（遗传学专业论文）耐热对硝基酚磷酸酶的表达纯化、性质及晶体结构研究.pdf

摘要 我们克隆到脂肪芽孢杆菌曰口c f f ，s t e a r o t h e r m o p h i l u s 中的耐热对硝基酚磷酸 酶( t h e r m o s t a b l ep n i t r o p h e n y l p h o s p h a t a s e ，t n p p a s e ) 基因，将其编码区c d n a 连 接到p q e 3 0 表达载体中，在e c o l im 1 5 中经i p t g 诱导得到高效表达。用n i n t a s u p e r f l o w 层析柱对表达产物进行了分离纯化，纯化后其比活为1 2 0u m g ，初步 测定了t n p p a s e 的酶学性质。发现它的反应最适p h 是1 0 0 ，最适反应温度是 5 5 ，热稳定性t 。值为5 2 ，m 孑+ 、m n 2 + 和c o ”对t n p p a s e 的活性有一定 的促进作用，而z n 2 + 和n i 2 + 对t n p p a s e 没有影响。该酶是中度耐热蛋白质，金 属离子有助于提高其热稳定性。确定耐热对硝基酚磷酸酶是金属酶蛋白，活性部 位含有镁离子；该酶的k 。为3 0 3 1m m o l l ，v 。为3 1 3 5g r a o l ( m g m i n ) 。其在 p h7 0 ，1 2 0 的范围内相当稳定。该酶在s d s 溶液中稳定性较差，在t r i t o n x 一1 0 0 溶液中较为稳定，在t w e e n2 0 溶液中很稳定。采用悬滴法进行2 0 0 个结晶条件 的筛选和优化，在众多结晶条件中优化培养得到的t n p p a s e 最大晶体达到o 4 0 3 0 ，l m m 。通过初步的x 射线衍射结构测定，并对数据进行结构解析，获得 了耐热对硝基酚磷酸酶t n p p a s e 的晶胞参数。运用基因工程技术，将t n p p a s e 分子中的甲硫氨酸( m e t ) 全部置换为甲硒氨酸( s e m e t ) 。培养出甲硒氨酸置换 的耐热对硝基酚磷酸酶( s e m e t - - t n p p a s e ) 的晶体。利用同步辐射光源收集了 s e m e t - - t n p p a s e 晶体的x 射线衍射数据，应用多波长反常散射方法测定了 t n p p a s e 的晶体结构。结果显示t n p p a s e 每个单体由结合比较紧密的两个结构 域组成，两个结构域的一级结构有交叉，其中一个结构域中存在n 一端和c 一端。 该项研究可为进一步进行该酶的结构解析和耐热蛋白质耐热机制的研究提供帮 助。 关键词：耐热对硝基酚磷酸酶，酶学性质，热稳定性，金属离子，晶体结构 a b s t r a c t t h et 1 1 咖o s t a b l ep - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t a s e ( t n p p a s e ) g e n ew a s c l o n e df r o m b n c i k ss t e a r o t h e r m o p h i l u s t h ec o d er e g i o no f t n p p a s ec d n aw a sc l o n e di n t o p q e 3 0 v e c t o ra n di tw a se x p r e s s e di ne c o l im 1 5w i t ht h ei n d u c t i o no fi p t ga f t e r p u r i f i e d w i t hn i - n t as u p e r f l o wc h r o m a t o g r a p h y , t h ep r o p e r t y o ft n p p a s ew a s s t u d i e d t h er e l a t i v ea c t i v i t yo f t h ep u r i f i e dp n p p a s ew a s1 2 0u m g t h eo p t i m u m p h v a l u eo fp n p p a s ew a s1 0 0 t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt m v a l u e w e r e5 5 a n d5 2 r e s p e c t i v e l y t h et n p p a s ec o u l db es t i m u l a t e db ym g ”， m n 2 + a n dc 0 2 + h u ti n f l u e n c e dl e s sb yz n 2 + a n dn i 抖i tw a ss e n s i t i v et om e t a lc h e l a t o r a n dm gi o nw a sn e c e s s a r yt oi t sa c t i v i t y t n p p a s ee x h i b i t e dam o d e r a t ed e g r e eo f t h e r m o s t a b i l i t y , a n dt h et h e r m o s t a b i l i t yo ft n p p a s ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y w h e n t r e a t e dw i t h1m m o f l m g ，m n ，c u ，b a , c a , n ia n dz ni o n s t n p p a s ew a ss t a b l e w i t h i naw i d e r a n g e o f p h ( p h7 0 - 1 2 o ) i t c a t a l y z e d t h e h y d r o l y s i s o f p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t ew i t ham i c h a e l i sc o n s t a n t3 0 3 1m m o f la n dav m “31 3 5 m o l ( m g m i n ) t n p p a s ew a s n o ts t a b l ei ns d ss o l u t i o n 。b u ts t a b l ei nt r i t o nx - 1 0 0 a n dt w e e n2 0s o l u t i o n s a sap r e l i m i n a r ys t e pi nt h es t u d yo ft h em e c h a n i s mo f t h e r m o s t a b i l i t yo ft h ee n z y m eo nt h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e ，w es t u d i e dt h e c r y s t a l l i z a t i o na n dp r e l i m i n a r yx - r a yd i f f r a c t i o na n a l y s i so ft n p p a s e a n dc o l l e c t e d h i 曲一r e s o l u t i o nd i f f r a c t i o nd a t a w eg r o wo n et y p eo fc r y s t a l o ft n p p a s ew h i c h c o n t a i nt h ec h e m i c a le l e m e n ts e l e n i u mi n s t e a do fs u l f u ri ne v e r ym e t h i o n j n ea m i n o a c i d u s i n gm u l t i - w a v e l e n g t ha n o m a l o u sd i f f r a c t i o n ( m a d ) ，t h ex r a y s f r o m s y n c h r o t r o n sa l l o wu s t oc o l l e c tt h er a wd a t ao fs e m e t - t n p p a s em u c hm o r e q u i c k l y t h a nu s et r a d i t i o n a lx - r a ys o u r c e s t h ed a t aw a s a n a l y z e db yc o m p u t e r s ，r e f i n e da n d c o r r e c t e d ，a n dt n p p a s ec o u l db ev i s u a l i z e di ni t st h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e t h e d a t as h o wt h a tt n p p a s ec o n s i s t so f t w o d o m a i n sc o m b i n e de a c ho t h e r c l o s e l y o n eo f w h i c hi sc o m p o s eo f n - t e r m i n a la n dc - t e r m i n a l k e yw o r d s ：t h e r m o s t a b l en i t r o p h e n y l p h o s p h a t a s e ，e n z y m a t i c c h a r a c t e r i s t i c s ， t h c r m o s t a b i l i t y , m e t a li o n ，s t r u c t u r eo f c r y s t a l s 堕垫型塑苎望壁墼塑堕耋垄丝些：丝堕墨曼堡堑塑竺墨一 文献综述 耐热蛋白的耐热机制研究进展 1 嗜热菌、嗜热蛋白及蛋自质热稳定性概念 生物的一个基本特征是对环境的适应性，而微生物对高温的适应能力尤为惊 人。有一类微生物能在地球上6 06 c 乃至8 0 c 以上温度下生长并发挥最大活性， 前者称为嗜热菌( t h e r m o p h i l e ) ，后者称为高度嗜热菌( h y p e r t h e r o p h i l e ) ( v i e i l l e e ta 1 1 9 9 。1 9 6 9 年，b r o c k 等在美国黄石公园的高温温泉中发现了高温菌 t h e r m u sa q u a t i c u s ，并因它的t a q 酶在当今p c r 技术中的应用而闻名，后来人们 又发现了在更高温度下生长的超高温菌。超高温菌是最适生长温度在8 0 1i o 。c 极端嗜热微生物，主要包括炽热球菌( p y r o c o c c u s ) 、古球菌属( a r c h a e o g l o b u s ) 、 高温变形菌属( t h e r m o p r o t e u s ) 、热质体属( t h e r m o p l a s m a ) 、高温球菌 ( w h e r m o c o c c u s ) 、甲烷杆菌属( m e t h a n o b a c t e n u m ) 和热棒菌属( p y r o b a c u l u m ) 、 硫化叶菌( s u l f o l o b u s ) 等，大多属古生菌类( a r c h a e a ) 。古生菌在生存环境、 生理生化、基因组等方面与真细菌、真菌的差异很大。s t e t t e r 等在海底热口发现 能在1 1 0 。c 环境中生活的细菌，b a r o s s 从火山口分离出可生活在高达2 5 0 环境 中的细菌。 嗜热菌在基因工程、蛋白质工程、发酵工程及矿产资源的开发利用上均有很 大的应用价值( l y n n “a 1 ，2 0 0 1 ) 。来源于嗜热菌体内的耐热酶( t h e r m o z y m c s ) 性质独特，它们除了具有较高的热稳定性外，还具有对酸、碱、去污剂、有机溶 剂等的广泛耐受性( c o w a l r l ，1 9 9 2 ) ，当前对耐热蛋白的耐热机制的研究已经引起人 们越来越广泛的兴趣。超高温菌酶是由超高温菌产生的酶，最适活性温度( t o p t ) 在1 0 0 。c 左右，甚至更高，具有独特的高温热稳定性。大多数超高温菌酶在常温 下无活性或活性很低，这也是它不同于中温酶的特点。已有多种超高温菌酶被分 离、纯化出来( v i e i l l ee la 1 ，2 0 0 1 ) ，如p w o e s e i 淀粉酶p h5 5 的最适活性温 度为1 0 0 。c e 由于超高温菌生存环境接近地球上产生生命的初始条件，因此，超 高温菌酶被生物学家、化学家、物理学家用作研究酶的演进、蛋自质热稳定性分 耐热对硝基酚磷酸酶的表达纯化、性质及晶体结构研究 子机理和更高温度对酶的机能影响的体系。目前科学家已经从嗜热菌中分离出各 种蛋白质，其中包括许多重要的酶类，它们的热稳定性高于嗜温菌的类似酶。对 超高温菌酶构象的刚性与热稳定性之间相互关系的探索将有助于预测蛋白质的 结构、通过基因工程酶提高酶在中等温度下的热稳定性，在理论上和应用上都有 重要意义。 热稳定性是指酶在不同温度下，保持其自身既定结构的稳定和功能正常运行 的一种能力。蛋白质结构的稳定是其功能正常发挥的基础。大多数酶在5 0 6 0 。c 温度范围内开始失活，个别酶在1 0 0 左右的高温下仍具活力，如s u t f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s 腺苷酸激酶在酸性p h 中能耐受1 0 0 的持续热处理。在生产实践 中，所采用的温度常常超过许多常温酶能耐受的温度，导致这些酶失活。虽然通 过固定化或化学修饰可提高有些酶的耐受温度，但往往它们的活性变低。自发现 最适生长温度在8 0 1 0 0 的超高温微生物以来，科学界对这些微生物产生的许 多酶很感兴趣。这些酶的活性能在1 0 0 c 或1 0 0 。c 以上保持几个小时。其独特的 热稳定性可能与其构象上的刚性密切相关。 所谓耐热性是指蛋白质在高温下维持正常生物活性及三维结构的能力，它 与蛋白质的折叠和热变性密不可分。在超过了耐热范围时，蛋白质会发生不可逆 的变性和失活现象。一般认为发生热失活的原因有：谷氨酰胺和天冬酰胺脱氨 ( a h e m & k l i b a n o v , 1 9 8 5 ) ，蛋白质凝聚，半胱氨酸氧化，水解。h a r t l e y 等人认为： 蛋白质的变性过程是一个不可逆的动力学过程，在变性压力下，肽键首先在某一 最脆弱的位点( w e a k p o i n t ) 断裂，进而启动蛋白质不可逆变性的开关( h a n l e v e t a 1 ，2 0 0 0 ) ，这个过程的限速步骤为蛋白质“w e a k p o i n t ”位点附近局部的结构的 改变。在变性过程中，蛋白质的构象由紧密、有序的折叠状态向松散、无规则的 去折叠状态转变，到最后完全失去生物学活性，这个过程一般伴随自由能的改变， 用下列公式表示：a g n d = g d - g ”( s t e t t e r , 1 9 9 6 ) ，其中g “表示蛋白质折叠状态的 自由能，g ”表示蛋白质去折叠状态的自由能，a g n d 是蛋白质热变性过程中的自 由能变化，又称稳定自由能，可用于定量地衡量蛋白质的耐热性。球蛋白的稳定 自由能一般在5 1 7k c a l m o 】的范围内，仅相当于几个氨键的能量。提高蛋白质 的耐热性可以通过提高折叠状态的稳定性、降低非折叠状态的稳定性或者二者并 用来达到( b r a i l l ，1 9 9 3 ) 。蛋白质的三维骨架结构是相当保守的( r o $ s m a i l n & l i j i a s 2 堕垫翌堂苎墅壁堕壁些壅垄丝些：丝垦丝曼堕堕塑型塑一 1 9 7 5 ) ，少量微小的氨基酸替换不会影响它的高级结构a 目前对蛋白质耐热性的测定主要有两种手段：一是通过酶活性的测定反映耐 热性，通常以t 。( m e l t i n g t 啪p e r a m r c ) 或者活性半衰期t l ，2 作为衡量耐热性的指标， 酶活性的检钡4 灵敏、快速、方便，是测定耐热性的常用方法：二是通过蛋白质热 变性过程中的构象或能量的变化来获得有关蛋白质耐热性的信息，常用的技术 有：热容法、紫外差光谱、荧光光谱、园二色性光谱、核磁共振、差示扫描量热 分析法( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y , d s c ) 等。嗜热菌酶的耐热性主要取决 于两个方面：( 1 ) 稳定的天然结构；( 2 ) 细胞内存在促热稳定因素。决定嗜热 菌耐热性的主要机制是蛋白质的热稳定性，在8 0 c 以上环境中能发挥功能的酶 称为嗜热酶。嗜热酶对不可逆的变性有抗性，并且在高温下( 6 0 。c 1 2 06 c ) 具 有最佳活性，有的酶甚至在超过1 4 0 也能稳定一个小时以上。这样的酶在工业 生产中有很大利用价值。那么，嗜热酶在高温环境中是如何保持其稳定性的呢? 2 。影响蛋白质耐热性的因素 2 1 动态平衡学说 最初有人认为嗜热菌的许多酶在高温下分解一再合成循环进行得非常迅速， 只要酶在这段很短的循环过程中有活性，细胞内的这种酶活就能保持一定水平， 这就是动态平衡学说。r o s v i t a 等人发现喜热嗜油芽孢杆菌( b a c i l l u s t h e r m o l e o v o r a n s ) 中的儿茶酚2 ，3 一双加氧酶是热不稳定的，这种酶必须被不断 的合成出来以维持较高的活性( r o s v i t a e t a t 1 9 9 9 ) 。 人们曾试图通过对嗜热蛋白与常温同源蛋白的比较分析来揭示蛋白质的耐 热规律，却惊奇的发现：这些耐热蛋白在生物学性质，如催化机理、活性、分子 量、等电点等方面与其同源蛋白并没有显著差异，它们的级结构和高级结构也 非常相似。例如：对来源于嗜热厌氧菌t h e r m o s u l f u r i g e n e s 木糖异构酶t t x i 和它 的同源蛋白t n ( t h e r m o t a g a n e a p o l i t a n a ) 进行一级氨基酸序列的同源性分析发 现，t n x i 和t t x i 的氨基酸序列具有7 4 的同源性，它们的晶体结构几乎完全相 同，c g t n x i 的耐热性却远远高于t 1 1 x i ，而且找不到任何结构上的明显差异来解 释这种耐热性的不同。这提示似乎并不存在蛋白质耐热性的特殊机制，不同耐热 蛋白采取的耐热机制千差万别，人们至今也无法找到对所有耐热蛋白适用的普适 耐热对硝基酚磷酸酶的表达纯化、性质及晶体结构研究 规律。唯一可以肯定的是：耐热蛋白的耐热特性是由它自身的遗传信息决定的。 耐热性的产生是许多微小的差异和变化累加的结果，这些微小的因素包括蛋白表 面的刚性和柔性、折叠状态、内源稳定作用( 如盐桥、氢键、疏水键、范德华力 等) 以及外源稳定因子等，它们具有加和性，最终赋予了蛋白质整体结构的稳定 ( s r i p r a p u n d he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 2 2 蛋白质的刚性 有人用蛋白质晶体表面积与体积的比例来表征蛋白质折叠的紧密程度和刚 性，统计学分析表明，耐热蛋白的上述晶体学参数一般要比其同源嗜温蛋白低很 多( t a n n e r ，1 9 9 6 ) ，也就是说，蛋白质的耐热性越高，折叠的紧密性和结构的刚性 也越大；从另一方面看，酶蛋白催化活性的发挥却需要酶的折叠结构具有较高 的柔韧性，因此在进化过程中耐热性的获得是酶活性与剐性相互妥协的结果。 2 2 1 刚性和柔性的概念 刚性是指酶的空间结构中各基团、原子以及二级结构之间相对的运动性小。 柔性是指酶的活性部位基团与其它结构部位相比，相对运动性较大。酶分子具有 整体上的刚性：而酶的活性部位次级键力量较弱，柔性比整体分子高。从f i s c h e r 提出的锁钥学说到所有现代阐明酶高催化效率的学说，如诱导契合学说、酶和底 物过渡态中间物的紧密结合等可以看出，人们通常对活性部位的思考均受到有紧 密的空间结构较大的影响。邹承鲁认为活性部位的柔性既是局部的，也是相对的。 酶分子活性部位一定程度的柔性可能是酶充分表现其催化活性所必需的。酶分子 整体上的刚性是酶保持其结构稳定、功能正常发挥的基础，而活性部位一定程度 的柔性则是酶行使催化功能的关键。 2 2 2 超高温菌酶构象的刚性是其热稳定性的结构基础 蛋白质的热稳定性通常由氢键、离子对、范氏力等非共价的相互作用来维持。 这些非共价相互作用维持蛋白质折叠的天然构象。研究表明，超高温菌酶蛋白质 结构中的氢键数目、离子对、盐桥和极化表面面积都明显高于中温同系物，有助 于增强其构象的刚性。如i v e t r i a n i 等( v e t r i a n i ，1 9 9 8 ) 对影响pf u r f o s u s n t 1 i t o r a l i s 谷氨酸脱氢酶热稳定性因素的研究中发现，大范围的离子对之间的相互作用是超 高温菌酶保持热稳定性的重要因素，残基在局部环境中的精确位置是影响稳定性 的决定性因素。r o b e r t s o n ( r o b e r t s o ne t a l ，2 0 0 2 ) 等认为，高温和超高温菌的蛋白 4 塑垫塾型苎竺壁堕堕些塞垄垫些：竺堕墨曼堡堕塑堡塞一 质分子表面分布的带电和非极性氨基酸残基数高于相应的中温蛋白质，这些电荷 之间、非极性残基之间的相互作用可稳定高温下蛋白质的结构。l i 等发现超高温 古生菌ph o r i k o s 砌组蛋白h p t 徂有一个较大的疏水接触区和还原性溶剂易接近 的区域，氢键数目也增加；在两个组蛋白单体的交叉点上，有一个特殊的酪氨酸 残基网，可稳定二聚体。l i ( “e t a l ，2 0 0 3 ) 认为这些因素可以解释它的热稳定性。 因此，非共价作用力的增强提高了超高温菌蛋白质结构的稳定性。 目前，有一个假说是：超高温菌酶在中温时比它们的中温同系物更具刚性， 并且剐性是超高温菌酶。在高温下保持热稳定性的先决条件。这个假说得到频率 域荧光测定法和各向异性衰变、氢一氘( 1 h - 2 d ) 交换( j a e n i c k e e ta 1 ，2 0 0 0 ) 以及 色氨酸磷光( g e r s h e n s o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 等实验数据的支持。在sa c i d o c a l d a r i u s 腺营 酸激酶酰胺质子的o h 2 d 交换实验中发现，2 0 c 时，a c i d o c a l d a r i u s 腺苷酸激酶 的酰胺质子被交换的数( 5 3 ) 比猪的胞液酶( 8 3 ) 少，这说明在高温酶中有 相当多的酰胺质子形成了稳定的氢键( v i e i l l e e ta 1 ，2 0 0 t ) 。在温度升到8 0 。c 9 0 c 时，sa c i d o e a l d a r i u s 腺苷酸激酶才能显示出与有催化活性的中温酶相当的交换程 度。 在蛋白质结构中，不同温度下原子的能量状态是影响局部柔性的主要因素。 1 9 8 7 年，v i h i n e n ( v i h n e n , 1 9 8 7 ) 从原子的能量状态着手，计算中温和高温蛋白质 的柔性指数。他的结果指出随着热稳定性的上升，柔性下降。由于v i h i n e n 的研 究是以高温蛋白质为研究对象，而没有超高温菌蛋白质，所以这种工作尚需做深 入研究。计算机模拟也显示，在皮秒时间范围内，中温的红素氧还蛋白比室温下 它的j p f u r i o s u s 同系物更柔韧( l a z a r i d i se ta l ，1 9 9 7 ) 。k o h e n 等在1 9 9 9 年发现 ( b e a u c a m p e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，在一种高温乙醇脱氢酶中，随着温度上升，氢隧道式转 移水平增高。这说明在常温时，超高温菌酶构象的刚性很强，酶活性部位的柔性 较低，但随着温度的升高，热运动加强，原予或基团间的相对位移加大，柔性变 大，活性增强。这就为热诱导的蛋白质运动在调节酶活力中的作用提供了一个新 的证据。 超高温菌酶在2 0 3 7 c - f 为什么无活性? 可以用极端的刚性来解释这个问 题。能支持这一观点的一系列证据有变性剂( 如：胍、盐酸和尿酸) f b e a u c a m p e t a 1 ，1 9 9 7 ) 、去垢剂( 如t r i t o n - 1 0 0 、十二烷基硫酸钠) 和有机溶剂 d 、a u r i as 甜4 ， 堕垫型堕薹堕壁墼堕竺壅鲨丝些：竺堡墨墨堡苎塑型壅一 1 9 9 9 1 常能在亚适温度激活超高温酶。变性剂、去垢剂和有机溶剂能和超高温酶， 尤其是活性部位的次级键相互作用，从而改变了酶的空间构象，使柔性变大，活 性增强。但若温度接近最适酶活温度时，由于热运动的加强，这种激活作用将消 失f b e a u c a m p e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在最适温度下，酶的活性部位是柔韧的( 没有变性剂 存在) ，所以充分表现了全部活性。甚至在3 7 。c ，少数超高温酶也比它们的中温 同系物的酶活性更大( m e r z e la 1 ，1 9 9 9 ) 。这些酶在中温下的高催化活性说明在这 些酶的活性部位兼有局部的柔性在低温下负责它们的活性，和高的整体上的 剐性负责它们的热稳定性。 对中温和超高温蛋白质刚性与柔性的许多研究都得出了同样的结论：超高温 菌酶蛋白质是更具刚性结构的酶。然而最近有一个研究却得出了不同的结论。 h e r n o n d e z ( h e r n a n d e z e ta 1 ，2 0 0 0 ) 等根据酰胺氢交换的数据，指出：( i ) p f u r i o u s 红素氧还蛋白( m b r e d o x i n ) 所有涉及酰胺氢的氢键，接近pf u r i o u s 其最稳定的 温度时，在1 秒钟内被断裂；( i i ) 对于整个蛋白质，溶剂进入引起的构象变化 发生在毫秒时间内； ( i i ) 并且在p h 为碱性时，由酰胺氢键贡献的最大熵解释 了常态下蛋白质伸展的活化熵比总活化熵减少5 的原因。到目前为止，这个结 果揭示了，具有最稳定特征的蛋白质，构象的柔性达到中温蛋白相同的程度。 另外，l a z a r i d i s ( l a z a r i d i se ta 1 ，1 9 9 7 ) 等认为柔性不是绝对的，一种蛋白质在 纳秒范围内可能是刚性的，但在皮秒内可能是柔性的，并且缺乏热稳定性与刚性 相互关系的基本理由。柔性意味着蛋白质折叠状态构象的熵增，因此它应有利于 蛋白质热力学的稳定。所以，在我们更好地理解构象的刚性在蛋白质热稳定性中 的作用前，尚须做进一步的研究，以寻找出各种温度下超高温菌酶蛋白的柔性与 刚性的情况。 许多超高温菌酶已成功地在中温菌中克隆和表达，利用基因定点突变技术探 索超高温菌酶热稳定性因素的实验报道越来越多，科学家们正在努力构建具有高 温热稳定性的中温工程酶。古生菌和细菌的超高温菌极其多样性代表个巨大的 酶库，寻找和选择新的酶将有利于开发新的生物技术应用领域。但还需进一步研 究各种温度下超高温菌酶蛋白的柔性与刚性的情况，以更好地解决构象的刚性在 蛋白质热稳定性中的作用。 2 3 蛋白一级结构的研究 6 堕垫堕塑苎墼堡墼壁塑壅堕丝些：丝堕墨曼竺堕塑堑壅一 研究表明在蛋白质的一级结构中，个别氨基酸的改变会引起离子键、氢键和 疏水作用的变化，从而大大增加整体的热稳定性，这就是氨基酸的突变适应( j u l i e s u s a n 1 9 9 9 ) 。有人比较了嗜热菌与常温菌蛋白质氨基酸的组成，发现嗜热菌 蛋白质r 和i l e 、p r o 、g l u 和a r g 的含量均高于常温菌，而c y s 、s e t 、t h r 、a s h 和a s p 的含量显著低于常温菌。这是因为p r o 的结构熵比较小，更易折叠，且经折叠， 则需很高的能量才能解开，这样在不影响其高级结构的前提下，p r o 的替代可以 提高整个蛋白的热稳定性；a r g 和g l u 分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链， 测链所提供的疏水作用及离子间相互作用能提高蛋白的热稳定性( 卢柏松等， 1 9 9 8 ) 。 研究表明酶本身的一级结构对其耐热性具有重要作用。酶的一级结构中 某些关键区域的个别氨基酸改变，就会引起高级结构的变化，使酶蛋白结构中的 氢键、离子键或疏水键稍有增加，从而提高整个分子的热稳定性( v a n d e n b u r g e t a 1 ，1 9 9 4 ) 。 t e s f a y 对热稳定和热不稳定的3 一磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列作过分析 比较，肯定了个别氨基酸的替代可以显著提高酶的热稳定性。热稳定的3 一磷酸 甘油醛脱氢酶( g p d h s t ) 来自嗜热脂肪芽胞杆菌( b c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) ，在8 0 c 保温1 0 分钟仍不失活性。热不稳定的3 一磷酸甘油 醛脱氢酶( g p d h - - c o ) 来f h b a c i l l u sc o a g u t a n s ，在5 5 时加热5 分钟，就有9 5 1 0 0 的酶失去活性：但这两种酶的一级结构都含有3 3 5 个氨基酸，存在着 9 1 6 的序列同源性。g p d h - - c o 和g p d h - - s t 氨基酸序列只有2 8 个位点不 同，且绝大多数的不同位点在序列的中间三分之一。其中5 个不同位点是g p d h - - c o 的丙氨酸被g p d h - - s t 的脯氨酸所代替。脯氨酸的结构熵比其它氨基酸小， 更易折叠。一旦折叠，则需要更高的能量才能解开。所以，在不会引起蛋白质三 维结构相反变化的位点，脯氨酸的代替可以提高热稳定性。每个脯氨酸代替丙氨 酸可以为折叠贡献约1k c a l m o l l 约自由能。这样，5 个替代的积累作用对热稳定就 有可观的影响( t e s f a y “口l ，1 9 8 9 ) 。 来自水生嗜热菌( t h e r r n u s a q u a t i c u s ) 的d n a 聚合酶( t a q i 酗i ) 已广泛应用 于p c r 技术，它的大片段( k l e n t a q i ) 与大肠杆菌d n a 聚合酶ii 拘k l e n o w 片段 ( k i e n o w p o l i ) 有4 9 6 的序列同源性，但两者的热稳定性却有显著的差异。 堕垫型壁茎墅壁墼堕塑壅姿墼些：堡堕墨曼笪堡塑里塑 分析它们的结构，t g k l c n o wp 0 1i 和k l e n t a q l 的c 一末端却有不同之处 ( k o r o l e we ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 k l e n t a q l 的n 一末端功能区碱基序列和高级结构的重排形成了一个疏水作用 更强的核心，消除了不利于热稳定的静电相互作用。k l e n t a q ln 一末端功能区含 有1 3 个脯氨酸，占总氨基酸的1 0 ，大量的代替t k l e n o wp o l i 中的丙氨酸。 k l e n o wp o lin 一末端功能区只含有6 个氨基酸，占3 。最终结果使得k l e n o w p 0 1i 中的a 结构在k l e m a q l 中被一个富含脯氨酸的袢结构所代替( l i m ，1 9 9 4 ) ； k l e n o wp o l i 中的有静电相互作用的残基在k l e n t a q l 中常被一些疏水或芳香基 团所代替。 人们曾在嗜热细菌细胞膜中发现与耐热性有关的类特殊脂类，但在耐热蛋 白中，却没有发现类似的特殊氨基酸存在，嗜热蛋白与嗜温蛋白一样，也是由2 0 个基本氨基酸组成的。只是在一类嗜热菌( s u l f o l o b u s ) 中，存在与耐热性有关 的翻译后l y s 的甲基化修饰( m a r a se ta l ，1 9 9 2 ) 。同源比较分析发现嗜热蛋白中 g l x a s x 和a r g l y s l 均比例相对于嗜温蛋白较高，而c y s 含量较低。对一些蛋白家 族的氨基酸序列统计分析发现g l y 一舭a ，s e r a l a ，s e r a r g ，l y s a r g ，以及 a s p g l u 这些氨基酸替换有助于提高蛋白质的耐热性( l a s a & b e r e n g u e r , 1 9 9 3 ) 。 这可能是由于在长期进化过程中，编码耐热蛋白的核苷酸序列中g c 含量比较 高，导致翻译过程中对某些氨基酸有较强的倾向性的缘故。1 9 8 9 年， m e n e n d e z a r i a s 和a r g o 分析了6 个蛋白质家族中的7 0 个耐热与不耐热蛋白质的序 列，提出只有位于表面的n 一螺旋区或结构域界面使蛋白质柔韧性下降和增加疏 水性的氨基酸替代蛋白质耐热性增加有关( m e n e n d e z - a r i a s a r g o ，1 9 8 9 ) 。研究 一级结构与耐热性关系的常用手段是氨基酸突变分析法，报道指出，有时一卜或 几个氨基酸残基就可能决定了蛋白质的整体热稳定性。比如上面提到的木糖异构 酶t n x i ，当把5 8 位和2 位的p r o 分别替换为g i n 和a l a 时，它的耐热性大幅度下降， 这表明这两个位点的p r o 残基对维持t n x i 的稳定性有重要作用( b r u i n s “口，。 2 0 0 1 ) 。 当嗜热菌基因在常温茵细胞中进行表达时，通常会保留酶的耐热性，这说明 嗜热菌的耐热性是可以遗传的，编码嗜热酶的基因是对高温适应的结果( g r e g o r y e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 塑垫堕壁茔堕壁墼堕盟塞垄些些：堡璺墨曼苎塑塑竺塞一 2 4 蛋白天然构象的热稳定性 嗜热菌的蛋白与常温菌蛋白的大小、亚基结构、螺旋程度、极性大小和活性 部位都极为相似，但构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅 基的聚集，以及糖基化作用、磷酸化作用等等却不尽相同，通常蛋白对高温的适 应决定于这些微妙的空间相互作用( r a m 既，1 9 9 6 ) 。但有同样活性部位的嗜热蛋白 在常温下会由于过于“僵硬”而不能发挥作用。 有人研究了激烈火球菌( e y r o c o c c u sf u , i o 目u s ) 在lt 8 。c 稳定的红素氧还蛋白和 铁氧还蛋白，发现蛋白中的环状结构很小，a 螺旋更长，并且在氨基酸的氨基端 和羧基端均有特殊的离子相互作用，这些相互作用在温度上升时能阻止末端区域 的解链( m i c h a e le ta 1 ，1 9 9 5 ) 。r a i n e r 等研究了海栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m e ) 中 的3 一磷酸甘油醛脱氢酶，证实大量极端嗜热菌的蛋白是一个带电残基的盐键网 络结构，该结构中辅酶的结合和结构域的偶联都能增加整体的热稳定性( g r e g o r y e t a l ，1 9 9 8 ) 。最近又发现，温度耐受性与氢键和n 螺旋及0 折叠的数目无关，而 与离子键( 盐桥) 有关，通常嗜热蛋白比嗜常温蛋白约多1 4 个盐桥即可获得热稳 定性( g i l l e r t ，2 0 0 0 ) 。 也有人从蛋白质的高级结构着手研究嗜热菌酶的耐热机制。蛋白质高级结 构的形成主要依靠非共价键，即氢键、离子键、疏水键。嗜热菌酶和嗜温菌酶的 差别只在于分子内部这些非共价键数量上的差别，并未发现有特殊的键( w a l l o n e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。倘若有解离氢键的变性剂存在，则嗜热菌酶的热稳定性将减弱，甚 至失活。但其比嗜温菌酶耐受变性剂的浓度要高。 最近，蛋白动力学研究嗜热菌酶耐热机制的常用途径是取代突变。即在酶 蛋白的某个位点改变氨基酸种类来改变蛋白质的高级结构，再筛选出热稳定性增 加或下降的变型株，进行蛋白质的结构分析。 一种由b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s 的类嗜热菌蛋白酶的中性蛋白酶，其野生 株的第6 3 位是苏氨酸( t h r ) 。若该酶克隆基因的6 3 位分别以其它氨基酸替代 则其热稳定性发生不同的变化。其中被精氨酸、赖氨酸或大的疏水氨基酸替代， 则耐热性可明显提高。若被天冬氨酸、谷氨酸或些极性中性的氨基酸替代，则 耐热性就下降。一般说，在蛋白质表面疏水性氨基酸的代替不适宜于热稳定性的 提高a 但该酶的第6 3 位苏氨酸残基若苯丙氨酸代替，则可显著提高耐热性。这是 耐热对硝基酚磷酸酶的表达纯化、性质及晶体结构研究 因为p h e 6 3 的侧链可以覆盖一个重要的b 折叠结构，阻止了水分子的侵袭以及折 叠的破坏。而且由于一些突出的表面残基的甲基基团与p h e 的芳香环连接可以掩 盖p h e 的部分侧链。v a l 9 和a r g li 、g l n 6 1 的疏水部分可形成一个疏水性口袋，包 围p h e 的芳香环。总之，p h e 的替代使遮盖的疏水表面积大幅度增加，从而提高酶 的耐热性。a r g _ j 1 l y s 突变株的热稳定性增加并不是由于氢键或离子键的形成。氢 键及离子键的作用力使非常小的，在a s p 和g l u 突变株中由于a s p _ 羊f g l u 有羧基， 很难与v a l 9 靠近，从而使得耐热性下降。 虽然外部因素对蛋白质的热稳定性有一定的影响，但外部因素是通过影响蛋 白质的内部结构来影响其热稳定性的，因而最终决定蛋白质热稳定性的还是其自 身的结构。一般认为，影响耐热蛋白质热稳定性的内源机制是分子内部结构的变 化导致分子间相互作用的增强。这是大部分耐热蛋白质所采用的热稳定机制。例 如，耐热菌zt h e r m o p h i l u s 中的p h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s e 和肽链延长因子t u t s 等，在没有底物，金属离子或其它保护因子的情况下，仍能保持很高的热稳定性 ( a r a ie ta 1 ，1 9 7 8 ) 。从目前已报道的研究工作来看，可使蛋白质热稳定性升高的 因素主要有：较高的疏水性( h a n e ye t a l ，1 9 9 7 ) ；分子堆积更加紧密，环区( l o o p s ) 缺失或较f 短( r u s s e l le ta 1 ，1 9 9 7 ) ；蛋白质分子中的空穴( c a v i t i e s ) 较小或较少， 被包埋的亚基表面积增大( s a l i n i n e ne ta l ，1 9 9 6 ) ；在二级结构内或外有倾向性的 氨基酸置换( h a n e ye ta l ，1 9 9 7 ；r u s s e l le ta l ，1 9 9 8 ；z u b e r , 1 9 8 8 ) ；p r o 含量增高 ( h a n e y e t a l ，1 9 9 7 ；w a t a n a b ee t4 f ，1 9 9 7 ；b o g i ne t a l ，1 9 9 8 ) ；不耐热的氨基酸残基 ( t h e r m o l a b i l ea m i n o a c i d ，即a s h ，g i n ，m e t 和c y s ) 含量下降( r u s s e l le t 以。1 9 9 7 ) ： 螺旋结构含量升高，极性表面积增大( v o 毋& a r g o s ，1 9 9 7 ；v o g tge 以，1 9 9 7 ； h a n e y e t a 1 ，1 9 9 7 ) ；氢键数量增多( v 0 毋a r g o s ，1 9 9 7 ；v o g t e ta l ，1 9 9 7 ) ：盐桥数 量增多( h a n e y e ta l ，1 9 9 7 ；r u s s e l le ta 1 ，1 9 9 7 ；r u s s e l le f 口t ，1 9 9 8 ；y i pf t 4 ，1 9 9 5 ； y i p e t a l ，1 9 9 8 ；e l c o c k , 1 9 9 8 ；x i a o & h o n i g , 1 9 9 9 ；k u m a r e t a l ，2 0 0 0 ) 等。 2 4 1 分子问作用力 2 4 1 i 疏水作用 有研究表明：化学基团从蛋自质亲水表面向蛋白质内部转移所需要的稳定性 能量大约是2 5 3 0c a lt o o l 。1 a 2 ，这证实了疏水作用对稳定蛋白质结构的重要性 ( c h o t l i a 1 9 7 4 ) 。 耐热对硝基酚磷酸酶的表达纯化、性质及晶体结构研究 e r i k s s o n 以t 4 溶藩酶为实验材料，进行了一系列出亮氨酸( l e u ) 至0 丙氨羧 ( a 1 a ) 的在蛋白质疏水内腔的氨基酸置换实验，并测定了它们的晶体结构。