（细胞生物学专业论文）苹果果胶寡糖的分离制备及其活性研究.pdf

苹果果胶寡糖的分离制备及其活性研究 摘要 本文以苹果皮为原料提取苹果果胶多糖，对酶解后产生的果胶寡糖进行了分离纯化 及制备，对得到的寡聚半乳糖醛酸进行e s i m s 分析，并对其活性进行了研究，主要结 果如下： 1 苹果果胶多糖的提取和理化性质的测定 苹果皮经水提取、醇沉、s a v a g e 脱蛋白及透析，冷冻干燥得苹果果胶多糖，得率为 1 5 8 ；气相色谱测定结果表明苹果果胶主要由g a l a 、g a l 、r h a 、a r a 、g l c 、x y l 六种 单糖组成，其相应摩尔比为7 8 5 4 ：6 2 9 ：4 7 1 ：6 2 1 ：2 2 7 ：1 9 8 ；苯酚硫酸法测得其总糖含量 为9 1 7 5 ；考马斯亮蓝法测得其蛋白含量2 3 3 ；间羟联苯法测得其糖醛酸含量为 7 6 4 ；高效液相色谱法测得果胶甲酯化度为8 0 7 ，乙酰化度为1 0 6 。 2 苹果果胶寡糖混合物的制备和分离纯化 苹果果胶多糖经脱脂化得到果胶酸，以果胶酸为底物通过酶解得到聚合度为2 8 的 果胶寡糖混合物，运用阴离子交换柱层析对果胶寡糖混合物进行了分离制备。结果表明， 以果胶酸为底物在4 0 。c 用果胶酶( e c 3 2 1 1 5 ) 酶解反应6 0m i n 为最佳酶解条件得到 果胶寡糖混合物，经分离制备得到聚合度为2 - - , 5 的寡聚半乳糖醛酸单体，总得率为3 7 ， t l c 和e s i m s 检测其纯度为9 2 以上。 3 寡聚半乳糖醛酸的e s i m s 分析 在对分离后的寡聚半乳糖醛酸进行e s l 分析的过程中，我们发现寡聚半乳糖醛酸在 离子化过程中易形成一种二聚体，通过与寡聚半乳糖醛酸标准的e s i m s 分析的结果作对 比，表明酸性寡糖在离子化过程中都能形成二聚体；二聚体形成后很难解聚，这表现在 对二聚体进行m s 2 时，所需要的碰撞能量大于糖苷键断裂所需要的能量。将寡聚半乳糖 醛酸还原后的结果表明，二聚体是以非共价键( 氢键) 结合而成。 4 寡聚半乳糖醛酸的活性分析 本实验用m t t 法研究寡聚半乳糖醛酸及其与化疗药物5 - f u 联合用药后对人结肠癌 细胞( s w 二6 2 0 ) 的影响，结果显示，寡聚半乳糖醛酸与肿瘤化疗药物具有协同效应的倾 向。利用f c m 分析测定细胞周期，结果表明，用寡聚半乳糖醛酸处理后d n a 合成期( s 期) 细胞数明显增加，说明寡聚半乳糖醛酸具有显著地促进人结肠癌细胞( s w - 6 2 0 ) 进 入s 期的趋势，使细胞周期阻滞于s 期，阻断癌细胞由s 期向g j m 期的进程，阻滞细 胞的有丝分裂。 关键词 果胶多糖，寡聚半乳糖醛酸，分离纯化，e s i m s ，生物活性 s t u d i e so np u r i f i c a t i o n ，p r e p a r a t i o na n da c t i v i t i e sa s s a yo fp e c t i c o i i g o s a c c h a r i d e sf r o ma p p l ep e e l a b s t r a c t i nt t d sp a p e r , p e c t i no l i g o s a c c h a r i d e sh y d r o l y z e db yp e c t i n a s ef r o mp e c t i ne x t r a c t e df r o m a p p l ep e e la sam a t e r i a lh a db e e ni s o l a t e da n dp u r i f i e d ，t h eo b t a i n e do l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d w a sa n a l y z e db ye l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s s ( e s i m s ) ，a n di t sb i o l o g i c a la c t i v i t yh a db e e n s t u d i e d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 e x t r a c t i o na n d p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fa p p l ep e c t i n a p p l ep e c t i np o l y s a c c h a r i d e sw e r eo b t a i n e db ya c i d - e x t r a c t e d ，a l c o h o lp r e c i p i t a t i o n , a n d d e p r o t e i n a z a t i o nf r o ma p p l ep e e l t h er a wy i e l dw a s15 8 g a sc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s s h o w e dt h a ti tm a i n l yc o m p o s e do fg a l a ，g a l ，r h a , a r a , g l c ，x y lw i t ham o l a rr a t i oo f 7 8 5 4 ：6 2 9 ：4 7 1 ：6 2 1 ：2 2 7 ：1 9 8 ；p h e n o l - s u l p h u r i ca c i da n a l y s i sr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et o t a l s u g a rc o n t e n to fp e c t i nw a s9 1 7 5 ；t h ep r o t e i nc o n t e n tw a s2 3 3 ( b r a d f o r dm e t h o d ) ，i t s u r o n i ca c i dc o n t e n tw a s7 6 4 ( i n - h y d r o x y d i p h e n y lm e t h o d ) ；h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r e p h ya n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ed e g r e eo f m e t h y l a t i o n ( d m ) w a s8 0 7 ，t h ed e g r e e o fa c e t y l a t i o n ( d a c ) w a s10 6 2 p r e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fa p p l ep e c t i no l i g o s a c c h a r i d e s al o wd e g r e eo fe s t e r i f i c a t i o np e c t i ca c i dw a so b t a i n e db ys o d i u mh y d r o x i d et r e a t m e n to f a p p l ep e c t i n p e c t i c a c i dw a s d i g e s t e d w i t ha c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p e c t i n a s e ( e c 3 2 1 1 5 ) t oo b t a i nam i x t u r eo fo l i g o g a l a ( d p 2 - - 8 ) t h em i x t u r ew a ss e p a r a t e db ya l o w - p r e s s u r ei o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yt oo b t a i np u r e o l i g o g a l a t h ed e g r a d a t i o n c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e da se n z y m a t i cr e a c t i o na t4 0 cf o r11 l ，o l i g o g a l aw a so b t a i n e d ( y i e l do f 3 7 ) w i t ht h er a n g eo f d p2 - 5t h r o u g hs e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o na n ds h o wp u r i t y o v e r9 2 a n a l y z e db yt l ca n de s i - m s 3 e s i m sa n a l y s i so fo l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d i nt h ee s i m s a n a l y s i sp r o c e s s f o r o l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d ，w e f o u n dt h a t o l i g o g a l a c t u r o n i ca c i dm o n o m e rw a se a s i l yt of o r mad i m m e ri nt h ep r o c e s so fi o n i z a t i o n ， c o m p a r e dw i t ho l i g o g a l a c t u r o n i ca c i ds t a n d a r d ，t h er e s u l t so fe s i m sa n a l y s i ss h o wt h a tt h e d i m m e rw h i c hf o r m e di nt h ei o n i z a t i o np r o c e s se x i s ti nt h ea n a l y s i so fa c i d i co l i g o s a c c h a r i d e s i t h ed i m m e rf o r m a t i o ni sm o d e r a t e l ys t a b l e ，w h i c hp e r f o r m e dt h a tt h ec o l l i s i o ne n e r g y r e q u i r e di sg r e a t e rt h a nt h ee n e r g yn e e d e dt ob r e a kd o w nt h eg l y c o s i d i cb o n di nt h em s 2 a n a l y s i sp r o c e s s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i m m e rw a s c o m b i n e db yan o n - c o v a l e n tb o n d ( h y d r o g e nb o n d i n g ) a f t e rr e d u c e db yn a b h 4 4 b i o l o g i c a la c t i v i t i e sa s s a yo fo l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d t h em t tm e t h o dw a su s e df o rs t u d y i n gt h ee f f e c to fo l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d ，5 - f u ，a n d t h e i rc o m b i n a t i o no nt h e g r o w t h o fs w - 6 2 0c e l ll i n e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t o l i g o g a l a c t u r o n i ca c i da n dc a n c e rc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g s ( 5 - f u ) h a ds y n e r g i e st e n d e n c i e s t h ec e l lc y c l em e a s u r e da n da n a l y z e db yf c m ，r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed n as y n t h e s i s p h a s e ( sp h a s e ) c e l l si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rt h eo l i g o g a l a c t u r o n i ca c i dt r e a t m e n t ，w h i c h i n d i c a t i n go l i g o g a l a c t u r o n i ca c i dh a dc o n t r i b u t e dt os i g n i f i c a n t l yp r o m o t i n gs w - 6 2 0c e l ll i n e t oe n t e rsp h a s e ，i tc a nm a k et h ec e l lc y c l ea r r e s ti nsp h a s e ，b l o c kt h ep r o c e s so fc e l l sf r o ms p h a s et og 2 mp h a s e ，a n db l o c k c e l lm i t o s i s k e y w o r d s a p p l ep e c t i n ，o l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，e s i - m s ，b i o l o g i c a la c t i v i t y 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：猛选。 指导教师签名：壹粥 年 月 日 冽d 年月b 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ，氛f 学位论文作者签名：侮狻 沙f 9 年6 月，乡h 西北大学硕士论文 1 1 果胶多糖研究概述 第一章绪论 果胶多糖是一种多糖类高分子化合物，天然果胶是以原果胶、果胶、果胶酸的形 态广泛分布于高等植物的根、茎、叶及果实的细胞初生壁和细胞间层中，在初生壁中与 不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，把植物组 织紧紧的黏结在一起，使细胞组织稳固，表现出固有的形态。果胶对细胞组织起着软化 和粘合作用，同时也是植物抵御病原体微生物入侵的天然屏障【2 】。 1 1 1 果胶多糖的化学结构 果胶多糖是一类结构复杂的酸性杂多糖，果胶的分子结构由光滑区和毛发区组成【3 】。 其中光滑区是由供( 1 呻4 ) d 半乳糖醛酸组成的半乳糖醛酸聚糖( h o m o g a l a c t u r o n a n ，i q g a ) 所形成的主链，h g a 结构占到果胶分子结构的6 5 以上。其结构如图1 1 所示，糖链分 子中部分半乳糖醛酸残基的c 6 上被甲酯化，部分半乳糖醛酸残基的在0 2 ，0 3 处发生 乙酰化反应。毛发区包括鼠李半乳糖醛酸聚糖i ( r h a m n o g a l a c t u r o n a n s ，r g - i ) 和鼠 y le s t e r s 图1 1 半乳糖醛酸聚糖的基本结构 f i g l t h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fh o m o g a l a c t u r o n a n ( h g a ) 1 第一章绪论 李半乳糖醛酸聚糖i i ( r h a m n o g a l a c t u r o n a n s ，r g i i ) 两个结构区域，其中r g - i 的主链是 由一种重复的二糖结构卜4 ) 一a - d g a l p a - ( 1 ，2 ) l r h a p - ( 1 一 组成的，线性或带有分支 结构的弘l a r a f 和伊d g a l p 的残基侧链构成侧链【4 1 。r g i i 与r g i 的主链结构不同， 它是由1 ，4 连接的o t - d g a l p a 残基构成主链，已确认四种支链结构。两种双糖残基侧 链结合于g a l p a 的c 3 位，另外两种寡糖残基侧链结合于g a l p a 的c 2 位5 一。 每种果胶多糖随植物来源、组织以及发育阶段等的不同，其侧链中残基的种类、数 目和连接方式以及其它取代基存在的情况都存在着较大的变化，这些都体现出果胶多糖 在结构上的高度复杂性。 1 1 2 果胶多糖的理化性质 果胶多糖为粉末状，色泽从乳白色到淡黄褐色，根据原料、生产工艺各不相同，颜 色也各不相同，有非常好的特殊水果香味，无异味、无固定熔点和溶解度，不溶于乙醇、 甲醇等有机溶剂中，呈微酸性【7 8 】。 果胶多糖是一种高分子化合物，平均分子量介于2 0 0 0 0 - 4 0 0 0 0 0 之间，存在于植物 体内的果胶一般有原果胶、果胶及果胶酸这三种存在形式。其中，果胶酸能溶于水，原 果胶不溶于水，但可在酸、碱、盐等化学试剂的作用下，水解成水溶性果胶，而果胶分 为水溶性和水不溶性两种，但水不溶性果胶可溶于六偏磷酸钠溶液或盐酸溶液中，按照 酯化度的不同，通常把酯化度 5 0 ( 甲氧基含量 7 ) 的果胶称为高酯果胶，把酯化度 5 0 ( 甲氧基含量 7 ) 的果胶称为低酯果胶【9 1 ，酯化度的高低对果胶的凝胶强度和溶解 度有很大的影响，果胶及果胶酸在水中的溶解度随着果胶链长的缩短而增加，在一定程 度上还随着酯化侧基的增加而增加。 目前，用于生产商品果胶的原料主要是柑橘皮( 含量3 0 ) 、柠檬皮( 含量2 5 ) 及苹 果皮( 含量1 5 ) 。此外，甜菜废粕、向日葵盘、芒果渣等中的含量也比较丰富，也可作 为生产果胶多糖的原料。由于原料的种类、生长期、采割期、保存时间及提取方法等因 素的影响，果胶的自身组成和理化性质也会有很大的差异【1 0 , 1 1 , 1 2 】。 1 1 3 果胶多糖的提取工艺 由于自然界天然的果胶大多是以原果胶形式存在于高等植物细胞壁中，而原果胶是 不溶于水的，但可在酸、碱、盐等化学试剂及酶的作用下，水解转变成水溶性果胶，因 而果胶的提取是一个不溶性果胶转化为可溶性果胶和可溶性果胶向液相转移的过程 【1 3 ，1 4 】 o 2 西北大学硕士论文 目前果胶多糖的提取方法主要有：酸提取法、离子交换树脂提取法、微生物法、微 波萃取法和草酸铵、e d t a 鳌合钙离子提取法。国内多采用酸解法，国外这几种方法都 有使用。 1 酸提取法这是工业生产果胶最普遍的方法。酸解一醇沉提取果胶的技术早在 1 9 2 5 年就有报道。根据在加热条件下，果胶在稀酸中可转变为水溶性果胶的原理，将原 料粉碎、漂洗后加入一定料液比的水，用酸将溶液p h 调至2 0 左右，在8 0 - - 9 0 c 范 围内加热提取一段时间，使大部分果胶溶解从而抽提出来，其中所用的酸多是硫酸、盐 酸、磷酸等无机酸。 目前，国外在柑橘、苹果果胶多糖的生产中主要采用酸解提取技术，国内在酸解提 取果胶的技术方面也做了大量的研究工作。张鸿发等【1 5 悃盐酸提取、乙醇沉淀的方法从 柑橘皮中提取果胶多糖，结果表明，在p h1 5 ，温度8 0 c ，时间2h 条件下果胶提取率 达到1 3 8 8 ，该方法操作简单、生产成本低、适用性强。但在酸提取过程中存在一些 难于避免的缺点，如果胶多糖分子易发生局部水解，导致果胶分子量降低，从而影响果 胶的产率和质量，同时提取的温度、时间、料液比、p h 、酸的种类等因素在不同工艺中 变化较大。 2 离子交换树脂提取法据美国专利报道，用离子交换树脂法提取果胶，果胶得率 及胶凝度比酸法提取的高得多。张燕等【硒1 用离子交换树脂法提取橘皮中果胶时，在酸提 取液中添加离子交换树脂改进传统提取果胶的方法，好于常规不加离子交换树脂的工 艺，并且酯化度达到7 4 6 ，比常规法提高7 5 。取得了较理想的效果。但该法生产成 本高，目前生产中使用较少。 3 微生物法微生物法提取果胶是借助于微生物分泌的酶将果胶提取出来。阪井拓夫 等【1 7 】经试验发现，帚状丝抱酵母及其变异株能从植物组织中分离出果胶多糖。用微生物 发酵法具有萃取的果胶分子量大，品质佳，萃取液中果皮不需破碎，和进行热、酸处理， 萃取完全等优点，但该法要求的工艺条件较严格。 4 草酸铵、e d t a 鳌合钙离子提取法果胶多糖通常是以部分甲酯化的多聚半乳糖醛 酸的钙盐或镁盐的形式存在，用草酸铵作萃取剂提取果胶多糖，可以将水不溶性的果胶 酸钙转变为水溶性果胶，从而增加果胶的产率。n s h i b u g a 等采用草酸铵作萃取剂提取 果胶，将果皮洗净，用0 2 5 的草酸铵溶液在9 0 处理2 4h ，过滤即可得到果胶提取液。 这种提取方法可使不溶性果胶酸钙转化为可溶性铵盐，而c a 2 + 以草酸钙沉淀的形式除 去。另外也可用鳌合剂六偏磷酸钠，使不溶性果胶的溶解性增加，效果较好，但周期相 3 第一章绪论 对较长。 综上所述，目前关于提取果胶多糖的方法有很多种，方法比较成熟，有多种方法已 成功应用于工业化生产中。 1 1 4 果胶多糖的纯化方法的研究 目前对于果胶的纯化技术还未深入研究，大多参照多糖一般的纯化技术，对果胶粗 提液进行纯化处理，上述提取方法得到的多糖粗制品中含有较多的杂质如色素、糖分、 蛋白质等，这些物质的存在对成品果胶的质量有很大影响。在进一步研究之前须先将其 除去【1 8 1 。 1 除蛋白蛋白质一般以胶体状态存在于提取液中，用乙醇沉淀果胶时，蛋白质 也一同被沉淀下来，为此加入乙醇前，应先除去蛋白质。脱除果胶中蛋白质的方法s a v a g e 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法和酶法。 2 脱色大量色素存在时，会导致果胶在烘干过程中因色素发生褐变而使果胶变 黑，影响产品的感官品质。目前脱色的方法很多，但是适用果胶的脱色方法较少。主要 的方法有三种：活性炭脱色、树脂脱色和双氧水脱色。 3 脱盐、低聚糖果胶溶液中的无机离子低聚糖以及脱色时残留的水溶性色素等 物质的存在同样会影响果胶多糖的品质，一般去除这些的杂质的方法为透析、超滤等方 法。 1 1 5 果胶多糖的应用研究 果胶多糖具有良好的增稠、胶凝化、乳化稳定作用，在食品行业有着广泛的应用f 1 9 】， 果胶可作为果浆、糖果、果冻、冰淇淋、婴儿食品、果汁及乳品的稳定剂及蛋黄乳化剂 和增稠剂，它还可作为脂肪替代品，即利用果胶低热量的性能，用各种不同酯化度的低 酯果胶制成一种脂肪仿制品，随着对低热量食品需求量的增加，用作脂肪和糖的替代品 的果胶的用量将会增加2 0 1 。另外，随着功能性多糖的开发研究，果胶类多糖作为水溶性 膳食纤，也将越来越受到重视。 果胶多糖还具有良好的抗腹泻、抗癌、减肥、降低血糖和胆固醇的作用，在医药工 业上通常用其制造止血剂、血浆代用品、毒性金属解毒剂等，医学上可用于防止血液凝 固、治疗便秘、肠出血、作为金属中毒时的解药等方面2 1 2 2 1 。 此外，果胶多糖还被作为一种辅料应用在化妆品、纺织及冶金化工等工业生产中【2 3 1 。 4 西北大学硕士论文 1 2 寡聚半乳糖醛酸研究综述 1 2 1 寡聚半乳糖醛酸的定义和来源 寡聚半乳糖醛酸是由2 1 0 个半乳糖醛酸通过1 ，4 糖苷键连接而成的寡糖，其化 学结构式如图1 2 所示。 o i l o n = o 一8 o i i c o h o h ( h ) o h 图1 2 寡聚半乳糖醛酸的化学结构式 f i g1 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fo l i g o g a l a c t u r o n i ca c i d 获得寡聚半乳糖醛酸的途径主要有以下几种方法：从天然植物中提取、利用化学法 合成、酶催化反应合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖等【2 4 2 5 1 ，每种方法均有各自的 优缺点。 1 从天然植物中提取 果胶多糖是植物细胞壁中的一个主要成分，在植物进行自身防卫反应时，植物会用 体内的果胶酶降解部分果胶多糖生成寡聚半乳糖醛酸作为诱导子，从而激发植物防卫反 应，因此在绝大多数天然植物中都含有些游离的寡聚半乳糖醛酸，但是其数量较少。 从天然植物中分离提取寡聚半乳糖醛酸，是获得这类化合物的最初手段。但是这种方法 由于其提取率低，而且提取物中所含的组分复杂，给寡聚半乳糖醛酸的后续的分离纯化 带来困难，更不能满足大量制备的需求。因此该方法目前已很少采用。 2 化学法合成 化学法合成是制备寡聚半乳糖醛酸的种有效方法。为了研究不同聚合度的寡聚半 乳糖醛酸性质和结构，国内外的学者通过采用化学合成的手段来获得所需的目标产物。 5 第一章绪论 1 9 8 0 年s c h m i d t 建立的三氯乙酰亚氨酰法是现代寡糖合成的首选方法【2 6 】。近年，以硫代 异头碳作为合成糖苷键的糖基供体是另一种较常用的方法，这些硫代基团包括硫醚、各 种硫酚醚、氢硫基硫代基、砜、亚砜以及硫羟酸、硫代羟酸等。但化学合成路线较长， 过程繁琐，副产物生成量大，产物得率较低，较难分离纯化及大量制备。 3 酶催化反应合成或酶解天然多糖 用于寡糖合成的酶包括糖基转移酶、糖苷水解酶及磷酸化酶等3 大类。由于酶催化 反应立体特异性很强，对于反应底物、糖苷键类型及位置都有特定的要求，因而与化学 合成法相比有很大的优越性。为了研究不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸单体，国内外学者 往往通过选择特异性酶作为催化剂来合成所需的目标产物。卢丽丽等旧介绍了获得和筛 选各种糖苷合成酶及其合成反应机制，为寡糖的工业化生产提供了新的选择。但是，酶 法合成寡聚半乳糖醛酸所需的特异性糖苷酶价格昂贵，并不适用于大规模的制备寡聚半 乳糖醛酸。 果胶的基本组成单位是半乳糖醛酸，而果胶在自然界分布广泛，丰富的原料来源是 酶解果胶生产寡聚半乳糖醛酸的最显著优势。目前制备寡聚半乳糖醛酸的方法大多是用 果胶酶来水解果胶或果胶酸，得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸的混合物。这种方法制 备寡聚半乳糖醛酸具有反应重复性好、条件温和、产物分离纯化过程简单、所得到的寡 聚半乳糖醛酸品质优良等特点，例如a r l a n dth o t c h k i s s 2 8 】采用内切聚半乳糖醛酸酶和果 胶裂解酶两种酶酶解半乳糖醛酸聚糖制备得到寡聚半乳糖醛酸混合物。孙丽娜等【2 9 】比较 了4 种不同的商品果胶酶酶解果胶和果胶酸制备得到寡聚半乳糖醛酸混合物，筛选出酶 解果胶得到寡聚半乳糖醛酸的最佳果胶酶为p e c t i n e xx x l ，底物为果胶酸，在最佳条件 下得到以二糖和三糖为主的寡聚半乳糖醛酸的产率大于5 4 3 。目前已能将果胶酶固定 化来连续生产寡聚半乳糖醛酸。 4 酸水解天然多糖 化学降解法通常是用稀酸水解果胶得到寡聚半乳糖醛酸。降解速度快( 特别是在加 热的条件下) ，降解的比较完全，不易得到低聚糖。稀酸水解果胶过程难于控制，由于 在降解过程中引入了各种反应试剂，生成的产物复杂，得到的寡糖产率低下，不易得到 高活性寡聚半乳糖醛酸而未被推广应用，因此目前己很少选择化学降解法来生产和制备 寡聚半乳糖醛酸。 1 2 2 寡聚半乳糖醛酸的生物活性 6 西北大学硕士论文 寡糖对植物的生理调节作用是在研究植物与病原菌互作过程中信号的传导时发现 的，能够作为信号分子的类具有生物活性的寡糖称为寡糖素 3 0 , 3 1 】。由2 2 0 个 a - ( 1 - - , 4 ) d 半乳糖醛酸残基连接而成的寡聚半乳糖醛酸是最早被发现的一种在植物体 中具有生物活性的寡糖之一，它是由植物初生壁中广泛存在的果胶降解得到的活性片 段。已有很多关于寡聚半乳糖醛酸的不同的生物活性的的报道，但是其表现出来的生物 活性由于植物种类、活性测定方法、所使用的寡聚半乳糖醛酸的化学结构的不同而不同 【3 1 1 。寡聚半乳糖醛酸对植物所产生的生物学活性主要表现在两个方面：诱导植物的防御 反应和调节植物的生长、发育。 1 寡聚半乳糖醛酸诱导的植物防御反应 在植物体受到致病菌的攻击时可释放寡聚半乳糖醛酸作为内源激发子，诱导植保素 的产生，提高植物的抗病能力。致病菌入侵到植物体内至少有三种途径：分解植物细胞 壁，入侵植物的损伤部位，或者是入侵植物本身存在的开放性部位如气孔等，而存在于 植物初生壁中的果胶是入侵致病菌要降解的第一种目标物质【3 2 1 ，当致病菌所产生的寡聚 半乳糖醛酸内切酶和果胶裂解酶寡聚糖降解果胶而产生寡聚半乳糖醛酸时，所释放的寡 聚半乳糖醛酸一方面可以做为一种碳源提供给致病菌，另一方面也可以作为一种信号物 质被植物体检测到从而诱导植物防御反应。 寡聚半乳糖醛酸作为植物免疫激活因子的基础研究始于6 0 年代。a y e r s 等1 9 7 6 年 发现细胞壁的寡糖碎片能诱导植物植保素的合成【3 3 1 。由寡聚半乳糖醛酸所诱导的植物防 御反应因所研究的目标体系而有所不同，它与寡聚伊葡萄糖协同作用时，引起植保素积 累所需的浓度小于单独作用时所需的浓度【3 4 ，3 5 1 。能够诱导防御反应的寡聚半乳糖醛酸的 分子量分布范围较窄，通常情况下半乳糖残基数在1 0 - - 1 5 之间【3 6 】。 中国科学院大连化学物理研究所用酶解法制各得到寡聚半乳糖醛酸( 中科2 号) 并进 行了一系列的试验。寡聚半乳糖醛酸水剂对苹果花叶病防效达8 7 8 1 , - - - 9 2 0 8 ，是防 治苹果花叶病较理想的药剂3 7 1 。寡聚半乳糖醛酸对线辣椒病毒病也有较好的防治效果， 喷雾施药防效达6 8 7 7 ，是防治辣椒病毒病较理想的药剂【3 引。寡聚半乳糖醛酸对黄 瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌都有不同程度的抑制作用。 2 寡聚半乳糖醛酸对植物生长和发育的调节 对植物体添加外源性的寡聚半乳糖醛酸可以调节植物生长和发育，寡聚半乳糖醛 酸可以抑制植物生长素所诱导豌豆茎片段伸长，还可以诱导烟草t c l s ( t h i n c e l l 1 a y e r ) 和叶肉细胞的生长分化【3 9 】。当寡聚半乳糖醛酸被添加到含有一定浓度植物激素的烟草外 7 第一章绪论 植体细胞培养基中，本来发育很少或不发育的t c l s 发育成花，而本来发育成根的t c l s 只发育出很少的根【删。值得注意的是寡聚半乳糖醛酸引起植物形态发生变化所需的浓度 比引起抗性反应所需的浓度低1 0 1 0 0 倍。 另外，寡聚半乳糖醛酸还可调节果实的成熟【4 ，已有研究表明在番茄和柑橘的生长 过程中，寡聚半乳糖醛酸可以诱导调节乙烯的产生量从而调节果实的成熟。从番茄果实 中提取的其成熟的各个阶段能够提取引起乙烯产生量变化的寡聚半乳糖醛酸片段，这说 明由寡聚半乳糖醛酸内切酶降解果胶产生的寡聚半乳糖醛酸在果实的成熟阶段中起着 重要的作用。 此外，寡聚半乳糖醛酸的生物活性还表现在可以抑制小鼠肝细胞中油脂的积累 【4 2 ，2 5 1 ，具有抗肿瘤、抗病毒、抗补体、促有丝分裂【4 3 】等生物活性，可用于作为植物促生 长剂1 4 4 , 4 5 1 、抗菌剂、防腐剂j 等方面。 1 2 3 寡聚半乳糖醛酸的分离纯化 各种分离分析技术如薄层色谱，毛细管电泳，高效液相色谱、柱层析法等都应用于 分离寡聚半乳糖醛酸混合物。高效液相色谱法是最常用的方法，离子对反相色谱，离子 交换色谱，空间排阻色谱等均有文献报道。t h i b a u l t 等【4 7 】通过聚丙烯酰胺凝胶色谱分离 得到聚合度达到9 的寡聚半乳糖醛酸单体，j i na n dw e s t 掣4 8 】通过d e a es e p h a d e x a - 2 5 离子交换色谱柱分离得到寡聚半乳糖醛酸单体的聚合度达到了1 1 ，上述分析型色谱柱得 到的分离量仅为鸺级。a r l a n dth o t c h k i s s 等【4 9 】采用制各型的c a r b o p a c p a l 色谱柱，通 过脉冲安培检测器检测经多次分离得到可达m g 级的聚合度为2 - 2 0 的寡聚半乳糖醛酸。 但该方法一次上样量少，得到的各个聚合度的寡聚半乳糖醛酸为0 1 - - 一0 6m g 。高效液相 色谱法虽然有效，但由于设备较昂贵，技术性较强，大多只用于进行分析，不适合大量 制备寡聚半乳糖醛酸。 柱层析法是分离纯化寡聚半乳糖醛酸混合物得到单体的更为实用的方法。现已有在 研究中采用阴离子交换柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和琼脂糖凝胶柱层析分离纯化了不同 聚合度的寡聚半乳糖醛酸，h o n g - n if a n 等【5 0 】运用d o w e x 1 x 4 阴离子交换树脂通过梯度 洗脱得到了聚合度为2 6 - 5 寡聚半乳糖醛酸纯品，其中以三糖和四糖居多。h o n g n if a n 等【5 0 】同时也以s e p h a d e xg 一2 5 葡聚糖凝胶为填料分离聚合度为2 5 的寡聚半乳糖醛酸， 但效果不好，纯度不高。s u z u k it 等【5 1 】则通过d e a es e p h a d e xa 2 5 柱层析得到了聚合 度2 - - 1 6 的寡糖，经f a c e 检测纯度较好。活性炭柱层析法也被用于寡聚半乳糖醛酸的 8 两北大学硕士论文 分离纯化，但仅得到乙二醇酯化的半乳糖醛酸、半乳糖醛酸二糖和三糖【5 2 1 。 1 2 4 寡聚半乳糖醛酸的检测 糖生物学的高速发展和新技术的大力推动，使寡糖的检测方法也取得了长足的进 步。寡聚半乳糖醛酸的检测方法有高效液相色谱( h p l c ) 、高效离子色谱( h p a e c ) 、聚丙 烯酞胺凝胶电泳( p a g e ) 、毛细管电泳( c e ) 及薄层层析( t l c ) 等。高效液相色谱、高效离 子色谱是最常用的两种方法。t h o m a ss t o l l 用高效液相色谱分离并可以同时检测饱和和 不饱和的寡聚半乳糖醛酸( d l p 2 7 ) 【5 3 1 ，a r l a i l dth o t c h k i s s 则用高效离子色谱与脉冲安培 检测器联用检测未柱前衍生的寡聚半乳糖醛酸【4 9 1 ，采用这种方法不仅可以检测到聚合度 2 2 0 的寡聚半乳糖醛酸，采用制备型的色谱柱用于制各的量更可以达到m g 级。毛细 管电泳【5 4 1 、聚丙烯酰胺凝胶电泳【5 5 】也是检测寡聚半乳糖醛酸常用的有效的方法。 由于上述设备昂贵或技术性较强，定量检测寡聚半乳糖醛酸常采用高效液相色谱和 高效离子色谱法等上述方法，而定性检测产物成分，最简便有效的方法则是纸层析【5 6 1 和薄层层析( t l c ) 5 7 】。 1 2 5 寡聚半乳糖醛酸的结构测定 目前寡聚半乳糖醛酸结构测定的常用方法有x 射线衍射、红外光谱( i r ) 、核磁共振 ( n m r ) 、质谱( m s ) 等。 核磁共振是测定糖结构最常用也是最基本的方法，它能给出五种结构信息，糖残基 数目，糖残基组成，异头碳构型，连接位点及顺序，取代基的位置等。通过一维的1 h n m r 、 1 3 n m r 与x 一射线衍射可以分析得出聚合度低、结构简单的寡聚半乳糖醛酸的结构【5 8 1 ， 而对于聚合度高、结构复杂的寡聚半乳糖醛酸，则需再做1 h 1 hc o s y 、1 h t 3 ch m q c 等二维核磁共振5 9 1 ，有时还需要综合运用m s 方法，才能分析得到聚合度高、结构复杂 的寡聚半乳糖醛酸的化学结构。采用上述方法对寡聚半乳糖醛酸进行结构分析的研究国 内尚未见报道。 质谱包括快原子轰击质谱( f a b m s ) 和电喷雾电离质谱( e s i m s ) 、基质辅助基光解吸 质谱( m a l d i m s ) 、基质辅助激光解吸飞行时间质谱( m a l d i t o f m s ) 等。通过质谱可 获得寡糖的离子碎片信息，它可以获得寡糖的分子离子峰，根据其图谱中碎片离子所提 供的糖裂解的信息，还可以推断糖苷键连接位点及寡糖链的结构顺序。b e m a r dq u e m e n e r 等【印1 用0 1 8 标记寡聚半乳糖醛酸的还原端，通过e s i i t - m s 多级质谱在正负离子模式下 的一些特征碎片离子，解析得到寡聚半乳糖醛酸的糖苷键的连接位点。 9 第一章绪论 目前，作为分离手段的色谱技术与作为分析手段的质谱、酶学方法等联用已经在糖 分析与糖生物学中得到广泛应用，各种分离分析手段逐步实现自动化和智能化，寡糖的 分离与结构分析变得更为高效、准确、快捷和灵敏。 1 3 苹果果胶及果胶寡糖的研究现状 国内从二十世纪五十年代开始，相继对果胶多糖的提取开展了大量的研究。有关从 柑橘皮、柚皮、苹果渣、向目葵及甜菜渣等中提取果胶多糖的研究已有很多报道，目前 果胶多糖的提取已能实现工业化规模生产【6 1 1 。 目前，国外果胶的商业性生产原料是以柑桔果皮为主，而我国用于果胶提取的苹果 渣资源十分丰富。作为世界苹果生产大国，每年我们有数百万吨的苹果渣可加以利用， 并且苹果果胶( 含量1 5 2 0 ) 比柑橘果胶胶凝性更强【6 2 1 ，开发前景广阔。吴惠芳等【6 3 】 用盐析法从果渣中提取果胶多糖，其研究结果为：调萃取液p h 值为2 ，提取温度为9 0 。c ， 萃取时间为7 0m i n ，以硫酸铝作为沉淀剂，当浓度为6 时，果胶的提取率达到了4 以上，比酒精沉淀法提高了3 4 5 。陈雪峰等m 】利用酸提醇沉法从苹果渣中提取果胶工 艺进行了研究，筛选出在酸液p h 2 0 , - - - 2 5 、料液比1 ：8 、温度8 7 , - 一9 0 。c 、时间lh 条件 下提取果胶多糖，得率可达到1 1 1 ， 田泽贤次等【6 5 1 动物试验证实了苹果渣果胶可降低易发生肿瘤的远端大肠粘膜中的 前列腺素e 2 的含量，具有抑瘤作用，为系统开展苹果果胶生物活性研究奠定了良好基 础。据报道，果胶可以提高机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖血脂、抗辐 射等【删，被医学界所青睐。苹果果胶多糖产品已得到部分开发与应用。 国内外对寡聚半乳糖醛酸应用的研究集中于生物农药方面。它可以作为植物免疫激 活因子激活植物的自卫防御系统，通过调整植物自身的能力产生植保素来抵御病虫害的 侵袭，另外对植物病原菌等有体外抑菌作用。据文献报道，寡聚半乳糖醛酸在控制棉花 黄萎、苹果花叶病、辣椒病毒病等【明方面具有显著效果。人们对绿色食品的需求量日趋 增加，使寡聚半乳糖醛酸类生物农药在农业上的研究和应用将会越来越大，具有广阔的 市场前景。 另外，果胶多糖在酶解到一定程度后得到的果胶寡糖混合物具有很强的抗菌作用， 是一种极有开发价值的新型天然食品防腐剂【6 8 】。主要研究发现，果胶在酶解到一定程度 后具有明显的抑菌活性，可显著抑制食品中常见细菌，特别是乳酸菌的生长。日本已研 究开发了果胶水解物作为新型的天然食品防腐剂【6 9 1 。 1 0 西北大学硕士论文 上述对果胶及其寡糖的研究和应用均是以多糖或寡糖混合物作为研究对象的，而通 过各种物理化学，生物化学以及色谱技术等从果胶寡糖中分离得到各个聚合度的单体寡 糖对于研究果胶结构及这些寡糖所产生的生物功效的的机理有重要的意义。国内关于分 离果胶寡糖混合物得到单体寡糖、并对其结构和活性进行系统研究的报道较少。 1 4 本研究的目的及意义 作为世界苹果生产大国，每年我们有数百万吨的苹果渣可加以利用，是以浓缩汁为 主的苹果加工业迅速崛起后产生的亟待开发的农业资源，合理开发苹果多糖并以其为原 料对其进行后续的深入的研究符合我国加强利用可再生生物资源，发展循环经济的总体 要求，同时对苹果采后增值，促进苹果产业的可持续发展具有重要意义。 果胶寡糖自身在组成、连接、衍生化、微观不均一性等方面的高度复杂性及其检测 上的困难，使得果胶寡糖混合物的分离工作一度进展缓慢。因此，寡糖的分离和纯化是 寡糖结构与活性研究至关重要的环节。目前，对寡聚半乳糖醛酸的分离及其活性的研究 是国内外报道的难点和热点。国内所做的研究大多是对苹果果胶的提取分离过程进行了 条件的优化，对苹果果胶的理化性质的研究及寡聚半乳