（细胞生物学专业论文）tff3twistnfkb信号通路上游调节机制初探.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 肓订一言8 刖茜芍 材料方法lo 实验结果2 0 讨论一3 0 结j 沧”3 3 四、本研究创新性的自我评价3 4 五、参考文献3 5 六、附录 综j 盎“3 9 在学期间科研成绩4 9 致谢5 0 个人简介5 1 中文论著摘要 t f f 3 - t wis t - n fkb 信号通路上游调节机制初探 目的 肠三叶因子3 ( t r e f o i lf a c t o r3 ，t f f 3 ) 是三叶草因子家族的成员之一，为 一种调节性小肽。我们前期实验数据表明：t f f 3 可以诱导n f kb 激活，伴随ikb 磷酸化。t f f 3 诱导ikb 不完全降解，ikb 的丝氨酸介导磷酸化参与这个过程； t f f 3 诱导n f - kb 同源二聚体p 6 5 p 6 5 瞬时激活，同时调节t w i s t 蛋白表达。 t w i s t 基因是最早在果蝇中发现的一种碱性螺旋一环一螺旋结构的转录因子， 能与转录因子n f kb 相互作用，近期发现t w i s t 作为n f - kb 信号通路的负调控 因子，抑制n f - kb 依赖的转录激活，调节转录。 n f - kb 信号通路的激活，需要其上游调控分子的精准控制，以保证其激活的 特异性调节，实现刺激或组织特异性应答。ikb 激酶复合物( ikbk i n a s e s ) 作 为n f kb 信号通路的上游关键调控分子，对n f kb 的激活起到重要作用，研究 发现：i l 一1 可以激活ikb 激酶2 触发n f kb 信号通路的激活，启动靶基因转录， 引起炎症反应。c h u k l ( c o n s e r v e dh - l hu b i q u i t i u o sk i n a s e l ) 是我们前期筛 选的ikb 上游调控子同型亚基的一个分子片段，研究提示其同型亚基参与n f kb 信号通路调控，新近研究表明其调控对于n f kb 信号通路激活相关的固有免疫和 获得性免疫应答调节起到重要作用。有研究提示它的同型分子受到多个交叉通路 的调节，目前发现丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路中的分子m e k k l 、m e k k 2 、m e k k 3 和n i k 等参与此调节。 丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路是介导细胞外刺激向内转导反应的主要信 号系统，普遍存在于多种生物中。激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路可通过磷 酸化等方式调节转录因子，细胞骨架相关蛋白，酶类等多种底物，参与介导生长、 发育、分化、凋亡等生理过程。 丝裂原活化蛋白上游激酶作为丝裂原活化蛋白激酶信号通路的一个基本成 员，起到传递细胞外信号进而激活细胞内下游通路的关键近受体调控作用。p 6 4 是上游激酶家族新辨认的成员，其所编码的蛋白为s e r t h r 蛋白激酶家族一员， 参与发育相关信号通路，可能在多条炎症，肿瘤信号通路中起到不可缺的重要作 用，并能够参与n f kb 信号通路调节。 我们小组自订期的研究表明：t f f 3 诱导的n f kb 瞬时激活伴随t w i s t 蛋白的 上调表达，e r k 激酶的特异抑制子可以下调t f f 3 诱导的t w i s t 表达。有研究提示， e r k 激酶的激活受到丝裂原活化蛋白上游激酶家族分子的调控，而且该激酶家族 分子参与n f kb 激活调控，但是t f f 3 如何参与此类上游激酶家族成员调节及该 调节应答对n f kb 和丝裂原活化蛋白激酶信号通路的效应及调节机制并不清楚， 本研究意在探讨p 6 4 及c h u k l 在t f f 3 一t w i s t n f kb 信号通路中的作用及其可能 由t w i s t 介导的t f f 3 应答调节机制和t f f 3 诱导n f kb 激活效应。 方法 1 、构建实验相关质粒。 2 、r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 技术检测t f f 3 过表达。 3 、r t p c r 和w e s t e r nb l o t 方法检测t f f 3 凋节的t w i s t ，p 6 4 和c h u k l 表达变化。 4 、体外g s t p u l ld o w n 实验验证p 6 4 与c h u k l 的相互作用关系。 5 、免疫共沉淀验证p 6 4 与c h u k l 相互作用的体内效应。 6 、双荧光素酶报告系统分析t f f 3 对n f kb 启动子活性的调节。 7 、w e s t e r nb l o t 技术结合t w i s t 干扰检测c h u k l 的调节表达。 结果 1 、成功构建了原核表达载体p g e x 一5 x 一卜p 6 4 和真核表达载体p c d n a 3 1 h i s c c h u k l 。 2 、t f f 3 过表达上调t w i s t l ，p 6 4 和c h u k l 转录和蛋白表达水平。 3 、体外g s t - p u lld o w n 实验证实p 6 4 与c h u k l 能够直接作用。 4 、免疫共沉淀实验进一步证实p 6 4 与c h u k l 在体内相互作用，且在t f f 3 高表达 状态下相互作用增强。 5 、双荧光素酶报告系统证实t f f 3 增强n f kb 启动子活性。 6 、r n a 干扰实验证实，阻断t w i s t 表达后，提示c t l u k l 蛋白表达水平上调。 2 结论 实验显示p 6 4 和c h u k l 表达受t f f 3 高表达调控，并可能通过p 6 4 和c h u k l 直 接互作参与t f f 3 - t w i s t n fkb 信号途径调节，t f f 3 调节p 6 4 和c h u k l 发生互作 增强；同时，t f f 3 增强n f - kb 启动子活性；t f f 3 上调的t w i s t 表达可能调节n f kb 活性，t w i s t 的调节作用需要n f kb 上游特异调节子介导来实现。 关键词 p 6 4 ：c h u k l ；t f f 3 ；t w i s t 3 英文论著摘要 u p s t r e a mr e g u l a t o r ym e c h a n i s m o f t f f 3 - - t w i s t - n u c l e a rf a c t o r - k bs i g n a l i n gp a t h w a y o b j e c t i v e i n t e s t i n a lt r e f o i lf a c t o r3 ( t r e f o i lf a c t o r3 ，t f f 3 ) i sam e m b e ro ft h et r e f o i lf a c t o r f a m i l y o u rp r e v i o u sd a t as h o w e dt h a tt f f 3i n d u c e dt h ea c t i v a t i o no fn f r bv i ai k b p h o s p h o r y l a t i o na n dp a r t i a ld e g r a d a t i o n i r d 3 一m e d i a t e dp h o s p h o r y l a t i o no fs e r i n em a y b ei n v o l v e di nt h i s m o d u l a t i o n f u r t h e r ，t f f 3 i n d u c e dt r a n s i e n ta c t i v a t i o no f h o m o d i m e rp 6 5 p 6 5 t w i s tg e n ei sab a s i ch e l i x - - l o o p - h e l i xt r a n s c r i p t i o nf a c t o r , f i r s t l yi d e n t i f i e di n d r o s o p h i l a i ts e r v e sa san e g a t i v er e g u l a t o r yf a c t o ro fn f - k ba n di n h i b i t st h e a c t i v a t i o no fn f 一1 c b n f r d 3s i g n a l i n gp a t h w a ys w i t c h e so no ro f fb yt h er e g u l a t i o no fu p s t r e a m m o d u l a t o r so rc r o s s i n g o v e rm e d i a t o r s i k bk i n a s ec o m p l e xi sa nu p s t r e a mk e y m o d u l a t i n gm o l e c u l eo fn f r d 3s i g n a l i n gp a t h w a y ，p l a y i n g af i n e t o n e dr o l eo f r e g u l a t i o ni nt h ec o n t r o lo fn f r ba c t i v i t y c h u k1 ( c o n s e r v e dh l hu b i q u i t i u o s k i n a s e1 ) i sa ni s o f o r mf r a g m e n to ft h ei r bk e ym o d u l a t o r ，a n dp a r t i c i p a t e si nn f 一1 c b s i g n a l i n gp a t h w a y m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s es i g n a l i n gp a t h w a yr e s p o n s e se x t r a c e l l u l a rs t i m u l i ， u b i q u i t o u s l ye x p r e s s e di nm a n yd i f f e r e n tt i s s u e s m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s i g n a l i n gp a t h w a yw a sr e g u l a t e db ym o d u l a t i n gt h ep h o s p h o r y l a t i o no ft r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ，c y t o s k e l e t o np r o t e i n s ，e n z y m e sa n do t h e rm o r es u b s t r a t e si n v o l v e di nt h e g r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，d i f f e r e n t i a t i o n ，a p o p t o s i s u p s t r e a mm i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s e r v e sa sa ne s s e n t i a lm e m b e ro f m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e s i g n a l i n gp a t h w a y , p l a y i n gac r i t i c a l r o l ei n e x t r a c e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o ni n t oc e l l p 6 4i sa m o n gt h em e m b e r so fu p s t r e a m 4 m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ef a m i l y , s h a r i n g t h ec h a r a c t e ro fs e r t h rp r o t e i n k i n a s e r e c e n ts t u d i e si n d i c a t e di ts e r v e s m u l t i p l e f u n c t i o n si n v o l v e di nt h e d e v e l o p m e n t ，i n f l a m m a t i o na n dc a n c e rs i g n a l i n gp a t h w a y , b e s i d e si t sp a r t i c i p a t i n gi n r e g u l a t i o no f n f k bs i g n a l i n gp a t h w a y o u rp r e v i o u ss t u d i e sh a v es h o w nt h a tt f f 3 - i n d u c e dt r a n s i e n ta c t i v a t i o no fn f k b l e dt ot h ei n c r e a s eo ft w i s tp r o t e i n ，e r kk i n a s es p e c i f i ci n h i b i t o rc a nr e d u c et h e t f f 3 - i n d u c e dt w i s te x p r e s s i o n s t u d i e ss h o w e dt h a te r kk i n a s ew a sa c t i v a t e db yt h e u p s t r e a mm i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，a n dt h e ya r ea l s om e d i a t o r s i nn f - k b a c t i v a t i o n b u tw i t ht h et f f 3o v e r - e x p r e s s i o n ，t h er o l eo fu p s t r e a mm i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e si n t h em o d u l a t i o no fn f - k ba n dt h em e c h a n i s mo ft h e i rs i g n a l i n g t r a n s d u c t i o ni ss t i l lo p e n i n gq u e s t i o n t h i ss t u d ya i m e dt o i n v e s t i g a t eu p s t r e a m p 6 4 c h u k lm o d u l a t i n gm e c h a n i s mi nt f f 3 - t w i s t - - n f r bs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o na n d p o s s i b l em o d u l a t i o nb yt w i s t m e t h o d s 1 e x p e r i m e n t r e l a t e dp l a s m i d sw e r ec o n s t r u c t e d 2 t h eo v e r e x p r e s s i o no ft f f 3w a sd e t e c t e dw i t hr t - p c ra n dw e s t e r nb l o ta s s a y 3 t h ee x p r e s s i o no ft w i s tl ，p 6 4a n dc h u k ib yt f f 3w e r ed e t e r m i n e dw i t hr t - p c r a n a l y s i sa n dw e s t e r nb l o ta s s a y 4 g s tp u l l - d o w na s s a yf o r t h ed i r e c tb i n d i n gd e t e c t i o no f p 6 4w i t hc h u k 1w a s e m p l o y e d 5 i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a yf o rt h eb i n d i n g d e t e c t i o no fp 6 4w i t hc h u k1w a s c o n d u c t e di nv i v o 6 d u a l l u c i f e r a s er e p o r t e rs y s t e ma s s a yw a sp e r f o r m a n c e dt od e t e r m i n a t et h e a c t i v a t i o no fn f - r d 3p r o m o t e rb yt f f 3 7 t h ee x p r e s s i o no fc h u k lw a sd e t e c t e db yw e s t e r nb l o ta f t e rt w i s ti n t e r f e r e n c e r e s u l t s 1 p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp g e x 一5 x 一1 一p 6 4a n de u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r p c d n a 3 1 h i sc c h u k la r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d 5 2 t w i s t ，p 6 4a n dc h u k 1a r eu p - r e g u l a t e dw i t ht f f 3o v e r - e x p r e s s i o nb yr t - p c ra n d w e s t e r nb l o ta s s a y 3 i nv i t r o ，p 6 4a n dc h u k la l ed i r e c t l yi n t e r a c t e d ，w h i c hw a sd e c t e db yg s t - p u l l d o w na s s a y 4 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np 6 4a n dc h u k1w a si nv i v oc o n f i r m e db yi m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y ，a n dt h ei n t e r a c t i o ni se n h a n c e db yt f f 3 5 t h ea c t i v i t yo f n f k bp r o m o t e rw a se n h a n c e db yt f f 3w i t he m p l o y i n g d u a l - l u c i f e r a s er e p o r t e rs y s t e ma s s a y 6 r n ai n t e r f e r e n c ee x p e r i m e n t sc o n f i r m e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fc h u k1i s u p r e g u l a t i o na f t e rt w i s ts i l e n c i n g c o n c l u s i o n t h ee x p r e s s i o no fp 6 4a n dc h u k la r ei n c r e a s e db yt f f 3 t h e s et w om o l e c u l e s p a r t i c i p a t ei nt f f 3 - t w i s t - n f k bs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n ，a n dp 6 4a n dc h u k la r e d i r e c t l yi n t e r a c t e di ni e c ，m o r e o v e r , t h eb i n d i n go fp 6 4w i t hc h u k 1e n h a n c e db y u p e x p r e s s i o no ft f f 3 m e a n w h i l e ，t f f 3e n h a n c e sn f 一1 ( bp r o m o t e ra c t i v i t y ，a n dt h e e x p r e s s i o no f t w i s t d a t ap r o p o s et h em e c h a n i s mb yw h i c ht h eu p s t r e a mm o l e c u l eo f n f - r d 3m a yp r o b a b l yb em o d u l a t e dv i at f f 3 一t w i s t p 6 4 ，c h u k l ，t f f 3 ，t w i s t k e yw o r d s 6 英文缩略语 7 论文 t f f 3 - t wis t - n fkb 信号通路上游调节机制的初探 日i j吾 t f f s 家族是一组最初在胃肠道中被发现的小分子多肽。哺乳动物t f f 家族有 三个成员：t f f l ( p s 2 ) ，t f f 2 ( 解痉肽) ，t f f 3 ( 肠三叶因子) 。该家族包含特异的 富含半胱氨酸的三叶草区域，这种结构确保其在肠道中发挥活性，不受消化酶和 p 1 变化的影响。t f f s 家族的一个重要成员t f f 3 是包含5 9 个氨基酸的分泌型短肽， 主要在小肠和结肠中表达，由杯状细胞分泌。 t f f 3 的主要生理作用是保护和重建肠道上皮，维持肠上皮细胞屏障。t f f 3 在肿瘤发生过程中参与细胞迁移、结肠癌细胞生长、细胞问粘连改变，与肿瘤细 胞的浸润及转移相关。t f f 3 激活肠上皮细胞n f kb ，从而防止肠上皮细胞的凋亡 堙1 。t f f 3 诱导n f - kb 的激活，其t j l sj j 不清楚，我们的报道指出：ikb 磷酸化并 降解介导这一过程。但发现t f f 3 诱导的ikb 降解是不完全的，ikb 的丝氨酸介 导磷酸化参与这个过程；t f f 3 诱导n f kb 同源二聚体p 6 5 p 6 5 的瞬时激活口1 。并 且，我们发现t f f 3 诱导n f kb 同源二聚体p 6 5 p 6 5 的瞬时激活，是由t w i s t 介 导发生。 t w i s t 基因是最早在果蝇中发现的一种碱性螺旋一环一螺旋结构的转录因子， 主要表达于胎盘、胚胎中胚层和成人的某些中胚层来源的未分化组织，在幼稚中 胚层细胞和中胚层起源器官中表达最多，而在出生后降至低水平h 1 。t w i s t 基因 57 端调节区域的启动子序列上游有n f - kb 结合位点，能与转录因子n f kb 相 互作用，t w i s t 是n f - kb 信号通路的一个负调控因子，抑制n f kb 依赖的转录 激活，调节转录嵋1 。 转录因子n f kb 普遍存在于真核细胞中，通常以j 源或异源二聚体的形式存 在，该家族主要由5 个r e l 蚩白家族成员组成：n f kb 1 ( p 5 0 p 1 0 5 ) 、n f kb 2 ( p 5 2 p 1 0 0 ) 、r e l a ( p 6 5 ) 、r e l b 和c r e l 。哺乳动物细胞中最常见的是p 6 5 与p 5 0 结合形成的p 6 5 p 5 0 异二聚体。静止状态下，n f - kb 分子存在于在胞质中，并因 8 与其抑制物ikb 家族成员结合而处于非活性状态，并且ikb 蛋白能够掩盖 n f - kb 上的核定位基序( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns e q u e n c e ，n l s ) ，阻止其进 入细胞核1 。许多胞外刺激都可以诱导ikb 激酶的激活，从而导致ikb s 蛋白磷 酸化，泛素化降解，n f kb 二聚体得到释放，并转移到绌胞核中与目的基因结合， 以促进靶基因的转录。n f kb 信号通路的激活，需要其上游调控分子的调节。ikb 激酶复合物( ikbk i n a s e s ) 作为n f kb 信号通路的关键上游分子，对n f - kb 的激活起到十分重要的作用。 在i l - 1 、l p s 诱导的应答中，ikb 激酶是n f - kb 信号转导途径关键成员分子之 一，1 9 9 6 年作为一种能够磷酸化ikbq 第3 2 、3 6 位上丝氨酸的高分子量复合物被 纯化出来盯1 ；该激酶复合物有多种亚基同型体，依据细胞类型、刺激类型形成不 同组成构成参与应答，包涵t c f l 6 、i k k 、i k k 2 及n e m o 等。 ikb 激酶高度同源，皆具有n 端激酶结构域( k i n a s ed o m a i n ，k d ) 、亮氨酸拉 链( 1 e u c i n ez i p p e r ，l z ) 、螺旋一环一螺旋( h e li x l o o p h e l i x ，h l h ) 和富含s e r 的c 术端。n 端激酶区域含有m a p k i n a s e k i n a s 激活环( t 环) 结构 ( s e r - 一x a a x a a x a a s e r ，x a a 为任意氨基酸) ，包含有两个保守的丝氨酸位点， 这种结构类似于m e k i 矛i m e k 2 的磷酸化位点陋1 。亮氨酸拉链结构；f i t l l t t 结构是t c f l 6 和i k k 2 等形成同源和异源二聚体的基础。n e m o 由4 1 9 个氨基酸残基组成，相对分子 质量约为4 8 k d a 。n e m o 不含催化激酶结构域，但能选择性地和i k k 2 结合。在经典白 细胞的炎性应答中，n e m o 对ikb 激酶复合物的形成及i k k 2 和n f kb 的活化是必须 的引。 c h u k l ( c o n s e r v e dh - l - hu b i q u i t i u o sk i n a s e l ) 是我们前期筛选的遍在h l h 保守激酶1 同型亚基的一个分子片段。我们小组前期报道了ikbq 以快速部分降 解方式参与t f f 3 的瞬时n f - kb 二聚体激活，我们尝试明确其上游调节分子的作 用。目前有研究指出，ikb 激酶的调控可能受到其上游激酶的修饰，丝裂原活化 蛋白激酶信号转导通路的某些成员参与了这个过程n 0 1 2 1 。 丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路是介导细胞应答m o t o g e n 的重要信号途 径，普遍存在于多种生物中。其信号通路一般由丝裂原活化蛋白3 激酶磷酸化调 节丝裂原活化蛋白2 激酶，最后激活丝裂原活化蛋白激酶的方式发挥作用。激活 9 的丝裂原活化蛋白激酶可通过磷酸化等方式调节转录因子，细胞骨架相关蛋白， 酶类等多种底物，参与介导生长、发育、分化、凋亡等生理过程n 引。 丝裂原活化蛋白上游激酶作为丝裂原活化蛋白激酶信号通路的一个基本成 员，起到传递细胞外信号进而激活下游通路的重要作用n 卜峭1 。许多新的成员不断 被辨认，m e k k l 、m e k k 2 、m e k k 3 、p 6 4 和n i k 已经被证实在体外具有磷酸化ikb 激酶丝氨酸残基的作用，并且其过表达会引起n f - kb 的激活，p 6 4 是丝裂原活化 蛋白上游激酶家族新成员之一，其所编码的蛋白为s e r t h r 蛋白激酶家族的一员。 p 6 4 最初被发现在参与发育相关信号通路中发挥作用n7 。，目b u 下q - 多报道已证实p 6 4 在多条炎症、肿瘤信号通路中起到不可或缺的重要作用 1 8 1 9 o 我们小组前期的研究表明：t f f 3 诱导的n f kb 瞬时激活导致t w i s t 蛋白的 产生，e r k 激酶的特异抑制子能降低t f f 3 诱导的t w i s t 表达。有研究也显示，e r k 激酶的激活受到丝裂原活化蛋白上游激酶家族分子的调控呦1 ，而且该家族分子在 n f kb 激活中有重要作用n 0 比1 ，但是在t f f 3 作用下，丝裂原活化蛋白上游激酶 在应答t f f 3 诱导的n f - kb 启动子应答中作用和其调节机制并不清楚，本研究揭 示了p 6 4 与n f kb 信号通路上游调控分子c h u k l 的相互作用，并初步明确t f f 3 高表达对p 6 4 和c h u k l 的效应及其在t f f 3 一t w i s t n fkb 信号通路中的作用和可能 的调节机制。 材料方法 一、材料与试剂 ( 一) 菌株，表达载体和细胞系 1 、宿主菌大肠杆菌( e c o l i ) d h 5q ，b l 2 1 由本研究室保存。 2 、原核表达载体p g e x 一5 x l 购自a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e e h ：真核表达 质粒p c d n a 3 1 h i sc 购自i n v i t r o g e n ：p c d n a 3 卜p 6 4 质粒由j i a n h u ay a n g 教授 惠赠；p c m v f l a g t f f 3 由d r h u b e r 教授惠赠；p s i r e n r e t r o q 系列载体由j u n n i n o m i y a t s u j i 教授惠赠。 3 、i e c 细胞和人胚肾1 t e k 2 9 3 细胞由本研究室保存。 ( 二) 主要抗体及试剂 1 0 l 、抗体 鼠抗p 6 4 单克隆抗体购自s a n t a 公司，t w i s t 抗体购白a b c a m 公司；c h u k l 多 克隆抗体购自c s t 公司；h i s 和f l a g 标签抗体购白南京金斯瑞公司；b a c t i n 单 克隆抗体，h r p 标记山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗购自北京鼎国公司。 2 、主要实验试剂 r n a 提取试剂盒( t a k a r a 公司) ；m m i 。v 反转录酶试剂( p r o m e g a 公司) ；p f x 高保真d n a 聚合酶( i n v i t r o g e n 公司) ；t a qd n a 聚合酶、d n t p 、限制性内切酶和 t 4d n a 连接酶( t a k a r a 公司) ；凝胶回收纯化试剂盒( a x y g e n 公司) ；质粒提取 试剂盒( o m e g a 公司) ；脂质体转染试剂l i p o f e c t a m i n t m2 0 0 0 ( i n v i t r o g e n 公司) ； t n tq u i c kc o u p l e dt r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t i o ns y s t e m sk i t ( p r o m e g a 公司) ； p r o t e i nas e p h a r o s ec l4 b ，g s t p r o t e i nas e p h a r o s eb e a d s ( g eh e a l t h c a r e b i o s c i e n c e sa b 公司) ；d n a 分子量标准m a r k e r ( t a k a r a 公司) ：蛋白质分子量 标准m a r k e r ( t a k a r a 公司) ；p v d f 膜( m i l l i p o r e 公司) ；琼脂糖( b b i 公司) ；琼 脂粉、胰化蛋白胨和酵母提取物( o x o i d 公司) ；甘氨酸、t r i s 碱和十二烷基磺 酸钠( 北京鼎图) ；d u l b e c c o sm m o d i f i e de a g l em e d i u m ( d m e m ) 和r p m im e d i u m 1 6 4 0 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清( g i b c ob r l 公司) ；d m s o ( b b i 公司) ；牛血清 白蛋白( b s a ) ( 上海生物工程公司) ；e c l 或e c l p u l sw e s t e r nb l o t t i n gd e t e c t i o n s y s t e m ( a m e r s h a mb i o s c i e n e e s 公司) 。氯化钠、盐酸、冰乙酸、甲醇、无水乙 醇和异丙醇等分析纯试剂均购自标注的不同注册化学试剂公司。 ( 三) 主要仪器设备 台式高速低温离心机( s o r v a l lp r i m o r 型) ；台式高速离心机( e p p e n d o r f5 4 1 5 型) ；一8 0 。c 超低温冰箱( 海尔公司) ；紫外分光光度计( 日本岛津7 5 0 0 ) ；酶标仪 ( 美国b i o r o d ) ；p c r 扩增仪( b i o m e t r at 1 t h e r m o c y c l e r ) ；聚丙烯酰胺凝胶电 泳系统( b i o r a d 公司) ；水平板凝胶电泳系统( 美国b i o r o d ) ；凝胶成像系统( 上 海天能，t a n o n 一3 5 0 0 ) ；l u m a tl b9 5 0 7 化学发光仪( 德国b e r t h o l dt e c h n o l o g i e s 公司) ；水平摇床脱色摇床( 北京六一) ；恒温振荡摇床( 哈尔滨东联电子技术丌 发有限公司) ；超净工作台( 苏净集团安泰公司) ；水浴箱( 上海天平仪器厂) ；细 菌恒温培养箱( m m m 公司) ；c 0 2 孵箱( t h e r m o ) ；倒置显微镜( r 本0 1 y m p u s ) ；荧 光显微镜( o l y m p u s l x 7 0 ) 、多通道共聚焦激光扫描显微镜( 德国l e i c at c s s p 2 ) ； 微量加样器( g i1 s o n ) 等。 二、实验方法 ( 一) 细胞培养 i e c 细胞培养于含l o d 、牛血清的r p m i1 6 4 0 培养基，h e k 2 9 3 细胞养于含1 0 小牛血清的d m e m 培养基，于5 c 0 ：、3 7 条件孵箱中培养。 ( - - ) 原核表达载体p g e x 一5 x 一卜p 6 4 的构建 1 、p 6 4 基因的扩增 根据的p 6 4 基因信息及预测，使用p r i m e r 5 0 设计并合成引物，上游序列引 入e c o ri 酶切位点，上游引物p 1 ：5 一嬲a a t t c c c g c g a g g g a t c a t g t c t a c 一3 ( 斜 体部分为保护碱基，划线部分为酶切位点) 。下游序列引入x h oi 酶切位点，下游 弓j 物p 2 ：5 一7 f 7 c t c g a g t c a t g a a g t g c c t t g t c g t 3 。 以提取的p c d n a 3 卜p 6 4 质粒为模板，利用上述引物进行p c r 扩增p 6 4 ，反应 体系( 2 5p1 ) ： 质粒模板( 1 0 n g l a1 ) 1 0 p c rb u f f e r d n t pm i x t u r e ( 各l o m m ) 上游引物( 1 0um ) 下游引物( 1 0u1 ) p f x 酶 1 5ul 2 5u1 lu1 lul 1ul 0 2ul 灭菌蒸馏水 反应条件： 9 4 ，2 m i n - 9 4o c ，2 0 s - - 5 5 ，3 0 s - - 6 8 ，2 m i n3 0 c y c l e s - - 6 8 ，l o m i n 一4 一反应结束。 扩增产物经l 琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，用胶回收试剂盒纯化，并回收 1 2 目的基因片段。 2 、重组质粒的构建及鉴定 纯化后的p 6 4 片段和p g e x 一5 x 一1 载体与e c o ri 和x h o i 孵育，3 7 。c 酶切过夜， 体系如下： p 6 4p g e x 5 x 1 双酶切产物经1 琼脂糖凝胶电泳，双酶切后的凝胶产物用胶回收试剂盒分 别纯化回收，在3 7 。c ，t 4 连接酶作用下，以纯化后的p 6 4 片段与p g e x 一5 x 一1 载体 片段摩尔浓度比为3 ：1 进行过夜连接反应，连接产物转化感受念的e c o l yd h 5q ， 在含有氨苄霉素抗性的l b 平板上筛选克隆，挑取阳性克隆进行扩增，质粒提取， 双酶切鉴定，最后将阳性克隆进行测序鉴定。 3 、重组质粒的诱导表达及纯化 将测序鉴定正确的重组质粒转化到b l 2 1 表达菌种中，挑取单克隆，经菌液 p c r 鉴定正确后，进行诱导表达。 将菌液以1 ：1 0 0 0 接种到含有氨苄霉素抗性的l b 液体培养基中，3 7 。c 振摇培 养过夜，第二天再以1 ：1 0 0 的比例接种到新鲜培养基中，培养至0 d 值约为0 6 时， 分别加入终浓度为o 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 、1 2 、1 4 、1 6 、2 o m m o l l 的i p t g ， 3 0 下继续振摇培养3 h ，取l m 菌液离心，收集菌体，用5 0u12 蛋白l o a d i n g 吹打裂解菌体，l o o 加热5 m i n ，1 0 0 0 0 9 离心5 m i l 3 ，取l oi ll 上清进行聚丙烯凝 胶电泳( s d s p a g e ) 鉴定诱导表达产物。 确定好i p t g 的浓度后，再以此浓度在3 0 下，诱导2 h ，3 h ，4 h ，5 h ，确定 最佳诱导时间，诱导结果由s d s p a g e 鉴定。 1 3 确定好最适的i p t g 浓度和最佳诱导时间后，批量诱导g s t p 6 4 蛋白，收集菌 体，每l o o m l 菌液加入1 5 m l 细菌裂解液，超声破碎后收集上清液，加入处理好 的g s tb e a d s ，4 。c 下，1 8 r p m 混合旋转3 h ，5 0 0 9 离心收集结合后的b e a d s ，加入 5 0 0uln p 4 0b u f f e r ，4 。c 下，1 8 r p m 混合旋转l o m i n 、洗涤b e a d s 以去除非特异 性结合，5 0 0 9 离心收集b e a d s ，重复2 次。取1 0h1 结合后的b e a d s ，进行s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 鉴定。鉴定后，分装g s t p 6 4 纯化蛋白、放入- 8 0 。c 保存。 ( 三) 真核表达质粒p c d n a 3 1 h i sc - c h u k l 的构建 1 、r n a 的提取 将i e c 细胞接种子2 4 孔板，次同细胞密度达到9 0 左右后，吸弃培养基， 用冷的p b s 清洗一遍，在培养板中直接加入2 0 0u1t r i