（分析化学专业论文）压电体声波模拟生物传感器的研制与应用.pdf

塑重查堂坌堑竺堂! ! 堡堡主笙兰! 垦皇堡曼鎏堡垫生塑堡些璺竺翌! ! 量堡旦 塑塑垄 一 耱f雾 o i y 一 厂 f 压电石英晶体( p q c ) 传感器因其具有灵敏度高、结构简单、操作方 便、成本低廉等优点而广泛应用于分析化学、生命科学、药物科学、表面科 学、膜科学和环境科学等诸多领域。然而其响应具有广谱性，选择性能差。 生物物质如酶、受体、抗体等作为分子识别元件具有很高的选择性能，但是 这些物质往往不易长期保存，且操作稳定性不高。 ， 新兴的“分子印记”技术可以弥补生物识别元件的不足，为传感技术的 发展开辟新了的途径。通过分子印记技术可以获得稳定的合成聚合物分 子印记聚合物( m i p ) ，它的识别部位可根据待测分子的结构和官能团来进 行“量身”定做，因此具有选择分子识别的性质。与天然的生物分子识别系 统如单克隆抗体或受体相比，m i p 具有很高的选择性和稳定性，因此适合于 用作模拟生物传感器的识别元件。k 。 本文在本实验室已有的压电传感前期研究工作的基础上，基于p q c 灵敏 的响应性能，结合m i p 的特异识别性能，研制出了系列压电体声波模拟生 物传感登，极大地提高了p q c 的选择性。我们合成了非那西丁、尼古丁、扑 热息痛和氨基比林四种模板分子的印记聚合物，得出了压电模拟生物传感器 的响应模型。详细探讨了膜的粘弹性对传感器响应的影响，验证了m i p 的印 记效应。通过理论分析和实验相结合，优化实验条件，将该分析体系成功地 运用于馇这z 泣中多种药物的定量测定，证明了我们所研制的体声波模拟生 物传感器的可行性，得到了令人满意的结果。 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用 谭怡光 a b s t r a c t p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ( p q c ) s e n s o rh a sf o u n di t se x t e n s i v ea p p l i c a t i o ni n v a r i o u sf i e l d s i n c l u d i n ga n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，l i f es c i e n c e ，p h a r m a c e u t i c a l c h e m i s t r y ，m e m b r a n es c i e n c e ，s u r f a c es c i e n c e ，a n de n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g b e c a u s eo fi t s o u t s t a n d i n ga d v a n t a g e s s u c ha s h i g hs e n s i t i v i t y ，s i m p l e c o n s t r u c t i o n ，c o n v e n i e n to p e r a t i o na n dl o wc o s t ，e t c h o w e v e r , d u et oi t sb r o a d s e n s i n g s p e c t r m n ，t h es e l e c t i v i t y o fp q ci s p o o r a n a l y t i c a l m e t h o d su s i n g b i o l o g i c a lm a t e r i a l ss u c ha se n z y m e s ，r e c e p t o r sa n da n t i b o d i e ss u f f e rf r o mal o t o fd i s a d v a n t a g e s ，e g c o m p l e xa n dt i m e c o n s u m i n gp r o c e d u r e s ，p o o rs t a b i l i t y a n dr e p r o d u c i b i l i t ya l t h o u g hs h o w i n gah i g hs e l e c t i v i t yw i t ht h e s em o l e c u l a r r e c o g n i t i o na g e n t s m o l e c u l a ri m p r i n t i n gi sar a p i d l ye x p a n d i n gt e c h n i q u et oc r e a t em o l e c u l a r l y i m p r i n t e dp o l y m e r sr m i p s ) w i t i lh i g hs e l e c t i v i t y t h i st e c h n i q u ei s ap o w e r f u l m e t h o df o r p r e p a r i n g t h et a i l o r - m a d e b i n d i n g s i t e sb a s e do nt h em o l e c u l a r s t r u c t u r ea n df u n c t i o n a lg r o u po ft h ea n a l y t e m i p sa r es u i t e da sb i o - m i m e t i c m a t e r i a l sd u et ot h e i rl o n g t e r m s t a b i l i t y ，d u r a b i l i t yt o e x t r e m ep h y s i c a la n d c h e m i c a lc o n d i t i o n s t h e r e f o r e ，m o l e c u l a r i m p r i n t i n gp a v e s an e ww a yf o r s e n s i n gt e c h n i q u eo v e r c o m i n gt h ed i s a d v a n t a g e so ft h eb i o l o g i c a lr e c o g n i t i o n m e t h o d s o nt h eb a s i so ft h ef o r m e rw o r kw i t hp i e z o e l e c t r i cs e n s o r so fo u rl a b ，w e p r o p o s e das e r i e so f p i e z o e l e c t r i cb u l ka c o u s t i cw a v e s e n s o r s t h e s es e n s o r sr e l y o nt h es e n s i t i v er e s p o n s eo fp q ca n dt h es p e c i f i cs e l e c t i v i t yo fm i p w eh a v e s y n t h e s i z e dt h ei m p r i n t e dp o l y m e r su s i n gp h e n a c e f i n ，n i c o t i n e ，p a r a c e m a t o la n d a m i n o p y r i n ea st h et e m p l a t em o l e c u l e sr e s p e c t i v e l ya n dd e d u c e dt h er e s p o n s e m o d e lo ft h ep i e z o e l e c t r i cb i o m i m e t i cs e n s o r s t h ei n f l u e n c eo ft h ec o a t i n g v i s c o e l a s t i c i t yo n t h er e s p o n s eh a sb e e n i n v e s t i g a t e di nd e t a i la n d t h ei m p r i n t i n g e f f e c to fm i p sh a sb e e nv e r i f i e d b yc o m b i n i n gt h e o r yw i t he x p e r i m e n t sa n d o p t i m i z i n gt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h e s en e w s e n s o r sh a v eb e e ne m p l o y e d i nt h ed e t e r m i n a t i o no f p h a r m a c e u t i c a l si nb o d yl i q u i d sa n ds a t i s f a c t o r yr e s u l t s h a v eb e e no b t a i n e d 2 湖南人学分析化学9 8 级颁| 一论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用 谭怡光 第一章绪论 当今科技发展日新月异，其显著特点之一是多学科的相互渗透与交叉，形成以多 种现有学科的原理、技术为基础的边缘学科。压电化学与生物传感技术的结合，已经 得到了广泛深入的探讨与应用n 6 1 。 一、压电化学与生物传感 最近的发展趋势表明：设计简单而且成本低廉的化学和生物传感器比复杂的传统 分析方法与技术要受欢迎。生物传感器是一种将生物活性传感元素与电子转换器结合 的测定装置。由于利用了生物识别过程，生物传感器具有很好的选择性。生物组分与 待测物质反虑或感席剑待测物质，转换器辨别出信号并将生物过程转化成一种能进一 步被处理和显示的响应，如数字输出。大量生物组分( 包括酶、抗原抗体、核酸、受 体、细胞、微生物、动植物组织) 已广泛应用于传感体系，而信号元素则有电化学、 光学、热学和声学等。生物传感系统的整体应用性和灵敏性取决于生物层、转换器以 及检测环境的条件。基于声学原理的传感系统，压电石英晶体( p q c ) 传感器的设计相 对米说比较简单。 1 、p q c 质量传感的发展 p o c 是从单晶上切下来的石英片，实际中通常用a 一石英。p q c 被夹在两个电极 之间，电极通常用金电极或银电极，通过热蒸发附在年j 英表面。在两电极之间施加电 乐差，品体点阵的物理定向发生扭曲，产生穿过石英片的剪切驻波，此波具有特征化 的振动频率( 即晶体的谐振频率) 。振动的方向取决于电场中晶体点阵韵方向，而晶体 点阵的方向取决于晶片的精确几何特性，几何特性与晶体的切型有关。厚度剪切模式 ( t s m ) 的振动会产生平行于石英片表面的位移，t s m 振动是对质量改变最敏感的模 式，且只有电极之间的区域是压电活性的，其中a t 一切的晶体占了分析化学压电工作 的火部分。a 1 1 切晶体的频温系数很小，几乎为零，表明在相当宽的温度范围内其谐 振频率稳定【7 - 。 3 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压电体声波模j ! ； 生物传感器的研制与应用 谭恰光 1 9 5 9 年，s a u e r b r e y 导出了晶片上附加物质质量( m ) 与器件的谐振频率变化( f ) 之间关系的方程【”。 a f ：一里。坐 、q p q “ 式中f 0 、a 、“q 、p 。分别为p q c 的基频、电极面积、弹性模量和密度。对于基频为1 0 m h z 、 电极面积为o 2 2c m 2 的a t 切石英晶体，在气相中的质量灵敏度约为1 h z n g ，表明p q c 是一种非常灵敏的质量传感器。s a u e r b r e y 的工作极大地推动了p q c 的广泛应用。1 9 6 4 年，k i n g 首次将p q c 应用于分析化学u 0 1 。压电气相物质传感作为一门相当成熟的技 术，现在正广泛应_ e j 于系列气相检测条件下的科学、工程检测1 1 1 - 1 3 1 。 近来气相检测主要集中在将有机化合物或生物物质修饰晶体表面，使之与一种特 定气相底物键合以提高检测灵敏度。1 9 8 3 年，g u i b a u l t “1 应用生物膜层在气相中直接 进行分析测定，用酶涂层的p q c 来监测气相甲醛。n g e h n g w a l n b i 等将涂覆了对硫磷 抗体的p q c 引入气相免疫传感 “1 。w u 和w a n g 把嗅觉受体蛋白质固定在p q c 表面 上通过检测液上气体对红高粱酒进行质量评估【i 。r a j a k o v i c 等表明有机物和农药的 气相吸附于抗体涂覆的p q c 是完全可逆的 ”】。p q c 生物传感器应用的真正重心是液 相传感，如f 所述。 2 、p q c 液相传感 因为晶体浸在溶液中时容易停振，所以早期将p q c 传感系统用于液相检测的尝 试火败了。为了检测液相组分，样品或是转化为气相，或是采用繁冗的浸渍步骤，1 h 。 p q c 在液相中停振的问题最终通过改进振荡电路或通过采用单面触液型p q c 传感器 而得到了解决。1 9 8 0 年，k o n a s h 和b a s t i a a n s 尝试用声学装置作液相传感器，p q c 被 用作液相色谱检测器，晶体的一个表面与有机液相接触。该系统灵敏度低，重现性 也不好，但它们表明p q c 能在液相中产生稳定的振荡。随后，野村等又进一步使p q c 舣面触液振荡获得了成功1 2 们。由于s a u e r b r e y 方程只适合于气相物质沉积的刚性层， 而不能用于液相传感系统。为了探索p q c 液相传感体系中与频率改变有关的物理参 数研究者们进行了火量的工作。n o m u r a 和o k u h a r a l 2 1 i 在对p q c 与空气中和1 7 种有 机溶剂中的振荡频率进行比较的基础上，导出了p q c 的频移与溶液粘度、密度的经验 性相关关系式。1 9 8 5 年，k a n a z a w a 和g o r d o n 2 2 ”j 通过考虑p q c 剪切波传播进入纯 粘滞牛顿流体发生阻尼衰减的过程，描述了流动相中频率啊应与p o c 被测物溶液物理 4 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用 谭怡光 特性之间的关系。剪切波的渗透深度随溶液粘度的平方根变化，衰减长度与液体和p q c 共同运动时的有效厚度有关。此模型把液层当作加于p q c 上的一层物质，流动层是连 续的，p q c 表面与液体之间没有边界。p q c 表面与葡萄糖和乙醇接触时证实了此方程， 用纯水中的振荡频率作参比，频率的减小随溶液的粘度与密度的乘积增加而改变。同 年，b r u c k e n s t e i n 和s h a y 提出了类似于k a n a z a w a 和g o r d o n 的模型【2 ”。他们假设p q c 表面与其接触液体之间形成了一个粘性边界层，此粘性边界层被看作是p q c 上附加的 质量负载，此质量决定于溶液的粘密度。此模型应用于单面触液或双面触液，与实验 结果十分吻合。液层所附加的质量负载与在s a u e r b r e y 关系中处理方法类似。尽管液 体的物理特性影响l 作频率，但其质量灵敏度基本上不受影响。随后的研究者用实验 验证了这些方程，但是发现高粘度及电导性溶液中的情况与这些方程有偏差【2 5 ，“。尽 管他们清楚地表明了频率响应受溶液粘密度影响，但响应并不是完全受这些因素控制。 更进一步的研究表明p q c 在液相中振荡的情况十分复杂，与界面环境的物理及化学性 质有关的许多参数对其频率有影响：固液界面的结构，如表面粗糙度和表面应力【2 7 z s 】：电导率，溶液的极性和温度 2 9 , 3 0 】；界面粘度和表现为亲水性和憎水性的表面自由 能1 3 “3 2 j ；晶体表面涂覆的均匀性p 3 】：晶体与液相接触的程度等p ”。h a g e r 和v e r g e t 3 5 j 以及h a g e r “j 应用流体力学藕合分析，考虑晶体表面粘性能量损失、流体速度和介电 效应，建立了频移经验公式，并成功地用于液体性质的测量。m u r a m a t s u 等测定了p q c 在空气、乙醇、氯化钠溶液及纯水中的振荡频率，发现与液体的密度、粘度、温度和 电导率有关，并且基丁机电藕合的等效电路分析，建立了频移与粘度密度乘积二分之 一次方的线性关系【2 6 】；s h a n a 等f ”1 考虑溶液的压电效应，通过解n a v i e r - s t o k e s 偏微分 方科得到频移与溶液粘度、密度及溶液深度的关系。姚和周( 3 0 1 基于机电藕合模型，建 立了压电晶体振荡频率与溶液粘度、密度、电导率和介电常数的完整关系式。基于扰 动理论，1 9 9 5 年s c h n e i d e r 和m a r t i n i ”】建立了压缩声波传感模型，导出频移与电感的 关系式。基于牛顿液体的n a v i e r s t o k e s 方程和阻尼波传播波动方程，t h o m p s o n 等研 究了界面边界条件、液体粘度和密度对频率响应的影响m ”1 ，建立了四层结构界面理 论f 4 l 】，讨论了可测量液体性质( 粘度、密度、表面张力、接触角) 与频率响应的关系 t ”，以及用阻抗分析法研究了晶体在溶液中的振荡行为【4 3 i 1 9 9 1 年前后，n o m u r a “】和 本研究室【。5 】分别独立地开发出一种新型压电传感器一电极脱开式压电传感器( e s p s ) 。 导出了频移公式1 ，详细探讨了等效电路参数【4 6 “7 1 、溶液性质和温度对频率响应的 影响m ”i 。随后本室又进一步开发出串联式压电传感器( s p q c ) 5 0 l ，对等效电路模 型及参数进行了详细的讨论i ”5 “。 5 湖南大学分析化学9 8 级硕：e 论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用谭怡光 3 、p q c 生物传感 把压电效应应州于生物传感器通常的方法是将压电石英晶体进行修饰与待测物选 择性地相互作用。住将生物活性成分固定于石英表面后，p q c 生物传感有两种方法： 一种是在空气中测定修饰后的频率，然后将p q c 浸入反应溶液中使待测物质与生物活 性成分充分结合( 物理吸附或化学吸附) ，p q c 移出溶液后清洗干燥测定频率，由频 率的变化计算出反应过程中附加物质的质量。这种方法的不足是操作较繁琐需浸入溶 液与干燥两个步骤，而且不能进行实时监测。另一种方法弥补了这些不足，整个测定 都在液相中完成，因而可实时监测待测物质与修饰生物活性成分结合的过程。压电石 英晶体表面吸附被测物，截面结构的粘弹性发生变化，该变化通过振荡频率的降低而 被识别。 3 1 p q c 生物传感器膜的固定方法 p q c 生物传感器的修饰就是将活性物质结合到压电石英晶体电极上或电极表面的 惰性支持物上。对于p q c 的固化层有一些特殊要求，即：修饰层粘弹性越低越好( 理 想状态是刚性层) ，生物相容性好，减少非特异性吸附等。按照特异性生化反应体系是 否直接同定于晶片的电极表面而将p q c 的固定化分为直接固定法和间接固定法两大 类。 3 1 1 直接固定法 直接固定法一般就是将电极用含有生物分子的溶液涂覆或浸泡，从而使电极表面 生成具有识别功能的生物膜。h a r t e v e l d 等 i ”通过物理吸附作用在镀金晶片表面固定上 葡萄曲肠毒素b ( s e b ) ，用抗原抗体竞争反应法来检测s e b 含量。e b e r s o l e 等口”在电 极表面吸附固定上5 - 磷酸硫酸酯腺苷( a p s ) 抗体或人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 抗 体，j 目以检测对应的a p s 还原酶或h c g 。c h a n c e 等【5 5 1 在金表面直接涂覆消胆胺来作 为胆酸的检测器。杀虫剂对硫膦的气相免疫检测也是在金电极表面对硫膦抗体而实现 的 。s u 等o s 3 将单链d n a 吸附于氧化铅电极表面来研究d n a 杂交。一些细胞生长过 程的动态检测也是将细胞吸附固定于电极上来进行的 5 ”。直接固定法步骤简单、快速， 但是适应性不好，许多生物分子直接固定后会导致特异性反应不能发生 1 ”。而且。在 周定过程中应注意非特异吸附、脱吸的发生。一般在固定化后使用牛血清蛋白( b s a ) 6 塑堕查堂坌盟些兰! ! 丝堡主笙壅! 堡皇堡苎垫堡垫生塑堡璺璺竺竺型芝壁旦 等惰性蛋白封闭非特异吸附位点以减少干扰。 3 1 2 间接固定法 为了提高固定效率和固定化层的适应性，以及提高反应灵敏度，许多研究中采用 了间接蚓定化法，即采用中间连接层来连接电极和生物体系。其中，最常用的有：戊 二醛交联；硅烷或抗生物素蛋白生物素的共价结合；以及在凝胶或聚合物中的包埋。 另外，还有自组装技术、l b 膜技术等的应用。 s h o n s 等“町通过戊二醛交联固定白蛋白和y 一球蛋白，研制成了第一个p q c 生物 传感器，此后这种同定方法被广泛采用o ”跏。在共价结合方法中最常采用的是硅烷法 删，而通过抗生物素蛋白生物素的化学吸附方法 6 1 1 应用相对较少。此外通过溶胶哑“】 和聚合物”“删包埋的方法也被许多研究者采纳。其中n a k a n i s h i 吲在1 9 9 6 年提出了一 个与众不同的利用等离子体聚合膜固定抗体的方法，这种膜薄而均匀，噪音低而且灵 敏度高。另外还有先同定蛋白质a ，再利用活性物质在蛋白质上吸附的方法睇 。间接 ( 包括交联法、共价键合法、包埋或通过蛋白质a 联连) 的同化操作的不足之处在于： 庄分析检测前，要在压电石英晶体表面加上较多的物质，这样会增加界面的粘度，降 低灵敏度以及质罐负载可能接近p q c 稳定振荡的极限。 白组装单分子层( s a m ) 技术可以在电极表面获得致密有序的单分子层，而且分 f 的另一端可以带上不同的活性官能团，因而可适应不同的修饰电极的要求。在压电 传感器的研究中，金电极表面上硫醇分子的s a m 应h j 很多 6 76 9 ，主要有两种途径： 可以选择带合适的功能团( 如n h 。，c o o h ，o h 等) 的硫醇先进行自组装，然后再 通过活性官能团来吲定抗体等：也可以先将生物分子标记上巯基基团，最后通过自组 装米达到固定的效果。l b 膜在压电传感器研究中可以直接固定作为受体膜m ，也可 以用作其它物质的刚定层，如蛋白质 _ 1 、d n a 7 2 1 等。 3 2 液相p q c 生物传感器及其应用 最初使用的p q c 液相生物传感器采川浸蘸一干燥检测方法，该方法是将一种选 择性结合的试剂键合剑p q c 的表面，定姑测定被修饰的p q c 和被分析物相互作用前 后的频率，这样，在液相中反应，再在气相条件下进行分析和定量测定。该技术用于 检测抗原抗体嘞7 、细胞，7 “、d n a 杂交 7 6 , 7 7 1 等等。浸蘸一千燥法压电传感的优点 7 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用 谭怡光 在于气相中测定的频移信号大多符合s a u e r b r e y 方程，因此尽管水合、溶剂滞留等可 能会引起误差，这种方法在压电传感器于液相中成功振荡以后仍然在采用。然而，分 析过程的耗时和操作的繁琐使该方法不可能成为常规的分析操作。相比之下，液相压 电传感具有明显的优势且更适于在线分析和实时数据分析。 液相p q c 生物传感器要么设计振荡电路并把晶片与溶液直接接触使p q c 起振， 要么将p q c 表面掩盖而避免与溶液接触。对于大部分生物传感技术而言，将生物成分 修饰到p q c 表面，通过识别吸附物而得到响应信号，其灵敏度取决于分析物与修饰膜 之间相互作用的位点数。 免疫检测是液相p q c 生物传感最重要的领域之一，人多是直接基于固载在晶片 上抗体抗原或带有抗原的细菌和细胞等的特异性吸附导致的频移响应。r o e d e r e 和 b a c t i a a n s 利用修饰羊抗人i g g 的表面卢波( s a w ) 装置检测溶液中的l g o ，实现了完 全的液相压电免疫传感检测 6 。t h o m p s o n 等最早利用p q c 与溶液接触来研究界面免 疫化学。m u r a m a t s u 等用蛋白质a 修饰晶体来测定i g o 抗体子代 6 “。m i n u n n i 等实 现了i g g 直接吸附于p q c 表面的实时监测”。用相应的抗体抗原修饰p q c 还测定 了溶液的抗牛血清向蚩白抗体m 】、人血清白蛋白】、l g ml 圳、人体铁传递蛋白 、 蓖麻蛋白和纯化羊抗蓖麻蛋白【8 ”1 等等。压电免疫法还可用于细胞和微生物的检测， 如：红血球的检测m ：微生物生长过科质量变化的检测m l 】；乳头假丝酵母c a n d i d a a l b i c a s 7 ，大肠杆菌】，病毒、孤菌和，盘贺氏菌c “ ，饮用水中的e c o l i k l 2 和肠菌科 各种抗原m 】，鼠伤寒杆菌 “ ，沙门氏菌m 1 和金葡萄球菌1 等的检测。p q c 传感器还 被h j 丁酶分析 “】、核酸【7 0 1 等的研究和测定。 p q c 生物传感器在液相中的非质繁效席也得到了广泛应用。p q c 响应和介质粘 弹性的关系被用来传感凝胶作_ l = i 和凝聚作州，m u r a m a t s u 等通过监测l i n m u l sa m e b o c y t e 溶菌产物的凝胶作州测定内毒素 9 “。k u r o s a w a 等利用抗原结合溶液中胶乳表面的抗 体的粘弹性发生变化来测定c 一反应性蛋白质 9 ”。粘弹性效应还可用于测定纤维蛋白 原删、血凝过程 ”3 和血小板吸附 ”】等。血液粘弹流变过程的监测及血液粘性、凝血 因子活性、血浆中纤维溶酶原和纤维蛋白降解产物等的检测”n ” 。基于明胶培养基的 液化和凝固测定表皮葡萄球菌 g 目和奇异变异杆菌嗍 。基于介质电导变化，何等用频率 检测时间的方法测定了e c o l ie 1 。利用电导变化还可用于测定阿司匹林和水杨酸浓度 1 0 ”及脲酶活度 1 0 “。基于对溶液阻抗的传感，阻抗法测定血清中总盐量 ”“ ：与酶 分析技术结合，测定血液和尿液中的脲 1 “” ，测定脲酶抑制剂汞和有机磷农药 】m 8 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用谭怡光 1 0 9 ，以及测定谷氨酸酶 1 1 0 、精氨酸“、脂酶。：1 、磷酸酶“1 ”、l - 乳酸脱氢酶5 1 和异柠檬酸脱氢酶“等其它类型的水解酶及其分析底物。新近本实验室曾报道用s p s 阻抗法监测儿种变形杆菌的生长7 ，1 。 二、分子印记技术基本原理与应用 随着人们对于环境和健康的高度关注，越来越依赖于高选择性和高灵敏度的化学 分析方法，通常要求能够识别和定量基体中痕量级的被测物，为此，对被测物具有高 亲和性和高选择性的分子识别要素得以广泛的应用。在经典的生物分析技术中，常用 的分子识别元素是蛋白质，如在测定低浓度中不同分子所使用的抗体、酶或受体，以 及测定特殊d n a 序列所用的低聚核苷酸。这些亲和技术，通过使用对分子库进行的 小的、稳定的识别元素，有望得到进一步改善。但令人遗憾的是，由于生物要素的稳 定性不高、结合位点密度低且难以再生从而限制了那些基1 = 生物分子识别的方法。 j 嗣此，越米越多的化学工作者不断地去寻找具有高选择性和稳定性的新物质。新兴的 “分子印记”技术有可能弥补生物识别元件的不足，为分子识别技术开辟新的途径。 i i 。 早在2 0 世纪4 0 年代，著名的诺贝尔奖获得者p a u l i n g 在研究抗体和抗原的相互 作川时，提出了以抗原为模板来合成抗体的设想i ”。虽然这一设想现在证明是行不通 的，但却是对分子印记技术最初的描述。剑了7 0 年代，随着w u l f f 1 m o s b a c h 等人在 共价$ 1 1 t i ! 共价型分子印记上的开拓性f ：作，这一技术领域得到了蓬勃发展。国际性的 分子印记协会( s m i ) 已有数百名会员。根据s m i 的统计，1 9 9 7 年一年关于分子印记 的文献相当于1 9 9 0 至1 9 9 2 年三年总和的两倍。e u r o p e a nc o m m i s s i o n 于1 9 9 8 年启动 了一项计划，旨在资助欧洲8 个研究小组从事分子印记聚合物( m i p ) 的制备、结构 表缸e 以及将m i p 川丁临床分析、环境分析以及生物分析等方面的研究。分子印记技术 由 i 其卓越的分子识别性能已成为化学j ：作者的热i 、j 研究课题【12 2 。 l 、基本原理 m i p 又称塑料抗体，属于合成分子识别系统，主要是将要分析的目标分子( 又称 印记分子) 作为模板，与功能化单体、交联剂一起发生聚合反应。m i p 的制备技术比 9 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压乜体声波模拟生物传感器的研制与应用 谭怡光 较简单，般包括3 个步骤【i ：( i ) 功能单体和印记分子在一定条件下形成某种可逆 的复合物：( 2 ) 加入交联剂将这种复合物“冻结”起来，制得高聚物；( 3 ) 将印记分 子抽提出来，这样通过“量身定做”( t a i l o r m a d e ) ，在聚合物的骨架上便留下了与印 记分子空间结构和化学官能团两方面均互补的识别部位( 空穴) ，其大孔结构使印记分 子可以在聚合物基体中进行扩散。识别部位具有“分子记忆”功能，可以选择性地识 别印记分子。 根据印记分子和功能单体形成复合物时作_ l j 力的性质，分子印记可分为共价型和 1 | 共价剐两种。共价型分子印记过程中，印记分子和单体通过可逆的共价作用( 如形 成可逆的硼酸酯和席夫碱) 形成复合物 t 2 4 , 1 2 5 i 。而在非共价型分子印记过程中，印记分 子和单体则通过氢键、偶极、离子、金属螫合、电荷转移、疏水乃至范德华力m 6 “2 7 i 相互作用形成复合物，m o s b a c h 认为非共价型的分子印记是一种分子自组装的过程。 共价型分子t t p $ 0 中，单体和印记分子间的作用力较强，形成的复合物也很稳定， 但印记过程复杂，印记分子实际上是在被单体衍生化后再交联固化，而且印记分子 的抽提也较困难。非共价型的分子印记作用力的形式多种多样，使得强度很小且无方 向性的范德华力也可铍用来形成复合物3 2 i ，其分子识别过程也更接近于那些天然的分 子识别系统，如酶和底物以及抗体和抗原等。在印记过程中还可同时使用多种单体f n ”， 印记分f 易丁除去。目前绝人多数m i p 均是通过州价刑分子印记技术制得的。 w h i t e c o m e 巧妙地将以上两种技术结合起米2 9 i ，j j4 乙烯基苯基碳酸酯作单体， 通过共价作川同印记分子形成复合物，j j 碱水解时，随着c o ：的失去而打开了单体和 印记分子间的共价键，此时m i p 上便产生了一个非共价型的分子识别位，识别位上的 酚基可以通过氢键进行分子识别。 与生物识别元件( 如酶、受体、抗体、核酸等) 相比，m i p 具有很多优点。( 1 ) m i p 对各种不同的化合物( 包括医药、环境、i 业等方面) 都显示出良好的专一性。 生物识别体系具有较好的分子识别功能，但通常稳定性较差，不易产生信号，固定化 时会较严重地破坏其识别功能。而m i p 的稳定性好，能反复使用5 0 次以上i ”0 1 ；在室 温干燥环境中可保存数年，水中保存4 周以上不会影响其性质；用酸性、碱性、金属 离子和其它多种溶液处理时不会降低其识别特性t ”】：能耐受一定的机械强度、高温及 i 衔压i ”“。( 2 ) m i p 针对性很强，它对印记分子而言是“鼙身定做”的，而且理论上对 丁f n j 一个分子均可制备相应的m i p 。对丁某些小分f 化合物如药物来说，制备其m i p 是相当简单和省时的，而要获取合适的生物识别分子通常十分困难【”。( 3 ) 生物识别 元什来自于生物源，冈此在生产过程中往往要使用动物：而分子印记技术完全是化学 1 0 塑塑叁堂坌堑些兰! ! 丝堕! ：堡兰! 墨! ! 丛主鲨壁墨! ；塑堡些鲨塑塑型兰生旦里笪堂一 合成过程，可避免使j h 动物。( 4 ) 生物分f 识别系统由于不易建立批量生产工艺，所 以价格昂贵，而m i p 则费用低，容易建立人规模生产。 2 、印记聚合物的应用 2 1m i p 在色谱和电泳分离系统中的应用 因为m i p 特有的“预定”的高选择性能，所以用m i p 作色谱或电泳的固定相在 手性及异构体分离尤其是制各分离方面有美好的前景。目前有关分子印记技术的文献 、l j 数以上都是关于手性及异构体分离的。在这方面瑞典的l u n d 大学的m o s b a c h 及其 合作者的i ：作最有代表性【13 4 - 1 3 6 1 。基于m i p 的手性l 削定相( c s p s ) 的o l 值大都在1 5 - 5 之间。尽管少数情况得到了更高的u 值。与其它c s p s 相比，m i p 固定相应有相当好的 分离效果，然而事实并非如此，色谱峰会拓宽及拖尾而影响其分离效果，由于结合位 点的1 f 均匀性以及可利用的官能团数量的限制，从而使分离在等温吸收曲线的非线性 区域1 13 ，i 。解决的最好方案可能是进一步优化颗粒的形状大小和填充柱。将印记聚合物 粉末和粘接剂混合涂在板子上，用于寻性t l c i “。印记聚合物也应用于亲和毛细管电 泳( c e ) ，作为选择性的基体m ”。采_ j 原位悬浮聚合方法可以解决研磨的聚合物粉末 填充刮毛细管的困难，在聚合过程中，聚合物颗粒沉降到毛细管。尽管对映异构体选 择性印记的c e 柱很有用，但到目前为止仍然难以捉摸。使用水有机溶剂作流动相， 川毛细管原位聚合的多孔聚合物块作同定相，抗肾上腺素药物的手性异构体普那洛尔 和美托洛尔通过毛细管电色谱( c e c ) 得以分离l “。采刚多孔聚合物块【“1 】和聚丙烯 酰胺的印记聚合物颗粒1 1 4 2 作c e ci 划定相，可以将苯丙氨酸酰基苯胺的对映体分离。 2 2 分子印记模拟传感器 m i p 对待测化台物可显示出良好的专一性，并且具有优良的操作稳定性，识别性 能不会受到酸、碱、热、有机溶剂等各种环境因素的影响，因而非常适于用作传感器 的识别元件。2 0 世纪8 0 年代末，在将m i p 用于传感器技术的早期尝试中，曾将椭圆 偏振光谱法用于被维生素k 印记过的聚合物薄层研究i “”。另外还测量过用苯基丙氨 酸酰替苯胺( p h e n y l a l a n i n ea n i l i d e ) 印记过的m i p 填充的h p l c 柱的电流电势的变化 1 4 4 。但由于这些方法都没有完全满足传感器应拥有识别元件和转换器这一准则，因此 都不能被称为严格意义上的传感器。进入9 0 年代以后将分子印记技术用于传感器的 塑堕盔堂坌堑些兰! ! 塑堡主堡苎! 堡皇堡主些塑型圭塑堡壁登竺堕型兰生旦堡堕垄 研究越来越多f 4 s ，m f 。所用方法包括电流法、电容法、电导法、荧光法等等。 22l 电化学传感器 1 9 9 3 年，h e d b e r g 等7 1 将m i p 涂住场效应晶体管表面，当溶液中有印记分子存 在时，m i p 与印记分子相互作用并导致晶体管电容发生变化，即将化学信号转换为电 信号，根据电容的变化可检测溶液中的印记分子。但此法仅为定性测量。p i l e t s k y 等4 8 】 将m i p 膜用于电导传感器，来检测除草剂莠去津，溶液中莠去津检测范围为o 0 1 0 0 5 1 1 1 l ，响应时间3 0r a i n 。另外，k r i z 等9 1 也将m i p 用于电导传感器，当带负电的m i p 与带正电的分析物键合时，可直接产生信号。k r i z 等【】还将m i p 用于检测吗啡竞争 型电流传感器中，首先吗啡选择性地结合到传感器中被印记过的m i p 上，接着加入电 活性竞争物可待因，并用电流法测定释放出来的吗啡。此外，还有将m i p 与离子选择 性电极结合以检测溶液中的c a 2 + 的传感器5 。i ，以及通过m i p 膜的通透性的变化( 测 电导) 米进行测母的传感器”。 2 22 光化学传感器 d i c k e r t 等【15 3 住多种以有机溶剂印记的聚合物中添加有机染料，使其成为光敏物 质，然后制成光化学传感器，通过对光吸收量的变化来检测相应的有机溶剂蒸气。分 子印记技术还可同荧光光谱技术结合。p i l e t s k y i ”4 1 等将荧光标记的三嗪结合到以被三 嗪印记过m i p 中，再用来检测溶液中的三嗪。还有人i ”。”6 1 将印记分子同荧光染料一 起印记剑m i p 中，然后与荧光检测器结合作成传感器，当水溶液中有印记分子存在时， 聚合物中的荧光会淬灭，由此检测水溶液中的印记分子。k r i z 等m 2 】将m i p 颗粒涂于 光纤传感器的石英窗上，用于识别荧光标记的氨基酸衍生物。此外研制了基于分子印 记技术的镧系发光传感器，用于检测神经性毒剂的水解产物7 i 。 2 3 其它传感器 d i c k e r t 等5 8 把m i p 与质量传感器( f i 英晶体微犬平q c m 和表面声波s a w ) 结 合舀：一起，发展了t l f j 丁检测芳香化合物、卤代烃及极性溶剂蒸气的化学传感器。近年 来，越米越多的研究j ：作者对p q c 与m i p 的结合感兴趣i ”6 ”。由于这两个装置的谐 振频率均随质量的变化而变化，因此可检测传感器表面涂层的吸附过程。另外，还有 将m i p 用于竞争性放射性配位键合分析m 2 “i ，这主要是以待测底物和放射性标记底 物之间的竞争关系为依据。 1 2 湖南大学分析化学9 8 级硕一j 二论文：压电体声波模拟生物传感器的研制与应用谭怡光 2 3 类抗体配体结合 配体结合( 1 i g a n d b i n d i n g ) 通常用抗体作受体，但是操作上很不方便且费用高。 因此，a n d e r s s o i l 等刚m i p 来模拟抗体的结合位i t ”“i ，分析血液中药物的浓度。 所得的结果与用免疫分析得到的结果相比较，表明m 1 p 具有与抗体相似的选择性结合 能力和交叉反应分布，且与抗体相比，m i p 具有性能稳定，易制备等优点。 2 4 样品前处理 对丁大多数生物分析体系，样品的前处理是必不可少的步骤，样品的前处理过程 包括被测物的预浓集、样品的提纯而与分析技术相匹配。近年来分子印记聚合物在固 相萃取( s p e ) 的应h | 与日俱增m 7 1 。传统的s p e 通常是利用被分析物和吸附剂问的相 互作用如反相、正相及离子交换进行萃取。由于它们之间的作用力是非特异性，因而 洗脱及萃取条件要根据样品及样品中杂质的化学性质来仔细确定，而采用m i p 来进行 同相萃取问题便得到了简化。t a k e u c h i 等6 8 】采刖悬浮聚合的方法制得了球形的m i p ， 州丁从水中提取三嗪类除草剂中的西玛三嗪，西玛三嗪可被浓缩5 6 倍，回收率达9 1 。 a n d e r s s o n l l 6 9 1 也研制了一种用于s a m e r i d i n1 州相苹取的m i p 。s t a n k e r 等【1 7 0 1 研制的m i p l q 从牛叶中富集除草剂莠去津，使得h p l c 的精度得剑提高。m a r t i n i ”1 贝0 用m i p 从体 液中宿集p r o p r a n o l o l 川丁二临床药物分析。 2 5 模拟酶催化 d a v i s p t z - 1 7 3 1 综述了分子印记的纳米催化材料的性能及研究情况。m o r i h a r a 等1 ”4 1 分别以( r ) 和( s ) - n - b e n z y l - - m e t h y l b e n z y l a m i n e 为模板在硅胶表面形成了一个分 子印记的空穴，这种材料对苯甲酸的乙酰基有催化转移功能。当手性的印记分子重新 结合到有关的空穴上后，催化活性消失，这说明空穴的手性识别来源于印记空间结构。 压屯石英晶体作为一种有效的生物传感器在化学和生命科学领域发挥着重要作 川，p q c 具有相当高的灵敏度，然而其响麻具有r 谱性，选择性差。本文是将压电传 感器的高灵敏性与分子印记技术结合，利川印记聚合物的类抗体性质，即高选择的识 别性能以提高和改善p q c 的选择性，制成了p q c 模拟生物传感器。成功地应用于体 液【 i 药物的检测斤详细探讨了膜对p q c 响应性能的影响。 湖南大学分析化学9 8 级硕士论文：压电体声波模拟生物传惑器的研制与应用谭怡光 参考文献 l a b d a n i e l ，d m i c h a e l ，c h e m r e v ，9 2 ( 1 9 9 2 ) 1 3 5 5 2 s z y a o ，b s y a o ，rc h e n ，l