3w i t hs t o i c h i o m e t r i cp r o p o r t i o n2 ：1o r i ：i ，a n dw i t hg q u a d r u p l e xf o r m e df r o m5 a g g g ( t 1 a g g g ) ，3w i t l i s t o i c h i o m e t r i c p r o p o r t i o n 1 ：1 a tt h es a m et i m ei m p r o v e st h e s t a b i l i t y o f g q u a d r u p l e x e s i n c r o w d i n g c o n d i t i o n t h ed a i d z i n c a nc o m b i n ew i t h g - q u a d r u p l e xa n di m p r o v e st h eg - q u a d r u p l e x e sg r e a t l y n er e s u l to fs i m u l a t i o n i n d i c a t et h a tt h ea b i l i t yo fd a i d z i nc o m b i n i n gw i t hg , q u a d r u p l e xf o r m e df r o m 5 g 4 t 4 g 4 3s t r o n g e rt h a nc u r c u m i n s ，w h i c hc o n f o r mw i t ht h er e s u l t so f e x p e r i m e n t k e yw o r d s ：t e l o m e r e ；g q u a d m p l e x ；c u r c u m i n ；d a i d z i mc d ；e s i - m s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得 的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨注盘鲎或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：丞己龋- 卫签字日期：2 。 年月厶f i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨生盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定。特授权盔洼盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。 同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：狄日；乙生 导师签名 签字日期：王。睁月幻日签字日期：动。箨月b 日 h u 舌 在活细胞的各种组分中，核酸是最为关键的。它包含了遗传信息，并参与这 些信息在细胞内的表达，从而促成代谢过程并控制这一过程。由于核酸介入了生 物的生长、发育、繁殖等正常的生命活动，还与生命的异常情况也密切相关，并 且随着分子生物学和生物技术的迅猛发展，有关核酸的分子生物学和生物物理化 学研究已经成为当前生命化学、分子生物学及医学领域中最具活力的研究方向之 恶性肿瘤是继心脑血管疾病之后发病率和死亡率均很高的疾病，严重威胁人 类的健康。著名科学家、癌基因研究先驱之一r w e i n b e r g 曾在世界权威杂志 c e u 上指出：细胞只有获得六大性质之后才能成为恣意妄为的侵袭性细胞， 这六大性质包括( 1 ) 细胞必须发生突变；( 2 ) 癌细胞必须有它们自己的生长信 号途径而不依赖于外界的信号；( 3 ) 它们必须摆脱一种称为“细胞凋亡”的生理 学死亡过程，即它们再也不受细胞内原有的“生命程序”的安排而成为“永生不 死者”；( 4 ) 他们还要发展出无限增殖的能力。例如正常细胞大约可以分裂7 0 次，而成为恶性者便能永久分裂下去。这是因为正常细胞每分裂一次，他们染色 体末端一种称为“端粒”的保护帽便会缩短一些，并且随着分裂次数的增加，保 护帽的这种结构将会丧失殆尽，染色体得不到保护，导致细胞死亡。然而癌细胞 开发出一种端粒酶，它可以重建癌细胞的端粒，因此染色体不会随细胞的分裂而 变短，于是细胞便获得无限分裂的能力。另外两种性质是仅适用于肝癌、胃癌这 样的实体瘤的，即( 5 ) 肿瘤必须建立它们自身的血管网络系统以便得到足够的 氧气与营养的供应；( 6 ) 癌症的组成细胞能够从主体肿瘤中脱离并进入血液或淋 巴系统，他们随着血液或淋巴液到达组织远处，在那里生长，这一过程称为肿瘤 的转移，十之九的患者都死于这种过程。 端粒是真核细胞染色体的天然末端，含有许多简单非编码的串联重复d n a 序列及多种蛋白质成分，其d n a 序列富含鸟嘌呤。端粒酶是由r n a 和蛋白质 亚基组成的一种特殊的逆转录酶，它能以自身r n a 为模板直接在染色体末端合 成端粒重复序列，使端粒长度保持稳定或增加。端粒酶以自身为模版复制端粒， 依靠其对端粒d n a 引物的识别是其链状结构而非特异序列。研究发现某些含有 大量鸟嘌呤碱基重复序列的d n a 可以形成四连螺旋结构，因此被称为g 一四链体。 一旦端粒d n a 形成g 一四链体结构，端粒酶便不能对其识别，从而抑制端粒酶的 活性，因此g 四链体d n a 己成为抗癌药物设计的极具有吸引力的潜在靶点i l j 。 在g 四链体结构的基础上，目前已有若干研究小组成功设计和合成了与其相互 作用的先导化合物，并且广泛研究了它们与g 四链体的作用。 本文利用圆二色谱仪( c d ) 、紫外光谱( u v ) 和质谱( m s ) 等仪器研究了 天然小分子化合物姜黄素( c u r c u m i n ) 在不同的离子条件下对g 四链体和双链 d n a 的结构和稳定性的影响，并考察了大分子拥挤环境对姜黄素和g 一四链体作 用的影响和比较了大豆苷、姜黄素与g 四链体的作用。本文还利用计算机模拟 软件对姜黄素和大豆苷与g 一四链体的作用进行了模拟。 第一章文献综述 第一章文献综述 随着分子生物学的研究深入以及现代物理技术的发展和在核酸结构研究中 的广泛应用，人们逐渐发现在生物体中d n a 的存在具有多样性，最常见的d n a 是由两条互补链通过碱基配对的方式所形成的双螺旋结构 2 1 ，可是在一些小的细 菌噬菌体中，d n a 是以单链形式存在i 拘 3 1 ；而在一些生物体( 如病毒、细胞器 等) 则是咀环状超螺旋形式存在。当研究深入到基因组及相关分子相互作用的层 次时，发现d n a 的行为和特征是十分多样化的。如依赖于d n a 的核酸序列和 环境条件，除标准的b d n a 外，双螺旋还存在着几种不同的构型，如a - d n a ， z d n a ( 左手双螺旋) ，p d n a ( 平行双螺旋) 1 4 1 等。甚至在负超螺旋的超螺旋 应力作用下，某些d n a 序列经历了一个从b d n a 到非b d n a 的结构转变，这 包括重复序列的反转形成的十字形结构，交替嘧啶嘌呤链形成的左手z d n a 结 构，具有镜面对称性的同型瞟呤同型嘧啶序列形成的h d n a ( 铰链三螺旋) 以 及通过单链之间或单链内对应的g 残基之间形成h o o g s t e e n 碱基配对，从而形成 的g 一四链体结构等1 4 , 5 1 。 癌症是发病率和死亡率均很高的疾病，严重威胁人类的健康。根据目前癌症 的发病趋势判断，今后数年将是全球癌症的高发年份。预计2 0 2 0 年全世界癌症 发病率将比现在增加5 0 ，每年将新增1 5 0 0 万个癌症病例和1 0 0 0 万人死于癌 症。据统计，2 0 0 0 年全球共有6 2 0 万病人死亡，其中1 2 是死于各种癌症1 6 】。 近几年来，中医药学在抗癌治疗方面的研究越来越多，并且随着分子生物学的研 究深入以及现代物理技术的发展和在核酸结构研究中的广泛应用，以及对涉及到 d n a p , n a 的生命过程的不断深入研究，人们已经开始在分子水平上对中医药抗 癌作用机制进行了探讨。 1 1 中医药在抗癌方面的研究近况 癌症是目前危害人类健康的主要疾病之一，目前在癌症的治疗方面应用最多 的是使用化学药物，这些化学药物在作用于靶细胞的同时，也作用于正常的细胞， 尽管可以起到一定的治疗作用，但是化疗药物的免疫抑制、骨髓抑制等严重的毒、 副作用是很难避免的，因此化学疗法未必能确实提高患者的生存质量、延长患者 的寿命。因此使用中药来抗癌，寻找抗癌药物中的有效成分，并对其进行化学、 药理以及临床研究，成为国内外药物化学工作者的研究研究重点之一【7 】。 3 第一章文献综述 第一章文献综述 随着分子生物学的研究深入以及现代物理技术的发展和在核酸结构研究中 的广泛应用，人们逐渐发现在生物体中d n a 的存在具有多样性，最常见的d n a 是由两条互补链通过碱基配列的方式所形成的双螺旋结构1 2 1 ，可是在一些小的细 菌噬菌体中，d n a 是以单链形式存在的i m ；而在一些生物体( 如病毒、细胞器 等) 则是以环状超螺旋形式存在。当研究深入到基因组及相关分子相互作用的层 次时，发现d n a 的行为和特征是十分多样化的。如依赖于d n a 的核酸序列和 环境条件，除标准的b d n a 外，双螺旋还存在着几种不同的构型，如a - d n a ， z d n a ( 左手双螺旋) ，p d n a ( 平行双螺旋) 1 4 j 等。甚至在受超螺旋的超螺旋 应力作用下，某些d n a 序列经历了一个从b d n a 到非b d n a 的结构转变，这 包括重复序列的反转形成的十字形结构，交替嘧啶嘌呤链形成的左手z d n a 结 构，具有镜面对称性的同型瞟呤同型嘧啶序列形成的h d n a ( 铰链三螺旋) 以 及通过单链之间或单链内对应的g 残基之间形成h o o g s t c c n 碱基配对，从而形成 的g 一四链体结构等1 4 , 5 。 癌症是发病率和死亡率均很高的疾病，严重成胁人类的健康。根据目前癌症 的发病趋势判断，今后数年将是全球癌症的高发年份。预计2 0 2 0 年全世界癌症 发病率将比现在增加5 0 ，每年将新增1 5 0 0 万个癌症病例和1 0 0 0 万人死于癌 症。据统计，2 0 0 0 年全球共有6 2 0 万病人死亡，其中1 2 是死于各种癌症1 6 】。 近几年来，中医药学在抗癌治疗方面的研究越来越多，并且随着分子生物学的研 究深入以及现代物理技术的发展和在核酸结构研究中的广泛应用，以及对涉及到 d n a p - n a 的生命过程的不断深入研究，人们已经开始在分子水平上对中医药抗 癌作用机制进行了探讨。 1 1 中医药在抗痛方面的研究近况 癌症是目前危害人类健康的主要疾病之一，目前在癌症的治疗方面应用最多 的是使用化学药物，这些化学药物在作用于靶细胞的同时，也作用于正常的细胞， 尽管可以起到一定的治疗作用，但是化疗药物的免疫抑制、骨髓抑制等严重的毒、 副作用是很难避免的，因此化学疗法未必能确实提高患者的生存质量、延长患者 的寿命。因此使用中药来抗癌，寻找抗癌药物中的有效成分并对其进行化学、 药理以及临床研究，成为国内外药物化学工作者的研究研究重点之- - u 。 药理以及临床研究，成为国内外药物化学工作者的研究研究重点之- - u 。 第一章文献综述 据统计，我国当前已对药用植物中的2 8 个科( 属) ，3 0 0 0 多种以上的中草 药进行了抗癌筛选，其中含有抗癌活性成分的中草药有2 0 0 种左右。下面是近 1 0 年来药物化学工作者研究出来的一些抗癌中药中的有效成分。 1 1 1 生物碱 1 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ，简称c p t ) 是从热带植物喜树的根、皮、茎和种子中 分得的生物碱，它在体外对h e l a 细胞和1 1 2 l o 细胞及啮齿动物显示较强的抗癌活 性。拓扑特肯( t o p o t e c a n ) 为喜树碱的半合成品，对p 3 8 8 白血病、l e w i s 肺癌 能治愈，对小鼠结肠癌3 8 及5 1 、5 0 7 6 网状细胞肉瘤、乳腺癌1 6 c 及人结肠癌 裸鼠移植h t 2 9 等均很有效学j 。 2 苦参碱( m a t r i n e ) 对s 1 8 0 实体瘤均有不同程度的抑制作用，其中各单体生物 碱的抑瘤率均在3 5 以上。从豆科植物苦豆子的根茎中提取的槐果碱可用于治疗 子宫颈癌。苦参中所含的生物碱均属喹喏里西啶类衍生物，苦参生物碱在抗肿瘤 过程中，能提升白细胞，提高机体免疫功能1 9 j 。 此外，石蒜科植物水仙中的石蒜碱、三尖杉属植物含的三类杉酯碱和高三尖 杉酯碱、唐松草属植物所含的双苄基异喹啉生物碱、百合科秋水仙属植物的生物 碱、芸香科花椒属的异喹啉生物碱，从美登木中提取的美登木碱，从长春花中提 取的长春新碱以及秋水仙碱、秋水仙胺等都有抗癌活性【”。 1 1 2 萜类化合物 紫杉醇( t a x 0 1 ) 和紫杉次碱( t a x o t i n e ) ：从短叶红豆杉树皮中提取分离出 来的紫杉醇，是一种复杂结构的二萜类化合物，能作用于细胞有丝分裂过程中形 成纺锤体的微管蛋白，促进微管聚合以抑制其解溶，具有广谱、抗癌活性强的效 果，尤其是对子宫癌、卵巢癌、卵巢癌具有特殊疗效。紫杉次碱是从云南红豆杉 的树皮中分离得到含有t a x a y i n t i na b c d 四个新紫杉烷类的的四环二萜类化 合物，具有显著的抗癌活性i l 。 1 1 3 多糖类 多糖( p o l y s a c h a r i d e ) 是一类大分子化合物，中药抗癌多糖类成分主要来自 三个方面。 1 植物多糖从刺参中提取的酸性多糖对移植性实验肿瘤有较显著疗效，对 m a 7 3 7 乳腺癌的疗效更加显著，对肉瘤1 8 0 的治疗作用也非常明显。枸杞多糖 对s ，8 0 荷瘤细胞免疫功能有增强作用和相应的抑瘤作用，与环磷酰胺合用有协同 抗瘤作用 1 l 】。 第一章文献综述 2 真菌多糖从冬虫夏草中提取得到的多糖可增加化疗药物的抗肿瘤作用。从云 芝菌丝体提取的多糖是每四个葡萄糖单位含有一个带0 - - 1 ，6 毗喃糖苷支链的 1 3 - - 1 ，4 葡聚糖，其中还有一些肽基，它对实验动物肿瘤具有明显的抑制作用。 而从支芝发酵液提取的多糖为不含蛋自质的葡聚糖，微溶于水，也具有抗癌活性 。 3 动物多糖从圆背无齿蚌中分得一种具有抗肿瘤活性的糖蛋白h b i i ，分子量 为1 7 9 0 0 d 。含糖2 1 1 7 ，h b i i 对小鼠e a c 和s 1 8 0 肿瘤的抑制率分别为4 8 2 4 和5 4 8 f 1 引。 除此之外，还有许多其它类的化合物也具有较强的抗癌活性。如河南民间治 疗食管癌验方中的主要药物为冬凌草，其有效成分为冬凌草甲素，对k 5 6 2 怂0 2 细胞有诱导凋亡、逆转耐药性的作用，是一种很有前途的抗白血病中药。b 榄香 烯对体外培养的肝癌细胞有诱导凋亡作用i v 。 总之，中草药抗肿瘤已成为世界范围内的研究热点，而且在治疗肿瘤过程中 越来越占优势。随着我国加入世界贸易组织，制药专利技术越来越显示其重要性， i 习此，在分子生物学水平上加强抗癌中草药作用机理的研究，必将为中草药在抗 癌方面的应用的推广以起着很重要的促进作用。 1 2 端粒与端粒酶 1 2 1 端粒 2 0 世纪三四十年代，h e r m a n nm u l l e r 和b a r b a r am c c l m t o c k 同时提出了端粒的 概念，端粒是真核细胞染色体的天然末端，含有许多简单非编码的串联重复d n a 序列及多种蛋白质成分，其在生物体内如图1 1 所示。其生物学功能是防止染色 体复制过程中的错误重组、端端融合、抵御核酸酶、连接酶对d n a 的损伤，维 持基因组的稳定，调控细胞的寿命及其分化发育以及参与核膜附着等功能【1 4 , 3 1 1 。 端粒的d n a 序列最早是由b l a c k b u r n 等在1 9 7 8 年从嗜热四膜虫中分离出5 ( t r g g g g ) 3 。的重复序列【l “，后来人们相继在不同生物体中也发现了相似的 端粒重复序列，大多数有机体的端粒d n a 是由非常短且数目精确的串联重复 d n a 序列排列而成，富含鸟嘌呤。端粒序列在生物体内广泛存在，如纤毛虫类 四膜虫( t e t r a h y m e n a ) 的端粒序列为5 - t t g g g g 一3 1 1 6 】、纤毛虫类尖毛虫 ( o x y t r i c h a ) 和游仆虫( e u p l o t e s ) 的端粒序列为5 - i q t f g g g g 一3 【1 7 l 、真菌类酿酒 酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的端粒序列为5 t ( g ) 2 _ 3 f r o ) 1 ，6 、人和脊椎动物 的端粒为5 t t a g g g 3 “”1 等。人的端粒约有1 5 k b 反复串联的t t a g g g 结构组成， 并且9 5 0 2 0 0 b p 次分裂进行性缩短，其双链d n a 序列位于染色体的3 7 端，突出 第一章文献综述 约1 2 1 6 个g 核苷酸。 图1 - 1 细胞内的端粒示意图 f i 9 1 - 1t h es c h e m a t i cd i a g r a mo ft e l o m e r ei nc e l l 端粒对于染色体的稳定及其基因组的完整性非常重要，能够为染色体末端提 供一个保护性的“帽子”，保护染色体末端免受损伤，防止染色体互相融合、重 组及一些外切酶、连结酶的作用，防止d n a 的损伤并记数在线性d n a 复制时 出现的末端d n a 片断的丢失i 圳。生物界最基本和普遍的d n a 复制是半保留不 连续的复制，但在染色体线性d n a 的复制中却存在着一些问题，由于d n a 聚 合酶绝对需要r n a 引物，并且从5 一3 方向延伸，当聚合结束时，冈崎片断的 r n a 引物水解，随后由d n a 连结酶完成，在新合成链的5 端r n a 引物去处后， 传统的d n a 聚合酶不能修复，势必造成每经过一次细胞分裂，染色体端粒就会 缩短，这就是所谓“末端复制问题”【2 1 】，l e v y 2 2 1 等研究发现，正常人的组织和 细胞在复制过程中均有端粒d n a 的丢失( 包括造血细胞核性腺细胞) ，而且端 粒的长短控制着细胞的分化及复制能力，通过对t r f 分析，正常体细胞在体内 分裂或体外传代过程中，细胞每分裂一次，端粒d n a 减少5 0 2 0 0 b p ，当端粒长 度缩短到某一极限时，染色体不能保持稳定，即作为一种信号，触发细胞的复制 衰亡( r e p l i c a t i v es e n e s c e n c e ) ，使细胞停滞与细胞周期的某一阶段而丧失自我复 制能力，导致细胞最终退出细胞周期，进入衰亡过程，如图1 - 2 所示。故有人称 端粒为“生命的时钟”【硐或“有丝分裂的计数器”。 第一章文献综述 1 2 2 端粒酶口啦5 l 图1 - 2 端粒的作用 f i 9 1 2t h ee f f e c to ft e l o m e r e 端粒酶是由r n a 和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶，它能以自身 r n a 为模板直接在染色体末端合成端粒重复序列，使端粒长度保持稳定或增加。 端粒酶由三个部分组成，包括端粒酶r n a ( h t r ) ，逆转录酶催化亚基 ( h t e r t ) 和端粒酶其它聚合蛋白f r e p l p 矧。端粒酶的生物功能是合成染色体末 端的端粒，是一种依赖于r n a 的特殊的d n a 聚合酶，属于逆转录酶类型。逆 转录( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ) 是相对于转录而言，我们将以d n a 为模板，在r n a 聚合酶( 依赖于d n a 的r n a 聚合酶) 的催化下合成r n a 的过程叫做转录，而 将以r n a 为模板，在逆转录酶( r e v e i s et r a n s c r i p t a s e ，依赖于r n a 的d n a 聚合 酶) 催化下合成d n a 的过程叫逆转录。逆转录酶是一种特殊的d n a 聚合酶， 其可以以r n a 和d n a 作为模板。 端粒酶r n a 模板区的序列与端粒的重复序列互补，到目前为止，在纤毛虫、 酵母、乳酸菌、小鼠及人类等生物中已经克隆出超过3 0 个端粒酶的r n a 的基 因，由于不同物种的端粒重复序列不尽相同，所以模板区的重复性较低，如四膜 虫的端粒r n a 为1 5 9 个核苷酸，其模板序列为5 c a a c c c c a a - 3 ，人的端粒 酶r n a ( h t r ) 有4 5 5 个核苷酸，其模板序列为5 c u 必c c c u a a c 3 。模板区 又可以分为两个功能区域，一个用作与端粒的末端结合定位，如四膜虫的膜扳区 序列中的5 c a a 3 部分，另一个作用为延伸复制的模板，如四膜虫的膜板区序 列中的5 - c a a c c c 3 。延长的端粒d n a 与端粒酶r n a 模板解链重新互补定 位，又可以开始新的一组端粒重复序列的合成，如此循环既可以使端粒不断延长， 以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，“解决末端复制问题”闭。 第一章文献综述 1 2 3 端粒酶活性与肿瘤相关性 1 9 9 7 年8 月，m e y e r s o n 和n a k a m u r a 两个小组几乎同时分别在c e l l 和s c i e n c e 上发表了人端粒酶蛋白催化亚基基因( h u m a nt e l o m e r a s ec a t a l y t i cs u b m i t h e s t 2 h t r t ) 的克隆序列。近来研究表明在8 5 9 5 的人肿瘤细胞中可检测到 端粒酶的活性【2 7 j ，h t r t 的m r n a 在多种肿瘤细胞株中高度表达，而在许多正常 组织细胞中不表达，或表达水平很低，在无端粒酶活性的正常人细胞中表达 h t e r t 可使这些细胞出现端粒酶活性，端粒酶活性的出现与h t r t 的表达近于平 行的相关性，所有这些提示h t r t 可能是端粒酶的主要逆转录酶，h t r t 的调控 可能与细胞永生化和恶性肿瘤形成中端粒酶的激活机制密切相关【2 4 , 2 8 , 2 9 。 随着p c r t r a p 法检测端粒酶活性方法的应用推广，人们发现大多数恶性 肿瘤标本中均可以检测出端粒酶活性，k i m 2 1 等检测了来源于各种组织中的8 9 5 例恶性肿瘤标本，其中有6 4 6 ( 8 5 ) 呈端粒酶阳性反应，而在7 0 个不同来源的 正常体细胞中，均未检测出端粒酶活性，提示端粒酶可以作为恶性肿瘤的标记物 之一。l i n 3 0 】等研究发现在3 1 例前列腺癌活检标本中，2 8 例( 9 0 ) 可测到端粒 酶活性，而且肿瘤细胞分化越差，端粒酶活性相对较高，而与肿瘤相邻的正常前 列腺组织和良性前列腺增生的标本中端粒酶活性检测为阴性或低水平表达。因此 端粒酶的活性与恶性肿瘤之间具有高度的相关性，如果使用端粒酶抑制剂抑制端 粒酶的活性，则可使肿瘤细胞端粒缩短直至细胞停止增殖，转入细胞凋亡过程， 从而抑制肿瘤的发展。 1 2 4 端粒酶对端粒的作用 合成端粒序列并维持端粒序列的长度是端粒酶的一个功能，以哺乳动物为 例，合成端粒序列包括三个步骤，即( 1 ) 结合：细胞内富含g 碱基的突出端粒 区t f a g g g t t a g 与端粒酶r a n 模板区3 c a a u c 5 配对结合，如图1 - 3 中a 和b ；( 2 ) 合成：以端粒酶r n a 模板区3 c c a a u a c 5 为模板，在端粒酶的聚 合酶作用下，以d g t p 、d t r p 、d a t p 为底物合成六个核苷酸5 一g 1 r a g g 3 序 列，如图1 3 中c ；( 3 ) 移位：新合成的d n a 与r n a 模板配对打开，模板向 d n a 3 方向移动6 个核苷酸的位置，新的端粒末端重新与模板区结合，进行下 一个循环的合成，端粒得到延伸如图1 - 3 中d 。人的各种细胞内端粒酶的表达和 活性的存在与否决定着端粒长度的延长、平衡或缩短 2 4 , 2 5 】。 第一章文献综述 图1 - 3 端粒酶复制端粒的示意图 f i 9 1 - 3t h es c h e m a t i cd i a g r a mo f t e l o m e r a s er e p l i c a t et e l o m e r e 端粒酶的另一个功能是修补功能，比较一系列1 6 号染色体短臂末端区自然 发生的平截，发现这些断裂染色体都是通过在断裂处加上端粒序列d ( t t a g g g ) n 来重新连接。用p c r 技术分析人疟原虫时也发现有潜在的染色体断裂点，己 加入端粒序列得到愈合。在上述染色体断裂处，端粒酶序列加入位置前的d n a 序列与相应端粒酶的r n a 模板有互补性，据此可推断，染色体的修复可由端粒 酶来调节，断裂染色体末端与端粒酶中r n a 模板互补的小片段起引物的作用 出矧 i t 帅 端怒嵩船 工3 ：1 广 土 图1 4g 四链体作为抑制端粒酶活性靶点示意图 f i g l - 4t h es c h e m a t i cd i a g r a mo fg - q u a d r u p l e xa st h et a r g e tf o rr e s t r a i n i n gt e l o m e r a s ea c t i v i t y 端粒富含鸟嘌呤，研究者发现富含鸟嘌呤的d n a 序列在一定的离子环境中 能够自组装形成g 四链体结构 5 】。研究者还发现端粒酶对端粒d n a 引物的识 第一章文献综述 别是其链状结构而非特异序列，因此可以认为，g 四链体的形成阻止了端粒酶对 端粒d n a 引物的识别，并因此抑制了端粒酶的活性，如图1 4 。有问接的证据 可以证明这种机制，有人观察到，抑制作用总是发生在3 - 4 个端粒重复单元被合 成以后，而3 - 4 个单元与形成分子内g 四链体所需的重复单元数相一致 3 3 ；另 一个证据是，用7 d e a z a g t p 取代g t p 作为引物链让端粒酶识别，由于前者7 位 氮上的氢被保护，使之不可能与羟基氧之间形成氢键，阻止了g 一四链体的形成， 因此抑制作用明显减弱p 。所以，g 一四链体是个很好的端粒酶抑制剂作用的靶 点峨 1 3g 四链体结构的研究进展 1 3 1g - 四链体 在r n a 和d n a 分子的五种正常核苷中，只有鸟苷及其类似物能够在溶液中 形成广泛的自组装结构，它能在中性和不同的盐的浓度下，形成g g 碱基对和 g 一四碱基体( g u a n i n eq u a r t e t s ) 。对四联体螺旋的研究是从1 9 5 8 年开始的，富含 鸟嘌呤的d n a 在特定的离子强度和p h 崖i 条件下，通过单链问或单链对应的g 残 基之间形成h o o g s t e e n 碱基配对，从而使四条或四段富g 的单链d n a 旋聚成一段 平行右旋的四链体d n a ，称为d n a 的g 一四链体1 5 , 3 2 , 3 5 j 。它是由堆积的g 一四分体 组成，在四链体中，鸟嘌呤杂环之间借n 电子相互作用，从而形成一个由4 个g 残基的杂环平面联合而成的大四链体平面。并且由于g 一四链体的堆积，在中轴方 向通过螯合作用有一极性的中央孔道，这个孔道可以螫合适当体积的阳离子，而 阳离子的结合明显加强了g 一四链体的稳定性，其中n a + 、k + 、n - h + 、m 9 2 + 、c a “ 等阳离子已被国内外的许多研究人员进行了实验并得到了证实1 3 6 , 3 l 3 引。 ab 图卜5 稳定的h o 。g s t e e 型氢键力形成的g 一平面四联体( a ) 与g 一平面堆积的四链螺旋结构( b ) f i g l 一5s c h e m a t i cd i a g r a mo fh o o g s t e e nb o n d i n g ( a ) a n dg t e t r a h e l i xf o r m e df r o mg - q u a r t e t s t a c k i n g ( b ) - 1 0 第一章文献综述 1 3 2g 一四链体的多态性o 8 】 g 四链体可同时表现为不同形式的结构，被称为多态性( p o l y m o r p h i s m ) 。 g 四链体多态性的基础在于： 1 ：链的数量。同一寡核苷酸可在分子内折叠也可在分子之间折叠。如图1 6 ( a ) 所示的一条包含四个重复富g 单元的端粒d n a 序列可以形成分子内折叠的四链 体结构1 4 0 , 4 1 】，图i - 6 ( b ) 所示的双分子折叠结构 4 2 】以及四条链形成的平行的分子 间四链体结构【4 引，如图卜6 ( c ) 所示。 矗 图卜6 不周数量的链形成的g 一四链体结构。( a ) 一条链形成的单分子g 一四链体，( b ) 两条链 形成的双分子g 一四链体，( c ) 四条链形成的分子间p 四链体 f i 9 1 6 v a r i o u s s 拄a n d s t o i c h i o m e t r i e s o f g q u a d r u p l e x s t r u c t u r e s ( a ) a o n e - s t r a n d e ds t r u c t u r e y i e l d sau n i m o l e c u l a rg - q u a d m p l e x ( b ) t w os t r a n d sr e n d e rab i m o l e c u l a rg - q u a d r u p l e x ( c ) f o i l r s e p a r a t es t r a n d sp r o d u c eaq u a d r i m o l e c u l a rg - q u a d r u p l e x 。 2 ：链的排列方向。在分子间四链体内四条链可有三种组合方式：分别是4 条链都 平行 4 4 , 4 5 ，如图1 7 ( a ) 所示；3 条链平行而另一条反平行也可能【4 l 】，如图1 7 ( b ) ；2 条链平行而另2 条与之反平行【3 5 , 4 7 1 ，如图1 7 ( c ) 和( d ) 所示。 瞽鼍 8 食 l i 岔 l l 图卜7g 一四链体不同链排列的极性。( a ) 所有的链都平行，( b ) 三条平行的链和一条反平行 的链，( c 两对相邻的链平行，( d ) 四条链交替反平行 f i g l - 7d i f f e r e n ts 缸a n dp o l a r i t ya r r a n g e m e n t so fg q u a d r u p l e x e s ( a ) a l ls t r a n d sp a r a l l e l l ( b ) t h l r e ep a r a t l e us t r a n d sa n d0 1 1 es t r a n da