（遗传学专业论文）溶酶体半胱氨酸蛋白酶生理功能的研究.pdf

! ! = 堕盟兰垫查叁兰竖! ：论l 作者：刘健 导师：徐i i t 仁、施冈、i ， 一一一 ：= ： c a t i c e m h c i i c l i p h l a m m p p c d e c s m c e c m m t i m p s a p o e 一7 一 。 t n f i f n b f g f t g f m d m v c a m 一1 m c p 一1 l d l r 一一 o x l d l m i a a a e l i s a l v e d d e c g q c a 缩略词表 c a t h e p s i n 组织蛋白酶 i n t e r l e u k i n 一1p c o n v e r t i n ge n z y m e 白介素一1b 转化酶 m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x 主要组织相容性复合物 i n v a r i a n tc h a i n 固定链 c l a s si i a s s o c i a t e di n v a r i a n tc h a i np e p t i d e s i i 类分子相关的固定链肽 h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n 人类白细胞抗原 m a t r i xm e t a l l o p r o t e a s e 基质金属蛋白酶 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h 程序性细胞死亡 e n d o t h e l i a lc e l l 内皮细胞 s m o o t hm u s c l ec e l l 平滑肌细胞 e x t r a c e l l u l a rm a t r i x 血管壁胞外基质 m a c r o p h a g e 巨噬细胞 t i s s u ei n h i b i t o ro f m e t a l l o p r o t e a s e s组织金属蛋白酶抑制剂 a p o l i p o p r o t e i ne - d e f i c i e n t载脂蛋白e 缺失 i n t e r l e u k i n 白介素 t u m o rn e c r o s i sf a c t o r 肿瘤坏死因子 i n t e r f e r o n 二f 扰素 b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 基本的成纤维细胞生长区l 子 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r 转化生长因子 m o n o c y t e - d e r i v e dm a c r o p h a g e 单核细胞来源的巨噬细胞 v a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e 一1 血管细胞粘附分子一1 m a c r o p h a g ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n 一1 巨噬细胞趋化蛋白一1 l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r - d e f i c i e n t低密度质蛋白受体缺失 o x i d i z e dl d l 氧化的低密度脂蛋白( o x l d l ) m y o c a r d i a li n f a r c t i o n 心肌梗塞 a b d o m i n a la o r t i ca n e u r y s m s 腹主动脉瘤 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附分析 l e f tv e n t r i c l ee n dd i a s t o l ed i m e n s i o n 左心室舒张术期范围 e l e c t r o c a r d i o g r a m心电图 q u a n t i t a t i v ec o r o n a r ya n g i o g r a m 冠脉造影 i q 科学技术人学博i j 论义作者：刘健 导帅：徐j i f 乎、施阳、i ? l a d c x r c a a m i a p b i p m i u a c h d v l d l h a r v i i b c p 2 0 e v c b v c p v g p b m d r c p l r n a i l e f ta n t e r i o rd e s c e n d i n ga r t e r y c i r c u m f l e xa r t e r y r i g h tc o r o n a r ya r t e r y a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n a n g i n ap e c t o r i s b r a i no rc e r e b r a li s c h e m i a p r e v i o u sm y o c a r d i a li n f a r c t i o n u n s t a b l ea n g i n ap e c t o r i s c o r o n a r yh e a r td i s e a s e v e r yl o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n h e l i c o v e r p aa f m i g e r a v i t e l l i n b m o r ic y s t e i n ep r o t e i n a s e 2 0 一e c d y s o n e v i t e l l o g e n i cc a t h e p s i nb v i t e l l o g e n i cc a r b o x y p e p t i d a s e v i t e l l o g e n i n p o s t b l o o dm e a l d r a d i c u mc y s t e i n ep r o t e a s e r n ai n t e r f e r e n c e ce l c ec u t i c l em a de p i d e r m i sl a y e r h a l 一c l h e l i c o v e r p aa r m i g e r ac a t h e p s i nl b r f b m g m t 弋x o r f 1 3 r a i n f a tb o d y m i d g u t m a l p i g h i a nt u b u l e t r a c h e a o p e nr e a d i n gf l a m e 左自仃降支 回旋支 右冠状动脉 急性一心f t l t 梗塞 心绞痛 膳i 梗塞 陈旧性心肌梗塞 不稳定心绞痛 冠心病 极低密度脂蛋白 棉铃虫 卵黄蛋白 家蚕半胱氨酸蛋白酶 2 0 一羟基蜕皮酮 卵黄c a tb 卵黄丝氨酸羧肽酶 卵黄原蛋白 吸血后 菜蛆半胱氨酸蛋白酶 r n a 干扰 表皮和真皮层 棉铃虫组织蛋白酶l 脑 脂肪体 咋一肠 马氏管 气管 丌放阅读框 扣周科学技术人学博i ：论文作者：刘健导师：徐i io 扛、施冈、i ? 摘要 第一部分 在半胱氨酸蛋白酶中，组织蛋白酶( c a t ) l 是最有效的哺乳动物弹性蛋白 酶和胶原蛋白酶，在多数检验的组织和细胞型中以基础水平广泛表达，并受促炎 性刺激的调控。炎性动脉疾病腹主动脉瘤( a a a ) 矛h 粥样动脉硬化包含了广泛的组 织重建，而这种重建要求弹性蛋白和胶原蛋白的水解。组织蛋白酶l 可能在人 a a a 和粥样动脉硬化损伤( 粉瘤) 中过表达，且在损伤的血管细胞型中的表达 可能被促炎型因子所调控，本研究检验了这一假说。免疫组化和免疫印迹分析证 明了，在人a a a 和粉瘤中c a tl 表达的升高，且表达定位于损伤部位的平滑肌细 胞( s m c ) 、内皮细胞( e c ) 和巨噬细胞中。在原代培养的人s m c 、e c 和单核细胞 来源的巨噬细胞中，促炎性细胞因子或生长因子诱导了c a tl 的表达及其对胞外 胶原蛋白和弹性蛋白的活性。用定量冠脉造影区分了冠脉狭窄( 船= 6 5 ) 病人和 无可检测损伤的病人( ，2 = 3 0 ) ，前者的血清组织蛋白酶l 水平更高( 1 4 7 + 0 3 3 n g m lv s 0 6 0 + 0 0 6n g m l ，p o 0 2 ) 。冠脉狭窄病人中，左前降支的狭窄百分率和 皿清组织蛋白酶水平间存在极显著的相关性( r = o 。5 4 2 ，p 0 0 0 0 1 ) ，这也提示了 c a tl 在这些血管疾病中的重要作用。 粥样动脉硬化和糖尿病是紧密相关的，二者都包含了大量的主动脉弹性蛋白 的降解，并且糖尿病动物主动脉的弹性蛋白活性升高。实验证明了，在人粥样动 脉硬化损伤中，具有弹性蛋白水解活性的c a ts 量的升高，但其内源抑制剂 c y s t a t i nc 的量是降低的，这提示了在粥样动脉硬化或糖尿病人中c a ts 和或 c y s t a t i nc 的血清水平可能被改变。本研究用e l i s a 测定了2 4 0 名病人的c a ts 和c y s t a t i nc 的血清水平。在这些病人中，1 0 7 名是粥样动脉硬化病人( 具有冠 状动脉的狭窄) ，1 0 3 名有糖尿病，3 0 人( 正常人) 无这两种疾病。多线性回归 分析证明了粥样动脉硬化病人( p 0 0 4 ) 与糖尿病人( p = o 0 0 0 5 ) 血清c a ts 水平 升高，在对c y s t a t i nc 水平、肾功能、吸烟和血糖水平调整后，显著性依旧= 0 0 0 8 ， p = 0 0 0 0 5 ) 。此外，在对急性心肌梗塞( p = 0 0 0 9 ) 或陈旧性心肌梗塞p o 0 2 ) 或不 稳定心绞痛( p 0 0 5 ) 病人的吸烟、肌酐、c y s t a t i nc 和血糖水平调整后，其c a ts 水平【包较证常人更高。相反，在对年龄、吸烟和肾功能调整后，糖尿病患者比诈 常人有更高的血清c y s t a t i nc 水平( p = 0 0 0 0 0 1 ) ，而i 二常人与粥样动脉硬化病人u ! u 是无显著性差异( 矽= 0 1 4 ) 。虽然c a ts 或c y s t a t i nc 在粥样动脉硬化和糖尿病巾 的病理生理学作用还需要进一步的研究，但是血清c a ts 水平的升高提示该指标 i i _ j 能成为这两种疾病的生物标记，而应用于临床监测。 关键词：组织蛋白酶l ( c a tl ) ，腹主动脉瘤，粥样动脉硬化，平滑肌细胞，内 皮细胞，巨噬细胞，冠脉狭窄，糖尿病，组织蛋白酶s ( c a ts ) ，c y s t a t i nc ，i f l l 清 j 冈利学技术人学博i j 论义作名：刘健导帅：徐i ! o f 、施周、1 7 第二部分 蜕皮是昆虫发育的一个重要事件。止1 ：6 s 的研究显示半胱氨酸蛋白酶参与了昆 虫的胚胎发育和变态过程，但在其它发育过程中的作用几乎不知道。本研究以鳞 巡曰昆虫棉铃虫为材料，测定了从5 龄到新蛹期问e l ，组织蛋白酶活性在整体、 幼虫表皮和真皮层( c e l ) 以及血淋巴中的变化情况。在5 龄到6 龄的蜕皮期l 、j ， 棉铃虫组织提耿物对c a tb 和l 的选择性底物z p h e a r g m c a 的水解活性比。i i 蜕皮阶段显著升高，并且半胱氨酸蛋白酶抑制剂e 6 4 d 或c a tl 的选择性抑制剂 c l i k l 4 8 能完全或部分抑制该活性。用r t p c r 结合r a c e 方法，从幼虫的c e l 成功克隆了1 5 1 3b p 的c a tlc d n a ，并命名为棉铃虫组织蛋白酶l ( h a r c l ) ， 这是首个克隆的夜蛾科c a tl 。h a r c l 和其它物种的c a tl 有一定的同源性， 并搠有c a tl 类基因一些特征的花样( m o t i f ) 。该基因表达于幼虫的脑、c e l 、 脂肪体和马氏管中。在c e l 以及整体中，h a t c l 的表达在蜕皮期间是较高的， 此后降低。此外，蜕皮激素是一个关键的蜕皮调控激素，而从5 龄到蛹0 天i n j ， 血淋巴中h a r c l 水平与蜕皮激素的滴度相关。c l i k l 4 8 和e 6 4 d 注射进棉铃虫， 导致了5 龄到6 龄的蜕皮延迟，提示h a r c l 在幼虫蜕皮中起到了关键作用。 在全变态昆虫中，如棉铃虫，蛹期( 幼虫到成虫转换期间) 幼虫脂肪体逐渐 被解离后再重建。如上所述，h a r c l 参与了蜕皮过程已经被证实，化是蛹蜕皮 f 再在繁体中该蛋白酶的表达并不降低，提示了其它组织( 如脂肪体) 可能高表达 h a r c l 。组织蛋白酶活性分析显示，蛹初期脂肪体解离的非滞育个体和i 不解离 f 向滞育个体问，脂肪体表现出, h , f n j , 的组织蛋白酶活性变化。活性抑制分析砬示， 在沂肚最高的非滞育和滞育0 天蛹中，h a r c l 导致了大约9 0 的组织蛋白酶活 性。滞f ! j i 和非滞育脂肪体问有类似的h a r c lm r n a 和蚩白表达模式。纰织! 、j 乏研 究、i l a 址示，h a r c l 阳性细胞存在于非滞育和滞育幼虫脂肪体及滞育蛹0 大脂肪体 t ，似在非滞育蛹0 天脂肪体中却消失了。用2 0 羟基蜕皮酮注射滞育蛹，蛹启 动发育后导致脂肪体的重建，结果h a r c l 阳性细胞也消失，表明h a r c l 在脂 肪体解离期间从这些细胞释放出去。此外，血淋巴的w e s t e r nb l o t 和活性分析显 求，释放出的h a r c l 可能存在于脂肪体基质中。这些数据提示h a r c l 在棉铃 虫脂肪体解离过程中起着重要作用。 关键词：棉铃虫，棉铃虫组织蛋白酶l ( h a r c l ) ，蜕皮，整体，表皮和真皮层， i f l l 淋巴，脂肪体，解离 巾罔科学技术人学博i j 论文作揣：刘健 导帅：徐i io 扛、施l 目、i j a b s t r a c t p a r t0 n e t h ec y s t e i n ep r o t e a s ec a t h e p s i nli so n eo ft h em o s tp o t e n tm a m m a l i m le l a s t a s e s a n dc o l l a g e n a s e s ，w i d e l ye x p r e s s e da tb a s a ll e v e l si nm o s tt e s t e dt i s s u e sa n dc e l lt y p e s ， a n d r e g u l a t e db yp r o i n f l a m m a t o r y s t i m u l i t h e i n f l a m m a t o r ya r t e r i a l d i s e a s e s a b d o m i n a la o r t i ca n e u r y s m ( a a a ) a n da t h e r o s c l e r o s i si n v o l v ee x t e n s i v ev a s c u l a r r e n a o d e l i n gt h a tr e q u i r e se l a s t o l y s i sa n dc o l l a g e n o l y s i s t h i ss t u d ye x a m i n e dt i m h y p o t h e s i st h a tc a t h e p s i nl i so v e r e x p r e s s e di nh u m a na a aa n da t h e r o s c l e r o t i c l e s i o n sa n di t se x p r e s s i o ni nv a s c u l a rc e l lt y p e sf o u n di nt h e s el e s i o n si sr e g u l a t e db y p r o i l f f l a m m a t o r yc y t o k i n e s i m m u n o h i s t o c h e m i c a la n dt i s s u ee x t r a c ti m m u n o b l o t a n a l y s i sd e m o n s t r a t e di n c r e a s e de x p r e s s i o no fc a t h e p s i nli nh u m a na a aa n d a t h e r o m a t aa n dl o c a l i z e di t se x p r e s s i o nt ol e s i o n a ls m o o t hm u s c l ec e l l s ( s m c ) ， e n d o t h e l i a lc e l l s ( e c ) ，a n dm a c r o p h a g e s i np r i m a r yc u l t u r e dh u m a ns m c ，e c ，a n d m o n o c y t e d e r i v e dm a c r o p h a g e s ，p r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s o r g r o w t h f a c t o r s i n d u c e dt h ee x p r e s s i o no fc a t h e p s i nla n di t sa c t i v i t ya g a i n s te x t r a c e l l u l a rc o l l a g e n a n de l a s t i n p a t i e n t sw i t hc o r o n a r ya r t e r ys t e n o s i s ( n = 6 5 ) h a dh i g h e rs e r u mc a t h e p s i n ll e v e l st h a nt h o s ew i t h o u tl e s i o n sd e t e c t a b l eb yq u a n t i t a t i v ec o r o n a r ya n g i o g r a p h y ( 胛 = 3 0 ) ( 1 4 7 - + 0 , 一g dn g m lv e r s u s0 6 0 + 0 0 6n g m l ，p 0 0 2 ) as t r o n gc o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ep e r c e n to fs t e n o s i so fl e f ta n t e r i o rd e s c e n d i n gc o r o n a r ya r t e r ya n ds e r u m c a t h e p s i nll e v e l si np a t i e n t sw i t hs t e n o s i s ( r = 0 5 4 2 ，p 0 0 0 01 ) ，a l s os u g g e s t s i n v o l v e m e n to fc a t h e p s i nli nt h e s ev a s c u l a rd i s e a s e s a t h e r o s c l e r o s i sa n dd i a b e t e sa r ec l o s e l ya s s o c i a t e da n db o t hi n v o l v ee x t e n s i v e d e g r a d a t i o no ft h ea o r t i ce l a s t i n i n c r e a s e de l a s t a s ea c t i v i t yh a sb e e nd e t e c t e di n d i a b e t i ca n i m a la o r t a e w eh a v ed e m o n s t r a t e de n h a n c e de l a s t o l y t i cc a t h e p s i nsi n h u n l a na t h e r o s c l e r o t i cl e s i o n sb u ti n s u f f i c i e n ta m o u n t so fi t se n d o g e n o u si n h i b i t o r c y s t a t i nc ，s u g g e s t i n ga l t e r a t i o n so fs e r u mc a t h e p s i nsa n d o rc y s t a t i nc i np a t i e n t s w i t ha t h e r o s l c e r o s i so rd i a b e t e s i nt h i ss t u d y ，w em e a s u r e dl e v e l so fb o t hc a t h e p s i ns a n dc y s t a t i nci ns e r af r o m2 4 0p a t i e n t sb ye l i s a a m o n gt h e s ep a t i e n t s ，10 7h a da d i a g n o s i so fa t h e r o s c l e r o t i cs t e n o s i s ，10 3w e r ed i a b e t i c ，a n d3 0h a dn e i t h e rc o n d i t i o n m u l t i p l el i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a ts i g n i f i c a n t l yh i g h e rs e r u ml e v e l s o fc a t h e p s i nsi np a t i e n t sw i t he i t h e ra t h e r o s c l e r o t i cs t e n o s i s o 0 4 ) o rd i a b e t e sp = o 0 0 0 5 ) p e r s i s t e da f t e ra d j u s t m e n tf o rc y s t a t i ncl e v e l ，r e n a lf u n c t i o n ，s m o k i n g ，a n d s e r u l ng l u c o s el e v e l sp = 0 0 0 8 ，p = 0 0 0 0 5 ) f u r t h e r m o r e ，p a t i e n t sw i t ha c u t e 2 o 0 0 9 ) o rp r e v i o u sm y o c a r d i a li n f a r c t i o np o 0 2 ) o ru n s t a b l ea n g i n ap e c t o r i s ( ， f lc y s 一- - - c y s 6 3 的二硫桥。由j ：r 一 结构域顶部两l o o p s - 叠，上部l o o p ( 1 3 3 15 9 ) 被川连续线显示，卜部l o o p ( 1 7 5 - 2 0 5 ) ! j ! i j 刚间 隔线。一些关键的残基、底物结合位3 1 1 1 0 0 p 被标山。 1 2 3 溶酶体半胱氨酸蛋白酶原的活化 溶酶体半胱氨酸蛋白酶以前酶原形式( p r e p r o e n z y m e s ) 被合成。合成后， 在通过内质网期l 、白j 信号肽水解，剩下的组织蛋白酶原( p r o c a t h e p s i n s ) 则在后内 体或溶酶体的酸性环境中经蛋白水解而加工为活化的成熟酶( k o n a i n a m ie ta l ， 1 9 8 8 ，n i s h i m u r ae ta l ，1 9 8 8 ) 。这些有限的蛋白水解是控制组织蛋白酶活性的关键 步骤( n e u r a t h ，1 9 8 4 ；n e u r a t h ，1 9 9 3 ) 。许多研究已聚焦于酸性p h 条件下的自活化。 m = j | 的研究提示该过程包含了分子内的反应机制( r o w a ne ta l ，1 9 9 2 ；m a c he ta l ， 19 9 4 ) 。然而，c a tb 、l 和k 等的酶原晶体结构分析( p o d o b n i ke ta l ，1 9 9 7 ；c y g l e re t a l ，19 9 6 ；c o u l o m b ee ta l ，19 9 6 ；l a l o n d ee ta l ，19 9 9 ；s i v a r a m a ne ta l ，l9 9 9 ；t u r ke t a l ，1 9 9 6 ) 证明了一个不同的机制。这些酶原的结构显示，i ，j 肽区阻i j 二了底物和酶 一性捌j 位的接近( 图4 ) ，它形成一个以催化部位顶部c 【螺旋为术端的结构域， 二 以引芪物结合相反的方向穿过活性位裂缝而到达成熟酶n 端。这样，为了结合于 活性部位进行自活化，i ，j 肽区需要适当方向的巨大移动。较后 9 c a t1 4 u k f f i j l 0 1 ：究 心科学技术人学博f j 论义作名+ ：刘健导帅：徐i i f 扛、施i 、1 7 漫示酶原的活化包含了分子间及分子内的反应机制( m c q u e n e ye ta l ，19 9 7 ； m e n a r de ta l ，1 9 9 8 ) 。而对人c a tb 的研究表明，溶酶体组织蛋白酶的活化事实| - 是一个分子间过程( r o z m a ne ta l ，1 9 9 9 ) 。活化过程被p i _ 1 值降低所触发，这可能是 二i 二p h 值的降低充分弱化了自仃肽区与催化区域问的相互作用( f o xe ta l ，l9 9 2 ； c a r m o n ae ta l ，1 9 9 6 ) 。这样，自订肽区采用了一种较松散的构型，较不紧密的结合 于活性部位，而没有二级结构的丧失( m e n a r de ta l ，1 9 9 8 ；r o z m a ne ta l ，1 9 9 9 ) 。然 而，日仃肽水解连锁反应的起始仍是整个过程中令人感兴趣的部分。虽然，酶原极 小的催化活性对于连锁反应可能是充足的，但是别的蛋白酶的参与并不能排除。 起始后，活化随着具催化活性的酶分子数量的增加而快速完成( m c q u e n e ye t a l ，1 9 9 7 ；r o z m a ne ta l ，1 9 9 9 ) 。前肽区可能从成熟酶分离并被水解( r o z m a ne t a l ，19 9 9 ；m a u b a c he ta l ，1 9 9 7 ) ，也可能在活化期i 旬在几个位点上被分解，而丧失或 减少其抑制作用，这已见于c a tl 、k ( m c q u e n e ye ta l ，1 9 9 7 ；m e n a r de ta l ，1 9 9 8 ) ：乖n c 的活化中。在所有的成熟酶序列中，+ 2 位的p r o 残基是绝对保守的( 图1 ) 。 图4c a tl 原的折叠。成熟酶利前肽区分 1 1 1 ) i - j 细线和粗线被显示。活性侮、l ，胱氨酸被标 u 。 1 2 4 溶酶体半胱氨酸蛋白酶的活性调控 半胱氨酸蛋白酶的调控是复杂的。除了基因表达外，许多因素也控制了半胱 氨酸蛋白酶的水解活性： 1 d h 。除了c a ts 夕b ( w a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) ，大多数半胱氨酸蛋i - j 酶在中。i 生p h 值l l , l 疋ii 1 i 稳定和弱活性的，而在细胞内的酸性囊泡( 如溶酶体) 畔，被活化。随着溶哺 体f 门成熟，其p h 值降低，在完整细胞中能低至3 8 ( l l o y da n dm a s o n ，1 9 9 6 ) 。陔p l l 仙足以导致c a tb 、s * n l f j , 3 不可逆变性( t u r kbe ta 1 ，19 9 9 ) 。此外，在较低的p h 心，所有的配体，包括底物、抑制剂和i ，j 肽，仅微弱地与酶结合( f o xe ta l ，1 9 9 2 ； 中闻科学技术人学博i j 论文作省：刘健导师：徐卑、施闻、l j c a r m o n ae ta l ，1 9 9 6 ；t u r kbe ta l ，1 9 9 9 ；o g r i n ce ta 1 ，1 9 9 3 ) ，表明由于溶酶体成熟， 这些酶可能缓慢而不可逆地变性。变性的c a tl 能被天冬氨酸蛋白酶c a td 水解 ( t u r kbe ta 1 ，1 9 9 9 ) ，提示p h 值所诱导的失活及其后的蛋白水解可能是所有溶酶 体半胱氨酸蛋白酶共同的失活过程。 2 氧化还原力。酶活性部位半胱氨酸是易被氧化的，因而这些酶在还原环境是 最有活力的。内体特异性地聚集半胱氨酸以维持这样的环境( p i s o n ie ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 3 酶定向于内体和溶酶体。所有酶拥有可被甘露糖苷化的n 一糖基化位点。甘露 糖一6 一磷酸受体是在分泌通路中溶酶体蛋白定向的主要受体，磷酸甘露糖苷化的 酶与之结合，使酶定向于溶酶体。 4 蛋白酶抑制剂。对于溶酶体半胱氨酸蛋白酶，上述所有因素相互结合以使蛋 白酶活性被控制在溶酶体这一封闭的区间中。而内源性蛋白酶抑制剂则似乎是优 先作用于那些从该区间“逃离”的活性酶。因此，胞质和胞外空间拥有大量的半 胱氨酸蛋白酶抑制剂。这些抑制剂中最丰富的是c y s t a t i n 家族，它包括缺乏信号 肽的胞内型( i 型，c y s t a t i na 年e i b ) ，通常称为s t e f i n s ；充分分泌的胞外型c y s t a t i n c ( i i 型1 ；和循坏激肽原( k i n i n o g e n s ，i i i 型) ( m a s o na n dw i l c o x 1 9 9 3 ；b a r r e t t ，1 9 8 7 ) 。 这些蛋白与活性半胱氨酸蛋白酶通过抑制剂上的多个位点相互作用( l i n d a h le t a l ，1 9 9 4 ) ，紧密而不可逆的结合，并且它们对靶酶的抑制没有选择性( t u r ke t a 1 、1 9 9 7 ；s t u b b se ta 1 ，1 9 9 0 ) 。与上述别的因素相结合，这些抑制剂似乎保护细胞、 组织和循环系统免受不需要的半胱氨酸蛋白酶活性。 1 2 5 溶酶体半胱氨酸蛋白酶生理功能 c a tl 矛i b ，与天冬氨酸蛋白酶c a td ，是人体含量最丰富的溶酶体蛋白酶， 它们的溶酶体浓度高达l m m ( l l o y da n dm a s o n ，1 9 9 6 ) 。尽管c a tb 与d 有高的局部 浓度，但用选择性抑制剂分析提示它们对溶酶体蛋白的降解并不是非常重要的 ( k o l n i n a l n ie ta 1 ，1 9 9 1 oc a td 敲除实验也证明了其在该过程中的次要作用( s a f i i g e ta 1 ，】9 9 5 ) 。这提示c a tb 以外的其它半胱氨酸蛋白酶在这方面的作用。 除了在溶酶体中的作用外，半胱氨酸蛋白酶也参与溶酶体外蛋白的水解和加 1 ：，诸如肾素的加1 - v ( a u t h i e re ta 1 ，1 9 9 5 ；w a n ge ta 1 ，19 9 1 ；j u t r a sa n dr e u d e l h u b e r ， 1 9 9 9 ) 。咔i 状腺球蛋白是甲状腺激素的来源，它是半胱氨酸蛋白酶加工的最重要 胁体之一( d u n ne ta 1 ，1 9 9 1 ；b r i xe ta 1 ，1 9 9 6 ；n a g a y ae ta 1 ，19 9 8 ) 。其它许多重要的 细胞过程也与溶酶体半胱氨酸蛋白酶紧密相关，它们包括抗原的递呈和。日e i l j f 内i q ：i 牧 收。当溶酶体半胱氨酸蛋白酶分泌的时候，对环境也是极其有害的，常导致一些 疾病的发生。据报道半胱氨酸蛋白酶参与了许多疾病，诸如癌症、捌亡、风濉性 哭：仃炎和骨关节炎( m o r te ta 1 ，1 9 8 4 ；m o r t e ta 1 ，1 9 9 8 ；b a i c ie ta 1 ，1 9 8 8 ；b a i c ie t t 同f ： 学技术人学博i j 论义作者：刘健导帅：徐l i 扛、施闻、i ， a 1 ，1 9 9 5 ) 、a l z h e i m e r 氏症( c a t a l d oa n dn i x o n ，1 9 9 0 ) 、多发性硬化( b e v e rj ra n d g a r v e r ，1 9 9 5 ) 矛h 肌肉萎缩( t a k e d ae ta 1 ，1 9 9 2 ；k o m i n a m ie ta 1 ，1 9 8 7 ) 。在这些疾病 中，溶酶体酶被发现以的体形式存在于胞外溶酶体外环境( m a s o ne ta 1 ，1 9 8 7 ； m o r te ta 1 ，19 8 4 ) 。 1 2 5 1 溶酶体半胱氨酸蛋白酶和m h ci i 类抗原递呈 主要组织相容性复合物( m h c ) i i 类分子递呈多种内吞蛋白水解产生的抗原 j j j 娅i j c d 4 + 细胞。i i 类0 【b 二聚体能结合这些肽，但是非常不稳定且经常聚集。因而， 稳定的结合需要该二聚体与第三个i i 类分子固定链( i i ) 的结合。结合发生于内质 网中，在那旱，i i = 聚体与三个i i 类0 【d 异二聚体结合形成一个九聚体。这些九聚 体然后定向于内吞通路，0 【p i i 复合物蛋白水解为0 l p c l i p 复合物，随后c l i p 在另 一个i i 类分子h l a d m ( 或小鼠中的h 一2 m ) 的帮助下脱离，并与一个肽片段结合。 这一复合物最终转运到细胞表面( c h a p m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ；c r e s s w e l l ，1 9 9 8 ；p i e r r ea n d m e l h n a n ，19 9 8 ) 。 溶酶体半胱氨酸蛋白酶通过加工i i 和降解抗原肽而在m h c i i 类分子调节的抗 原递呈中起重要作用( c h a p m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。c a ts 是多数抗原递呈细胞，诸如树 突状细胞、巨噬细胞, n b 细胞中参与这一过程的主要半胱氨酸蛋白酶( r i e s ee t a 1 ，19 9 6 ；r i e s ee ta 1 ，19 9 8 ；v i l l a d a n g o se ta 1 ，19 9 7 ；p i e r r ea n dm e l h n a n ，19 9 8 a ； n a k a g a w ae ta 1 ，19 9 9 ；s h ie ta 1 ，19 9 9 a ) ，而c a tl 在皮层胸腺上皮细胞中是重要 的，在该细胞中c a ts 表达非常低( n a k a g a w ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。c a tv 近来被提示作 为c a tl 的一个潜在替代酶，这是出于小鼠缺乏c a tv ，而人c a tv 与小鼠c a t “内 相似性l l 4 , 鼠c a tl 与人c a tl 的相似性更高( b r o m m ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。有趣地，c a tl ， 而非c a ts ，能被i 珀勺一个剪切变体p 4 1 片段所抑制( b e v e ce ta 1 ，1 9 9 6 ) 。而c a ts 被 c y s t a t i nc 所调控( p i e r r ea n dm e l l m a n ，1 9 9 8 b ) 。 1 2 5 2 骨重建和c a tk 的特异作用 骨重建是骨形成和再i 吸收中一个持续的过程。后者山破骨细胞介导，这些纠 胞在其附着位产生一个酸性环境，称为再吸收坑。在那罩的基质蛋白水解中，半 胱氨酸蛋白酶起了关键作用。由于组织蛋白酶的高胶原蛋白水解活性，提示了它 们可能参与了这一过程。此后，几个研究组同时发现了c a tk 在破骨细胞中的选 择性表达( b a r r e t te ta 1 ，1 9 9 8 ；c h a p m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。i 型胶原蛋白存在f 9 0 l ! ( , j i i l j l 挂质中，c a tk z f j - , 匕1 5 极其有效地降解它( b r o m i n ee ta 1 ，1 9 9 6 ；b o s s a r de ta 1 ，1 9 9 6 ； k a f i e n a he ta 1 ，19 9 8 ) 。此外，c a tk 对成年骨不可溶。i l - w 2 j t p 蛋白的水解能力1 j 乡l 闲胶原蛋白酶相当，而比基质金属蛋白酶( m m p s ) 高效得多( g a r n e i oe t a 1 1 9 9 8 ) 。l 司时在组织蛋白酶中，c a tk 也是最有效i t , j 弹性蛋白酶( c h a p i n a ne t 中闻科学技术人学博j j 论义作省：刘健导! j | j ：徐i i 仁、施网、j a 1 ，l9 9 7 ；b r o m m ee ta 1 ，19 9 6 ) 。与c a tk 的选择性表达相反，其它溶酶体组织蛋 白酶，诸o u c a tb 、l f f s 几乎都不在破骨细胞中表达( b r o m n l ee ta 1 ，1 9 9 6 ；d r a k ee t a 1 ，19 9 6 ) 。这些发现提示c a tk 是导致骨再吸收的蛋白酶( c h a p m a ne ta 1 ，19 9 7 ) 。 c a tk 与致命性骨发育不全问相关性的研究也提供了这方面的证据( g e l be ta 1 ， 19 9 5 ；g e l be ta 1 ，1 9 9 6 ) 。这种疾病是一种常染色体隐性疾病，它以骨骼石化、长 骨生长过早终止和其它严重的骨发育异常为特征( b a r r e t te ta 1 ，1 9 9 8 ；c h a p m a ne t a 1 ，1 9 9 7 ) 。而c a tk 的缺乏可引起小鼠骨骼石化，这提供了一个最终的证据( s a f t i g e ta j 1 9 9 8 ) 。 1 2 5 3 半胱氨酸蛋白酶在肿瘤中 不同的蛋白酶参与了肿瘤的发展，它们以级联的方式降解基膜和胞外基质 ( k o sa n dl a h ，1 9 9 8 ) 。早在1 9 8 0 年代，半胱氨酸蛋白酶，尤其c a tb ，已被与肿瘤 的恶化相关联( p o o l ee ta 1 ，1 9 8 0 ；s l o a n ee ta 1 ，1 9 8 1 ) 。较后的研究显示，c a tb 、h , i l l 通过对胞外基质的直接降解或对别的蛋白酶，诸如尿基酶型纤溶酶原活化物 的活化而参与了肿瘤的发展( k o sa n dl a h ，1 9 9 8 ；s l o a n e ，1 9 9 0 ；s l o a n ee ta 1 ，1 9 9 4 ； l a ha n dk o s ，1 9 9 8 ) 。这种参与作用，可能是通过蛋白分泌、m r n a 矛1 1 蛋白表达以 及活性的升高来实现的。c a tl 和b 以成熟型或前体形式分泌( k o sa n d l a h ，1 9 9 8 ；s l o a n ee ta 1 、1 9 9 4k a n ea n dg o t t e s m a n n ，1 9 9 0 ) 。由于甘露糖一6 一磷酸受体 是导致溶酶体酶运输和定向的主要受体( l l o y da n dm a s o n ，1 9 9 6 ) ，因而人们最初 认为该通路中元件的改变可能是这些组织蛋白酶分泌增加的主要原因。然而，除 了这一机制，组织蛋白酶原也被发现与其它膜受体相结合，这提示了甘露糖一6 一 磷酸