（植物病理学专业论文）植物有益蜡样芽孢杆菌在小麦植株上的定殖动态研究.pdf

中文摘要 蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e ? e l l s ) 8 3 - 6 、8 3 1 0 、m 2 1 、m 2 2 、a 4 7 、9 3 1 、9 3 2 以及9 1 0 是植 物病害生物防治实验室从植物体内分离、筛选获得的具有防病、促生、改善品质、提高抗逆性作 用的有益蜡样芽孢杆菌。本研究分别在温室和田间条件下对供试细菌在小麦根、茎基部以及叶部 的定殖动态进行了研究。 温室条件下，将小麦种子在1 0 8e f u l m l 菌悬液中浸泡3 小时，播于营养钵内，采用浓度梯度 稀释法对供试细菌进行回收。结果表明，8 株蜡样芽孢杆菌均可在小麦根部定殖存活，并且可以 向茎、叶部转移，在出苗后1 7 天定殖量达到高峰期。根部、茎基以及叶部的菌量最高分别为1 0 7 c f u g - f w 、1 0 6c f u g - f w 、1 0 5c f u g - f w 。 田间条件下以1 0 9c f u m l 的菌悬液处理小麦种子，浸种时间与温室试验相同。检测结果表明： 蜡样芽孢杆菌在小麦根部的定殖量在出苗后2 8 天最高，可这1 0 6e f u g - f w ；出苗后4 2 天，根部除 m 2 2 外其余菌株定殖量均维持在1 0 5c f u g - f w 以上。田问小麦茎基的菌量在出苗后2 1 天上升至 1 0 5c f u g - f w 以上，除m 2 1 和m 2 2 外，其余6 株细菌菌量在出苗后4 2 天保持在1 0 c f u g - f w 左右； 叶部8 株细菌中仅a - 4 7 、9 3 1 、9 3 2 可检测至出苗后3 5 天。出苗后1 6 0 天以及1 7 0 天，回收不到 供试细菌。出苗后1 8 0 天，8 3 6 、m 2 1 以及9 3 1 定殖量分别为1 0 e f u g - f w 、t o c f u g - f w 以及1 0 5 e f u g - f w 。出苗后1 9 0 天，m 2 1 与9 3 1 茎基和叶部的菌量也恢复到1 0 4c f u g - f w 。而8 3 1 0 根部菌 量达到l0 4c f u g f w 。 本研究同时利用荧光显微镜以及激光共聚焦显微镜对置c e l t l l s9 3 2 进行了显微定位观测，结 果表明，b c e g e u s9 3 2 可以在小麦摄部定殖，并且在出苗后5 天转移至叶部。 关键词：蜡样芽孢杆菌、小麦、定殖 a b s t r a c t b a c i l l u sc e r e u s ( 8 3 _ 6 ，8 3 1 0 ，m 2 1 ，m 2 2 ，a - 4 7 ，9 3 1 ，9 3 2a n d9 1 0 ) w h i c hw e r ei s o l a t e db yt h e b i o c o n t r o lo fp l a n td i s e a s el a b o r a t o r yo fc h i n a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , c e n h a n c et h er e s i s t a n c eo f p l a n td i s e a s e s ，i n c r e a s et h ey i e l d ，i m p r o v et h eq u a l i t yo f c r o p sa n da d v a n c et h es t r e s sr e s i s t a n c e i nt h i s r e s e a r c ht h ed y n a m i c so f t h es t r a i n sc o l o n i z a t i o no nt h ew h e a tw a ss t u d i e db yd i l u t i o np l a t i n gt h r o u g h s e e db a c t e r i z a t i o ni ng r e e nh o u s ea n dn a t u r a ls o i l s t h eq u a n t i t i e sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eb a c t e r i ac o u l dc o l o n i z ea n dm i g r a t ei nt h ew h e a tt h r o u g h t h es e e dt r e a t m e n ti ng r e e n h o u s e t h ec o l o n i z a t i o no nt h er o o tw a su pt o1 0 7e f u g - f wi n1 7d a y sa f t e r g e r m i n a t i o nt h r o u g hs e e dd i p p i n gi nl o s c f o m lb a c t e r i as u s p e n s i o nf o r 3h o u r s ，a n dt h en u m b e ro f c o l o n i e so ns t e m sa n dl e a v e sw e r er e s p e c t i v e l y1 0 6c f u g f wa n d1 0 5c f u g f w w h i l ei nn a t u r a lc o n d i t i o n ，t h er o o t sc o l o n i z a t i o nw e r ej u s tu pt o1 0 6c f u go n2 8d a y sa f t e r g e r m i n a t i o nt h r o u g hd i p p i n gt h es e e d si n1 0 c f u m lb a e t e d as u s p e n s i o nf o r3h o u r s o n4 2d a y sa f t e r s h o o ts p r o u t i n gi nn a t u r a ls o i l s ，t h ed e n s i t yo fb a c i l l u so nr o o t sw a sm o r et h a n1 0 c f u g - f we x c e p t b a c i l l u ss t r a i nm 2 2 t h en u m b e ro f b a c t e r i ao ns t e m sm o u n t e du pt o1 0 5 c f u g - f wo n2 1d a y sa f t e rs h o o t s p r o u t i n g ，a n do n4 2d a y sw h i c hw a sa r o u n d1 0 c f u g - f we x c e p tb a c i l l u ss t r a i n sm 2 1 ，m 2 2 o nw h e a t l e a v e sf r o mn a t u r a lc o n d i t i o n ，o n l yac e r e u sa - - 4 7 ，9 3 1 ，9 3 2c o u l db er e c o v e r e do n3 5d a y sa f t e rs h o o t s p r o u t i n g t h er e s u l t so fn a t u r a ls o i la l s os h o wt h a ta l lt h eb a c i l l u ss t r a i n si n o c u l a t e dc o u l d n tb e r e c o v e r e df r o mt h ew h e a tp l a n t so u16 0a n d1 7 0d a y sa f t e rs h o o ts p r o u t i n g w h e nt h ew h e a tp l a n t sg r e w u pt o1 8 0d a y sa g e ，c o l o n i z a t i o no f b a c i l l u ss t r a i n s8 3 - 6 ，m 2 1a n d9 3 1o nw h e a tr o o t sw e r ei n c r e a s e d u pt ol o sc f u g f w , 1 0 4c f u ga n d1 0 5e f u g f wr e s p e c t i v e l y i n1 0d a y s ，w h e nt h ew h e a tp l a n td e v e l o p e d t o1 9 0d a y sa g e , t h en u m b e r so f c o l o n i e so f s t r a i n sm 2 1a n d9 3 1o nw h e a ts t e m sa n dl e a v e sw e r eb o t h 1 0 4c f u g - f w , a n d t h ec o l o n i z a t i o n o f b jc e r e u s9 3 1o nr o o t s w a sa b o u t1 0 4c f u g 真计。 m i c r o s c o p i ca n a l y s i sa l l o w e dt h eo b s e r v a t i o no ft h ed i s t r i b u t i o no f t h eb a c t e r i ac e l l sa c c o r d i n gt o t i m ea n ds p a c e t h er e s u l t so f t h es t u d yt e s t i f i e dt h a tg f p - t a g g e db a c i l l u sc e r e u s9 3 2c o u l dc o l o n i z eo n w h e a tr o o t s ，a n dc o u l dh a n s f e rt ol e a v e si n5d a y sa f t e rg e r m i n a t i o n k e y w o r d ：b a c i l l u sc e r e u s ，w h e a t ，c o l o n i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生虢王证时间：2 口。年月4 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：彳 j 、 1 导师签名： 时间：) 力。年月，日 时同l 以年g 窍| ，r 琵呼 中国农业大学硕十论文 第一章引言 第一章引言 1 1 植物内生细菌的研究进展 1 。1 1 植物内生细菌的定义 1 8 6 6 年d e a a r y y g 将植物附生菌( e p i p h y t e ) 与生活在植物组织内的微生物区分开，首先提出了 内生菌( e n d o p h y t e ) 的概念( 郭良栋日i 羽) t l i 。k l e 叩p e r 等在1 9 9 2 口j 年将植物内生菌定义为能够定殖在 植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立起和谐关系的一类微生物。w i l s o n 认为p l 内生菌包括 生活史的全部或某一阶段定殖于活体植物组织内，并且不引起寄主植物明显症状的真菌或细菌。 s t o n ep 1 等在2 0 0 0 年对植物内生细菌进行了定义，指出植物内生细菌是指在其生活史的某一阶段或 全部阶段存活于植物组织内部并且不引起明显症状的细菌，概念涵盏的范围较广，是迄今为止较 为完善的定义。 1 1 2 植物内生细菌的多样性 植物内生细菌的多样性包括不同植物问内生细菌种群的多样性以及同种植物体内多种内生 细菌的共同存在。人们从木本植物和草本植物中分离到了包括革兰氏阳性以及革兰氏阴性的内生 细菌，其中有假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、微杆菌属( m i c r o b a c t e r i u m ) 、 土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 以及固氮菌( a z o s p i r i l l u m ) p 1 等。s t u r z ( 1 9 9 7 ) 州从红花苜蓿的根部和 叶部分离出了1 4 个属的3 1 种细菌，证明了植物可以同时被多种细菌定殖。为了研究植物内生细菌 的种群多样性，人们尝试了很多种方法，但是由于检测方法的不同，得到的结果也不一致。随着 分子生物学的进展，人们开始尝试用分子生态学的方法来研究植物内生细菌的种群动态变化【”。 1 9 9 3 年m u z y e r s l 9 等将d g g e ( d e n a t u r i n g g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 技术应用于微生物的遗传 多样性和种群差异研究。由于d g g e 技术可以再现群落结构，成为研究微生物生态学的很有效的 ：= 具。在d g g e 的基础上，义出现了用温度梯度代替化学变性剂的温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a n 】r e g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 、瞬时温度梯度凝胶电泳( t e m p o m lt e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e l e l e c l r o p h o r e s i s ，t g g e ) 等技术【9 】。 1 1 3 植物内生细菌的生物功能及作用机制 植物内生细菌在与寄主植物互相作用时表现出的有益的生物功能有很多种，其中研究报道较 多的有促生作用、防病作用以及作为外源基因载体发挥特殊功能的作用。 1 t 31 内生细菌的促生作用及促生机理 内生细菌可以通过多种方式促进植物生艮的生长，其中研究做多的是对游离氨的固定。被证 实能参与联合同氮的细菌达1 6 属3 0 种以上卅，除再科植物形成共生阁氨系统的根瘤阉氮菌外， 禾谷类作物如水稻、玉米上的很多内生细菌也具有嗣氮能力。根据内生i 嘲氮细菌是否专性寄生丁| 中国农业大学硕士论文第一章弓f 占 寄主植物组织。b a l d a n i 等【川将内生固氮菌划分为专性内生固氮菌和兼性内生固氮菌，其中兼性 内生固氯菌包括固氮螺菌( a z o s p i r i l l u ms p ) 、肠杆菌( e n t e r o b a c t e r ) 1 2 1 0 3 1 、和粪产碱菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) 【1 4 1 等，专性内生联合固氨菌主要有固氨醋酸杆菌( a c e t o b a c t e rd i a z o t r o p h i c u s ) 、草螺菌 ( h e r b a s p i r i l l u ms p ) 、崮氮弧菌( a z o a r c u ss p ) i l ”等。内生细菌可以通过合成微量植物生长激素 的途径促进植物的生长，如假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) ，肠耔菌属( e n t e r o b a c t e r ) ，葡萄球菌属 ( s t a p h y l o c o c c u s ) ，固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) ，固氨螺菌属( a z o s p i r i l l u m ) 以及芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 等中的一些菌株可以产生微量植物生长激素，在植物生长的不同时期促进寄主植物的生长【9 i 。内 生细菌还可以合成植物生长调节剂或酶。如g l c ke ta l ( 1 9 9 5 ，1 9 9 8 ) 1 1 6 , 1 7 1 发现许多植物促生细 菌都产生氮基环丙烷羧酸脱氢酶，推测其可以通过调节植物体内乙烯的水平对植物的生路和发育 进行调节。 1 1 3 2 内生细菌的防病作用及机制 植物内生细菌可以通过多种途径发挥其防病作用：如产生次生代谢物质，包括一些抗生素、 抗菌肽和酶类，抑制病原物的生长【i8 1 ；通过诱导植物体合成成壁物质、植保素、几丁质酶及其它 一些抗氧化酶类使植物获得自身防御机制，对病原物产生局部或系统抗病性，如丑p u m i l u ss e 3 4 篚诱导豌豆的细胞壁加厚，使f u s a r i u mo x y s p o r u m fs p ，p i s i ，不能入侵u9 l ；内生细菌还可以通过在 生长过程中同病原物进行营养物质和生态位点的竞争的方式抑制病原物的生长，如植物在生长过 程中可以产生很多微量化学物质如类黄酮类物质等，诱导与植物具有亲和性的内生细菌进入植物 体内合适的生态位点1 2 0 , 2 q ，而某些有益细菌如荧光假单孢杆菌可以产生噬铁素螫合根围可利用的 大部分f f + ，导致病原物缺乏铁“。 1 1 3 3 内生细菌作为外源基因载体发挥特殊功能 植物内生细菌可以作为宦好的外源基因载体发挥特殊功能。通过遗传工程技术或细胞融合技 术将某些具有特殊功能的遗传基因导入到植物内生细菌，可以构建成具有防病、杀虫及促生等功 能的转基因工群菌。中国农业大学曾将河流弧菌v i b r o f l u v i a l i s 的几丁酶编码基因克隆后转化，作 为水稻纹枯病生防菌应用1 2 3 1 。k o s t l ! ( a 利用转入b t 基因的内生细菌木质棍状杆菌犬齿亚种( c x y l is u b s p c y n d o n t i s ) 进行玉米螟害虫的防治，m a f f e e 等用来自棉花的菲病原性内生细菌作为b t 杀虫基因载体防治棉花蚜虫和玉米茎蛀虫】。徐静将b t 杀虫晶体蛋白基因c r y l a ( c ) 通过综合 质粒载体整台到棉花优势内生细菌b e 9 0 0 2 的染色体上，成功构建重组工程菌阱j 。段灿星研究表 明，接种转c r y l a ( c ) 基因的抗虫工程菌植株对亚洲玉米螟有明显防效脚】。 1 2 芽孢杆菌在植物病理学上的应用 芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 是自然界广泛存在的一类细菌，因为可以产生耐热耐干燥的内生孢子， 典有储存期艮，施用方便的特点，被广泛的进行研究和在生产中推广应用，目前研究较多的主要 有枯草芽孢杆菌( 丑s u b t i l i s ) 、蜡样芽孢杆菌( 丑c e g e l g s ) 多粘芽孢杆菌( bp o l y m y x a ) 以及巨人 2 中国农业大学硕士论文 第一章引言 芽孢杆菌( 丑m e g a t e r i u m ) 等。 研究发现，芽孢杆菌可以合成微量植物生睦激素如吲哚乙酸，以及一些抗菌类物质如脂肽菌 素类物质、氨基多肽、多肽等。e v s t a b be ta l 研究报道矗c e r e u s u w 8 5 可以产生抑制磁，t o p h t h o r a m e d i c a g i n i s ；l 起的紫花苜蓿猝倒病的抗生素z w i t t e r m i c i na ，以及另一种抗生素可以抑制 o o m y c e t es 生长的抗生素k a n o s 锄i n e 仁”。 芽孢杆菌成功应用的实例有很多，其中枯草芽孢杆菌a 1 3 ( 丑s u b t i l i s a l 3 ) 是b r o d d e n t 等从罗 氏白绢病菌s o l e r o t i u mr o 舶i i 的溶裂菌丝中分离得到的，在离体条件下可抑制几种植物病原并且在 无菌士和自然土中能改善多种植物的生长，该菌从1 9 8 3 年开始被销售作花生的处理剂，它的商品 为q u a n t u m 4 0 0 p 。枯草芽孢杆菌g b 0 3 ( 曰s u b t i l i s g b 0 3 ) 的商品名为k o d i a k ，被g u s t a f s o n i n c 用于棉花、土豆种子处理和沟施，1 9 9 4 年2 0 0 万h m 2 以上土地施用了该菌株i z l 。2 0 0 1 年g u s t a f s o n l l c 将解淀粉枯草芽孢杆菌i n 9 3 7 a ( b a c i l l u sa m y l o ，f g u i f a c i e n ss t r e f i ni n 9 3 7 a ) 和浸麻类芽孢杆菌 g b 0 3 ( p a e n i b a c i l l u sm a c e r a n ss t r a i ng b 0 3 ) 混合制成生防药剂，称为b i o y i e l d 。德国拜尔公司将 解淀粉枯草芽孢杆菌变种f z b 2 4 ( b s u b t i l i sv a r a m p l o l i q u e f a c i e n s ) 作为植物促长剂被商业化生产 3 0 1 ，2 0 0 0 年取得了e p a 的注册，用于控制温室和大田植物的真菌病害以及促生和增产。在美国枯 草芽孢杆菌m b l 6 0 0 ( b a c i l l u s s u b t i l i s m b i6 0 0 ) ，商品名为s u b t i l e x ，被用于控制棉花、小麦、大 豆等作物上的真菌病害，对作物的生长也有促进作用。 国内有益芽孢杆菌的研究和开发发展很快。中国农业大学已故陈延熙教授及其同事研制出的 增产菌的成分主要是植物内生有益蜡质芽孢杆菌，已在全国3 0 个省市，5 0 余种作物上推广应用， 主要用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核病等，田间增产率达1 0 5 0 1 。云南农业 大学和中国农业大学共同研制的1 0 9 c f u g 芽孢杆菌可湿性粉剂“百抗o 1 已获得农药部登记注册， 并在多个省推广使用。 1 3 植物有益内生细菌在植物体内的定殖规律研究 内生细菌能否在寄主植物上成功定殖，是充分发挥其生物学作用的关键因素。上世纪7 0 年 代美国加州贝克莱学者首先对促进植物生长的根围有益细菌( p l a n tg r o w t h - p r o m o t i n g r h i z o b a e t e d a ，简称p g p r ) 的定殖问题进行了研究，此后数十年来国内外学者就内生细菌定殖的 问题进行了大量的研究。 1 3 1 影响细菌定殖的主要因素 影响植物内生细菌定殖的因素有生物因素和非生物因素其中生物因素包括内生细菌自身特 异性以及环境生物的影响，非生物因素包括环境中p h 值、温湿度以及其它化学物质的影响。 中国农业大学硕士论文 第一章引言 1 3 1 1 细菌特异性对定殖的影响 细菌自身的运动能力以及黏附作用在定殖过程中有着很重要的作用。t u r n b u l l p ”等在研究 p s e u d o m o n a s 1 u o r e s c e n s 在小麦根部的定殖时发现，细菌的运动能力在其存活以及定殖过程中有 着很重要的作用，可以运动的细菌存活能力以及定殖能力都较其失去运动能力的突变体高。粘附 作用主要依靠细菌表面的菌毛和胞外多糖( e x o p o | y s a c c h a r i d e s e p s ) 来实现，广义上的胞外多耱包 括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团，对细菌有保护作用和表面吸附作用等”_ ，它能使内生细菌较 为牢固的附着在植物细胞的表面，对细菌定殖有很好地促进作用 3 4 1 。 1 3 1 2 宿主植物特异性对定殖的影响 f a b i o f a r i a d a m o t a ( 2 0 0 2 ) 口5 1 的研究表明从不同栽培品种内分离到的内生细菌有很大差异， 内生细菌的数量是与宿主植物生物量的多少相适应的，植物本身基因型以及光合作用的效率是决 定内生细菌定殖数量。s t i l r z 【6 1 的研究表明不同的内生细菌适于生长的植株部位不同，p a m e l a d a d a m s 【3 6 】等通过对不同品种的棉花接种相同浓度的非土著细菌也证明了不同品种间细菌定殖量 存在显著差异，推测可能由于寄主植物基因型以及形态和生理上的差异引起这一结果。 1 3 1 3 非生物因素对定殖的影响 植物的不同部位由于结构不同可利用的物质也不同，研究表明营养物质和水对于内生细菌 的存活也有较大影响。紫外线对d n a 有直接损害，嗜铁索( s i d e m p h o r e ) 则可以增强内生细菌对 紫外线的耐受性，而有运动能力的细菌则可以通过在植物细胞间隙及其它一些部位移动躲避紫外 线的伤害。另外，植物体内分泌物的组成也影响着内生细菌的种群变化。 1 3 2 植物内生细菌定殖的研究方法 植物微生态系统是一个有很多微生物组成的复杂的生态系统，为对供试细菌进行研究，必须 对其进行特殊的标记，所采用的标记方法需要满足的条件有：( a ) 具有特异性：( b ) 具有很好 的稳定性；( c ) 对细菌的生长代谢影响较小。 1 3 2 1 血清学方法 血清学技术具有高灵敏度及特异性的优点，对革兰氏阴性和阳性细菌均适用，可进行原位检 测以及定量统计，并且无论是死细胞或活细胞、可培养的还是不可培养的细胞都可以检测到9 9 1 。 电镜免疫胶体金染色技术在定位植物内生细菌的过程中。有双重标记功能h “。荧光标记免疫反 应结合流式细胞光度技术，可以提高检测方法的专一性和灵敏度。1 9 7 5 年，m u s t e i n 等建立的杂 交细胞技术使单兜隆抗体的生产成为可能，单克隆抗体的同质性年【l 均一特异性的特点为细菌的检 测提供r 一个很好的办法l a u 。 4 中国农业大学硕土论文 第一章引言 1 3 ，2 2 抗生素抗性标记 抗生素标记是一种通过诱导和分子标记等使供试细菌获得抗性的方法，因其具有简便、快速、 消耗低以及方便统计等优点，很久以来被人们广泛用于微生物生态学的研究，尽管已经出现了很 多分子标记的方法，在对植物内生细菌进行种群动态研究的过程中，人们仍倾向于采用抗生素抗 性标记。但是这种方法也有很多局限性，如自然环境中可能存在对抗生素具有抗性的土著微生物 ”2 i ，细菌对抗生索的抗性不稳定，易丢失，另外，对供试细菌进行抗生素标记也存在一定的风险， 供试菌的释放也许会造成抗生素抗性在自然界的扩散1 4 ”。 1 3 ，2 ，3 发色团基因标记 发色团基因标记是一种将编码某种酶的基因导入生物体，引入基因装达后可以将某种特殊的 底物转化为有色产物，从而形成易于识别的有色菌落，如：l a c z 和g u s a 基因分别编码6 半乳糖 苷酶和争葡糖醛酸糖苷酶，在底物x - g a l a 以及x - g l u c a 的存在下，形成兰色菌落；x y l e 基因编 码邻苯二酚过氧化酶，作用于邻苯- 二酚，形成黄色菌落h 4 1 。 1 3 2 4 发光酶基因标记 发光酶基因标记是一种很灵敏的检测方法。原核生物发光酶基因来自费氏弧菌( v i b r i o f i s c h e r i ) 和哈氏弧菌( v i b r i o h a r v e y i ) ，真核生物发光酶基因a u c 基因) 来自北美萤火虫( p h o t i n u s p y r a l i s ) 。其中费氏弧菌 操纵子包括5 个基因：加叫b 编码荧光素酶的亚单位，l u x c d e 编码参 与醛式底物合成的酶 4 3 1 。将生物发光酶基因转入细菌后，基因的成功表达使得供试细菌获得发 光能力，在有分子氧存在时，发光酶基因标记是一种检测内生细菌定殖的很有用的方法p 5 1 1 。3 ，2 5 荧光标记：g f p 的应用及检测 绿色荧光蛋f ： ( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 是一个大小为2 7k d 的多肽，它是一种来自维多 利亚水母q e q u o r e av i c t o r i a ) 钙络合水母发光蛋i ；t ( a e q u o r i n ) ，能自催化形成生色团，用长波紫外 光或蓝光激发时可以发出绿色荧光。g f p 基因于1 9 9 2 年克隆成功f 4 “，此后，人们又对g f p 加以 政造，研究出了一系列的突变体，如：e c f p ( e n h a n c e dc y a n ) ，e g f p ( e n h a n c e d g r e e n ) 以及e y f p ( e n h a n c e dy e l l o w ) 4 7 1 , e r r a m p a l l ie ta 1 【4 ”对g f p 标记的优缺点进行了综述，其中最重要的优点有 g f p 的稳定性以及其对蛋白酶的抗性，而且方便检测，不需加底物和辅因子，被标记的样品不需 固定即可进行活体检测f 4 9 】。用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜等仪器能检测到单个标记g f p 的细菌【”。 t 3 26 分子标记的局限性 检测内生细曲定殖的标记力法存在齐种局限性例：( a ) 标记基田的检测依赖于细菌活细胞的 中国农业大学硕士论文第一章引言 存在：( b 某些标记基因的适用范围受限制，如l a c z y 基因；( c ) 基因标记需要结合抗性标记 才能达到的较高灵敏度t 如g f p 标记需要抗生素标记辅助检测；( d ) 抗生素抗性标记细菌的释 放可能会导致抗生素抗性因子在环境中的扩散：( f ) 标记基因的转入可能会增加细胞的代谢负荷， 影响供试细菌的正常生长以及生物学功能的发挥。 1 3 3 植物内生细菌种群动态的研究方法 研究植物内生细菌的手中群动态的方法依据是否依赖于培养可以分为两大类，依赖于培养的检 测方法是将供试细菌从寄主植物体内分离后，采用浓度梯度稀释法稀释至不同浓度梯度后涂于不 同抗性平板上的生物学方法。依赖于培养的研究方法在接种前需要对供试细菌进行特殊的标记， 缺陷是不能检测难养菌，而不依赖于培养的方法则可以克服这一缺陷。 不依赖于培养的检测方法大致可以分为三类闻：血清学方法、分子生物学方法以及细胞学方 法。e l i s a 是一种很常用的免疫学方法，曾被用于检测荧光假单胞菌在玉米根内外的定殖口“。基 于核酸的分子生物学检测方法有三种。m p n p c r ( m o s tp r o b a b l en u m b e r p c r ) 、c - p c r ( c o m p e t i t i v e p c r ) 以及q - p c r ( q u a n t i t i v ep c r ) 。其中p i c a r de ta l ，最先于1 9 9 2 年采用m p n - p c 姗f 鼽g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s 与f r a n k i as p p ”。t h i r u pe ta l 2 0 0 1 年将c - p c r 用于研究拮抗菌株c p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n sd r 5 4 和杀真菌剂i m a z a l i l 对n p “如m d s p 和a c t i n o m y c e t e s 在大麦根部定殖的影响 5 2 1 q - p c r i j | j i j 是一种直接检测的e c r u - 法。基于核酸的p c r 方法最大的优点是其灵敏度和特异性， 而且可以用于检测难养菌1 4 2 】。流式细胞仪是一种检测细菌定殖量的很有效的细胞学工具，可以 用于检测荧光抗体以及g f p 标记细菌的种群密度以及动态变化”j 。 1 4 研究目的与意义 蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 8 3 - 6 、8 3 1 0 、m 2 1 、m 2 2 、a 4 7 、9 3 1 、9 3 2 以及9 1 0 是由 中国农业大学植物病害生物防治实验室分离、筛选的植物有益芽孢杆菌，温室及田间试验中均表 现出很好的促生防病以及改善作物品质的作用。本研究分别在温室和田问对这8 株蜡样芽孢杆菌 在小麦植株上的定殖动态进行了分析，并以蜡样芽孢杆菌9 3 2 为例采用激光共聚焦显微镜技术对 小麦幼苗上的定位进行了观察，不仅有利于揭示蜡样芽胞杆菌作用机理，而且有利于指导在农业 生产中的推广应用。 6 第二章g f p 标记菌株与野生菌株生长动态的比较 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 是一种来自维多利亚水母( a e q u o r e av i c t o r i a ) 的钙络合水母发光蛋白，能白催化形成生色团，在a e q u o r e a 以外的生物体内仍然具有发光活性。 大量的报道证明g f p 标记研究细菌的定殖有很多的优越性本研究在实验室摇培条件下对8 株 g f p 标记蜡样芽胞杆菌的生长速度进行测定，为明确采用g f p 标记苗株研究蜡样芽孢杆菌的定 殖动态是否可行提供实验基础。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 供试菌株 g f p 标记吲蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 8 3 6 、8 3 1 0 、m - 2 i 、m 2 2 、a - 4 7 、9 3 1 、9 3 2 、 9 1 0 。以及野生菌株( 表1 ) 由本实验室提供。 菌株 b a e t e r i a ls t r a i n s 驺6 8 3 1 0 m - 2 1 m 一2 2 a - 4 7 9 3 l 9 3 2 9 1 0 2 1 1 2 培养基 麦1 螬样芽孢杆菌菌株 t a b l e1b a c i l l u sc e r e l l $ s t r a i n s 特征来源 r e l e v a n ta b a r a e t e r i s t i c sr e f e r e n c eo f s o u r c e u n i v e r s a ly i e l d - i n c r e a s i n gb a c i l l u sc e r e x f s t h i sl a b u n i v e r s a ly i e l d i n c r e a s i n gb a c i l l u sc e m u 3t h i sl a b y i e l d - i n c r e a s i n g b a c i l l u s c e r e u s f o r b e e t t h i s l a b s u g a r - i n c r e a s i n gb a c i l l u sc e f e u $ f o rb e e t t h i sl a b y i e l d - i n c r e a s i n gb a c i l l u sc e r e u so f w h e a t t h i sl a b b a c i l l u sc e r e u sa g a i n s tw h e a ts h a r pe y e s p o tt h i sl a b b a c i l l u sc e r e u sa g e l n s tr i c es h a r pe y e s p o tt h i sl a b y i e l d - i n c r e a s i n gb a c i l l u sc e p e u sf o rc o l e t h i sl a b l b 培养基：酵母抽提物5g ；胰蛋白胨1 0 9 ；氯化钠1 0 昏水1 0 0 0 m l 牛肉汁培养基：蛋白胨5 8g ，牛肉浸膏3g ，氯化钠1 0 9 ，水1 0 0 0 m l ( 固体培养基加琼 脂1 0 2 0 9 ) 新霉素：工作浓度7i _ t g m l ，用水溶解，过滤除菌 中国农业大学硕士论文 第二章g f p 标记菌株与野生菌株生长动态的比较 2 1 1 3 仪器与设备 培养皿、试管、量筒、三角瓶、酒精灯、计数器、湿热灭菌锅、烘箱、移液器、超净工作台、 恒温培养箱、摇床、p h 计、分光光度计、光学显微镜、o l y m p u s 生产的落射式荧光显微镜p m2 0 。 2 1 1 4 试剂 n a c i 、蒸馏水、酵母提取物、琼脂、牛肉提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、k 2 h p 0 4 、k h 2 p 0 4 。 均为市售。 2 1 2 方法 将低温保存的8 株g f p 标记菌株及野生菌株菌液涂于牛肉汁培养基平扳上，在3 0 恒温箱 中培养2 4 小时进行菌株的活化，然后用生理盐水( n a c l8 5 舀蒸馏水1 0 0 0m 1 ) 稀释至1 0 9c f i t m l 制成菌悬液，按1 ：1 0 0 的比例分别接种于l b 液体培养基中，于3 0 c 、1 7 0r p m 摇培。摇培后 l h 开始取样，之后每1h 取样一次。每次取样时记录培养液的o d 6 0 0 ，以时间为横坐标，以o d 值为纵坐标作出生长曲线。 2 。2 结果与分析 菌悬液的o d 值随着液体培养基中菌量而变化，在不同时间取样后得到的o d 6 0 0 反映着培养 基中的菌量变化动态。结果表明( 图2 1 ) ，8 株菌株及其g f p 标记菌株在l b 液体培养基中的生 长速度基本一致，为用g f p 标记菌株来研究蜡样芽孢杆菌的定殖规律的可行性提供了依据。 中国农业大学硕十论文 第二章g f p 标记菌株与野生菌株生长动态的比较 a - 8 3 - 6 - _ 8 3 - 6 - g f r , 2 h3 i t4 h5 h6 h7 h8 h 时问 + m 2 l + m 2 1 曲 2 h3 h4 h5 h6 h7 h 8 h 时问 。一a _ 4 7 - - 4 1 1 - - a - 4 7 - g 币 d 3 2 g 2 81 l 0 f 2 5 0 20 0 81 5 0 。0 0 9 o 5 0 0 0 0 - 一8 3 - 1 0 一8 3 1 0 g f v 2 h3 h4 1 15 h6 1 17 1 l8 h 时间 一m 2 2 + m 2 2 - g f v 2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h 时间 - 9 3 1 9 3 1 一g f p 2 h3 h4 h5 h 6 h 7 1 1 b h 时间 枷 瑚 m b 8 8 鲫卸帅加 ：，。掣剐o o o o 卯 如 如 2 2 l 1 o 0 c o o 崞 h o 孙 手 一北一孙拍 珊 瑚 哪 e s g 2 3 本章小结 2 h3 h4 h5 h 6 h7 h 8 h 时间 h 2 h3 h4 h5 h6 h7 hs h 时间 图2 1 植物有益蜡样芽孢杆菌及其g f p 标记菌株在l b 液体培养基中的生长曲线。 f i g 2 1 t h e g r o w t hc u r v e o f b c e r e l & e i n l b 注：图中所示结果为两次重复的平均值以及标准误差 n o t e ：r e s u l t a r ee x p r e s s e d t h e v a l u e ；a n ds t a n d a r de r r o r s o f 2r e p l i c a t e s 重组质粒p g f p 4 4 1 2 是由本实验室构建，已成功在8 株蜡样芽胞杆菌体内表达【5 ”，田涛研究 证明p g f p 4 4 1 2 具有较好的稳定性，并且在研究中发现菌落的大小、形状以及生长速度与野生菌 株均无明显差异，但g f p 标记菌株的生艮速度略低于野生菌株，这与本实验的研究结果基本一致。 由此基本可以判定，g f p 标记并未对蜡样芽孢杆菌的正常生长造成明显的影响。 1 0 =宝他。旺o 中国农业夫学硕士论文第三章植物有益蜡样芽孢杆菌在小麦植株上的定殖动春研究 第三章植物有益蜡样芽胞杆菌在小麦植株上的定殖 动态研究 内生细菌在寄主植物上有效定殖是发挥其作用效果的前提条件，本研究以8 株g f p 标记蜡样 芽孢杆菌为供试细菌，采用种子处理的方法，研究蜡样芽孢杆菌在温室和田间的定殖动态，为揭 示蜡样芽孢杆菌在小麦上的作用机制以及指导生产应用奠定基础。 3 1 材料与方法 3 1 1 材料 供试菌株：g f p 标记蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e l t 8 ) 8 3 6 、8 3 1 0 、m 2 1 、m