（遗传学专业论文）无菌间优势微生物的分离鉴定及其对一般消毒剂的抗性研究.pdf

无菌间优势微生物的分离鉴定及其对一般消毒剂的 抗性研究 摘要 对于药品和食品生产行业而言，无菌操作室是非常重要的基础设施之一。监 控无菌室内微生物分椎和室内优势菌株的分离鉴定是标准生产习惯的一部分。常 用的监控方案主要是媒介的使用，例如s c d 琼脂法在3 0 0 c 温度下培养4 天。依 照欧洲联合会的标准生产要求，可允许的表面接触平板的c p u 数量级别从a 到 b 分别是1 5 级。而美国药典u s p ( u s 。p h a r m a c o p e i a ) 中规定的级别分别是 1 0 0 - 1 0 0 0 从3 到5 级。为达到这个要求，无菌室所有的可接触表面包括地板、空 气等以及在操作人员的手部皮肤都要经过多种消毒剂进行常规消毒。在许多药品 类相关生产制造行业，紫外线照射、苯酚溶液擦洗( 苯酚又称来苏儿，l y s 0 1 ) 以及c h l o r h c x i d i n c g l u c o n a t e ( c h g ) 溶液浸泡，即本实验中的m a s k i n 消毒液， 是三种比较常见的用于无菌室空气、器械和人手皮肤的消毒方法 对于科研和医药食品生产而言，要保持无菌操作车间的真实洁净无异于一场 战斗，对保证产品质量极为重要。要决定用哪种消毒方法最合适，或者哪几种方 法的结合更合适于某个无菌生产操作室，我们就有必要掌握这些优势菌株的最初 污染源和污染菌株。因此必须先弄清楚该无菌室的微生物分布以及这些微生物所 具有的各自的特点，以及对各种消毒剂的抗性极限等。 本研究的目的就是分离和鉴定分布于某药品类无菌生产车间的微生物菌株 及其抗性特性的测定。在鉴定可能存在于无菌车间的微生物污染源的研究中，对 分离的菌株进行菌落和细胞形态学比较，并且做常规生理生化测定，同时对这些 分离得到的优势菌株进行1 6sr d n a 基因扩增和部分保守序列鉴定。 生理生化试验表明有3 株分离菌株在很多方面都有相似性，1 6 sr d n a 序列 分析表示3 株菌具有高于9 9 的相似性，部分1 6 sr d n ab l a s t 分析更加确定了 这3 株菌都属于葡萄球菌属，结合生理生化测定结果可以初步得出结论：其中2 株分别最相似于ss a p r o p h y t i c u s 和& c o h n 打的解脲亚种，余下l 株应该最有可 能是& w a r n e r i 或者s p a s t e u r i 。用同样的方法，5 株中的另外两株被鉴定出分 别为厚壁菌门的b a c i l l u s f u s i f o r m i s 和放线菌中的m i c r o b a c t e r i u mo l e i v o r a n 。 分离菌株的特有抗性测定过程中，一共测试了对3 种消毒剂的抗性作用( u v 、 苯酚、和c h g ) 。以金黄色葡萄球菌作对照，在实验结果的基础上分析分离菌株 对三种消毒剂的敏感度大小，即抗性能力，从而判定分离菌株是否属于抗性基因 获得型突变株。结果表明：虽然分离菌株的抗消毒剂能力较强而得以存活于无菌 室中，但是经过试验，与对照菌株金黄色葡萄球菌s a 进行的抗消毒剂能力的作 用时白j 和浓度的双因素差异分析，并无显著差异，这也就表明分离菌株只是普通 的现存野生株，而不是因为含有某种质粒或者遗传获得产生的突变株。 关键词：无菌室，优势菌株， 1 6 sr d n a ，系统进化树，消毒剂，抗性能力 c h a r a c t e r i z a t i o no fp r e d o m i n a n tb a c t e r i ai s o l a t e sf r o mc l e a n r o o m si nap h a r m a c e u t i c a lp r o d u c t i o nu n i ta n d a n a l y s i so ft h e i rs e n s i t i v i t yt od i s i n f e c t a n t a b s t r a c t c l e a nr o o m sa r ee s s e n t i a li n a s e p t i cp h a r m a c e u t i c a l o rf o o d p r o d u c t i o n m o n i t o r i n gm i c r o b i a ld i s t r i b u t i o na n di d e n t i f y i n gt h ep r e d o m i n a n ti s o l a t e si sp a r to f g o o dm a n u f a c t u r i n gp r a c t i c e s t h ec o m m o n l yu s e dp r o t o c o lf o rm o n i t o r i n gi n v o l v e s t h eu s eo fm e d i as u c ha ss c d a g a ra n di n c u b a t i o na t3 0 。cf o r4d a y s a c c o r d i n gt o t h ee u r o p e a nu n i o n sg o o dm a n u f a c t u r i n gp r a c t i c ed i r e c t i v e , t h ep e r m i s s i b l en m n b e r o fc f uo ns u r f a c ec o n t a c tp l a t e sf o rg r a d eaa n dbi s1a n d5r e s p e c t i v e l y t h e n u m b e rp e r m i t t e db yu s p ( u s p h a r m a c o p e i a ) f o rc l a s s1 0 0a n d1 0 0 0 0i s3a n d5 r e s p e c t i v e l y ( u sg e n e r a ls e r v i c e sa d m i n i s t r a t i o n1 9 9 2 ) t om e e ts u c hr e q u i r e m e n t s , a l lt h es u r f a c e sw i t h i nt h ed e a nr o o m , 血f l o o ra n dp c r s o n n dh a n d s , a r ed i s i n f e c t e d r o u t i n e l yu s i n gav a r i e t yo fd i s i n f e c t a n t s u l t r a v i o l e t ( u ”i r r a d i a t i o n , l y s o l ( p h e n 0 1 ) s o l u t i o ns w a b b i n ga n dm a s k i n ( c h l o r h e x j d i i l eg l u c e n a t e , c h g ) s o l u t i o ni m m c r g e n c e a r et h r e ew i d e l yu s e dw a y sf o rd i s i n f e c t i n gc l e a nr o o ma i r , f u m i t u r es u r f a c ea n d p e r s o n n e ls k i n si nm a n yp h a r m a c e u t i c a lf a c t o r i e s m a i n t a i n i n gt h ei n t e g r i t yo fac l e a nr o o mi sac o n s t a n tb a t t l e t od e c i d ew h i c h m e t h o d , 0 1 c o m b i n a t i o no fm e t h o d s , t ob ee m p l o y e di nd i s i n f e c t i n ga s e p t i cw o r k s h o p t h e r ei san e e dt ou n d e r s t a n dt h ek i n do fb a c t e r i at h a ta r et h ep r i m es o u r c e so f c o n t a m i n a t i o n t h e r e f o r e ，k n o w l e d g eo ft h em i c r o b i a ld i v e r s i t yo fa l e a nr o o n l s ，a s w e l la sa n ye x t r e m ec h a r a c t e r i s t i c st h e s em i c r o b e sm i g h tp o s s e s s , i se s s e n t i a lt ot h e d e v e l o p m e n to f d i s i n f e c t i o nt e c h n o l o g i e s t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st oi s o l a t ea n di d a n t i f yt h ep r e d o m i n a n tb a c t e r i as t r a i n s d i s t r i b u t c di nc l e a nr o o m so fap h a r m a c e u t i c a lw o r k s h o p i no n - g o i n gi n v e s t i g a t i o n s t od e t e r m i n ea n dd o c u m e n tp o s s i b l em i c r o b i a lc o n t a m i n a t i o ni nc l e a nl o o m s ，b a c t e r i a s t r a i n sw e r ei s o l a t e da n dt l l e i rc o l o n ya n dc e l lm o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c sw e l e c o m p a r e d a n dt h ef o l l o w i n gp r o c e s sm e a s u r e st h eb i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a l 3 c h a r a c t e r i z a t i o no f p r e e m i n e n tb a c t e r i a t oa n a l y z et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so f t h ep r l o m i n a n ti s o l a t e s t h e1 6 sr d n ag e n e sw r ea m p l i f i e da n dt l l e i rp a r t i a l s e q u e n c e sw e r ed e t e r m i n e d t h eb i o c h e m i c a la n d p h y s i o l o g i c a lt e s t sa l s os h o w e dt h a t3o f i s o l a t e sa l es i m i l a ri n m o s to ft h ep r o p e r t i e s ，a n d1 6 sr d n as c q u c ca n a l y s e sf u r t h e rd o n o n s t r a t e dt h a t t h e s e3i s o l a t e ss h a r em o r et h e n9 9 f i m i l a r i f i e s b l a s t i n ga n a l y s e so fp a r t i a l1 6 s r d n as e q u e n c e sc o n f i r m e dt h a tt h e s et h r c ei s o l a t e s b e l o n g t ot h eg e n u s s t a p h y l o c o c c u s h o w e v e r , m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n sw e r ea tt h el i m i t so fr e s o l u t i o n f o rt h ed i f f e r e n t i a t i o no f $ p e g i 鹤i nt h i sg e n u s c o m b i n e dw i t ht h er e s u l t so f b i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o 酬t e s t s ，i tc a nb ep r e l i m i n a r yc o n c l u d e dt h a to n ee n dr e s t o n eo ft h e3i s o l a t e sc l o s e l ym a t c h 最s a p m p h y t i c u se n d & c o h n i is u b s pu r e a l y t i c u s r e s p e c t i v e l y , a n do n em a yb e & w a r n e r io r & p a s t e u r w i t ht h es a m em e t h o d s t h e o t h e r so ft h e5i s o l a t e sw e r ei d e n t i f i e da saf i r m i c u t e sb a c 1 u s 如归r m s ，a n da l l a c t i n o b a c t e r i am i c r o b a c t e r i u mo l e i v o r a n sr e s p e c t i v e l y t od e t e r m i n et h ee x t r e m ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e s ei s o l a t e s , t h e i rr e s i s t a n c e1 e v e l st o3 d i s i n f e c t a n t s ( u 、p h e n o le n dc h g ) w e l et e s t e d i no r d e rt oj u d g e w h e t h e rt h e s e i s o l a t e sa r ej u s tt h en o r m a lb a c t e r i ai nt h ee n v i r o n m e n t , e n dt h er e s i s t i n ga b i l i t i e s 撇 t h ei n h e r e n tc h a r a c t e r i s t i c so f t h e s es t r a i n s ，o r # a s m i dh o l do rd n a c h a n g c dm u t a n t s ， s t a p h y l o c o c c u sa u r e l l sw a st ob ec o m p a r i s o n , a n dc o m p a r i n gt h ed i f f e r e n to f r e s i s t a n c eb e t w e e ns aa n di s o l a t e db a c t e r i u m t h er e s u l ts h o w e d ：a l t h o u g ht h e5 i s o l a t e sh a v ed i f f e r e n tr e s i s t i n ga b i l i t i e st o3d i s i n f e c t a n t s ，t w o - f a c t o r sv a r i a n c e a n a l y s e s s h o w e dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w l lt h e s e5i s o l a t e se n d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s s u g g e s t i n gt h a tt h e s ei s o l a t e sa f ej u s tt h en o r m a lb a c t e r i ai n t h ee n v i r o n m e n t , a n dt h er e s i s t i n ga b i l i t i e sa r et h ei n h e r e n tc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s e s t r a i l l s ，r a t h e rt h e np l a s m i dh o l do rd n a c h a n g e dm u t a n t s k e yw o r d s ：c l e a nr o o m , p r e d o m i n a n tb a c t e r i a , 1 6 sr d n a , p h y l o g e n e t i ct r i i d i s i n f e c t e n t , r e s i s t a n ta b i l i t i e s 4 前言 近年来，随着生活水平的提高，社会压力的增加，新的疾病频繁的出现，人 们对药品等医药用品的要求也只渐增加，制药公司的制药核心部位无菌操作车间 的环境水平也便成为众矢之的，对无菌车b j 的卫生要求也上了一个新的台阶要求 做到真实无危害菌状态 无菌室的基本要求主要包括：结构要求无外界污染源，便于清洁等；无菌室 内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯的杀菌效果；无菌室内应安装空气除菌过 滤层流装置及调温装置等。具体要求依照相关规定执行。但是生物学家n a g a r k a r 曾说过保持无菌室的完整性是一场持续的战斗，因此为达到无菌室的环境指定要 求，在无菌室构建和配备标准化后，我们还要持续监测无菌室微生物的存在状态 为了对制药公司的无菌车间内的微生物生存状况进行了解，对无菌室的管理 更加清晰明了，我们从某制药公司的无菌车间里分离生存微生物，得到几株优势 菌株，为了解其特性及来源，对其进行了一系列的研究。主要包括对分离得到的 未知菌株进行形态学特征以及生理生化特征和1 6 s r d n a 序列分析，以鉴定该菌 株。观察其形态特征，掌握其生长状况，以便了解掌握菌株的特点，并由序列系 统发育树结合生理生化实验结果分析得出其归属。初步确定分离菌株属性后，对 这几种菌进行抗一般消毒剂能力的测定，以检测分离菌株在不同浓度梯度的消毒 剂不同时间作用下的存活情况。 对分离纯化后的菌株再培养( 划线法或者涂平板法) ，制片后送拍电镜照片以 观察菌株形态特征，这是菌株鉴定中比较常规的实验，可以初步观察菌株细胞的 形态；做传统革兰氏染色实验，观察菌株菌体细胞的特点，培养过程中注意菌落 形态特征描述；后再进行常规生理生化实验，测各种糖的发酵氧化利用情况，盐 的分解利用，明胶液化反应及各种试剂反应。结果在细菌鉴定手册上比对，结合 分子鉴定结果进一步确定菌株归属。生理生化测定和革兰氏染色都是最基本的鉴 定手段。 分子水平鉴定，利用1 6 s r d n a 序列分析进行鉴定。随着核酸测序技术的发展， 1 6 sr d n a 序列越来越多地被用于细菌、放线菌的系统进化研究，并已经成为确 立细菌、放线菌新分类单位的必要数据。近年报道的链霉菌新种大多是以1 6 s r d n a 序列分析结果为依据的( s p r i n g e r b e t a l , 2 0 0 1 ) 。目前，1 6 sr d n a 已成为 细菌系统分类研究中最常用的分子指标。研究表明，编码1 6 sr d n a 的基因 ( r d n a ) 全长约1 5 0 0 b p ，由一系列保守区和可变区问隔而成。保守性能够反映 生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索，这些保守序列在千百万年的进 化过程中几乎没有发生过变化( b a c hl - i je ta t , 2 0 0 2 ) ：高变性则能揭示出生物物 种的特征核苷酸序列，是种属鉴定的分子基础。另外，随着互联网的迅速发展， 我们可以更快捷、更容易地从一些大型数据库如：r d p 、e m b l 或g e n b a n k 中 获得相关菌株的1 6 s r d n a 序列用于构建系统发育树。 分子鉴水平定中d n a 的提取方法：冻融法、碱提取法，这是微生物d n a 提 取方法比较常用而且简便的方法。p c r 反应引物为通用引物f 3 4 1 、9 0 7 r , p c r 产 物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收并送往测序。测序结果于n c b i 上比对，找出 相近种属，利用d n a m a n 软件制作系统发育树，并进行分析，得出初步结论。 菌种抗性试验主要针对于菌株对几种杀菌物质的抗性能力的确定，以便于确 定菌株是否具有很高的抗性能力，是否为突变性抗性菌株，还是只是含有抗性基 因显性的野生型菌株。同时了解菌株生长状况和特点以便于控制菌株生长存活， 找出最佳抑制方法及其来源控制。抗性能力测定的主要实验方法：分光光度比浊 法、平板计数法。实验具有可重复性。 本实验室于2 0 0 5 - - - 2 0 0 6 年对杭州某制药公司的无菌生产操作室内的优势菌 群进行了分离，用平板暴露法采集无菌室的生存菌株，根据菌落特征，挑选优势 菌，分离纯化后进行一系列生理生化测定试验，比对其1 6 sr d n a 的部分序列， 进行分子鉴定和系统发育关系研究。同时对分离菌株的抗常规消毒剂能力进行了 研究。 本实验的结果可为生物医药与食品生产有关部门构建合格的无菌操作室和维 护正常运行提供科学参考与技术措旄。本实验的完成还可以更好的帮助制药公司 管理无菌操作车间，实现真实无危害菌状态，更加有效的控制无菌车间的菌群生 长情况，防止有害菌株污染药品和制药环境，进而影响产品质量，以致危害人体 健康。总之，使药品食品类生产流程更加清晰化、整洁化，有利于保证药品食品 类的质量。 6 材料与方法 1 样品采集 样品采于浙江某药品类生产公司的无菌生产操作间，从经过常规消毒后的公 司员工手部及无菌室器械等表面和无菌作车间的空气中分离取得。空气中采样采 用平皿暴露法，在无菌室任选一对角线，在其中心及两端( 距墙角l m 处) 各设 一采样点，将采样用普通琼脂平皿( g c m 直径) 放在采样点距地面1 5 m 高度处， 打开皿盖，暴露1 5 m i n 后合盖，置3 0 。c 培养9 6 h 。操作车间员工手部及无菌室 器械表面采样采用棉签擦拭法，在经s 0 ( w v ) 苯酚溶液消毒后的地板或者无菌 室器械上2 5 c m 2 区域内擦拭取样，员工手部经1 0 ( w v ) c h g 溶液浸泡处理后擦 拭取样，样品于普通琼脂平皿培养基中3 0 。c 下培养9 6 h 基本分离得到菌株后，用涂平板法进行菌株纯化操作即得分离菌株单菌落。 2 培养基和试剂 2 1 形态和培养特征观察用培养基 2 1 1 发酵培养基 葡萄糖2 0 蛋白胨o 5 酵母膏o 1 k 2 h p 0 40 1 o h7 2 7 4 ，1 1 5 灭菌3 0 r a i n 海盐3 m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 2 1 2 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基( 计数培养基) 牛肉膏0 3 蛋白胨1 o n a c io 5 琼脂2 0 p h7 0 - 7 2 ，1 2 1 c 灭菌2 0 m i n 2 1 3 菌生长培养基( 营养琼脂培养基) 营养琼脂3 5 1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 2 生理生化特性测定用培养基( 周德庆。1 9 8 3 ) 2 2 1 葡萄糖氧化发酵培养基 葡萄糖1 o 蛋白胨o 2 k 2 h p 0 40 0 2 7 n a c l0 5 琼脂o 6 溴麝香酚蓝l 水溶液3 m l p h7 0 - 7 2 ，1 1 5 c 灭菌2 0 m i n 2 2 2 淀粉水解测定培养基 可溶性淀粉o 2 n a c l0 5 蛋白胨1 0 0 , 4牛肉膏0 5 琼脂1 5 p h7 0 - 7 2 ，1 2 1 c x 菌2 0 m i n 2 2 3 甲基红v - p 试验培养基 葡萄糖o 5 蛋白胨0 5 k 2 h p 0 40 5 p h7 0 - 7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 2 4 硝酸盐还原试验培养液 蛋白胨1 o 牛肉青o 5 n a c i0 5 硝酸钾1 p h 7 0 - 7 6 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 2 2 5 硫化氢产生测试培养液 蛋白胨1 o 牛肉膏0 3 n a c lo 5 硫代硫酸钠0 2 5 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 2 6 吲哚试验培养液 蛋白胨1 0 0 , 4 n a c i o 5 p h 7 2 - 7 6 ，1 1 5 c 灭菌3 0 m i n 2 2 7 柠檬酸盐利用试验培养基 n h 4 h 2 p 0 40 1 k 2 h p 0 40 1 m g s 0 4 7 h 2 0o 0 2 柠檬酸钠o 2 n a c l 0 5 琼脂2 0 0 , 4 1 溴百里酚兰1 0 m l p h6 8 ，1 1 5 c x 菌3 0 r a i n 2 2 8 明胶液化试验培养基 蛋白胨0 5 明胶1 0 - 1 5 o p h7 2 7 4 ，间歇灭菌或1 1 5 c 灭菌2 0 m i n 8 2 3d n a 提取主要试剂 d n a 提取主要试剂i ( 倪语星，洪秀华，2 0 0 2 ) t e 缓冲液 5 0 r a mt r i s - h c l - 5 m me d t a ，p n8 0 2 0 0s d s ( w v ) 2 4 ：1 氯仿- 异戊醇( v ：v ) 平衡酚 r n a 酶无水乙醇 d n a 提取主要试剂i i ( w ug e n - f u , z h o ux u e - p i n g , 2 0 0 5 ) o 2 m o f ln a o h 溶液0 2 m o f lh c l 溶液 2 41 6 sr d n a 特异性扩增实验用试剂 r a qd n a 聚合酶 1 0 x p c rb u f f e r ( m 矿+ ) d n t p 一对特异性引物琼脂糖t b e 缓冲液 e b 染液d n a 加样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖 2 5 试剂 2 5 11 对氨基二甲基苯胺盐酸盐水溶液 2 5 2 3 - 1 0 h 2 0 2 2 5 3l 溴麝香酚蓝水溶液：先用少量9 5 乙醇溶解，再加水配成1 水溶液 2 5 4卢哥氏碘液 2 5 5 甲基红试剂：0 0 2 甲基红，6 0 m l9 5 乙醇，4 0 m l 水 2 5 64 0 k o h 溶液和5 0 0 a 萘酚溶液 2 5 7 格里斯氏( g r i e s s ) 试剂： a 液：对氨基苯磺酸o 1 9 ，溶于3 0 m l1 0 稀醋酸 b 液：o 0 2 9m 萘胺先溶于4 m l 蒸馏水，然后加入3 0 m l1 0 稀醋酸 2 5 8 二苯胺试剂：o 5 9 二苯胺溶于1 0 0 m l 浓硫酸中，用2 0 m l 蒸馏水稀释 2 5 95 - 1 0 的醋酸铅溶液 2 5 1 0 石蕊溶液：石蕊2 5 9 ，溶于1 0 0 m l 蒸馏水，溶解后过滤 2 5 1 1 p h 6 0 磷酸缓冲液 2 5 1 20 8 的生理盐水 9 3 主要仪器设备： 电子天平( m e t t l e rp m 4 6 0 ) ，蒸汽灭菌锅( s a n y o 。a u t o c l a v em l s 3 0 2 0 ) ， 恒温培养箱( d h p 9 0 8 2 型，上海一恒科技有限公司) ，光学显微镜，恒温摇床 ( h z 9 3 1 i k 型，江苏太仓科技器材厂) 。l e n g g u a n g - 7 2 2 分光光度计( 上海精 密科学仪器有限公司) ，高速台式离心机( 1 g l l 6 c 型，上海安亭科学仪器厂) ， 落地恒温振荡器( h z 9 3 1i k ，太仓实验仪器厂) ，热循环仪( p e r k i n e l m e r 公司 9 6 0 0 型) ，d y y - 1 2 型电脑三恒多用电泳仪，全自动紫外与可见分析仪( f r 2 0 0 a 上海复日科技有限公司) ，电热恒温水槽( d k - 8 b 上海精宏实验设备有限公司) 4 优势菌株的分离 将各个样品置振荡器上振荡，以便附着在样品上的微生物振落入菌液中， 选取lo _ 1 ，l o - 2 ，1 0 3 和1 矿的样品稀释梯度，各吸取o 1 i i l l 于平板中，用涂 布棒进行涂布，每个稀释梯度分别重复3 次。 正面放置待液体稍干后，用报纸包扎好，倒置于3 0 培养箱内；在接下来 得1 7 d 内观察微生物生长情况。放线菌需培养一周后进行观察，霉菌在5 d 后观 察，细菌则培养2 3 d 即可，分别对各个平板中菌落的生长状况进行观察并计数： 所有的平板还需要额外培养两周左右，以便保证长势较慢菌株的生长。 根据各个平板内单菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从各种培养 ，7 基中，每个样品尽可能多的挑选出单菌落，进行二次划线复筛，确保纯化后，扩 大培养，以进行下一步试验。 5 筛选优势菌种的鉴定 5 1 筛选菌株细胞形态观察 由细菌的菌落形态挑选出具有代表性的细菌，对菌落的不同的菌株，进行革 兰氏染色，在光学显微镜下观察细胞革兰氏染色阴阳性以及细胞的形态。并拍出 其电镜照片，观察细胞的基本形态和芽孢、鞭毛等特殊结构。 5 2 菌株生理生化特性的测定( j o n e s d 。l e ta l , 1 9 9 4 ) 5 2 1 氧化酶试验 1 0 用灭菌牙签挑取1 8 2 4 h 的菌苔，涂在滴有1 o 对氨基二甲基苯胺盐酸盐水 溶液的干净滤纸上，6 0 s 内观察结果。 5 2 2 接触酶试验 用灭菌牙签挑取1 8 2 4 h 的菌苔，涂在滴有3 0 h 2 0 2 的干净玻片上，观察结 果。 5 2 3 糖醇氧化发酵试验 取1 8 - 2 4 h 的菌株，穿刺接种于4 支试管中，2 支用灭菌凡士林石蜡或2 琼 脂5 m l 封管，以隔绝空气，作为闭管；另2 支开管。2 8 培养l ，2 ，3 ，7 ，1 4 d 观察结果。糖醇发酵试验分别为葡萄糖、乳糖、木糖、山梨塘、麦芽糖、甘露 醇、蔗糖等常用糖醇类化合物。 5 2 4 淀粉水解测定 将菌株点种于淀粉水解测定平板上，2 8 培养2 5 d ，形成明显菌落后，在平 板上滴加卢哥氏碘液，铺满菌落周围，观察是否有透明圈产生。 5 2 5 甲基g z n - p 试验测定 将菌株接种到甲基红v - p 试验培养液中，2 8 培养2 - 6 d 左右，分别进行甲 基红与v - p 试验测定，观察结果。 5 2 6 吲哚试验测定 将菌株接种到吲哚试验培养液中，2 8 培养l ，2 ，4 ，7 d ，滴加吲哚测定试 剂，观察结果。 5 2 7 硝酸盐还原试验测定 将菌株接种到硝酸盐还原试验培养液中，2 8 培养l ，3 ，5 d ，滴加硝酸盐 还原试验测定试剂，观察结果。 5 2 8 硫化氢产生试验测定 将普通滤纸剪成0 5 1 0 c m 宽的纸条，用5 1 0 的醋酸铅溶液浸透，灭菌烘 干后，用无菌镊子夹取一条用棉塞塞紧，使之悬挂于试管中，下端接近但不触液 面，2 8 c 培养3 ，7 ，1 4 d 左右，观察结果。 5 2 9 柠檬酸盐利用试验 在斜面上划线接种，2 8 c 培养3 7 天，观察结果。 5 2 1 0 明胶液化试验 将菌株穿刺接种到明胶培养基中，2 0 恒温培养箱中培养，分别在2 ，7 ， l o ，1 4 和3 0 d 观察各菌株生长情况和明胶是否液化以及液化程度。 5 2 1 0 盐分耐受试验 将菌株接种到含不同浓度n a c i 的牛肉膏蛋白胨培养基上，可画十字，3 0 c 恒温培养箱中培养，分别在3 - 1 0 d 观察各菌株生长情况。 5 31 6 sr d n a 基因序列扩增 5 3 1 细菌d n a 的提取 挑取l 3 接种环的细菌加至o 2 m l0 2 m o l l 的n a o h 中，冻融2 次，每次 5m i l l ，然后加入等体积的0 2m o l lh c l ，1 0 0 0 0r p m 离心5r a i n 以去除细胞碎 片，取2m 的上清液用作d n a 模板进行1 6 sr d n a 基因序列扩增。 5 3 2p c r 扩增 应用标准的双链p c r 扩增分离菌株的1 6 sr d n a 基因序列片段。p c r 扩增 在e p p e n d o r fm a s t e r c y c l e l 中进行，采用的引物为 f 3 4 1 ( c c t a c g g g a g c _ r c a g c a g ) 和9 0 7 r ( c c c c g t c a a t i c c t r r g a g t i t ) ， 两引物所扩增的序列片段长度约为5 5 0 碱基对。p c r 扩增体系混合物包括： m g c l 2 2m m o l l ，d n t p2 0 0t t m o l l ，引物各l u m o l l ，t a gd n a 聚合酶2u ，最 终体系为5 0 u l 。经9 4 ( 2 预变性3m i n 后，按下列方式进行3 0 个循环的p c r ： 9 4 变性4 5 s ，5 5 退火4 5 s ，7 2 1 2 延伸lr a i n 。此外，循环结束后再在7 2 c 延伸 1 0 m i n ( w u g e n - f u , z h o u x u e - p i n g ，2 0 0 5 ) 。 5 3 3p c r 产物纯化 p c r 产物用1 ；韵琼脂糖凝胶电泳分析。用p c r 纯化试剂盒进行割胶回 收，从而达到纯化的效果。 5 a 基于1 6 sr d n a 序列比较的系统发育分析 序列用m e g a b a c e1 0 0 0d n a 自动测序仪以3 4 1 f 为引物测序。然后把分离 菌株的1 6 sr d n a 的测序结果提交到e u r o p e a nm o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y ( e m b l ) 核酸序列数据库。将各菌株的1 6 sr d n a 序列通过b l a s t ( e l i s a b e t t a c h e l o s s ic ta 1 2 0 0 4 ) 程序与g e n b a n k 中已有的核酸序列进行比较。选择与所测菌 株的1 6 sr d n a 基因序列相似性最大的菌株，构建系统发育树用d n a m a n p a c k a g e ( l y n n o nb i o s o f l , c 觚a 蚴进行序列捧列和系统发育树的分析( 进化距离 法，b o o t s t r a p p i n g1 0 0 0 砸a l s ) 6 分离菌株对消毒剂等抑菌性物质的敏感性测定 挑取纯培养后的菌体( 3 环左右) ，于装有发酵培养基的三角瓶( 3 0 m l l o o m l ) 中，放置2 8 摇床，1 8 0 f r a i n ，培养2 5 d 。 6 1 分离菌株对紫外线照射的敏感性，抗性测定 6 1 1 菌液准备 观察发酵液的发酵程度、颜色、是否污染等情况。保证菌液无污染且长势良 好( 颜色变化要有一定规律) 。 6 1 2 使用1 5 w 的紫外照射灯对菌株紫外线抗性能力进行测定 无菌操作箱中先将紫外灯打开3 0 r a i n ，使操作箱内资外照射密度稳定均匀。 菌株敏感性测定以常用大肠杆菌s t a p h y l o c o c c u sa l l r e 淞( s a ) 为对照。 用移液枪取0 5 m l 的菌株悬浮液置于盛有4 o m i 无菌水，0 8 5 n a d 无菌生理 盐水0 5 m l 的7 m l 无菌离心管中，5 0 0 0 r l m i n 离洗5 r a i n , 弃上清液，取沉淀，再用 5 m lo 8 5 n a e l 无菌生理盐水5 0 0 0 r m i n 离洗5 m i n 后弃上清液，加入5 m l 无菌水 摇匀。 取上述离洗后菌液5 m l 置入6 c m 直径的无菌平皿中，距离紫外灯下2 0 c m 处 照射若干分钟，同时使用磁力搅拌器搅拌使菌液受光均匀，分别在照射0 - s m i n 之间每隔半分钟便取样一次每次取样后分别稀释到l o 3 、l 矿、lo _ 5 、1 0 r 6 四个 浓度梯度在营养琼脂培养基进行平皿3 0 培养，2 7 d 后观察并计数菌落数。 6 1 3结果处理 待3 0 e 培养2 5 d 形成完整菌落后，在计数范围内有效计数( 3 0 3 0 0 菌落数 为有效计数范围) 。操作过程要在红色光下( 因日光灯等自光具有紫外线照射修 复功能，以防止试验有误差太大) 。 所得结果进行处理，算出存活率。再进行方差分析以判定与对照菌株的抗性 能力的差异显著与否。 存活率= 各时间紫外线照射后菌落数未经紫外线照射菌落数。 6 2分离菌株对苯酚和m a s k i n 消毒剂敏感性测定 6 2 1 菌株苯酚和m a s k i n 消毒剂敏感性测定的方法 苯酚就是常用的器械和无菌室内接触表面消毒剂，也就是常说的石炭酸、来 苏儿，巴斯德1 8 7 4 年首先用于外科消毒；洗必泰葡糖酸钠溶液( c h l o r h e x i d i n e g l u c o n a t e ，简写为c h g ) 即m a s k i n 也是一种常用消毒剂。其成分是葡萄糖酸氯 己定的可溶性盐。主要用于医学器械和皮肤消毒。 用两种方法来测定分离菌株抗消毒剂效果，一种是短时日j 接触也称为平板计 数法，将消毒剂和菌株相互作用一定豹时间，然后将菌株和消毒剂分离，将作用 后存活的菌株在平板固体培养一段时间，进行有效计数，以同等条件下未经消毒 剂作用的分离菌株平板培养物作为对照，最后算出存活率，以观察该消毒剂对分 离菌株的短时间作用效果。 另外一种是长时间作用也称为比浊法。比浊法是用消毒剂对分离菌株进行长 时间的共同作用( 如2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 等时问梯度) ，同时消毒剂使用不同的浓度 梯度( 从o 开始) ，即在不同浓度消毒剂作用下液体培养基中培养分离菌株， 在一定时问梯度中以同条件下对应的含各梯度消毒剂无接种菌株的样本做对照 进行分光光度的吸光值得测定，从而算出各个浓度梯度消毒剂各个时间梯度下对 分离菌株的杀灭效果。 1 4 6 2 2 菌株对苯酚和m a s k i n 消毒剂敏感性操作 取分离菌株l 到3 环，接种于发酵培养液中3 0 下于摇床中震荡培养，l - 2 d 。 观察菌液颜色浓度变化是否正常。确保菌液无污染。 用移液枪取l m l 的菌株悬浮液置于盛有9 0 m l 发酵培养液中，加入不同浓度 梯度的苯酚溶液和c h g 溶液于菌液中3 0 下于摇床中震荡培养，根据时间梯 度进行6 5 0 r i m 波长的分光光度计的o d 值测定。以常见金黄色葡萄球菌 s t a p h y l o c o c c u s4 “，纵s 为对照。记录数据。 6 2 3 结果处理 短时间作用的结果同上紫外线照射处理方法。 长时间共培养结果处理：将所得的o d 。5 0 。值结果整理后算出存活率，再进 行方差分析以判定与对照菌株的抗性能力的差异显著与否。 存活率= 含各浓度梯度消毒剂的菌液的o d 6 5 嘶，值消毒剂浓度o 的菌液的 0 d 6 ，o m 值 1 5 结果 1 优势菌株分离纯化及其鉴定结果 1 1 菌株分离结果 根据菌株在环境中的分布情况，以及初步菌落形态