（遗传学专业论文）京杭大运河杭州段水体中微生物结构与功能的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 微生物的群落结构与功能是微生物生态学的研究主题之一。水体中微生物与 区域环境有着密切的联系，在物质循环与能量流动中发挥着非常重要的作用，研 究微生物群落结构与功能有助于了解水环境污染现状及水域中c 、n 、p 循环方 式。为了对运河水环境的综合评价及进一步治理提供参考，本实验室于2 0 0 4 2 0 0 5 年对京杭大运河杭州段水体中可培养微生物的结构与功能进行了研究。 我们按季节采集水样，通过稀释涂平板( c f u ) 法和最大或然数( m p n ) 法 进行功能菌群的计数，用统计学的方法分析各功能微生物菌群的数量变化特征； 根据菌落特征，挑选优势菌，分离纯化后测定和比对其1 6 sr d n a 的部分序列， 进行分子鉴定和系统分类研究。 结果表明，水体中可培养异养细菌( 氨化细菌) 年平均值高达1 6 4 1 0 5 c f u m l ，固氮菌1 3 9 x 1 0 4c f u m l ，氨氧化细菌、亚硝酸氧化细菌分别为1 4 3 m p n m l 和1 9 2 5m p n m l ，脱氮菌、硝酸还原菌分别为9 3 5 1 0 3m p n m l 和 7 9 5 x 1 0 4m p n m l ，好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌分别为1 7 5 m p n m l 和5m p n m l ，无机磷分解菌和有机磷分解菌分别是2 7 5 x 1 0 4c f u m l 和5 7 2 1 0 3m p n m l 。水体中较高的异养微生物数量说明运河还遭受着严重的污 染。从空间分布看，远离杭州市区的义桥和塘栖大桥的微生物指标相对较好，而 在市区的几个位点，特别是拱宸桥的微生物指标较差；回归分析显示各类功能微 生物类群数量季节间差异并不显著。 对分离纯化得到的优势菌进行了分子鉴定和系统分类，结果表明，7 个优势 氨化细菌菌株中有6 株属于y 变形菌亚纲，分别为a c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i ， a e r o m o n a sh y d r o p h i l a k l e b s i e l l ap n e u m o n i a p s e u d o m o n a sr e a c t a n s ，y e r s i n i a k r i s t e n s e n i i ，e s c h e r i c h i ac o l i ；1 株疑似a 变形菌亚纲的b r e v u n d i m o n a st e r r a e ， 但两者序列相似仅为9 3 6 1 ，需进行进一步研究。6 株固氮菌中5 株属于y 变 形菌亚纲，分别为c i t r o b a c t e r 加u n d i i ，p s e u d o m o n a ss y n x a n t h a ，e n t e r o b a c t e r a s b u r i a e ，a c i n e t o b a c t e r o h n s o n i i ，k l e b s i e l l a p n e u m o n i a ，另外一株为变形菌亚 纲的a g r o b a c t e r i u mr u m e f a c i e n s 。5 株硝酸盐还原菌中4 株c f 加6 邪柳加“h 讲f ， a e r o m o n a ss a l m o n i c i d a ，a c i n e t o b a c t e r j u n i i ，p s e u d o m o n a sl i b a n e n s i s 属于y 变形 浙江大学硕士学位论文 菌亚纲，另外l 株c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i 属于b 变形菌亚纲。5 株有机磷分解 菌中，有3 株属于y - 变形菌亚纲，分别为k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ，e s c h e r i c h i ac o l i ， p a n t o e aa g g l o m e r a n s ，另外2 株属于b 一变形菌亚纲分别为a c h r o m o b a c t e r x y l o s o x i d a n s ，a c i d o v o r a xt e m p e r a n s 。9 株无机磷分解菌中，有7 株属于y - 变形菌 亚纲，分别为p a n t o e aa g g l o m e r a n s ，a c i n e t o b a c t e rs e o h a e n s 拈，p r o t e u sm i r a b i l i s ， p s e u d o m o n a s j e s s e n i i ，k l e b s 括l l ao r n i t h i n o l y t i c a ，c i t r o b a c t e r f r e u n d i i ，a e r o m o n a s c a v i a e ，另外2 株为属于放线菌纲的a u r e o b a c t e r i u mr e s 由t e n s 和黄杆菌纲的 c h r y s e o b a c t e r i u ms c o p h t h a l m u m 。实验室实验表明，分离得到的磷分解菌释放水 溶性磷的能力并不高。 关键词：京杭大运河，异养细菌，氮利用细菌，磷细菌，纤维素分解菌，1 6 sr d n a 磷释放 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f m i c r o o r g a n i s m si sa ni m p o r t a n ts t u d yt o p i co ft h e m i c r o b i a le c o l o g y m i c r o o r g a n i s m si na q u a t i ce c o s y s t e m sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n n u t r i e n tc i r c u l a t i o na n d e n e r g yf l o w s t u d y i n g t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f m i c r o o r g a n i s m sw a sr e d o u n dt o r e v e a lt h em e c h a n i s m so fc a r b o n ，n i t r o g e no r p h o s p h o r u sc i r c u l a t i o ni na q u a t i ce c o s y s t e m s i no r d e rt om o r ec l e a r l yu n d e r s t o o dt h e r o l eo fm i c r o o r g a n i s m si ne u t r o p h i ca q u a t i ce c o s y s t e m sa n do f f e rs o m ea d v i s eo n p o l l u t i o nc o m p o s i t i v ec o n t r o l ，w es t u d i e dt h ep h y s i o l o g i c a lg r o u ps t r u c t i o na n d f u n c t i o no fc u l t i v a b l em i c r o o r g a n i s m si nt h ew a t e rb o d yo fh a n g z h o us e c t i o no ft h e g r a n dc a r i a li n2 0 0 4 2 0 0 5 w a t e rs a m p l e sw e r ec o l l e c t e ds e a s o n a l l y t h eb a c t e r i a l p h y s i o l o g i c a lg r o u p s w e r ec o u n t e db yc o l o n y f o r m i n gu n i t ( c f u ) m e t h o do rm o s tp r o b a b l en u m b e r ( m p n ) m e t h o d b a s e d0 nc o l o n yc h a r a c t e r i s t i c s ，p r e d o m i n a n tb a c t e r i a lw e r ef u r t h e ri s o l a t e d a n dt h e i rp a r t i a l16 sr d n aw e r es e q u e n c e da n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n sw e r e c o n s t r u e t c d r e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h ea n n u a la v e r a g ea m o u n to fh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a ( a m m o n i f i e r s ) i sa sh i g ha s1 6 4 x 1 0 5c f u m l ，n i t r o g e nf i x e r s ，a m m o n i ao x i d i z e r s ， n i t r i t eo x i d i z e r s ，n i t r a t er e d u c e r sa n dd e n i t r i f i e r sw e r e1 3 9 xl0 4c f u m l ，1 4 3 m p n m l ，1 9 2 5m p n m l ，7 9 5 1 0 4m p n m la n d9 3 5 1 0 3m p n m l ，r e s p e c t i v e l y ； i n i r g a n i cp h o s p h a t es o l u b i l i z i n gb a c t e r i a ( i p b ) a n do r g a n i cp h o s p h o r u sm i n e r a l i z i n g b a c t e r i a ( o p b ) w e r e2 7 5 x 1 0 4c f u m la n d 5 7 2 1 0 3 m p n m l ，a e r o b i ca n d a n a e r o b i cc e l l u l o s ed e c o m p o s e r sw e r e1 7 5m p n m la n d5m p n m l ，r e s p e c t i v e l y t h el a r g ea m o u n to fh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i ai n d i c a t e st h a ts e v e r ep o l l u t i o ns t i l le x i s t s i nt h ew a t e rb o d yo fc a n a l f r o ms p a t i a ld i s t r i b u t i o n ，m i c r o o r g a n i s m sa r er e l a t i v e l y l o w e ri ny ib r i d g ea n dt a n g q ib r i d g e ，t w ol o c a t i o n sf a ra w a yf r o md o w n t o w n ，t h a n t h o s ei ng o n g c h e nb r i d g e ，al o c a t i o ni n s i d eh a n g z h o uc i t y h o w e v e r , t h e r ei sn o s i g n i f i c a n tv a r i a t i o nf r o ms e a s o n a ld i s t r i b u t i o n 3 浙江大学硕士学位论文 t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a t ，a m o n gt h e7 h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i as t r a i n s ，6s t r a i n s 卅c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i ija e r o m o n a sh y d r o p h i l a ，k l e b s i e l l ap n e u m o n i a ， p s e u d o m o n a sr e a c t a n s ，y e r s i n i ak r i s t e n s e n i i ，e s c h e r i c h i a c o l i ) b e l o n gt o t - p r o t e o b a c t e r i a , t h eo t h e rs t r a i nh a dn o te n o u g hh i g hs i m i l a r i t i e s ( a b o u t9 3 6 1 ) w i t h i t sc l o s e s tm a t c h e s ( b r e v i b a c t e r i u mt e r r a e ) ，w h i c hi sb e l o n g st oa p r o t e o b a c t e r i a ，t h i s s t r a i ni sw o r t hf a r t h e r s t u d y i n g a m o n gt h e6n i t r o g e nf i x e rs t r a i n s ，5s t r a i n s ( c i t r o b a c t e r f r e u n d i i ，p s e u d o m o n a ss y n x a n t h a ，e n t e r o b a c t e ra s b u r i a e ，a c i n e t o b a e t e r j o h n s o n i k l e b s i e l l ap n e u m o n i a ) b e l o n gt o y - p r o t e o b a c t e r i a , a n o t h e r s t r a i n ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) b e l o n g st o c t - p r o t e o b a c t e r i a a m o n g t h e5n i t r a t e r e d u c e rb a c t e r i as t r a i n s ，4s t r a i n s ( c i t r o b a c t e rf r e u n d i i ，a e r o m o n a ss a l m o n i c i d a ， a c i n e t o b a c t e rj u n i i ，p s e u d o m o n a sl i b a n e n s i s ) b e l o n gt oy - p r o t e o b a c t e r i a , t h eo t h e r s t r a i n ( c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i ) b e l o n gt o1 3 - p r o t e o b a c t e r i a a m o n gt h e5o p b s t r a i n s ， 3s t r a i n s ( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ，e s c h e r i c h i ac o i l ，p a n t o e a a g g l o m e r a n s ) b e l o n g t o7 - p m t e o b a c t e r i a , t h eo t h e r2s t r a i n s ( a c h r o m o b a c t e rx y l o s o x i d a n s ，a e i d o v o r a x 地m p e r a n s ) b e l o n gt o1 3 - p r o t e o b a c t e r i a a m o n gt h e9i p bs t r a i n s ，7s t r a i n s ( p a n t o e a a g g l o m e r a n s a c i n e m b a c 陀rs e o h a e n s 括rp r o t e u sm i r a b i l l s p s e u d o m o n a s e s s e n i i k l e b s 地l l a o r n i t h i n o l y t i c ar c i t r o b a c 胞rp e u n d i i a e r o m o n a sc a v i a e 、b e l o n gt o 7 - p r o t e o b a c t e r i a , t h eo t h e r2s t r a i n s ( a u r e o b a c t e r i u mr e s i s t e n s ，c h r y s e o b a c t e r i u m s c o p h t h a l m u m ) ，b e l o n g st oh i g hg + c g r a mp o s i t i v eb a c t e r i u ma n df l a v o b a c t e r i a r e s p e c t i v e l y l a b o r a t o r yt e s t ss h o w e dt h a t ，t h ep h o s p h o r u sr e l e a s ea b i l i t i e so fs e l e c t e d p h o s p h o b a e t e r i a ls t r a i n sa l er e l a t i v e l yl o w k e y w o r d ：t h eg r a n dc a n a l ，h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a ，n i t r o g e n u t i l i z i n g ， p h o s p h o b a c t e r i a ，c e l l u l o s ed e c o m p o s i n gb a c t e r i a ，1 6 sr d n a ，p h o s p h o r u sr e l e a s e 4 浙江大学硕士学位论文 日舌 京杭大运河是世界上开凿时间最早、流程最长的一条人工河流。全长 1 8 0 1 k m ，是苏伊士运河的1 6 倍，巴拿马运河的3 3 倍，纵贯南北，历史上曾是 我国南北交通的大动脉。它北起北京通州，南至浙江杭州，纵贯北京、天津、河 北、山东、江苏、浙江6 省市；沟通海河、黄河、淮河、长江、钱塘江5 大河流。 联接五大水系的京杭大运河是我国古代伟大的水利工程，也是中国唯一南北走向 的长河，对我国古代南北政治、经济、文化交流发展起到了重大作用。它和长城 并称中国古代的两大工程奇迹。 运河( 杭州段) 是京杭大运河的最南端河道，干流从运河和钱塘江沟通口一一 三堡船闸，至余杭区博陆东止，全长4 8k m ，从南至北横贯杭城，属太湖流域平 原河网水系。从三堡船闸至义桥干流两侧支流纵横，港叉密布，与东苕溪、上塘 河、西湖和钱塘江也有密切联系。运河( 杭州段) 是杭州市主城区水位最低的地 表河流，常年平均水位3 2 3m ，是市区各类河水、地表径流和众多支流的主要受 纳水体。 二十世纪五十年代初，运河水质清洁，水草丛生，鱼虾遍布。此时，运河具 有饮用水源、渔业养殖、航运、农业灌溉等多种功能。六十年代后，随着工业的 发展和人口增加，大量工业废水和生活污水排入运河。使水生态环境遭到严重破 坏，水质逐年恶化，至七十年代末，鱼虾绝迹，部分河段水质黑臭。在2 0 世纪 8 0 年代，水质恶化到极点，水质常年黑臭，于流断面d o 几乎为零，水质指标 劣于地表水v 类标准。运河( 杭州段) 水流滞缓，水资源贫乏，补充水源少， 1 9 9 9 年两次实测干流平均流速o 0 6 7 0 1 7m s ，平均补充水量不到3m 3 s ，自净 能力低，运河已成为杭州市污染最为严重的河道( 沈满洪，2 0 0 1 ) 。 浙江省、杭州市历届政府都十分关注运河( 杭州段) 污染综合防治，二十 世纪八十年代后期开始，相继实施了运河一一钱塘江沟通工程、中东河治理工程、 西湖引水工程、运河截污工程、运河疏浚工程。运河经过多年的综合整治和污染 治理工程后，运河水质恶化的势头开始得到遏制，特别使钱塘江环境引水工程对 改善运河水环境效果明显，使运河水污染得到基本控制。但运河水质总体上仍劣 于v 类，污染状况仍相当严重。 5 浙江大学硕士学位论文 运河的水质状况与杭州作为国际风景旅游城市极不相称。近年来，市政府 进一步加大对运河整治的力度，让运河水变清已成为杭州市政府的一项重要举 措，对运河进行了大规模的截污、疏浚、引配水、两岸整治等综合治理，特别是 2 0 0 1 年起，杭州市全面启动新一轮运河杭州段综合整治和开发保护工程，凸现 运河航运、水利、居住、生态、文化、旅游这6 大功能。2 0 0 0 年后，运河( 杭 州段) 水体生态得到改善。多数河段消除了黑臭现象，特别是在2 0 0 1 年后，市 区干流水质黑臭现象基本消除，水环境质量有了质的提高( 蔡临明，2 0 0 3 ) 。与 1 9 9 9 年前相比，2 0 0 1 年的生态环境质量得到明显恢复和改善。运河杭州段的污 染治理已达到了阶段性目标：消除水体黑臭，改善并基本实现水环境的生态功能。 目前，运河的污染得到了一定的控制和减负，但距生态恢复到良性生态环境质量 还有距离，还有很多工作要做。 水体中微生物与区域环境有着密切的联系，在物质循环与能量流动中发挥着 非常重要的作用，研究微生物群落结构与功能有助于了解水环境污染现状及水域 中c 、n 、p 循环方式。 氮素是生物有机体的重要组成元素之一，氮素循环是自然界中各种元素循环 的中心。微生物在氮素的物质转化和能量流动中起着非常重要的作用( f r e t t ee t a l ， 1 9 9 7 ) 。水体中的固氮细菌能固定大气中不活泼的气态氮，因此会增加湖泊的氮 负荷( m o l e ne ta l ，1 9 9 8 ；g r u b e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。氨化细菌可将大分子有机含氮化合 物分解成植物可利用的氨态氮，因此有利于有机污染物的降解和转化；氨氧化细 菌能将氨氮氧化成亚硝氮，而亚硝酸氧化细菌能将亚硝氮氧化成硝氮( a c e a e ta 1 ， 1 9 9 6 ；s t i e fe ta 1 ，2 0 0 3 ) ，因而可避免氨盐和亚硝酸盐对水生生物的毒害作用。 生成的硝酸盐可被植物吸收利用，未被吸收的硝酸盐也可被硝酸盐还原菌或脱氮 菌还原。其中的脱氮菌能将硝酸盐还原成气态的n 2 或n 2 0 而释放到大气中，因 此可减少水生生态系统的氮负荷( t a k a y ae ta l ，2 0 0 3 ；s i e m e n se la 1 ，2 0 0 3 ) 。正是 由于水域中各类氮利用菌的相互作用，才使生态系统中各种氮的形态保持在一个 合适的水平。 碳素循环也是地球化学循环的重要内容之一，微生物在碳素的分解过程中发 挥着不可替代的作用。在碳素循环中，绿色植物和藻类通过光合作用将大气中的 c 0 2 固定成细胞内的含碳物质，另外，入河水体中也会有一部分碳素负荷带入， 浙江大学硕士学位论文 再加上旅游垃圾中的含碳化合物，构成了运河碳素的主要来源。这些漂浮于水体 中或沉入湖底的含碳物质或被异养微生物分解成腐殖质，或被微生物吸收参与湖 泊食物链循环，或通过呼吸或发酵作用生成气态物质( 如甲烷，c 0 2 等) 回归到 大气中。因此，异养微生物在碳素的分解过程中发挥着不可替代的作用。自然界 中的有机碳可以以多种形式存在，如纤维素、半纤维素、几丁质、木质素、腐殖 质等。其中纤维素( c e l l u l o s e ) 是分布最广的一类，了解水体中纤维素分解菌的数 量及分布，对研究整个水域生态系统的碳素循环具有积极的意义。 磷是影响水体生产力的主要营养物质，在水生生态系统中可以以有机磷和水 不溶性无机磷等多种形式存在。其中水溶性无机磷( w s i p ) 是最重要的一种， 因为它能被浮游植物直接吸收，因此可直接地影响水体生产力：水不溶性无机磷 ( i s i p ) 和有机磷( o p ) 不能被浮游植物直接利用，但能被无机磷溶解菌( i p b ) 和有机磷分解菌( o p b ) 转变成可溶性的形式( k i m e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。由此可见微生 物在释磷过程中也起着非常重要的作用。 然而，目前对水生生态系统的研究大多停留在物质转化和能量流动的形式 上，至于转化的机理及参与转化的微生物的多样性还不是很清楚。从群落或种群 水平上对微生物区系的分析不但可以了解环境潜在的生理生化能力( g l o c k n e re t a l ，2 0 0 0 ) ，而且有可能分离筛选到具有优良性状的功能微生物菌株。 最近，随着分子生物学技术的发展，一系列揭示生态系统中微生物系统发育 多样性的方法得以建立。基于p c r 技术的1 6 sr r n a 基因分析方法就是其中之 一。根据微生物的菌落形态挑选有代表性的菌株，测定其1 6 sr d n a 序列并对其 加以鉴定，已发展成一种方便而有效的群落结构多样性分析方法，并已有力地促 进了微生物生态学的发展( h e n d r i ke la 1 ，2 0 0 1 ) 。 为了对运河水环境的综合评价及进一步治理提供参考，本实验室于 2 0 0 4 - - - 2 0 0 5 年对京杭大运河杭州段水体中参与n 、p 和c 素循环的可培养微生 物的结构与功能进行了研究。 我们按季节采集水样，通过稀释涂平板法和最大或然数( m p n ) 法进行功 能菌群的计数，用统计学的方法分析各功能微生物菌群的数量变化特征；根据菌 落特征，挑选优势菌，分离纯化后测定和比对其1 6 sr d n a 的部分序列，进行分 子鉴定和系统发育关系研究。 浙江大学硕士学位论文 材料与方法 1 样品采集 1 1 采样位点 参照环保部门的监测站位，沿运河干流从上游( 顾家桥) 到下游( 武林头塘 栖大桥) 选取5 个断面：顾家桥、卖鱼桥、拱宸桥、义桥、塘栖大桥( 见图1 ) 。 图1 运河杭州段采样位点示意图 f i g 1 s c h e m a t i cd i a g r a mo f s a m p l e si nt h es e c t i o no f t h eg r a n dc a n a l 浙江大学硕士学位论文 1 2 采样时间 分别于2 0 0 4 年2 月2 3 日( 冬) 、5 月1 3 日( 春) 、8 月1 7 日( 夏) 和1 1 月 2 4 目( 秋) ，按季采集4 次水样。由于运河水浅，河水一年四季都不发生分层现 象，因此只调查微生物在河水中的水平分布，采样点仅设水面下3 0 c m 一处深度。 2 培养基和试剂 2 1 计数用培养基( 许光辉等，1 9 8 6 ) 2 1 1 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏o 3 琼脂2 o 蛋白胨1 n a c io 5 p h 7 0 7 2 2 1 2 阿须贝( a s h b y ) 无氮琼脂培养基 葡萄糖1 k 2 s 0 40 0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 2 k 2 h p 0 4o 0 2 琼脂2 o p h 7 2 - 7 4 2 1 3d o b u s 纤维素培养基 n a n 0 30 0 5 k 2 h p o d0 1 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 f e 2 ( s 0 4 ) 3 痕迹 p h7 5 n a c lo 0 2 c a c 0 30 5 k c l0 0 5 琼脂2 o 将培养基分装于试管内，每管1 0 m l ，然后加入滤纸条一条( 普通滤纸剪 成7 1c m 2 纸条) ，滤纸条附于试管壁上，一部分浸入培养液内，一部分 暴露于空气中，1 2 i 灭菌2 0 分钟。 2 1 4 o m e l i a n s k y 纤维素培养基 ( n h 4 ) 2 s 0 41 k 2 h p 0 4o 1 m g s 0 4 7 h 2 0 o 0 5 c a c l 2 0 2 n a c l 痕迹 琼脂2 o p h7 3 将培养基分装于试管内，每管1 0 m l ，各管中插入l 3c m 2 滤纸条一片( 深 层造成厌氧条件) ，1 2 1 灭菌2 0 分钟。 浙江大学硕士学位论文 2 1 5 氨氧化细菌计数用培养基 ( n h 4 ) 2 s 0 40 0 5 k 2 h p 0 40 1 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 3 c a c 0 3o 7 5 p h 自然，分装试管，每管3 m l n a c l0 0 3 f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 3 2 1 6 亚硝酸氧化细菌计数用培养基 k n 0 20 0 0 0 6 k 2 h p 0 40 1 n a c l0 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0o 0 1 c a c 0 30 ，1 f e s 0 4 7 h 2 0 o 0 0 3 c a c l 2 0 0 3 p h 自然，分装试管，每管3 m l 2 1 7 g i l t a y 培养基 溶液a k n 0 3o 2 天冬酰胺0 2 1 溴百里酚兰酒精溶液1 ( 体积比) 溶液b 柠檬酸钠1 7 m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 f e c l 3 6 h 2 0o 0 1 k h 2 p 0 40 2 c a c l 2 - 2 h 2 0 0 0 4 混合a 、b 两溶液，p h7 0 7 2 2 1 8 有机磷分解菌培养基 葡萄糖1 f e s 0 4o 0 0 3 ( n i - h ) 2 s o a 0 0 5 k c l0 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 o 0 3 卵磷脂o 0 0 2 5 p h7 0 7 4 2 1 9 无机磷溶解菌培养基 葡萄糖1 f e s 0 4 o 0 0 3 ( n t - h ) 2 s 0 4 o 0 5 k c io 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 3 c a 3 ( p 0 4 ) 20 4 n a c lo 0 3 m n s o a0 0 0 3 c a c 0 3o 5 n a c lo 0 3 m n s o do 0 0 3 琼脂2 1 0 浙江大学硕士学位论文 2 2 生理生化特性测定用培养基( 东秀珠，2 0 0 1 ) 葡萄糖氧化发酵培养基，吲哚试验培养液，甲基f 工v - p 试验培养基，柠檬酸 盐利用试验培养基，硝酸盐还原试验培养液，硫化氢试验培养液，明胶培养基 2 3 微生物生理群计数用试剂 2 3 1 g r i e s s - l l o s v a y 试剂： a 液：对氨基苯磺酸o 1 6 9 ，冰醋酸1 0 m l ，蒸馏水3 3 m l b 液：d 一萘胺o 0 3 3 9 先溶解于热蒸馏水3 3 m i ，冷却后加入1 0 m l 冰醋酸 使用前混合a 、b 两液 2 3 2 硫酸钼锑抗试剂： ：9 7 3 m l 浓硫酸，2 0 2 5 m l 蒸馏水 ：钼酸铵1 0 9 ，1 5 0 m l 蒸馏水 ：缓缓倒入中搅拌加入5 0 m l0 5 酒石酸锑钾溶液 使用前1 0 0 m l 试剂加入1 5 9 抗坏血酸 2 4 生理生化特性测定用试剂 2 4 1 1 对氨基二甲基苯胺盐酸盐水溶液 2 4 2 3 h 2 0 2 2 4 3 吲哚试剂：对二甲氨基苯甲醛2 9 ，9 5 7 , 醇1 9 0 m l ，浓盐酸4 0 m l 2 4 4 甲基红试剂：0 0 4 9 甲基红，6 0 m l9 5 7 , 醇，4 0 m l 水 2 4 5 v r 试剂： i 5 a 一萘酚无水乙醇溶液：一萘酚5 9 ，无水乙醇1 0 0 m l i i 4 0 k o h 溶液 2 4 6 1 溴百里酚蓝指示剂：溴麝香草酚蓝1 9 ，0 0 1 mn a o h6 a m l 2 0 乙醇9 3 6 m i 2 4 7 格里斯氏( g r i e s s ) 试剂： a 液：对氨基苯磺酸0 1 9 ，溶于3 0 m l1 0 稀醋酸 b 液：0 0 2 9 e t 一萘胺先溶于4 m l 蒸馏水，然后加入3 0 m l1 0 稀醋酸 浙江大学硕士学位论文 2 4 8 二苯胺试剂：0 5 9 二苯胺溶于1 0 0 m l 浓硫酸中，加入2 0 m l 蒸馏水 2 4 95 - 1 0 的醋酸铅溶液 2 5 分子鉴定用试剂 2 5 1d n a 提取用主要试剂( w ug e n f ue t a l ，2 0 0 5 ) o 2 m o l ln a o h 溶液0 2 m o l lh c i 溶液 2 5 21 6 sr d n a 特异性扩增实验用试剂 t a qd n a 聚合酶，1 0 p c rb u f f e r ( 含m 9 2 + ) ，d n t p ( 1 0 m me a c h ) ( 购自 t a k a r a ) l o g mf 2 7 ，1 4 9 2 rp r i m e r ( 生工合成) f 2 7 ：5 。一3 g a g l v i t g a t c c t g g c t c a 1 4 9 2 r ： 5 一3 a c g g r l a c c t t g r i a c g a c t t ( o s u l l i v a ne l a l 2 0 0 4 ) 2 5 3 电泳试剂 1 琼脂糖溶液o 5 t b e 缓冲液e b 染液 d n a 加样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖或6 x 上样b u f f e r ( t a k a r a ) 3 主要仪器设备 电子天平，蒸汽灭菌锅( a u t o c l a v em l s 3 0 2 0 ，s a n y o ) ，恒温培养箱( d h p 9 0 8 2 型，上海一恒科技有限公司) ，光学显微镜，恒温摇床，分光光度计( l e n g g u a n g - 7 2 2 ， 上海精密科学仪器有限公司) ，高速台式离心机( t g l 1 6 c 型，上海安亭科学 仪器厂) ，p c r 仪( b i o m e t r a rt g r a d i e n tt h e r m o b l o c k ) ，d y y 1 2 型电脑三恒 多用电泳仪，全自动紫外与可见分析仪( f r 2 0 0 a ，上海复日科技有限公司) ， 电热恒温水槽( d k 8 b ，上海精宏实验设备有限公司) 。 4 各功能菌群的计数 4 1 氮利用菌的计数 4 1 1 氨化细菌( 异养细菌总数) 和固氮菌的计数 一一 氨化细菌( 异养细菌总数) 和固氮菌的计数用稀释涂平板法。氨化细菌的计 数用营养琼脂或肉膏蛋白胨培养基，固氮菌的计数用a s h b y 无氮培养基，数量分 别以3 0 。c 培养2 天和7 天后的菌落形成单位( c f u ) 来表示。 4 1 2 氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌的计数 氨氧化细菌用氨氧化细菌计数培养基( 以硫酸铵为唯一氮源) ，亚硝酸氧化 细菌用亚硝酸氧化细菌计数培养基( 以亚硝酸钠为唯一氮源) 。氨氧化细菌和亚 硝酸氧化细菌的计数采用最大或然数( m p n ) 法( a c e ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 。具体采用 五级梯度稀释，三管重复法。分别向每支试管接种稀释样l m l ，这样每个样品 共接种1 5 支试管。然后把接种的试管和没接种的2 3 支试管( 作为对照) 3 0 培养2 8 天。培养后，向氨氧化细菌的试管中滴入g r i e s s i l o s v a y 试剂1 乏滴。如 出现红色乃至褐色，则说明由于氨氧化细菌的生长繁殖而积蓄了n 0 2 一。2 3 分 钟后再在未现色的试管中加入锌粉少许，静置，如果加入后现红色，则说明生成 的n 0 2 一已由与氨氧化细菌共同存在的亚硝酸氧化细菌氧化成n 0 3 一了。记录下加 锌粉和未加锌粉出现红色的各稀释度试管数，查表得出样品中的氨氧化细菌数。 向培养亚硝酸氧化细菌的各试管滴入g r i e s s i l o s v a y 试剂1 - 2 滴，如果不出现红 色，则说明由于亚硝酸氧化细菌的生长繁殖，消耗掉了n 0 2 一，记录每一稀释度 未出现红色的试管数，查表得出各样品中的亚硝酸氧化细菌丰度。 4 1 3 脱氮菌和硝酸还原菌的计数 脱氮菌和硝酸还原菌的计数也采用最大或然数法( t a k a y ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。用 g i l t a y 培养基( 以硝酸盐为唯一氮源) 分装试管，放入杜氏小管( 倒立) ，注意 勿留气泡，1 1 54 c 灭菌3 0m i n 。测定时将不同稀释度样品l m l 接入试管，3 0 培 养1 4 天后观察。颜色由绿变蓝说明有硝酸盐还原菌生长，在颜色变化的同时产 生气体，说明有脱氮菌生长。 4 2 磷利用菌的计数 无机磷分解菌用无机磷琼脂培养基( 以磷酸钙为唯一磷源) ，稀释涂平板， 3 0 。c 培养7 天后计数菌落形成单位( c f u ) ( n a u t i y a le ta 1 ，1 9 9 9 ) ；有机磷分解 浙江大学硕士学位论文 菌用最大或然数法( m p n ) 计数，样品经1 0 倍梯度稀释后，1m l 稀释液加至9 m l 有机磷培养基( 以卯磷脂为唯一磷源) 中。培养1 4 天后，加入硫酸钼锑抗 显示剂1 9m l ，3 0 c 显色3 0m i n ，颜色变蓝则说明溶液中有水溶性p 的存在， 即有有机磷分解菌生长。 4 3 纤维素分解菌的计数 纤维素分解菌的计数用最大或然数法，好氧性纤维素分解菌用d u b o s 纤维素 培养基，厌氧性纤维素分解菌用o m e l i a n s k y 纤维素培养基，将不同稀释度的样 品分别接入装有上述两种培养基的试管中。3 0 。c 培养1 4 天，滤纸条断裂、变薄 或有斑点，说明有纤维索分解菌生长。 5 优势菌的分离 5 1 氨化细菌和圃氮细菌的分离 根据各自培养基平板内菌落的色泽、表面形状、隆起状况、边缘形状、透明 感等来判断菌落类型，结合细胞形态、革兰氏染色及接触酶和氧化酶等生理生化 反应进行分析。挑取优势菌菌落，划线分离，纯化后保存。 5 2 硝酸盐还原菌和脱氮菌的分离 将硝酸盐还原菌的富集培养物( 即液体稀释法中在g i l t a y 培养基中产酸产气 的试管中的培养物) 稀释后，涂布在营养琼脂培养基中，挑取具有独特形态特征 的菌落，经纯化后接入g i l t a y 液体培养基中进行确证，若培养基变兰，证明是硝 酸盐还原菌，若杜氏小管中有气泡，证明是脱氮菌。 5 _ 3 磷细菌的分离 5 3 1 无机磷分解菌的分离 根据平板内菌落的形态、大小、色泽等特点，挑取具透明圈的独特菌落，划 线分离，纯化后保存。 5 3 2 有机磷分解菌的分离 浙江大学硕士学位论文 用稀释涂平板法，在卵黄培养基( 与无机磷培养基相似，区别是用4 0 r a l 卵 黄和5 9 c a c 0 3 代替磷酸钙) 挑取具透明圈的独特菌落，纯化后保存。 6 菌株的菌种鉴定 6 1 菌株细胞形态观察 革兰氏染色后光学显微镜下观察细胞的形态。 6 2 菌株生理生化特性的测定( 东秀珠，2 0 0 2 ) 氧化酶试验，接触酶试验，葡萄糖氧化发酵，吲哚试验测定，甲基红。p 试验测定，柠檬酸盐利用试验，硝酸盐还原试验测定，硫化氢产生测试，明胶液 化试验 6 3 基于1 6 sr d n a 序列比较的系统发育分析 挑取培养1 8 2 4 h 的细菌2 3 接种环加至o 2 m