（水产养殖专业论文）β—萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏cdna文库的构建及分析.pdf

1 3 一萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏c d n a 文库的构建及分析 摘要 当今，水生实验动物开发和研究备受世界各国的重视，预示着水生实验动物科学 又进入了一个新的发展阶段。我国标准水生实验动物的开发研究起步较国外晚，经过 近十多年的努力，在剑尾鱼、稀有绚鲫和红鲫的实验动物化研究方面取得了可喜的成 绩。 剑尾鱼原产地为墨西哥及危地马拉，1 9 8 7 年，中国水产科学研究院珠江水产研 究所开始了剑尾鱼的定向培养和相关的实验动物化研究工作。到目前为止，剑尾鱼已 经被应用到水环境监测、水产药物安全评价、动物疾病模型等方面。由于近交剑尾鱼 的遗传均一性较高，加上饲养过程的营养标准化和管理规范化，作为一种标准化的实 验材料，保障了不同个体在应用中的反应一致性和实验的可重复性，从而提高研究的 总体水平。但是剑尾鱼的已知e s t 序列还相对较少，许多功能基因以及可以在水环 境监测中应用的基因数量更是有限，限制了剑尾鱼的应用。 本研究以暴露于p 一萘黄酮( b e t a - n a p h t h o f l a v o n e ，f l - n q ：) 中的剑尾鱼( x i p h o p h o r u s h e l l e r i ) 为研究对象，采用s m a r t t m ( s w i t c h i n gm e c h a n i s ma t5 e n do fr n at r a n s c r i p t ) 技术，成功构建了剑尾鱼肝脏e d n a 文库。用s vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m 试剂盒 提取m r n a 后，以逆转录酶m m l vr e v e r s et r a n s e r i p t a s e 反转录合成第一链c d n a ，然 后通过l d p c r 合成并扩增d sc d n a 。扩增产物经纯化、酶切、过c h r o m a s p i n - 4 0 0 t m 柱去除小片段后，连接到s f i i 消化过的p d n r - l i b 质粒栽体中，最后用 电转化法将重组质粒转化到e c o l id h 5 a 内得到原始文库，扩增后的文库保存在9 6 孔细胞培养板中。经测定该文库约含有4 2 1 0 7 个重组子，重组效率达9 9 ，插入 片段多在0 6 2 5k b 之间，平均插入片段长度约1 3 k b ，扩增后文库滴度为 7 0 x 1 0 9 c f u m l 。随机挑取1 0 0 0 个重组子进行测序检验，共得到长度大于5 0 0 b p 的 e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g ( e s t ) 序列9 7 6 个，对所测e s t 序列进行拼接，得到7 2 个 重叠群( c o n t i g s ) ，2 5 0 个单拷贝e s t ，总计单基因簇3 2 2 个。结果表明剑尾鱼肝脏的全 长c d n a 文库已构建成功，且质量较高，从而为筛选剑尾鱼肝脏的功能基因全长序列 奠定了基础。成功筛选出了用于后续荧光定量p c r 反应的1 8 s 核糖体内参引物。为剑 尾鱼基因水平监测环境雌激素模型的构建打下了基础。 关键词：剑尾鱼；肝脏；c d n a 文库 co n s t r u c t i o na n dch a r a c t e r i z a t i o no ft h ec d n a l i b r a r y f r o mt h el i v e ro fx i p h o p h o r u sh e l l e r ie x p o s e dt o b e t a n a p h t h o n a v o n e a b s t r a c t t o d a y , t h ed e v o l o p m e n ta n dr e s e a r c ho fa q u a t i ce x p e r i m e n t a la n i m a l sh a sb e e no f g r e a ti m p o r t a n c et oa l lc o u n t r i e sw h i c hi n d i c a t et h es c i e n c eo fa q u a t i ce x p e r i m e n t a l a n i m a l se n t e r e du p o nan e w s t a g e t h er e s e a r c ho fs t a n d a r da q u a t i ce x p e r i m e n t a la n i m a l s o fo u rc o u n t r ys t a r t sr e l a t i v e l yl a t e rt h a na b r o a d , a f t e rn e a r l yt e ny e a r so fe f f o r t , w eh a v e g a i ng r a t i f 啦ga c h i e v e m e n ta tt h er e s e a r c ho fe x p e r i m e n t a la n i m a l i z a t i o no fx i p h o p h o r u s h e l l e r i ，g o b i o c y p r i sr a r u sa n dr e dc r u c i a nc a r p t h es w o r d t a i lf i s h , x i p h o p h o r u sh e l l e r i ，w h i c hi so r i g i n a t e df r o mm e x i c oa n d g u a t e m a l a , w a sa r t i f i c i a l l yc u l t u r e db yp e a r lr i v e rf i s h e r yr e s e a r c hi n s t i t u t ea se a r l ya si n 19 8 7 u pt ot h ep r e s e n t , t h es w o r d t a i lf i s hi sa p p l i e dt ot h es t u d yo fw a t e r - e n v i r o n m e n t d e t e c t i n g , a q u a c u l t u r a ld r u g ss a f e t ya s s e s s m e n t , a n i m a ld i s e a s em o d e la n ds oo n t h e x i p h o p h o r u sh e l l e r i ，a sas t a n d a r d i z e de x p e r i m e n tm a t e r i a l s ，c a ne l l s u r et h ea p p l i c a t i o no f d i f f e r e n ti n d i v i d u a l si nr e s p o n s et ot h ec o n s i s t e n c ya n dr e p e a t a b i l i t yo fe x p e r i m e n t s b e c a u s eo ft h eh i g hg e n e t i ch o m o g e n e i t yo fi n b r e e d i n gx i p h o p h o r u sh e l l e r ia n dt h e s t a n d a r d i z a t i o no f m a n a g e m e n ta n dn u t r i t i o n h o w e v e r , t h ea m o u n to f k n o w ne s t s e q u e n c ea n dm a n yf u n c t i o n a lg e n e sa sw e l la sw a t e r - e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n gg e n eo f x i p h o p h o r u sh e l l e r iw a sv e r ys m a l lt h a tl i m i t e dt h ea p p l i c a t i o no f x i p h o p h o r u sh e l l e r i ae d n al i b r a r yf o rt h el i v e ro f x i p h o p h o r u sh e l l e r ie x p o s e dt ob e t a - n a p h t h o f l a v o n e w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e db ys m a r t t m ( s w i t c h i n gm e c h a n i s ma t5 e n do fr n a t r a n s c r i p ou s i n gc r e a t o r t ms m a r t t m c d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t s i n g l e - s t a n d e d n aw a ss y n t h e s i z e dw i lt h et e m p l a t eo ft o t a lr n aw h i c hh a sb e e ne x t r a c t e df r o mt h e l i v e ro f x i p h o p h o r u sh e l l e r iu s i n gs vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m b ym m l vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ，a n dd o u b l e s t r a n de d n aw a ss y n t h e s i z e da n da m p l i f i e db yl o n g - d i s t a n c e p c r t h ep c rp r o d u c t s ，w h i c hw e r es i l l - d i g e s t e da n ds i z ef r a c t i o n a t e db yc h r o m a s p i n - 4 0 0 t m ，w e r el i g a t e dt ot h ep d n r - l i bv e c t o rw h i c hw a ss f i l - d i g e s t e da n d d e p h o s p h o r y l a t e d t h el i g a t i o nm i x t u r ew a st r a n s f o r m e di n t oe c o l id h 5 ab y e l e c t r o p o r a t i o n t h ee d n al i b r a r yc o n t a i n e d4 2 xl0i n d e p e n d e n tc l o n e sw i t hd n ai n s e r t s o f0 6k b 2 5k b t h er e c o m b i n a t i o nr a t ew a s 9 9 9 91e s t sw e r eo b t a i n e db yg e n e h s e q u e n c i n go f10 0 0r c w o m b i n a n t sw h i c hw e r ep i c k e du pr a n d o m l y i na d d i t i o n ，3 2 2 n o n - r e p e t i t i v es e q u e n c e sw e l ef o r m e di n c l u d i n g7 2c o n t i g sa n d2 5 0s i n g l e t o n sf r o mt h e s e e s t sa f t e ri n i t i a la s s e m b l y t h er e s u l tp r o v e st h a tt h eq u a l 埘o ft h i se d n a l i b r a r yi sv e r y g o o d t h i sc d n al i b r a r yp r o v i d e dav a l u a b l er e s o u r c ef o rt h ef u n c t i o n a lg e n o m er e s e a r c h o ft h ex i p h o p h o r u sh e l l e r i , a n di tw i l lf o r maf u n d a m e n t a lb a s ef o rf i f f t h e rs c l - na n dc l o n e o ft h ee n v i r o n m e n t a l l y - r e l a t e dg e n e s k e yw o r d s ：x i p h o p h o r u sh e l l e r i ；l i v e r ；c d n al i b r a r y l i i 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：纠次 2 0 。i 年月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在参年解密后适用本授权书。 2 、不保密囱。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 4 技 孙库 2 0 。1 年6 月日 2 0年 月日 广东海洋大学硕士学位论文 第一章文献综述 国外利用鱼类作为实验材料已开展了大量的工作，涉及环境毒理学、胚胎学和发 育生物学、生理学和内分泌学、药理学、生物医学等方面。其中，斑马鱼作为脊椎动 物发育生物学的模式动物，在胚胎发育分子机制研究、基因研究等多个领域成为研究 者的宠儿。在生理学和内分泌学方面，鱼鳃、鱼肾被用于研究膜生理学，金鱼眼被用 来研究视觉器官结构和功能，鲫鱼的m 细胞作为模型被用来研究神经元突触生理， 有灵敏电感觉的鲇被用于研究电生理等。在药理学方面，斗鱼是研究药物抑制本能行 为的敏感动物。在环境毒理学方面，因水环境污染问题日趋严重，如因各种工业废水、 生活污水而引起的水域生态的严重破坏和生物资源的衰竭。以鱼类为代表的水生实验 动物的研究和应用，对于水环境污染的研究与检测监控是必不可少的。日本等国家已 将鱼类作为农药毒性、水环境污染检测的重要实验动物。 当今，水生实验动物开发和研究备受世界各国的重视，预示着水生实验动物科学 又进入了一个新的发展阶段。我国标准水生实验动物的开发研究起步较国外晚，经过 近十多年的努力，在剑尾鱼、稀有约鲫和红鲫的实验动物化研究方面取得了可喜的成 绩。 1 9 8 7 年，中国水产科学研究院珠江水产研究所就开始了剑尾鱼的定向培养和相关 的实验动物化研究工作。目前剑尾鱼已通过全国水产原良种审定委员会的审定，农业 部第3 4 8 号公告也明确了剑尾鱼r r b 系在水环境监测、水产药物安全性评价、动物疾 病检验模型等不同领域的应用。由于近交剑尾鱼的遗传均一性较高，加上饲养过程的 营养标准化和管理规范化，作为一种标准化的实验材料，保障了不同个体在应用中的 反应一致性和实验的可重复性，从而提高研究的总体水平。但是剑尾鱼的已知e s t 序 列还相对较少，许多功能基因以及可以在水环境监测中应用的基因数量更是有限，限 制了剑尾鱼的应用。 c d n a 文库的构建是真核分子生物学研究的基本手段之一，目前已经广泛用于研 究不同发育阶段基因表达的变化，某特定发育期基因表达的情况，克隆新细胞因子， 分离组织特异性基因等方面。构建剑尾鱼肝脏c d n a 文库，可以为下一步e s t 序列分 析及代谢关键酶基因、环境污染物相关基因的克隆、表达等研究打下基础。 成功筛选出用于后续荧光定量p c r 反应的1 8 s 核糖体内参引物。为剑尾鱼基因水 l b 一萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏c d n a 文库的构建及分析 平监测环境雌激素模型的构建打下了基础。 1 剑尾鱼简介及其应用 剑尾鱼( x i p h o p h o r u sh e l l e r ) 属硬骨鱼纲( o s t e i c h t h y e s ) 、 鳝形目 ( c y p r i n o d o n t i f o r m e s ) 、胎鲻科( p o e c i l i i d a e ) 、剑尾鱼属( x i p h o p h o r u s ) ，原产地为墨西哥 及危地马拉。目前剑尾鱼已通过全国水产原良种审定委员会的审定，农业部第3 4 8 号公生【2 6 】也明确了剑尾鱼r r b 系在水环境监测、水产药物安全性评价、动物疾病检 验模型等不同领域的应用【2 - 3 】。由于近交剑尾鱼的遗传均一性较高，加上饲养过程的 营养标准化和管理规范化，作为一种标准化的实验材料，保障了不同个体在应用中的 反应一致性和实验的可重复性，从而提高研究的总体水平。 1 1 剑尾鱼简介 1 1 1 剑尾鱼的生物学特性 剑尾鱼( x i p h o p h o r u sh e l l e r i ) 体型小，头较尖，吻尖突，口中等大，下颌微突出。 背鳍起点在臀鳍基部上方，臀鳍起点在背鳍起点下方，胸鳍末端可达腹鳍基部，腹鳍 末端超过臀鳍基部，尾鳍较大。雌雄鱼体型相差较大，雌鱼腹部圆大，怀卵时尤大； 而雄鱼体型细长侧扁，尾鳍最下方5 - 6 鳍条合并向后伸延，呈剑状【1 1 。 由于长期人工选择和杂交育种，剑尾鱼体型和体色变异较大，构成品种的多样性。 体色有深红、浅红、橘黄、白腹、全白、绿色和黑色斑纹等诸多变异。眼球有红眼和 黑眼等类型l l j 。 剑尾鱼属卵胎生鱼类，仔鱼自母体产出后即可自由生活。7 0 日龄左右出现雄性 性征( 尾鳍出现剑尾) ，1 2 0 日龄左右两性出现追逐、嬉戏等性行为，雄鱼具生殖器 ( 由臀鳍演变而来) ，由其完成授精行为。繁殖期水温宜在2 2 2 9 度之间。剑尾鱼妊 娠期为3 0 d 左右，临产前1 2 d 母鱼喜欢独居一处。一般在1 5 0 日龄左右即可产出仔 鱼，条件适宜时，每隔3 0 - 4 0 d 即可再产一胎。每窝产仔数量为2 0 2 0 0 尾。产过小鱼 的有些雌鱼身体逐渐变细，圆形的臀鳍逐渐变成棒状，尾鳍下端开始长出“剑尾 突 起物。此外，采用5 0 m g m 3 m 甲基睾丸酮分别浸泡4 0 日龄仔鱼和3 0 0 日龄的雌鱼2 0 天，全部鱼均可长出剑尾。尚未发现雄剑尾鱼变成雌剑尾鱼的“性逆转”现象1 。 2 广东海洋大学硕士学位论文 1 1 2 剑尾鱼对我国水生实验动物学科的贡献 剑尾鱼( x i p h o p h o r u sh e l l e r i ) 是热带亚热带小型鱼类，对多种农药、重金属较敏感。 1 9 8 7 年，中国水产科学研究院珠江水产研究所开始了剑尾鱼的定向培育和相关的实 验动物化研究工作，在水生实验动物剑尾鱼的纯系选育研究方面已进行了2 0 多年， 在对剑尾鱼部分品系的纯系培育工作中，不断摸索和积累了一些经验，建立了剑尾鱼 纯化选育基地；课题组从剑尾鱼近交培育、生物学基础研究、遗传和遗传纯和度检测、 水环境与人工生态、营养需求与人工饲料、疾病普查和监控、日常管理规范、应用等 各个方面进行系统研究，目前主要有三种不同体征剑尾鱼近交系，r r b 系( 红眼红 体) 、r w - h ( 红眼白体) 、b y - f ( 黑眼橘红体) 。经多年培育，剑尾鱼群体间具较高 的遗传均一性，加上饲养过程的营养标准化和管理规范化，使得在应用中有良好的反 应一致性和可重复性，保证了结果的准确性、可信度和可比性，从而提高其应用领域 的研究水平。剑尾鱼r r - b 系已通过了全国水产原良种审定委员会的审定，确定剑尾 鱼r r b 系为适用于水环境监测、水产药物安全性评价、化学品毒性检测、动物疾病 模型等领域的水生实验动物。应用研究发现，剑尾鱼在环境检测等领域有好的应用前 景。中国环境科学研究院进行了剑尾鱼在生态毒力学中应用研究：广东省实验动物检 测所应用剑尾鱼进行了石油开发污染物毒性监测实验；南京农业大学动物医学院、华 南农业大学应用剑尾鱼进行了水产药物安全性评价中动物模型构建以及水产动物疾 病研究，这些开拓性的工作为我国水生实验动物学科的发展做出了贡献【l 】。 1 2 剑尾鱼的应用研究 剑尾鱼( x i p h o p h o r u sh e l l e r i ) 具有体型小、繁殖周期短、繁殖力强、易于在实验室 饲养、以及存在盲眼、畸形等诸多突变性状，适合作为实验模型。研究成果证明，培 育的水生实验动物剑尾鱼，可作为毒性实验、水污染检测、水环境毒力、药物安全性 评价标准化的实验材料。在鱼类某些细菌性疾病模型构建和营养性疾病研究中，显示 了良好的应用前景【。 1 2 1 在环境污染物评价和监测中的应用 评价有毒化学物质对水生生物的危害，急性毒性资料是最常用的依据之一。过去 我国主要利用四大家鱼、鲤、鲫等作为急性毒性试验材料，但由于四大家鱼性成熟时 间长，鱼种阶段生长快，且受饲养装置和饲养条件的限制，而难以成为理想的鱼类实 3 1 3 一萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏e d n a 文库的构建及分析 验动物，试验也相应受到季节限制。随着实验动物科学的发展，有关鱼类实验动物的 研究日渐活跃，毒性试验所用的材料鱼，除了要求实验室易于饲养且又对毒物较为敏 感外，更趋向于使用性成熟时间和性周期较短的小型鱼类，如o e c d 、i s o 和u s e p a 等组织机构推荐使用斑马鱼( d a n i or e r i o ) 和黑头软口鲦( p i m e p h a l e sp r o m e l a s ) 等 小型鱼类。剑尾鱼具有实验室易于饲养、性成熟时间和性周期短、个体小、对化学物 质敏感等优点。因此，剑尾鱼也是较为理想的测试化学品毒性的试验材料。 1 对几种有机磷和菊酯类农药的敏感性研究 有机磷和菊酯类是常用的农药，有时出现渗入养殖水体，造成水体慢性污染，引 起鱼类急性中毒死亡等事件。为评估农药对水环境的影响，珠江水产研究所进行了剑 尾鱼、斑马鱼、金鱼、白鲢等对有机磷和菊酯类农药的敏感性相关研究，研究表明4 种鱼类中，剑尾鱼对对有机磷农药均最敏感，说明剑尾鱼在对有机磷农药污染的监测 方面具有较好的应用前景 2 7 - 2 8 1 。 2 酚类、烷基苯类、硝基苯类化合物对剑尾鱼的急性毒性 典型环境有害化学品，如酚类、烷基苯类、硝基苯类化学物质是重要的化工、医药、 纺织、印染、农药等工农业生产的原料。它们在满足人们需求的同时，也带来了许多 潜在的环境安全性问题，如三致效应、生殖发育毒性等。自2 0 世纪9 0 年代以来，我 国水环境污染形势严峻，不仅面临着藻华和赤潮的爆发，而且还面临着大量有毒有害 有机污染物对水体的污染。目前，我国大部分水体和部分城市均不同程度受到有机污 染物的污染，特别是部分河湖流域更属于典型的以有机污染物污染为主的水域。因此， 开发酚类、烷基苯类、硝基苯类等典型化学品对水生生物安全性研究具有重要意义。 国家环境保护总局化学品登记中心卢岭、沈英娃等参照国家环境保护总局化学品测试 准则，测定了酚类、烷基苯类、硝基苯类的1 2 种化学品对剑尾鱼的急性毒性试验， 结果表明剑尾鱼作为毒性试验材料用于化学品和环境水样毒性测试是可行的，是较为 理想的毒性试验材料【2 9 1 。 3 在重金属和有机污染物毒理研究中的应用 菊酯类农药、有机磷、有机氯等有机污染物和重金属在环境中广泛存在，特别是 在水域环境中，鱼类为低等脊椎动物，在环境毒理研究中有较好的应用优势。有研究 表明雄性剑尾鱼对马拉硫磷以及重铬酸钾都有较好的敏感性，可望成为有机磷农药毒 性实验用鱼【3 0 l 。 现代工业的不断发展，人造化学物质对环境的污染越来越严重，而污染对生物造 成的危害也越来越大。环境中的许多污染物具有雌激素效应。这类污染物质可以通过 干扰生物的内分泌系统，破坏生物的生殖和繁育，对生态系统的平衡具有严重危害。 通常将这类污染物质统称为“环境雌激素 。寻找指示环境雌激素污染的生物标示物， 以及筛选适于实验室检测环境雌激素活性的敏感性实验生物，对于检测环境雌激素活 性，评估环境雌激素对生物尤其是人类健康的影响具有重要意义【3 l 】。剑尾鱼是一种体 型小、易于饲养，存活力高，便于实验室操作，对环境雌激素比较敏感的优良鱼种， 4 广东海洋大学硕士学位论文 今后在国内开展环境雌激素效应方面的研究时可以考虑推广使用。 4 在石油开发污染物毒性监测中的应用 石油污染物是海洋环境中的主要污染源之一，包括原油、溢油和溢油处理剂、海 上油气田工程废水等。消油剂是一种重要的溢油处理化学药剂，由于环境有污染，多 数国家对消油剂的使用作了严格的使用规定并列入法律条文，我国对消油剂的使用也 作了规定。随着我国海洋石油产业的发展和海上溢油事故的逐年增多，加强监测消油 剂毒性的试验生物筛选和消油剂对生物毒性的研究，具有十分重要的意义。目前，世 界各国用于监测水质污染的生物包括植物、微生物、动物在内的许多物种，由于监测 水质污染所用的生物种类差异太大，另一方面监测方法又远未实现标准化，故至今尚 未找到国际上普遍接受的指示生物种类。用水生动物监测水质环境在国外已相当普 遍，我国这方面的研究也已展开。广东省实验动物监测所黄韧等开展了以几种海水和 淡水动物为受试生物，从中筛选适于监测水体石油污染的动物研究。实验表明，剑尾 鱼是监测消油剂生物毒性较为适宜的物种【3 2 删。 1 2 2 在水产动物疾病及药物安全性评价研究中的应用 在水产动物疾病研究中，为了提高实验结果的精确度和结果重复性，在开展特定 水产动物疾病的病原毒力验证、病理学、流行病学、药物安全性与有效性以及免疫评 价研究时，标准化水生实验动物的使用是必要的。 1 剑尾鱼在水产动物细菌性疾病研究中的应用 水产动物病害中有4 0 由细菌引起，细菌性疾病对水产养殖业危害巨大。细菌性 疾病防治研究中，病原菌毒力检测、感染模型建立和疫苗免疫是重要的研究内容。南 京农业大学动物医学院陆承平教授等，采用剑尾鱼在水产细菌疫苗效果评价中作了有 益尝试。研究中提取5 株迟缓爱德华氏菌的胞外产物( e p c ) ，分别接种于h o p - 2 细 胞、小鼠和剑尾鱼，发现具细胞毒性作用的4 株迟缓爱德华氏菌的e p c ，可使小鼠和 剑尾鱼出现运动减少、不食等中毒症状，并可导致实验动物死亡；无细胞毒性的菌株 e p c ，对小鼠和剑尾鱼无致病性。试验证实，e p c 的细胞毒性与动物致病性平行，说 明e p c 是一种毒力因子，也说明剑尾鱼可作为实验材料用于动物致病性研究【3 5 3 6 】。 2 剑尾鱼在水产药物安全性评价的应用 2 l 世纪水产养殖业的发展更强调养殖环境和水产品质量安全，注重养殖与环境 的协调，遵循可持续发展战略。水产养殖业迫切需要安全高效的水产药品和用药方法 指导，相应的药物安全评价方法势在必行，标准化实验材料的应用越来越受关注。毒 性试验研究表明，不同浓度硫酸铜，在不同作用时间对剑尾鱼肝脏、鳃等器官的病理 损伤具有一系列的渐进性病理变化过程，损伤程度与硫酸铜用药时间、浓度具有相关 s 1 3 一萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏c d n a 文库的构建及分析 性。同时，用原子光谱吸收仪检测铜离子在肝脏、鳃中蓄积，中毒鱼肝脏中的蓄积量 明显高于鳃，表明肝脏是铜离子的重要蓄积器官，铜离子在肝脏中的蓄积量随时间的 延长、浓度的增高而增多，提示肝脏中铜离子浓度是铜中毒的最有力指标。说明剑尾 鱼是一种比较理想的毒性检测实验动物【3 7 1 。 1 2 3 在比较医学应用研究上的探讨 比较医学是对动物与人类之健康和疾病状态进行类比研究的科学。它是以动物的 自发性和诱发性疾病做模式，建立各种人类疾病的动物模型及模型系统，深入研究人 类疾病发生、发展规律，找寻预防、诊断、治疗疾病的正确方法，达到控制人类疾病 的目的。比较医学和实验动物学是实验动物科学的两个领域，两者的关系十分密切 1 3 8 - 3 9 1 o 鱼类属于低等脊椎动物，可以通过改变环境温度控制体温，进行炎症反应、免疫 功能以及膜生理学的相关研究，同时鱼类在消化系统、内分泌、神经、皮肤、眼、血 液循环等器官系统都已具有脊椎动物的基本结构模式，虽然相对简单，但无论在解剖 及组织结构上还是生理上都类似于哺乳动物的器官系统，与高等脊椎动物具有一定的 可比性，鱼类的生物学性状在一定程度上可与人类的对应性状相类比。因此，鱼类实 验动物不仅在比较解剖学、比较组织学、比较病理学及比较营养生理学等方面研究是 很好的材料，而且鱼类疾病模型的建立，将对相应疾病的机理和防治、病理与生理等 领域的研究开拓发展空间，提供新思路【i 】。 随着人类对重大传染性疾病的成功控制，肿瘤、白内障等非传染性疾病对人类健 康的危害越显突出。据资料报道，鱼类自然发生肿瘤的病例很多，种类也多样，机体 所有组织都会发生肿瘤，且与其它纲目的脊椎动物( 包括人类) 的肿瘤在临床过程、 一般生物学特征和形态学上有很大的相似性。国外已有用于人类肿瘤研究的鱼类疾病 模型，如鳟鱼肝肿瘤模型、鲴鱼乳头状瘤模型、白斑狗鱼淋巴瘤模型、新月鱼和剑尾 鱼的黑色素瘤模型、转基因斑马鱼t 细胞的白血病肿瘤模型等【l 】。 在剑尾鱼的培育过程中，不同类型的肿瘤被发现，在1 个近交群体中发现了白内 障。由于近交剑尾鱼有较好的遗传均一性，在应用上有一定的优势【。 6 广东海洋大学硕士学位论文 2c d n a 文库构建策略及其分析研究进展 自2 0 世纪7 0 年代中期首例e d n a 克隆问世以来，己用构建和筛选e d n a 文库 的方法克隆了很多基因。通过构建e d n a 文库能直接分离到生命活动过程中的一些调 控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系，构建e d n a 文库己成为研究 功能基因组学的基本手段之一。e d n a 文库是指某种生物某一发育时期所转录的各种 m r n a 片断与克隆载体重组，并储存于某一受体菌群体中，进而形成的克隆的集合。 c d n a 文库便于克隆和大量扩增，构建的文库复杂性低，适于特异基因的分离，而且 从e d n a 文库中筛选分离的目的基因可直接用于表达【删。因此e d n a 文库的构建往 往是分子生物研究和基因工程操作的出发点。 2 1 经典e d n a 文库构建的原理和方法 经典e d n a 文库构建的基本原理是用o l i g o ( d t ) 或随机引物为逆转录引物合成 e d n a ，再给合成的c d n a 加上适当的衔接头，连接到适当的载体中获得文库【4 1 】 其基本步骤包括：m r n a 的制备、e d n a 第一链的合成、双链e d n a 的合成、e d n a 与载体的连接、质粒的转化或噬菌体颗粒的包装及转染等。 2 1 1 提取细胞总r n a 并分离纯化m r n a 细胞总r n a 主要由m r n a ，t r n a 和r r n a 三类分子组成。m r n a 含量较少，通 常仅占细胞总r n a 的l 5 ，且分子种类繁多，分子量大小不一。但绝大多数真核 m r n a 分子的3 端都含有一段p o l y ( a ) 尾巴，可与寡聚胸腺p m 核昔酸o l i g o ( d t ) 发 生碱基配对。当细胞总r n a 流经结合有o l i g o ( d t ) 的纤维素柱时，m r n a 分子的p o l y ( a ) 尾巴便会与o l i g o ( d t ) 杂交结合而吸附到纤维素柱上，从而可将m r n a 与t r n a 和 r r n a 分子分离开来。高质量m r n a 的制备对构建e d n a 文库至关重要。因此处理 m r n a 样品时必须仔细小心，同时在合成e d n a 第一链前还要对其完整性进行检测。 2 1 2 以m r n a 分子为模板合成e d n a 第一链 高质量的m r n a 在逆转录酶的作用下用适当的引物引导合成c d n a 第一链。常 用方法有两种，即o l i g o ( d t ) 弓l 导的c d n a 合成法和随机引物引导的e d n a 合成法。 7 1 3 一萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏e d n a 文库的构建及分析 o l i g o ( dr ) 引导合成法也是利用真核m r n a 分子具有p o l y ( a ) 尾巴这种特性。通 常情况下，用1 2 2 0 个脱氧胸腺嘧啶核苷酸组成的o l i g o ( d t ) 短片段作为引物合成 e d n a 第一链，形成一种r n a d n a 杂交分子产物。但是这种方法要求e d n a 的合成 必须从3 端开始，而且易于从模板上脱离的逆转录酶往往无法达到m r n a 分子的5 端，这对分子量较大的长m r n a 而言是一个特别麻烦的问题。 随机引物引导合成法是根据各种可能的序列，合成出由6 1 0 个核昔酸组成的所 有寡核昔酸短片断为引物，这种随机短片断引物可与m r n a 模板在多个位点同时发 生配对杂交，这样e d n a 的合成就不仅仅从3 端一处开始。应用这种方法合成的 e d n a 常包含m r n a 模板的完整信息，尤其适用于较长m r n a 克隆。 2 1 3 双链e d n a 的合成是将m r n a d n a 杂交分子转变为双链e d n a 分子 通常用碱处理使杂交分子中的m r n a 模板降解，e d n a 第一链解离。单链e d n a 在其3 端发生自身环化，形成一个发夹环结构，在d n a 聚合酶的作用下便产生了 一个具有完整发夹结构的双链e d n a 分子。最后用s 1 核酸酶将该发夹环切割，得到 双链e d n a 分子。由于s l 核酸酶的单链切割作用常常导致m r n a 分子5 端的许多 信息丢失，目前常用大肠杆菌r n a s e h 降解来代替【4 2 1 。 2 1 4 双链e d n a 的末端修饰 用末端转移酶加尾或用t 4 d n a 连接酶在3 和5 端加上合适的衔接头，再与 经过适当处理而具有相应末端的载体分子连接。构成的重组子导入大肠杆菌宿主细胞 进行扩增，便得到了所需的e d n a 文库。双链e d n a 同载体的有效连接是e d n a 文 库构建好坏的关键，要选择尽可能有效的载体。 2 2 其它e d n a 文库的构建方法和技术 经典e d n a 文库存在的不足之处：第一，低丰度表达序列在文库中出现的机率很 低，因此，要想得到低丰度表达基因，至少要筛选1 0 6 个克隆；第二，构建经典e d n a 文库所需要的m r n a 量大，达数微克；第三，筛选经典e d n a 文库工作复杂，需要 时间长，限制了基因克隆的速度。在c d n a 文库中，相对于高丰度m r n a 的e d n a 广东海洋大学硕士学位论文 克隆所占的比例较高，分离起来也容易，而相对于低丰度m r n a 的e d n a 克隆所占 的比例较低，分离也就困难。为了解决低丰度或稀有m r n a 不易进行e d n a 克隆的 问题，近年来也相应发展了一些新的e d n a 文库的构建方法和技术，如差减e d n a 文库、均一化e d n a 文库、染色体或区域特异性e d n a 文库和固相e d n a 文库等。 2 2 i 差减c d n a 文库 差减c d n a 文库( s u b s t r a c t e dc d n a l i b r a r y ) 又称扣除文库。最早出现于上世纪8 0 年代初期【4 3 1 。其基本原理是从两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不 同的材料中提m r n a ，通过杂交使两种材料相同的表达基因彼此去除，最后将含有 相关目的基因的未杂交部分收集，并连接到载体上构成文库。该方法可以使差异表达 的基因得以富集，常用于克隆不同组织或同一组织在不同生理或病理状态下的差异表 达基因。差减杂交是构建差减文库的核心，差减杂交的效率决定了差减文库的质量。 差减杂交的方法有：( 1 ) 羟基磷灰石柱层析法( h a p ) f 4 4 1 ；( 2 ) 生物素标记一链亲和蛋白 结合排除法【4 5 】；( 3 ) 限制性内切酶与p c r 技术相结合的差减方法 4 6 1 ；( 4 ) 抑制差减杂交 法( s s h ) 【4 7 1 ；( 5 ) 磁珠介导的差减法( m a s t ) 4 8 】。 2 2 2 均一化e d n a 文库 均一化e d n a 文库包含了某一特定组织或细胞的所有表达基因，且表达基因对应 的c d n a 的拷贝数相等或接近。目前其构建方法主要有两种【4 9 - 5 0 1 ：一种是基于复性动 力学原理，在退火条件下，高丰度的e d n a 复性速度快，而低丰度的e d n a 复性需 要很长时间，从而通过延长复性时间使各种单链d n a 分子的浓度趋于均衡。另一种 是基因组d n a 饱和杂交法，通过e d n a 与基因组d n a 饱和杂交而降低在文库中高 拷贝存在的e d n a 的丰度。均一化e d n a 文库胜要有以下四方面的优点：第一，增 加了克隆低丰度m r n a 的机会，适用于分析发育阶段的基因表达及突变检测【5 。第 二，克服了因基因转录水平的巨大差异给文库筛选和分析带来的障碍，有利于研究基 因的表达和序列分析。第三，在大规模的e s t 测序中，可节约大量的实验成本。第 四，用与原始丰度的m r n a 拷贝数相对应的e d n a 探针与均一化的e d n a 文库作杂 交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。 2 2 3 染色体或区域特异性e d n a 文库 用某一染色体或基因组的d n a 与合成的e d n a 或已构建的e d n a 文库杂交，再 9 1 3 一萘黄酮诱导剑尾鱼肝脏e d n a 文库的构建及分析 将捕获的e d n a 进行p c r 扩增便可用于构建染色体或区域特异性e d n a 文库。文库 的e d n a 或定位于该染色体上或与之有同源性。这种文库可以有效地分离与染色体相 关的疾病基因，基因定位，以及种、属间同源基因的筛查【5 2 1 。 2 2 4 固相e d n a 文库 e d n a 通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，并在其上完成e d n a 的合成 与修饰。在反应过程中所用的酶和试剂与传统方法完全相同，只是在反应过程中可简 便而迅速的实现酶和缓冲液的更换【5 3 】。这种方法简便了e d n a 合成的操作，而且在 更换缓冲液时，e d n a 不会丢失，也不会被其它物质污染，所构建的文库质量高，并 包含了较小的e d n a 。因此，它可能会替代目前应用的e d n a 文库操作。 2 3e d n a 文库的应用 以d n a 片段为探针或通过特异性抗体结合重组e d n a 克隆表达的蛋白从文库中 分离目的基因，并直接用于该目的基因的表达研究；以外源物种的e d n a 为探针，通 过c d n a 文库筛选相应的同源基因；研究某些r n a 病毒，如流感病毒、脊髓灰质炎病 毒和呼肠孤病毒等的基因结构，并对其有关基因进行克隆分析；用于从某一特殊组织 中克隆特定序列，可极大地简化筛选工作量。如从鸡的输卵管所制备的c d n a 基因文 库中克隆卵清蛋白的基因序列；e d n a 克隆可在细菌中表达，直接应用于基因工程操 作，获得有生物活性的蛋白质产物：可用于真核细胞m r n a 的结构和功能研究，方 便地进行序列分析，初步确定m r n a 的起始、编码、转录与翻译的终止序列；用于 差异筛选技术和e d n a 微阵列技术以及建立表达序列标签( e s t ) 数据库，是目前功能 基因组学研究的基本手段之一；获得r f l p 分析标记，因为e s t 在染色体上大多是 单拷贝，位置数目有限，是很好的r f l p 标记来源。 2 4 表达序列标签及其应用 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 是指从不同组织来源的e d n a 文库中 随机挑选克隆进行3 或5 端测序后得到的部分e d n a 序列，长度一般在3 0 0 5 0 0 b p 左右。这一概念是由美国国立卫生研究院( n i h ) 生物学家v e n t e r 及其研究小组提出的， 它伴随着人类基因组计划而诞生。a d a m s 等于1 9 9 1 年首次将这一技术的应用于人脑 组织e d n a 文库的随机克隆测序【5 4 1 。e s t 最先应用于人类基因组计划，随后其它物 l o 广东海洋大学硕士学位论文 种e s t 计划相继开展，e s t 便被视为一种获取基因的重要捷径。 2 4 1 表达序列标签形成的原理 基因表达遵从中心法则，在此过程中遗传信