（遗传学专业论文）人类map1lc3家族三个成员的翻译后修饰分析及一种新的翻译后修饰形式的鉴定.pdf

复旦大学博士论文 人类m a p i l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 摘要 大鼠微管相关蛋白轻链3 ( m a p l l c3 ) 蛋白在体内同时以两种不同分子量的 形式存在其中18 k d a 的m a p l l c3 蛋白是微管相关蛋白1 的轻链亚基，称为l c 3 一i ； 另一种16 k d a 的m a p l l c3 蛋白则是自噬体膜的必须组分，称为l c 3 一i i 。l c3 一i 和 l c3 一i i 都是一系列翻译后修饰的产物，其中特征性的修饰是在保守g ly 12 0 后发 生的羧基端切割，此切割修饰对l c 3 一定位于自噬体膜尤为重要。然而在与大 鼠m a p l l c3 蛋白高度同源的人类l c 3 蛋白( 氨基端带m y ct a g 的l c 3 融合蛋白) 的w s t c r nb l o t 分析中，用抗m y ct a g 的单抗仅检测到一条单一的16 k d a 蛋白 条带7 。协毒确通过生物信息学方法还克隆到人l c3 的两个新的人类同源基因，分别 命名为m a p l c 3 a 和m a p i l c j c , 而最初的人l c j 基因也同时被重新命名为 m a f j l c 3 b o 三个同源基因的推导蛋白与大鼠m a p l 1c3 蛋白高度保守，尤其是对应 于大鼠m a p l lc3 蛋白的t y r g 】y 120 区域完全一致。 象同源物大鼠m a p l1c3 和酵 母a p 9 8 p 一样，带有m y ct a g 的m a p l l c3 a 和m a p l l c3 c 融合蛋白在体内皆分别以 两种大小不同的蛋白形式存在( l c 3 a - i 和l c3 a i i ；l c3 c i 和l c 3 c i i ) ，而且 较大分子量的l c3 a c i 蛋白的表达量明显多于相应小分子量的l c3 a c i i 蛋 白。一系列突变分析表明尽管在h e k 2 93 细胞内带m y ct a g 的融合蛋白m a p i l c 3 a 、b 和c 都经历过翻译后修饰，但只有m a p l l c 3 a 和c 发生了特征性的羧基端切割， 羧基端保守的甘氨酸仅对m a p i l c 3 a 和c 的翻译后修饰起作用。对于m a p i l c 3 b 独 特翻译后修饰的必需位点却是l y s l 2 2 ，而非保守的g 1 y 1 26 。j 蜥的研究结果显 示人m a p l l c 3 a ，b 和c 经过不同方式的调控，暗示它们在人体中可能存在不同生 理功能 此外，我们还分析了人m a f l c 3 家族三个成员的组织表达谱，结果显示它们 i 有着明显不同的组织表达谱。染色体定位分析表明m & p 1 l c 3 a 定位于 2o q l l 23 - 2 o q l2 ，g a p i l c 3 b 定位于16 q 2 4 1 ，m a ? l c 3 c 定位于l q 43 。基因组结 构分析显示这三个同源基因都由四个外显子和三个内含子组成。、 ， 关键词：茬垦卫生旦丝三全些! 丝缈醐! 望修赞，答基端切割，j j ! 塑迹 复旦大学博士论文人类m a p i l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 a b s t r a c t t w of o r m so fr a tm i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n1 l i g h tc h a i n3 ( m a p 11 c 3 ) e x i s ta n ds e r v ea sas u b u n i to ft h em i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n1a n da ne s s e n t i a l c o n s t i t u e n to fa u t o p h a g o s o m em e m b r a n e s ，r e s p e c t i v e l y i nv i v o ，t h et w of u n c t i o n a l f o r m so fr a tm a p i l c 3w i t ha p p a r e n tm o b i l i t i e so f1 8a n d1 6 k d a ，t e r m e dl c 3 一ia n d l c 3 一i i ，s e p a r a t e l y , w e r ep r o d u c e db ya s e r i e so fp o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s i n c l u d i n gac h a r a c t e r i s t i cc t e r m i n a lc l e a v a g ea f t e rt h ec o n s e r v e dg l y l 2 0r e s i d u ea n d t h i s c l e a v a g ei s e s s e n t i a lf o rt h em e m b r a n ea s s o c i a t i o no ft h e1 6 k d ar a t m a p l l c 3 p r o t e i n h o w e v e ri nw e s t e r nb l o t sa n a l y s i st h eo v e r e x p r e s s i o no fm y c t a g g e dh u m a n l c 3p r o t e i ns h o w e do n l ya s i n g l e 16 k d ap r o t e i nb a n dw i t h a n t i m y ce p i t o p e m o n o c l o n a la n t i b o d i e s f u r t h e r m o r e ，t w on o v e li s o f o r m so fh u m a nm a p i l c 3w e r e n a m e dm a p l l c 3 aa n d m a p l l c 3 c m e a n w h i l e ，t h ek n o w n h u m a nl c 3w a s r e n a m e dm a p l l c 3 b w ea l s of o u n dt h a tm y c t a g g e dm a p 1l c 3 aa n d m y c - t a g g e d m a p1l c 3 c p r o t e i n sp r e s e n t st h e m s e l v e sa sad o u b l e t ，w h i c hi ss i m i l a rt ot h a tf o u n d i nr a tm a p l l c 3a n dy e a s ta p 9 8 pm o r e o v e r ，t h ea m o u n t s o f l a r g e rm a p l l c 3 a a n dc p r o t e i n s w e r em o r ea b u n d a n tt h a nt h a to fs m a l l e rm a p l c 3 aa n dcp r o t e i n s ， r e s p e c t i v e l ya l t h o u 曲as e r i e so fm u t a t i o n a la n a l y s e ss u g g e s tt h a ta l lo ft h em y c t a g g e dh u m a nm a p 1l c 3 p r o t e i n su n d e r g op o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n si nv i v o ， t h ec h a r a c t e r i s t i cc t e r m i n a l c l e a v a g ef o u n di ny e a s ta p g s pa n dr a tm a p l c 3o n l y h a p p e n si nh u m a nm a p 1l c 3 aa n dcb u tn o tm a p 1l c 3 b ，a n dt h ec o n s e r v e dg t y r e s i d u ei so n l yc r u c i a lf o rt h ep o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n so fm a p l l c 3 a a n dc b yi n t r o d u c i n gs i t e - s p e c i f i cm u t a t i o n ，w e i d e n t i f i e dt h ea m i n oa c i d l y s l 2 2 d o w n s t r e a mo fg l y l 2 0a san o v e le s s e n t i a ls i t ef o rt h ep r e s e n c eo ft a g g e dw i l dt y p e m a p1l c 3 b o u rd a t ar e v e a l e dd i f f e r e n t i a lr e g u l a t i o no ft h et h r e eh u m a ni s o f o r m so f m a p l l c 3a n di m p l i c a t et h et h r e ei s o f o r m sm a y p l a yd i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lr o l ei n h u m a n i na d d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o ni n16n o r m a lh u m a na d u l tt i s s u e s ，t h ec h r o m o s o m e l o c ia n dt h eg e n es t r u c t u r e so ft h et h r e eh u m a nm a p i l c 3 g e n e sa r ea l s od e s c r i b e d k e y w o r d s ：r a tm a p l l c 3 ，h u m a n m a p i l c 3 ，p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n c t e r m i n a lc l e a v a g e ，i m m u n o b t o t 2 复旦大学博士论文 人类h p 1l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 前言 大鼠微管相关蛋白1 轻链3 ( m a p l l c3 ) 是微管相关蛋白1 ( 包括m a p l a 和 m a p l b ) 的轻链亚基1 。大鼠m a p l l c3 的抗体可在多种细胞内检测到分子量分别为 18 k d a 和16 k d a 的m a p l l c 3 蛋白。其中m a p l l c3 的18 k d a 分子是在纯化m a p l a 和 m a p l b 蛋白复合物时发现的，被称为l c 3 一i 蛋白2 ；16 k d a 的m a p l l c3 则是在哺乳 动物自噬体膜蛋白组分分析中被鉴定的，称之为l c 3 - 1 i 蛋白3 。大鼠m a p l l c3 编 码的这两种蛋白都是通过一系列的翻译后修饰而形成，其中特征性的修饰是羧端 保守g 1 y l 20 后的蛋白切割3 。与大鼠m a p l1 c3 同源的酵母a p g 8 p 和牛g a t e - 16 蛋 白中也存在类似的翻译后修饰，即它们都在翻译后切割修饰后形成两种不同大小 的蛋白34 。上述情况表明在大鼠m a p l l c 3 的同源家族中，特征性的翻译后蛋白羧 基端切割是非常普遍的，而保守的羧基端g 1y 是目前已知唯一的翻译后修饰曲需 活性位点。尽管在酵母和哺乳动物中的研究逐渐揭示了大鼠m a p ll c 3 的同源物的 特征性羧基端切割修饰情况，大鼠m a p 】c3 的人类同源物的翻译后修饰情况迄今 未见报道。y u k ik o 等3 曾描述了大鼠a t a p j c 3 在人类中的同源基因，但人z c 3 的蛋白产物是否也以不同分子量的两种形式存在仍未知晓。 在本文中，我们克隆了人l c 3 ，在h e k 2 93 细胞中瞬时表达氨基端带m y ct a g 的l c 3 融合蛋白并用抗m y ct a g 的抗体进行了w e s t e l - nb l o t 分析。尽管人l c3 与大鼠m a p l l c3 有9 4 的同源度，而且与大鼠m a p l l c3 的t y r l l3 一g 1 y 12 0 区域 完全相同，但m y ct a g 的抗体仅检测到一条单一的16 k d a 蛋白条带。因为大鼠 m a p l l c 3 不同分子量的两个蛋白各有不同生理功能，人l c3 单一的蛋白存在形式 提示我们在人体内可能还存在其他同源物。基于这个想法，我们将人l c 3 的氨基 酸顺序作为信息探针筛选n c b l 人e s t ( h u m a ng x p r gss e ds e q u e n c et a g ) 库后 得到一系列的e s t 片段，经拼接得到人的两个新同源基因，被分别命名为 a t a p i z c j a 和朋丹o c 而最初的人l c 3 基因也同时重新被命名为m a p i l c j & a t a p j l c 3 a ，曰和f 三个基因的推导蛋白和大鼠的m a p l l c 3 蛋白同源度分别为8 1 ， 94 和5 5 ，三个同源蛋白在相应大鼠m a p l l c 3 蛋白t y r l l3 - g l y l 20 区域呈高度 保守。用抗m y c 的单抗分别检测带m y ct a g 的m a p l l c3 a 和m a p l l c3 c 融合蛋白， 复旦走擘博士论文 人类m a p l l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 发现它们在h e k 2 9 3 细胞中都以两种形式存在进一步的系列突变分析结果表明 m a p i l c 3 a c 融合蛋白也同样经历了与同源物酵母a p g s p 和大鼠m a p l l c 3 蛋白类 似的翻译后切割修饰，羧基端保守的g l y 仍是翻译后修饰的必须氨基酸。有趣的 是与大鼠m a p l l c3 蛋白同源度最高的m a p i l c3 b ，虽然也经历了翻译后修饰，但 却不是特征性的羧基端切割修饰，翻译后修饰所不可或缺的氨基酸残基也不是 g l y l20 ，而是l y s 122 。这提示人m a p i l c 3 b 蛋白的翻译后修饰是一种全新的未报 道过的新修饰形式。 复旦大学博士论丈人类m a p l l c3 京族三个成员曲翻译后谬饰研究 一、材料 1 e d n a 文库 材料和方法 克隆用的人肝、肾、骨骼肌、睾丸、骨髓、胎盘、心和脑c d n a 文库均购自 c i o n t e c h 公司：文库载体为噬菌体九g t l l ，滴度为3 - 9 x l 0 9 p f u m l 。 2 质粒载体 质粒p g e m t 载体 哺乳动物表达载体i ) c m v - m y c ( 见图1 - 1 ) 3 宿主菌 大肠杆菌d h 5c 【 ( p r o m e g a 公司产品) ( c l o n t e c h 公司产品) 8 p8 p8 o8 2 08 e 她嫣嗽k i 娜瀚燧弧娥舷雠6 鲳溯c f 5 呷 瓤：g 8 8 08 妒 9 0 0 9 i o9 挚 姗瓤蜘嘲暇疆黼骶躔瓶潞i l c c 瞄艇瞄躲 洲圳驯丽驯妇| 图卜1p c m v m y c 载体限制性内切酶图谱及其多克隆位点 ( 本室保存) 4 细胞株 h e k2 93 细胞株 ( 本室保存) 5 复旦大学博士论丈人类m p 1 l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 引物 表1 实验中所用所有引物( 由上海生物工程公司合成) 一一 引历名称引物核苷酸顺序 一一 c d n a 克隆引物 乙c 3 a a ： l c 3 a b ： l c 3 一a ： l c 3 一b ： l c 3 c a ： l c 3 c b ： 基躅定位；i 物 l c 3 a r h a l c 3 a r h b l c 3 b r h a l c 3 b r h b l c 3 c r h a l c 3 c r h b 基因装表达载体引物 m y c l c 3 a a m y c - * l c 3 a - b m y c - l c 3 b a m y c - l c 3 b - b m v c l c 3 c a m v c l c 3 c b m y c t l c 3 a - h i s b m 一，c l c 3 bh ls b m y c l c 3 c h i s b 突变分析引物 m y c l c 3 a 一b m v c l c 3 b 一b m v c l c 3 c 一b m y c l c 3 a g 1 2 0 a b m y c l c 3 b g 1 2 0 a b m v c l c 3 c l x g l 2 0 a b m y c l c 3 b g 1 2 0 a - b m v c l c 3 b m 1 2 1 a b m y c l c 3 b k 1 2 2 a b m y c l c 3 b l 1 2 3 a b m y c l c 3 b s 1 2 4 a b m y c l c 3 b v 1 25 a b 测序引物 p g e m - t 载体引物r 2 p g e m t 我4 4 , i 1 j 物f 2 p c m v - m y c 载体引物c m v a p c m v - m y c 栽体引物c m v b 5 一c c c a a a c c g c a g a c a c a t c c 5 一a c g g t a g a g g c a g c t c a g t t c a g 5 一g c a c c a t g c c g t c g g a g a a g a c c 5 一c a c t c c t a g g t g g g a a c a c t a c t g 5 一g a c a c a g c t a c t g a g t g c a a t 5 - a c a c g t c t g t c a g a g c a c t c 5 一a t c c a t a c a c c a c g t g g a g a c c g 5 一a t c t a c g a g c a g g a g a a a g a c g a g 5 一a g g g g t g t t a c c a a c t g a g a t c g 5 一t c c a g a g t g a c a c t g g t a c a c t g c 5 。一a g c a g a g t g g t g g c t c t t c c t a g 5 。- c c t c c c a c a t a t a c c a c a g a a g a c 5 一t a g g a a t t c t a a t g c c c t c a g a c c g g c c t t t c 5 一t t g c t c g a g t c a g a a g c c g a a g g t t t c c t g 5 一a c g g a a t t c g c a t g c c g t c g g a g a a g 57 - g g c g g t a c c t t a c a c t g a c a a t t t c 5 一t t a g a a t t c a t a t g c c g c c t c c a c a g 57 一t t t c t c ( ；a g c t a g a g a g g a t t g c a g 5 。一a a t c t c g a g t c aa t g g t g a t g g t g a t g a t gg 童g c c g n g g t t t c 5 l a t t g g t a c c t t aa t g g t r g g t g a t g a t gc a t t g a c a a t t t c 5 _ a t a c t c g a g c t aa t g g t g a t g g t g a t g a r gg = a g g a t t g c a g 5 一g c g c t c g a g t c a g c c g a a g g t t t c c t g g g 57 一g c g g g t a c c t t a c c c g a a c g t c 5 一a g a c t c g a g c t a g c c a a a t g t c t c c 5 一g c g c t c i = a g t c a g g c g a a g g t t t c c t g g g 5 一g c g g g t a c c t t a c g c g a a c g t c 5 一a g a c t c g a g c t a g g c a a a t g t c t c c 5 一g g c g g t a c c t t a c a c t g a c a a t t t c a t g g c g a a c g 5 一a t t g g t a c c t t a c a c t g a c a a t t t g g c c c c g a a c g t c t c c 5 一t t t g g t a c c t t a c a c t g a c a a g g c c a t c c c g 5 一a t t g g t a c c t t a c a c t g a g g c t t t c a t c c c g a a c 5 一t t t g g t a c c t t a c a c g g c c a a t t t c a t c c c g 57 一g g c g g t a c c t t a g g c t g a c a a t t t c a t c t c a c a c a g g k u x c & g c t k t g a c c g c c a g g g t t t t c c c a g t c a c g a c g a a c t g c t c c t c a g t g g a t g t c a c t g c a t t c t a g t t g t g g 突变带下划线的核苷酸以编码目的突变氨基酸。黑体核苷酸表示限制性酶切位 点。h i sta g 以斜体表示缺失突变以表示某一氨基酸的点突变以该氨基酸 的缩写字母表示第一个字母表示野生型氨基酸，中间的数字代表该野生型氨基 酸的位置，最后一个字母表示该野生型氨基酸被突变成的目的氨基酸。a ：正义 引物b ：反义引物 复旦太学博士论文人类m a p l l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 6 实验材料及试剂盒 6 1 d n ah i n di i i e c o ri 双酶切d n a 标准分子量购自上海华美生物工程公 司 6 2 p e r 产物纯化试剂盒( b o e h r i n g e r 公司) 6 3 限制性内切酶( b i o l a b s 公司，b o e h r i n g e r 公司，g i b c ob r l 公司或 p r o m e g a 公司) 6 4 d n a 连接试剂盒( p r o m e g a 公司) 6 5 6 6 6 7 6 8 6 9 6 10 6 1 1 6 1 2 6 13 6 1 4 6 15 6 16 凝胶回收纯化试剂盒( b o e h r i n g e r 公司) 质粒抽提试剂盒( b o e h ri n g e r 公司) 放射性0 【一”p d a t p ：为a m e r s h a m 公司和d u p o n t 公司产品。 d n a 测序试剂盒：采用b i g d y et e r m i n a t o r c y c l es e q u e n c i n gr e a d y r e a c t i o i l ( p e 公司) 。 人体16 种组织m r n an or t h er n 印迹膜( m u l t i p l e t iss u en o r t h e r n b l o t ) ，所载的m r n a 分别来自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、 胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠粘膜和外周血白细胞 等1 6 种组织( m t nl 和m t ni i ，c l o n t e c h 公司) 。 辐射杂种板g e n e b r i d g e4 ( g b 4 ) p a n e l ( 美国r e s e ar c hg e n e t icso f f l u n ts v il1 e 公司) 蛋白标准分子量购自上海西巴斯生物技术开发公司 磷酸钙转染试剂盒为g i b c ob r l 公司产品 硝酸纤维素膜购自a h l e r s t i a m 公司 新生小牛血清和胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司 鼠抗c - g y c 的单克隆抗体购自c l o n t e c h 公司， 抗鼠免疫球蛋白g ( h + l ) h r p 结合物购自p r o m e g a 公司。 7 实验试剂 7 1 s d s - p a g e 胶配方： 12 分离胶( 20m 1 ) h 2 0 6 6i n l 5 浓缩胶( 10m 1 ) 6 8m l 7 墨兰苎兰堡主笙查 垒墨坠! ! 竖! 墨堡三全查墨羔塑堡墨兰! 竺堕 3 0 g e 【 8 0m l 1 7m l t r is h c l5 om l ( 1 5m ，p h 8 8 ) 1 25m l ( 1 0m ，p h 6 8 ) ，1o s d s 0 2m l 0 1m l 10 a p s0 2 m l 0 1m l t e m e d8ul 10 ul 7 2 5 t r is - g l y 电泳缓冲液：1 5 1 gt r is 碱，9 4gg l y ，5 0 m l 1 0 s d s ，加 水至1 l 。 7 3 2 s d s p a g e 上样缓冲液：2 0m l 0 5mt r is - h c l ，2 om l 甘油，2 0 m l 2 0 ( w v ) s d s ，0 5m l0 1 ( w v ) 溴酚蓝，1 0m l p 一巯基乙醇，2 5m l d d h 2 0 。 7 4 s d s p a g e 染色液：9 0m l 甲醇：水( 1 ：1 ，v v ) ；1 0m l 冰乙酸；0 2 5g 考 马斯亮蓝r 25 0 。 7 5 s d s p a g e 脱色液：9 0m l 甲醇：水( 1 ：1 ，v v ) ；1 0m l 冰乙酸。 7 6 丽春红染色液：0 5g 丽春红中加入1m l 冰醋酸，溶解后再加入1 00m 1 水，使用前配置。 7 7 1 x 磷酸缓冲液( 细胞用) 4 0 g n a c l i g k c l 5 75 g n 82 h p o a l g k hz p o 。 调节p h 至7 2 - 7 5 ，1 2 0 。c 高压蒸汽灭菌2 0m i n ，备用。 7 8 e d t a 试剂：0 2ge d t a 溶解于1 x 磷酸缓冲液中 7 9 5 x 胰酶： n a c l 4 g k c l 0 2 g n a 。h p o 。12 h2 0 o 0 6 g k h2po。00 3 g 葡萄糖05 g 胰酶 1 2 5 g 过滤灭菌，一2 0 。c 储存用时用e d t a 试剂稀释至1 x r 复旦大学博士论文 人类m i p ll c3 京族三个成员的翻译后修饰研究 7 10 5 x 磷酸缓冲液( p h7 4 ) n a2hpo。82 3 g n a h ：p o ； 20 4 g n a c l4 0 0 g 用0 1 nn a o h 调节p h 至7 4 。用双蒸水定容至2 升。 7 1 1 洗涤缓冲液为含0 2 吐温20 的1 x 磷酸缓冲液 7 12 封闭缓冲液为含5 的脱脂奶粉的洗涤缓冲液 7 13 裂解缓冲液( 储备) ： 10 0m l5 xp b s 5i l l lo 5 me d t a 2 5m 1t r i t o nx - 1 0 0 用双蒸水定容至5 0 0m l ，4 。c 储存。 7 1 4 裂解缓冲液( 实际用液) ；在裂解缓冲液( 储备) 中加入0 1i 【i m 的p m s f 10 洲的p e p s t a i na ，1 0 州的l e u p e p t i n 和2 5 1 t g m ia p r o t i n i n 7 15 n o r t h e r n ( 预) 杂交液：5 0 甲酰胺，5 x s s p e ，10 x d e n h ar d t s 溶液，2 s o s 小牛胸腺d n a ( 10 0 g g m 1 ) 。 7 16 l b 液体培养基： p o l y p e p t o n b a c t o y e a s te x t r a c t n a c l 1 0 0g 5 0g 1 0 0g 加d d h 2 0 定容至1 0 0 0 m l 灭菌条件为12 1 ，高压湿热灭菌20 r a i n ； 7 17 d u l b e c c o sm o d i f i e dg a g l em e d i u m 高糖培养基，抽滤除菌。 二、主要仪器设备 1 p c r 扩增4 z ：p t c 一150 ，p t c 一20 0 ( m jr es e a r c h 公司) ，p e9 60 0 型( p e 公司 产品) 。 2 s u p r a f u g e22 型高速冷冻离心机：德国h e r a e us 公司 3 t b l 一16 台式离心机：上海医用仪器厂 9 复旦大学博士论文 人美m a p i l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 4a b 【377 型全自动d n a 测序电泳仪：p e 公司 5 m o d e l 4 0 0 l 型d n a 测序电泳仪：g i b c ob r l 公司 6 m o d e ls a 型d n a 测序电泳槽：g i b c ob r l 公司 7 凝胶成像系统：u v p 上海复日公司 8 紫外检测仪：上海复生公司 9 h z c 型台式恒温振荡器：江苏太仓科教器材厂 10 电脉冲仪：b i o r a d 公司 1 1 微量加样器：10 0 0p i 2 0 0 p l 2 0p l ( g i l s o n 公司) 12 杂交反应箱：英国h y b a i d 公司 l3 微型同位素检测仪：m i n i i r o i i t o r s e t i e s9 0 0 型m i n i i n s t r u m e n t sl t o 1 4 d s 一8 0 0 型凝胶成像系统及相应配制扫- 描4 z ：美国b i o r a d 公司 15 c o 2 培养箱：h er a e u s 公司 三、计算机分析软件 1 国际n c b i ( n a ti o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n 0 1 0 9 yi n f o r m a ti o n 1 信息途径 i 1 人e s t 数据厍( ! ! ! p ；丛业：! ! ! i ：! ! ! ! i b ：g ! ! 地! ! ! ! ! ! ! ! ) 1 2 非重复数据库( n o n r e d u n d a n td a t a b as e ) b l a s t n ：! ! ! ! p ；! ! 坐：! ! ! i ：! ! ! ：! i ! ：g ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! b l a s t p ：h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l as t p n r z 2 国际s a n g e r 中心r i t 定位系统g e n b r i d g e4 分析信息途径 h t t p ：w w w s a n g e n a c u k r h s e r ，v ，e r r h s e r v 。e r s h 。t 。m 3 核酸及蛋白质序列分析软件 p r o t s c a l e ( h t t p ：w w w e x p as y , o r g c g i - b i n p r o t s c a l e , p l ) c l u s t a l w ( ! ! ! q ；! ! ! ：! ! ! ：! ! ：! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ) 复旦大学博士论文 人类m a p i l c 3 家族三个成员的翻译后修饰研究 四、实验方法 1 技术路线和实验方案 用大鼠m a p l l c3 蛋白顺序筛选国际n c b l 人类e s t 数据库 获得一系列的人类同源e s t l 拼接成一个重叠群，并向5 与3 末端延伸 获得近全长人类l c 3 基因c d n a ， j p c r 扩增含完整开放阅读框的人类l c 3 基因e d n a 片段 l 将人类口基因克隆入p c m v m y c 表达载体并研究带m y ct a g 的人l c 3 融 合蛋白在h e k 2 93 细胞中的瞬时表达 j 以人l c 3 蛋白顺序作为信息探针，采取类似方法拼接得到上口基因的两个新的 近全长的人类同源基因c d n a j p c r 扩增含完整开放阅读框的两个新的o 同源基因c d n a 片段 1 人类基因命名委员会将这两个新基因分别命名为m a p l l c 3 a 和m a p l l c j c , 最初 的c 3 重氟命名为m a p j l c j b l 将人类m a p i l c 3 a 和删刀仍f 基因克隆入p c m v m y c 表达载体，研究带m y c t a g 的m a p l l c 3 a c 融合蛋白在h e k 2 93 细胞中的瞬时表达 l 用突变的方法通过蛋白电泳迁移率分别研究m a p i l c 3 a ，b 和c 的翻译后修饰 l 同源性分析无根树分析亲水性分析 表达谱分析染色体定位 图卜2 人类m a p l l c 3 基因家族克隆及其翻译后修饰的初步研究技术路线示意图 复旦大学博士论文 人类m a p ll c3 家族三个成员的翻译后修饰研究 2 近全长人类m a p i l c 3 a ，m a p l l c 3 b 和删用口f 基因c d n as 的获得 利用n c b i 的b l a s t n 程序，以大鼠m a p l l c 3 基因( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ： u 0 578 4 ) 的氨基酸序列在n c b l 人类e s t 数据库中进行同源筛选，得到一系列的 人类同源e s t 从这些e s t 出发拼接成一个较长的重叠群。并用其5 与3 端 的序列，重复上述运作，分别得到更多的5 与3 端的序列，拼接成近全长的 人类l c 3 基因c d n a 序列。根据l c 3 基因c d n a 序列设计p c r 引物( l c3 b a ，l c3 b - b ) ， 在8 个人组织c d n a 丈库( 肝、肾、骨骼肌、睾丸、骨髓、胎盘、心和脑) 中分 别进行p c r 扩增。p c r 扩增产物与p g e m t 载体连接后测序证明与预测c d n a 序列 一致。将克隆的人类l c 3 基因的c d n a 序列和依据开放阅读框( o p e nr e a d i n g f r a m e ，o r f ) 推测的氨基酸序列，通过b l a s t ( n p ) 程序对n c b i 的基因和蛋白数 据库进行查新及同源性比较。经查新证实为全新序列后再次送往g e n b a o k 登录 ( g e n b a n ka c c ess i o nn u m b e r ：a f 0 87 8 7 1 ) 。检索的d n a 数据库包括 g e n b a n k + e m b l + d d b j + p d b 非重复数据库( n o n r e d u n d a n tg e n b a n k + e m b l + d d b j + p d b s e q u e n c es ) 和g e n b a n ke s t 非重复数据库( n o n r e d u n d a n td a t a b as eo fg e n b a n k e s td iv is i o n ) ；蛋白质数据库为g e n b a n kc d s tr a n s l a t i o n + p d b + s w iss p r o t + s p u p d a t e + f i r 。运用类似方法，将人l c 3 氨基酸序列在n c b l 人类 e s t 数据库中进行同源筛选并拼接得到6 个e s tc e n t i g s ，其中4 个c e n t i gs 为 已知基因( h u m a ng a b a r a p ( a f l 6 158 6 ) ，g a b a r a p l l ( a f 0 8 7 8 4 7 ) 删蜊删彤? ( a f 0 8 7 8 4 8 ) a n d 倒蜊删彤j ( a f l 80 5 19 ) ) ，另两个c e n t i g s 则证实为全新序列。 根据这两个序列所包含的完整开放阅读框设计引物进行p c r 扩增验证，p c r 扩增 产物与p g e m t 载体连接后测序证明分别与相应的预测c d n a 序列一致。人类基因 命名委员会将这两个全新的人l c 3 的同源基因分别命名为m a p i l c 3 a 和m a p l l c 3 c ( g e n b a n ka c c e ss i o nn u m b e r ：a f 2 7 6 65 8 和a f 2 7 6 6 5 9 ) ，同时最初的l c 3 被重 龠南姒p l l c 3 b o p c r 扩增反应体系：人组织c d n a 文库 2 5l l h i 引物i 25 u m 引物2 10 x b u f f e r 2 0m md n t p 2 5n 1 m m g c l ， t a q 酶( 5 u i 1 1 ) 1 1 1 5 1 1 0 “l “l “l l “1 “1 u 1 加d d h , o 补充至 5 0 0 1 1 2 复旦大学博士论文人类m a p ll c3 家族三个成员的翻译后修饰研究 p c r 扩增反应条件 9 4 9 4 55 7 2 7 2 2m i n 1m i n 1m i n t 一2m i l l 5m i n 1 c y c l e 3 5c y c l e s 1 c y c l e p c r 产物与p g e m t 载体标准连接体系( s t a n d a r dr e a c ti o n ) 及条件 连接体系p c r 产物( 5 0 n g ) l0u l p g e m t 载体 ( 5 0n g )1 0u l t d n a 连接酶1 0 x g u f f e r1 ou 1 t - d n a 连接酶( 1w e iss u n i t t ) 1 0u l 加d d h2