（应用化学专业论文）若干天然产物和痕量环境有机污染物的液质联用法检测研究.pdf

摘要 液相色谱质谱( l c ，m s ) 联用是当前分析化学最重要的工具之一，也是天然产物和 环境有机污染物分析最广泛应用的技术。本论文以大豆皂苷、雷公藤生物活性物和氯酚 类化合物为例，在深入考察它们的色谱热力学和动力学行为的基础上，开展了质谱检测 方法学的研究。建立与发展了一系列快速、灵敏、准确的大豆胚芽中大豆皂苷、血液中 大豆皂苷和雷公藤生物活性物及食品与环境中氯酚残留的l c m s 检测方法。具体包括： 系统构建了大豆胚芽中大豆皂苷的超声辅助提取，直接进样电喷雾质谱( e s i m s ) 快速定性分析方法和液相色谱电喷雾质谱( l c e s i m s ) 联用的快速定性、定量检测方 法，将来源未知的大豆胚芽样品转化成色谱已知样品。建立的方法可同时定量分析大豆 胚芽中5 0 多种a 类、b 类和d d m p 类大豆皂苷，各大豆皂苷的检出限在2 0 4 0n g m l 范围。 采用固相萃取和质谱的多离子反应监测( m r m ) 技术，建立了一种以甘草酸为内 标。液相色谱电喷雾串联质谱( l c e s i m s m s ) 法同时测定血清中大豆皂萤b a 和b b 的分析方法，血清中大豆皂苷b a 和b b 在0 5 1 0 0 0n g m l 范围线性关系良好，其检出限 分别为0 5 和0 3n g m l ，平均回收率分别为9 5 6 和9 0 0 。 建立了一组分别以泼尼松龙、醋酸地塞米松和氢化可的松为内标的全血样品中雷公 藤甲素，乙素和红素的液相色谱大气压化学电离串联质谱( l c a p c i m s m s ) 的测定 方法，全血样品采用醋酸乙酯提取后，经l c 分离，利用m r m 技术，全血中雷公藤甲 素、乙素和红素含量在1 0 - 1 0 0 。0n g m l 均具有良好的线性关系( ，冬o 9 9 5 ) ，其检出限分 别为0 5 ，0 5 和1 0n g m l 。 血清样品经醋酸乙酯提取后采用固相萃取净化，经l c 分离后采用a p c i 源在选择 离子监测( s i m ) 模式下检澳4 ，建立了以乌头碱为内标的血清样品中雷公藤定碱、雷公 藤次碱、雷公藤碱乙和雷公藤春碱共四种雷公藤生物碱的l c a p c i m s 同时测定方法， 结果四种雷公藤生物碱在1 0 1 0 0 0n g m l 均具有良好的线性关系，其检出限均为1 0 n g m l 。回收率在8 2 1 9 4 2 范围。 通过在柱后串接电导抑制器，自组装了一台离子色谱质谱联用仪( i c m s ) ，经调 节抑制器电流，有效地改变了柱后淋洗液的p h 值并降低了淋洗液中不挥发性盐的含量， 基本解决了l c 蹦s 联用时质谱信号的抑制与淬灭问题，获得了l c 与m s 的较好兼容。同时 结合固相萃取技术、膜抑制器技术与质谱的高灵敏和高选择性的检测能力，建立与发展 了一种新颖的环境水样和海产食品中有机氯酚类化合物残留的i c m s 联用的分离分析新 方法。结果各氯酚在环境水样中的检出限在0 0 0 5 - , , 0 0 4 8 n g m l 范围，在海产食品中检出限 在0 0 5 - o 5 0n e d g 范围。 关键词：液相色谱质谱联用：离子色谱质谱联用；天然产物；大豆皂苷；雷公藤；雷 公藤甲素；雷公藤乙素；雷公藤红素；雷公藤生物碱；氯酚；环境污染物 a b s t r a c t l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y ( l c m s ) i so n eo ft h em o s t i m p o r t a n tt o o l sf o rt h ea n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，a n d ，i ti so n eo f t h ew i d e l yu s e dt e c h n i q u e si nt h e a n a l y s i so ft h en a t u r a lp r o d u c t sa n dt h ee n v i r o n m e n t a lo r g a n i cc o n t a m i n a t i o n s i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，as e r i e so fr a p i d ，s e n s i t i v ea n da c c u r a t el c m sa n a l y t i c a lm e t h o d sw e r e e s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs o y a s a p o n i n si nh y p o c o t y l s ，s o y a s a p o n i n sa n dt h e t r i p t e r y 鲥u mw i l f o r d i ih o o k f ( t w h f ) b i o a c t i v ec o m p o u n d si nh u m a nb l o o d , a n dt r a c e c h l o r o p h e n o l i c sc o m p o u n d si nw a t e ra n dc l a mt i s s u e s ，a n dt h r o u g hd e t a i l e de x a m i n a t i o nf o r t h eb e h a v i o ro fl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i ct h e r m o d y n a m i c sa n dk i n e t i c s i ti n c l u d e st h e f o l l o w i n ga s p e c t s ： a r a p i dq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v em e t h o dw a se s t a b l i s h e df o rt h ec h a r a c t e r i z a t i o na n d d e t e r m i n a t i o no fs o y a s a p o n i n si n h y p o c o t y l sb yu l t r a s o u n d - a s s i s t e d e x t r a c t i o n ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t he l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( l c e s i m s ) a n dt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( l c e s i m s m s ) am a s ss p e c t r o m e t r y q u a l i t a t i v ea s s a yw a sa l s oe s t a b l i s h e db yd i r e c ti n j e c t i o ne s i m sa n de s i m s m s t h i s m e t h o dc o u l ds i m u l t a n e o u s l yd e t e r m i n e dm o r et h a n5 0c o m p o u n d so fg r o u pa ，g r o u pb a n d g r o u pd d m p ( 2 , 3 一d i h y d r o 一2 ，5 一d i h y d r o x y 一6 一m e t h y l 一4 ，卜p y r a n 一4 一o n e 、s o y a s a p o n i n si n h y p o c o t y l s t h el i m i t so ft h eq u a n t i f i c a t i o nf o rt h es o y a s a p o n i n sw c r ea sl o wa s2 o 4 0 n g m l al c e s i - m s m sm e t h o dw a sd e v e l o p e da n dv a l i d a t e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f s o y a s a p o n i n sb aa n db bi nh u m a ns e r u mu s i n gg l y c y r r h i z i na sa ni n t e r n a ls t a n d a r d ( i s ) s o y a s a p o n i n sb aa n db bw e r ee x t r a c t e db yc t ss o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) ，a n dd e t e c t e di n t h em u l t i p l e - r e a c t i o nm o m t o r i n g ( m r m ) m o d e t h ec a l i b r a t i o nc 1 l r v e $ w e r el i n e a r 移o 9 9 1 ) i l lt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f o 5 1 0 0 0n g m lw i t hal o w e rl i m i to f q u a n t i f i c a t i o no f 0 5a n d 0 3n g m li nh u m a ns e r u mf o r s o y a s a p o n i n sb aa n db b ，r e s p e c t i v e l y t h em e a nr e c o v e r i e so f s o y a s a p o n i n sb aa n db bw e r e9 5 6 a n d9 0 o r e s p e c t i v e l y b ye x t r a c t i o nw i t he t h y la c e t a t e ，a n dd e t e c t i o nw i t hn e g a t i v ea t m o s p h e r i cp r e s s u r e c h e m i c a li o n i z a t i o n ( a p c i ) a n di o n t r a pt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r yi nm r mm o d e ，a l c m s m sa s s a yw a sd e v e l o p e da n dv a l i d a t e df o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f t r i p t o l i d e ， t r i p d i o l i d ea n de e l a s t r o li nh u m a nw h o l eb l o o du s i n gp r e d n i s o l o n e ，d e x a m e t h a s o n ea c e t a t e i i i a n dh y d r o c o r t i s o n e ，r e s p e c t i v e l y ，a sa ni s t h ec a l i b r a t i o nc u r v e sw e r ew e l ll i n e a r ( r z o 9 9 5 ) i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 1 0 0 0n g m li nh u m a nw h o l eb l o o dw i t hnl i m i to f q u a n t i f i c a t i o no f0 5 ，0 5a n d1 0n g m l ，r e s p e c t i v e l y al c a p c i m sm e t h o di nt h es e l e c t e di o nm o n i t o r i n g ( s i m ) m o d ew a sd e v e l o p e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ff o u rt w h fa l k a l o i d s ( w i l f o r d i n e ，w i l f o r i n e ，w i l f o r g i n ea n dw i l f o r t r i n e ) i nh u m a ns e r u mu s i n ga c o n i t i n ea sa ni s a f t e rt h ea n a l y t e sw e r ee x t r a c t e dw i t he t h y la c e t a t e a n dc l e a n e d 叩b ys p e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec a l i b r a t i o nc u r v e sw e r el i n e a r ( ，z o 9 9 5 ) i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 1 0 0 0n g m li nh u m a ns e n l m 、析mal i m i to f q u a n t i f i c a t i o n o f1 0n g m le a c h t h em e a ne x t r a c t i o nr e c o v e r i e sf o rt h e mw e r eb e t w e e n8 2 1a n d9 4 2 a ni o nc h r o m a t o g r a p h ym a s s s p e c t r o m e t r ye q u i p m e n t ( i c m s ) w a ss u c c e s s f u l l y a s s e m b l e db yo u r s e l v e sb yc o n n e c t i n gi ns e r i e sac o n d u c t a n c es u p p r e s s o ra f t e rc o l u m n b e t w e e nt h ei o nc h r o m a t o g r a p ha n dt h en l a s ss p e c t r o g r a p h , w h i c hc o u l dc h a n g et h ep hv a l u e a tt h ep o s t c o l u m ne l u e n ta n dd e c r e a s et h ec o n t e n to f t h ei n v o l a t i l ei n o r g a n i cs a l ti nt h ee l u e n t b ya d j u s t i n gi t sc u r r e n t ，a n dw e l ls o l v e dt h es u p p r e s s i n ga n dq u e n c h i n gp r o b l e m so ft h em a s s s p e c t r o m e t r i cs i g n a lw i t ht h ec o n n e c t i o no fi ca n dm s an o v e ls e p a r a t i o na n da n a l y t i c a l m e t h o dw a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ec h l o r o p h e n o l i c sc o m p o u n d si nw a t e r a n dc l a mt i s s u e sb yi c a p c i m si nt h en e g a t i v em o d e t h em e t h o dc o m p r i s e do fas p e e x t r a c t i o nt e c h n i q u e ，m e m b r a n et e c h n i q u ea n dt h es e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ed e t e c t i o nt e c h n i q u e o ft h em a s ss p e c t r o m e t r y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o na r eo 0 0 5 0 0 4 8n e m li nw a t e r a n do 0 5 - o 5 0n e gi nc l a mt i s s u e s k e y w o r d s ：l c m s ，i c m s ，n a t u r a lp r o d u c t ，s o y a s a p o n i n ，t w h f ，t r i p t o l i d e ，t r i p d i o l i d e ， c e l a s t r o l ，t w h fa l k a l o i d s ，c h l o r o p h e n o l ，e n v i r o n m e n t a lc o n t a m i n a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝至三盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 字日期：多舢年口j 月口听 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝 江盘生有关保留、使用学位论文的规定， 有权保崮并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 p 7 叩 缈 签字r 期：力柙年。f 月。寥只 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师签名 签字日期：z 矽矿月多r 电话 邮编 浙江人学博十学位论文第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 液相色谱质谱联用技术( l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym a s ss p e c t r o m e t r y ，l c m s ) 是当 今最重要的分离和鉴定方法之一。它是以l c 为分离手段，m s 为检测器的一门综合性分 离分析技术，它集色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性于一体，已成为当前 天然产物分析和环境中痕量有机污染物分析不可或缺的有效工具。特别是随着近几年大 气压电离技术的革新，热喷雾( t s ) 、电喷雾电离( e s i ) 、大气压化学电离( a p c i ) 和大气压光学电离( a p p i ) 等新型离子源的相继问世，将质谱与多种类型的色谱分离技 术在线连接起来，成为既具有高分辨能力，又具有高灵敏度和高选择性且能提供分析物 碎片离子、裂解途径及结构信息的体化定性、定量分离分析系统。 1 2 l c m s 离子源接口技术进展【卜。1 离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度和选择性。常 见的离子化方式有两种：一种是样品在离子源中以气体的形式被离子化；另一种是从固 体表面或溶液中溅射出带电离子而被离子化，在很多情况下进样和离子化是同时进行。 近些年来，天然产物、环境污染物及生物大分子的分析需求对质谱的电离方式提出了更 高的要求，新的离子源不断出现。 1 2 1 热喷雾离子源( t h e r m o s p r a yi o n i z a t i o n 。t s i ) 存在于挥发性缓冲液流动相( 如乙酸铵溶液) 中的待测物，由细径毛细管导入离子 源同时加热，溶剂在细径毛细管中被除去，待测物进入气相。中性分子可以通过与气相 中的缓冲液离子( 如n h 4 + ) 反应，以化学电离的方式离子化，再被导入质量分析器。t s i 适用的液体流量可达2m l m i n ，并适合于含有大量水的流动相，可用于测定各种极性化 合物，但由于在溶剂挥发时需要利用较高温度加热，因此待测物有可能受热分解。 1 2 2 粒子束离子源( p a r t i c l eb i n di o n i z a t i o n p b i ) 将色谱流出物转化为气溶胶，在脱溶剂室中脱去溶剂，得到的中性待测物分子导入 离子源，使用电子轰击或化学电离的方式将其离子化，获得的质谱为经典的电子轰击电 离或化学电离质谱图，其中前者含有丰富的样品分子结构信息。但粒子束接口对样品的 浙江大学博士学位论文第一章绪论 极性、热稳定性和分子质量有一定限制，最适用于分子量在1 0 0 0 道尔顿( d a ) 以下的小 分子化合物分析。 1 2 3 快原子轰击( f a s ta t o mb o m b a r d m e n t f a b ) 将样品分散于基质( 常用甘油等高沸点溶剂) 制成溶液，涂布于余属靶上送) k f a b 离子源中。将经强电场加速后的惰性气体中性原子束( 如氙) 对准靶上样品轰击。基质 中存在的缔合离子及快原子轰击产生的样品离子一起被溅射进入气相，并在电场作用下 进入质量分析器。如用惰性气体离子束( 如铯或氩) 来取代中性原子柬进行轰击，所得 质谱称为液相二次离子质谱( l s m s ) 。此法优点在于离子化能力强，可用于强极性、 挥发性低、热稳定性差和相对分子质量大的样品。f a b 容易得到比较强的分子离子或准 分子离子，而且其所得质谱有较多的碎片离子峰信息，有助于结构解析。但对非极性样 品灵敏度较低，而且基质在低质量数区( 4 0 0 d a 以下) 产生较多干扰峰。f a b 是一种表 面分析技术，需注意优化表面状况的样品处理过程。样品分子与碱金属离子加合，如 m + n a + 和【m + k 】+ 一有助于形成离子，这种现象有助于生物分子的离子化。在f a b 离子 化过程中，可同时生成正负离子，这两种离子都可以用质谱进行分析。样品分子如带有 强电子捕获结构，特别是带有卤原子，可以产生大量的负离子，负离子质谱已成功用于 多种农药残留物的分析。 1 2 4 场电离( f i e l di o n i z a t i o n ，f i ) 和场解吸( f i e l dd e s o r p t i o n ，f d ) f i 离子源是由相距很近的阳极和阴极组成，两极问加上高电压后，阳极附近产生高 达1 0 7 1 0 8 v c m 的强电场。接近阳极的气态样品分子产生电离形成正分子离子，然后加 速进入质量分析器。对于液体样品( 固体样品先溶于溶剂) 可用f d 来实现离子化。将金 属丝浸入样品液，待溶剂挥发后把金属丝作为发射体送入离子源，通过弱电流提供样品 解吸附所需能量，样品分子即向高场强的发射区扩散并实现离子化。f d 适用于难气化， 热稳定性差的化合物。f i 和f d 均易得到分子离子峰。 1 2 5 基质辅助激光解吸离子化( m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n m a l d i ) 将溶于适当基质中的样品涂布于金属靶上，用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可 实现样品的离子化。此方式主要用于可达1 0 0 0 0 0 d a 质量的大分子分析，仅限于作为飞行 时间分析器的离子源使用。 2 浙江大学博十学何论文第一章绪论 1 2 6 电喷雾电离( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 带有样品的液体通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出，生成带电液滴，经干燥 气除去溶剂，带电离子通过毛细管或小孔直接进入质量分析器。传统的电喷雾离子源只 适用于流动相流速为1 5p l m i n 的体系，因此电喷雾离子源主要适用于微柱液相色谱。 同时由于离子可以带多电荷，使得大分子化合物的质荷比落入大多数四极杆或磁质量分 析器的分析范围( 毗小于4 0 0 0 ) ，从而可分析分子量高达几十万d a 的物质。 电喷雾离子源( e s i ) 是一种新发展起来的“软电离”质谱技术，能快速、准确地测 定从小分子到生物大分子或不稳定有机分子的分子量。其优点为；( 1 ) 液相中的被测分 子变成气相离子时没有经受外部能量的激发，因而不会发生裂解，故没有碎片峰，称为 无碎片质谱；( 2 ) 通过碰撞诱导裂解( c i d ) 可以产生碎片，从而提供分子的结构信息。 由于e s i 产生的多电荷离子、对某些极性化合物电离的高效率( 对蛋白质接近1 0 0 ) 以及软电离等特性，使得质谱成为在分析极性化合物( 包括溶液中的离子) 、易热分解 化合物和高分子量化合物方面最有效的工具之一。 1 2 7 大气压化学电离源( a t m o s p h e r i cp r e s s u r ec h e m i c a li o n i z a t i o n , a p c i ) 大气压化学电离是基于通过加热而挥发的样品与混合溶剂电晕放电产生的反应离 子发生气相化学电离反应。由于压力很高，化学电离反应产生的反应离子经常是复杂的 混合离子。它是通过在大气压下电晕放电产生的反应离子与样品分子发生离子一分子反 应，从而产生样品的质子化分子或加合离子。主要用于分析分子量较小的非极性或弱极 性化合物。 1 2 8 大气压光电离源( a t m o s p h e r i cp r e s s u r ep h o t o i o n i z a t i o n , a p p i ) a p p i 是以氪灯为能源，氖灯发射的光子能量只可以使待测化合物电离，但不足以 使其解离，是一种有效的软电离手段。与a p c i 和e s i 相比，a p p i 尤其适合于电离非极性 化合物，而且不存在电荷竞争效应，动态范围宽，也不消耗任何溶剂，它们的共同点是 样品的离子化在处于大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，分析的灵敏度和稳定 性好。特别适用于低极性的小分子化合物分析。 1 3 质谱及其联用技术进展i i - 刀 1 , 3 1 色谱质谱联用 浙江大学博七学位论文第一章绪论 色谱可作为质谱的样品导入装置，并对样品进行初步分离纯化，因此色谱质谱联用 技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保留时间，质谱可给出化合 物的分子量和结构信息，故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效。在这 些联用技术中，芯片质谱联用( c h i p m s ) 显示了良好前景，但目前尚不成熟，丽气相 色谱质谱联用和液相色谱质谱联用等已经广泛用于天然产物、环境污染物和生物大分 子的分析检测。 ( 1 )气相色谱质谱联用( g c 巾“s ) 气相色谱的流出物已经是气相状态，可直接导入质谱。由于气相色谱与质谱的工作 压力相差几个数量级，联用研究初期，在它们之间使用了各种气体分离器以解决工作压 力的差异。随着毛细管气相色谱的应用和高速真空泵的使用，气相色谱流出物已可直接 导入质谱仪。 ( 2 ) 液相色谱质谱联用( l c ，m s ) l c m s 联用的离子源前已论及，主要用于分析g c m s 不能分析，或热稳定性差，强 极性和高分子量的物质，如天然产物、合成药物、环境污染物和生物大分子化合物等。 ( 3 ) 毛细管电泳，质谱联用( c e m s ) 和芯片质谱联用( c h i p m s ) c e 适用于分离分析极微量样品( n l 级) 和难分离物质对( 如手性对映体) 。c e 流出 物可直接导入质谱或加入辅助流动相以达到和质谱仪相匹配。微流控芯片技术是近年来 发展迅速，可实现分离、过滤、衍生等多种实验室技术于一块芯片上的微型化技术，具 有高通量、微型化等优点。目前已实现芯片和质谱的联用，但尚未商品化。 ( 4 ) 超临界流体色谱质谱联用( s f c m s ) 常用超临界流体二氧化碳作流动相的s f c 适用于弱极性和中等极性物质的分离分 析，通过色谱柱和离子源之间的分离器可实现s f c 和m s 联用。 ( 5 ) 离子色谱质谱联用( i c m s ) 离子色谱( i c ) 是高效液相色谱( h p l c ) 的一个分支，主要用于分析无机阴离子 和可电离小分子有机化合物。由于i c 的淋洗液中常含有难挥发性盐，如直接引入质谱离 子化室必然会引起难挥发性盐在离子化室表面的沉积或毛细管的堵塞，导致质谱信号的 抑制甚至淬灭，影响m s 的检测。近年来，随着离子色谱抑制器技术的发展，通过调节 抑制器电流，能较好地降低或消除淋洗液中难挥发性盐的干扰，突破了i c n 以s 联用的技 术瓶颈，目前已有文献报道用于无机阴离子如b r 0 3 和c 1 0 4 的检测。 4 浙江大学博士学位论文第一章绪论 1 3 2 串联质谱 两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。最简单的串联质谱( m s - m s ) 由 两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器( m s ) 将离子预分离或加能量修饰，由第 二级质量分析器( m s 2 ) 分析结果。最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱。第一级 和第三级四极杆分析器分别为m s l 和m s 2 ，第二级四极杆分析器所起作用是将从m s l 得 到的各个离子进行轰击，实现母离子碎裂后进入m s 2 再进行分析。现在出现了多种质量 分柝器组成的串联质谱，如四极杆一飞行时间串联质谱( q - t o f ) 和飞行时间一飞行时间 ( t o f t o f ) 串联质谱等，大大扩展了应用范围。离子阱和傅里叶变换质量分析器可在 不同时间顺序实现时间序列多级质谱扫描功能。串联质谱法是指质量分离的质谱检测技 术，有分离、结构解析同步完成的特点，能直接分析混合物组分，有高度的选择性和可 靠性【”。 m s m s 最基本的功能包括能说明m s 中的母离子和m s 2 中的子离子间的联系。根据 m s 和m s 2 的扫描模式，如子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描，可以查明不 同质量数离子间的关系。母离子的碎裂可以通过以下方式实现：碰撞诱导解离，表面诱 导解离和激光诱导解离。不用激发即可解离则称为亚稳态分解。m s m s 在混合物分析中 有很多优势。在质谱与气相色谱或液相色谱联用时，即使色谱未能将混合物完全分离， 也可以进行鉴定。m s - m s 可从样品中选择母离子进行分析，而不受其它物质干扰。 1 3 3 液相色谱质谱联用应用 随着科学技术的进步，1 9 7 4 年，出现了等离子体解析质谱( p l a s m ad e s o r p t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y ，p d m s ) ，1 9 8 1 年，出现了快原子轰击质谱( f a s t a t o mb o m b a r d m e n t m a s s s p e c t r o m e t r y ，f a b m s ) ，质谱开始研究极性大、热不稳定的多肽和小蛋白质等。值得 一提的是1 9 8 8 年，出现了电喷雾电离质谱( e s i m s ) 和基质辅助激光解析电离飞行时 间质谱( m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m eo f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ，m a l d i t o f m s ) ，傅立叶变换质谱法( f o u r i e rt r a n s f o r mm a s ss p e c t r o m e t r y ，m a l d i f r m s ) 开创 了质谱分析研究生物大分子的新领域。从此以后，e s i m s 和m a l d i - m s 获得了迅速 的发展，质谱跨出近代结构化学和分析化学的领域而进入了生物质谱的范畴，也就是进 入了生命科学的范畴【i l 。为了解决生命科学中复杂体系内微量成分的分析，近年来，质 谱与各种色谱的联用技术发展迅速，如高效液相色谱电喷雾电离质谱联用( h p l c e s i m s ) ，毛细管电泳电喷雾电离质谱联用( c e e s i m s ) 等，从而发展了微量电喷 5 浙江大学博七学位论文第一章绪论 雾离子源。目前市场上用于l c m s 中的质谱检测器主要有四级杆式质谱( q m s ) 、离 子阱质谱( i t m s ) 、飞行时间质谱( t o f m s ) 和付里叶变换离子回旋共振质谱 ( f t i c r m s ) 等四种，这些商业化产品价格都十分昂贵。由于t o f m s 具有微秒级的 快速检测速度、高离子传输率和极低的最小检测限，以及理论上无限的质量检测上限等 众多优点，再加上近几年来t o f m s 的分辨率又有了长足的进步，因此e s i t o f - m s 成为l c m s 的最佳质谱检测器之一。目前，l c m s 主要用于天然产物和药物分析、生 物大分子分析及环境和食品中痕量污染物残留分析。 天然产物是新药开发的重要资源。通过对植物尤其是民间药用植物进行生物活性筛 选寻找新药先导化合物，进而开发成新药，已经成为当前国际上新药开发的一个热点。 天然产物的粗提物是一个十分复杂的体系，它可能包含数十种化学性质相似或差异较小 的化合物，这给提取与分离工作带来许多困难。传统的分析方法是将每个化合物分离提 取，再依靠多种成熟的分析技术来鉴定各自的分子结构，这种研究模式费力且效率低。 理想的分析技术最好能对一个天然产物提取物中各成分进行有效的分析，且对研究对象 不仅具有一个足够的灵敏度、选择性，同时还要能够给出结构上的定性识别。在分离过 程中充分运用l c m s 技术则既可以避免对已知化合物的重复鉴定，又可以快速转移到 一些结构新颖的新化合物上【8 卅。目前l c m s 在天然产物的研究中已得到了大量的应用 t o - 2 9 1 。例如，中药菟丝子中酚性化合物的鉴定【1 5 】，大h ( g l y c i n em a x ) 和黑豆_ ( v i g n am u n g o l h e p p e r ) 产品中大豆皂苷的分析与鉴定1 2 1 - 2 4 1 , 人参中人参皂苷( p a n a x n o t o g i n s e n g ) 【2 5 埘以及最近报道的莒蓿皂苷( m e d i c a g o ) 【2 m 9 1 等的结构分析与定量测定。 质谱在医药、环境与食品中痕量残留污染物方面的应用日益受到人们的重视，应用 也越来越广泛1 3 2 1 ，通过l c m s 的选择离子监测模式( s l m ) 或l c m s - m s 的多离子反应 监测模式( m r m ) ，可以较好地克服背景干扰，提高信噪比，如分析药物中某特定离子， 来自基质中其它化合物的信号可能会掩盖检测信号，用m r m 对特定离子的碎片离子进 行选择监测可以消除干扰，m r m 也可同时定量分析多个化合物。在药物代谢研究中， 为发现与代谢前物质具有相同结构特征的分子，使用中性碎片丢失扫描能找到所有丢失 同种官能团的离子，如羧酸丢失中性二氧化碳。如果丢失的碎片是离子形式。则母离子 扫描能找到所有丢失这种碎片的离子。l c ，m s 是药代动力学分析的好方法，9 0 年代后， e s i - m s 和m a l d i m s 用于生物分子间非共价健相互作用的研究，为药物一受体作用提供 了直接证明，更有望用于高通道筛选有效药物，对促进新药研究将发挥重要作用。利用 l c m s ，可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化工作，而且能分离鉴定以往难以辨识的 6 浙江大学博十学位论文第一章绪论 痕量药物代谢物。因此，在探讨中药与天然产物代谢特征、确定药物代谢物结构与代谢 途径、阐明药物与代谢物的药副作用以及不良反应白j 的关系，即结构代谢活性或毒性 三者之间的相关性等药物代谢研究方面，l c m s 和l c m s - m s 己显示出非常广阔的应用 前景【4 3 1 。 在生物大分子领域，质谱已较好用于蛋白质分子质量的测定，氨基酸序列的分析， 蛋白质的质量肽谱，天然和生物合成蛋白质突变体分析、蛋白质翻译后修饰的测定，配 位体结合的研究，酶的活力部位研究和蛋白质折叠和高级结构的研究，核酸片段分子质 量测定，寡核苷酸序列分析，核酸修饰部位的鉴定以及多糖和寡糖结构分析等【1 1 。 1 4 大豆皂苷的检测研究进展 大豆不仅富含优质的蛋白质和油脂，而且还含有大量具有生理活性成分，包括大豆 异黄酮，大豆皂苷、大豆磷脂、低聚糖类、蛋白酶抑制剂等。许多研究表明，大豆中存 在的大豆皂苷( s o y a s a p o n i n ) 是一种具有广泛应用价值的天然生物活性物质，具有许多 有益的生理功效，如抗氧化、抗自由基作用、增强免疫调节功能和抗肿瘤作用等【槔删。 大豆皂苷属于三萜类齐墩果酸型皂苷，系三萜类同系物( 皂苷元) 的羟基与糖分子 ( 或糖酸) 环状半缩醛上的羟基失水缩合而成的一类化合物。它可以水解生成多种糖类和 配糖体。目前已确认结构的大豆皂苷有5 0 多种，它们都是通过4 种皂苷元( 大豆精醇a 、 大豆精醇b 、大豆精醇e 和大豆精醇d d m p ) 与6 种糖基【p d 一葡萄糖( g l c ，p - d g l u c o p y r a n o s y 1 ) 、9 一d 一半乳糖( g a l ，旷d g a l a c t o p y r a n o s y l ) 、1 3 - d 一木糖( x y l ，p d x y l o p y r a n o s y l ) 、 a - l 一鼠李糖( r h a ，a - - l r h a m n o p y r a n o s y l ) 、旷l 一阿拉伯糖( a r a , 旷l a r a b i n o p y r a n o s y l ) 和 p _ d 一葡萄糖醛酸( g l c u a ，旷d g l u c o r o n o p y r a n o s y l ) 结合而构成，在目前所有已发现的大 豆皂萤中其皂苷元的c 3 位均连接8 d 葡萄糖醛酸1 5 1 5 2 1 。 大豆皂苷按目前流行的观点来分类，一般可分为a 类大豆皂苷、b 类大豆皂苷、e 类 大豆皂苷和d d m p 类大豆皂营，表卜l 列出了目前文献报道的主要大豆皂苷的组成、分 子量及分子式，图1 一l 给出了大豆皂苷a a 、a b 、b a 、b b 、b b 和p g 的结构式和分子量。 a 类大豆皂苷是以大豆精醇a 为苷元的双糖链皂苷，在c 一3 位和c - 2 2 位各有一个糖基 通过醚键连接到苷元上，在a 类大豆皂苷中又可分为含乙酰基大豆皂苷a 和脱乙酰基大 豆皂蕾a 。在大豆皂苷的提取纯化过程中，如果使用酸或碱性溶剂提取，很容易使a 类 皂苷中糖基上的乙酰基脱落而变为脱乙酰大豆皂苷。 7 浙江大学博十学位论文第一章绪论 s o y a s a p o n i na a ( 1 ) m w 2 1 3 6 5 5 s o y a s a p o n i n a b ( 2 ) m w 2 t 4 3 7 5 s o y a s a p o n i nb a ( 3 ) m w f f i 9 5 9 ，1 hh s o y a s a p o n i nb b ( 4 ) m w = 9 4 3 1 图卜1 人豆皂苷a a ( i ) 、a b ( 2 ) 、b a ( 3 ) 、b b ( 4 ) 、b b 。( 5 ) 和1 3 9 ( 6 ) 的结构及分子量 f i g u r ei - ic h e m i c a ls t r u c t u r e sa n dm o l e c u l a rw e i g h to f s o y a s a p o n i n sa a 0 ) ，a b ( 2 ) ，b a ( 3 ) ，b b