（遗传学专业论文）硝化细菌的富集培养及氨单加氧酶基因片段的pcr扩增.pdf

致谢 x4 i 0 3 i 7 本论文是在导师明镇寰副教授的g - 心抽导下完成的。在论文完成过程中，明 老师倾汪7 大量的心血和精力在此我向明老师致以最崇高的敬意在三年的即 究生学习生活中，明老师始终给予我无微不至的关怀、指导和帮助，速不仅体砚 在学习和实验中也体观在日常生活的各个方面中。他平易近人，对学生的无比 关爱，对科研的一丝不苟和孜孜不倦的求知精神，以及豁达开朗、乐观自信的人 格魅力一直感染着我，教育着我指引着我使我在做人和做学问等诸多方面受 益非浅，致用终生。 我特别要感谢师姐韩凝岳春梅，在实验过程中，她们都给予了我无私的帮 助和指导，在此向她们表示深深的敬意虽然和她们相处的时i 司短暂，但她们对 科研的专汪和求知精神是我学习的榜样。此外，赵小立老师、杜英老师、边红 武老师，金红建同学、王彦平同学陈虹同学、唐娟娟同学师姝陈岭、师弟李 明振、周增水、陈东等在实验及论文的撰写过程中都给予了莫大的支持和帮助 在此表示真挚的感谢。同时还要感谢陪我一起度过三年美好时光的施永泰、徐德 立、谢佳彦、张晓辉，褚衍亮、到震卢毅军等诸位同学他们在生活和学习午 给予j 我巨大的帮助，他们热情、友善、真诚，与他们结下的| ：笨厚友谊是我人生 中不可多得的虐贵财富。 碾后我要特别感谢我的父母及家人，正是他们的默默支持和无私奉献，才得 “l 使我顺利完成自己的学业他们所做的一切是我勇往直前的力量之源。再次向 明镇寰老师及其他所有关支持我顺辱3 完茂学业的亲人明友们致以最崇高的敬 意 张伟 溉江大学颀- ：论文 摘要 由硝化细菌催化氨氮氧化的硝化作用是氮循环的关键步骤，也是现代污水 处理厂生物处理氨氮废水的重要环节。自然状况下的化能无机自养硝化细菌具 有生长速率低、生物量小和对环境因子敏感等生理特点，为了快速获得大量硝 化细菌用于炼油化工废水中氨氮化合物的高效去除，我们在实验室里通过富集 ， 培养条件优化，直接对活性污泥中的硝化细菌进行富集培养研究。俟验结果表 明，在p l t 7 7 8 2 8 。c ，1 5 0r p m 振荡暗培养的条件下，通过不断添加富集 培养基，经过6 周的培养后，可以使硝化细菌的数量增加3 28 倍，硝化速率 一一 提高2 7 6 倍，达到了富集的目的。广1 厂一 将氨氧化为亚硝酸盐的氨氧化细菌是硝化菌群的重要组成部分，它的种类 随生境差异而有所不同。氨氧化细菌的氨单加氧酶( a m o ) 催化氨氧化生成羟 胺是硝化反应的第一步，也是最为重要的步骤。a m o a 基因是编码氨单加氧酶 活性多肽位点基因，我们通过引物筛选合成了对氨氧化细菌a m o a 基因特异结 合的引物序列，利用p c r 技术对活性污泥中的a m o a 基因片段进行特异扩增， 得到的d n a 片段大约为4 9 0 b p 。( 由于基于此引物的扩增对p r o t e o b a c t e r i a b 一 亚科氨氧化细菌具有特异性，所以a m o d 基因片段的特异扩增为我们检测和鉴 定环境样品中氨氧化细菌的种群提供了一个有效的工具。广、r 一 关键词：硝化细菌富集培养a m o a 基因p c r 扩增 溉江人学硕士论文 t h ee n r i c h m e n to f n i t r i f y i n g b a c t e r i aa n d a m p l i t i c a t i o no fa m m o n i a m ：o n o o x y g e n a s e ( a m o a ) g e n e a b s t r a c t n i t r i f i c a t i o n ，p e r f o r m e do x i d a t i o no fa m m o n i a t on i t r a t eb yn i t r i f y i n gb a c t e r i a i sak e yp r o c e s si nt h ec y c l i n go f n i t r o g e na n da ni m p o t e n tc o m p o n e n to f m o d e m w a s t e w a t e r t r e a t m e n t c h e m o l i t h o a u t o t r o p h i cn i t r i f y i n g b a c t e r i ah a v e m a n y u n f a v o r a b l ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，n a m e l y , s l o wg r o w t h ，s m a l lb i o m a s sa n d s u s c e p t i b l e t oe n v i r o n m e n t a lf a c t o r s t or e m o v e h i g ha m m o n i a n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o ni nw a s t e w a t e rf r o mr e f i n e r i e s ，w ed i r e c t l ye n r i c h e dn i t r i f y i n gb a c t e r i a o fa c t i v a t e ds l u d g ev i ao p t i m i z i n ge n r i c h m e n tc o n d f l i o n s ( t e m p e r a t u r e 、p h 、n h 4 + - n c o n c e n t r a t i o n ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h en u m b e ro fn i t r i f y i n gb a c t e r i aa f t e r6 w e e k se n r i c h m e n ti n c r e a s e d3 2 8t i m e sa n dn i t r i f i c a t i o nr a t ei m p r o v e d2 7 6t i m e s t h a nt h a tb e f o r ee n r i c h m e n t a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i aw h i c ho x i d i z ea m m o n i a t on i t r i t ei sak e yg r o u p o f n i t r i f y i n gb a c t e r i a t h ep o p u l a t i o no fa m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i ai sv a r i a b l ew i t h t h ed i f f e r e n te n v i r o n m e n t t h eg e n eo fa m o ai na m m o n i a o x i d i z i n ge n c o d e st h e a c t i v e s i t ep o l y p e p t i d eo fa m m o n i am o n o o x y g e n a s ew h i c hc a t a l y z e st h eo x i d a t i o n o fa m m o n i at oh y d r o x y l a m i n e w ed e s i g n e dap a i ro fp r i m e r ss p e c i a lf o rt h ea m o a g e n eb yc o m p a r i n gt h ek n o w n a m o ag e n es e q u e n c e sa n du s e dp c rt oa m p l i f yt h e a r n o a g e n ef r a g m e n t s t h e r e s u l t ss h o w e da b o u t 4 9 0 b pd n af r a g m e n t sw e r e a m p l i f i e d b e c a u s et h ea m p l i f i e dp r o d u c t s i s s p e c i f i c t ot h eb s u b c l a s so ft h e y r o t e o b a c t e r i a ，t h ea m p l i f i c a t i o no ft h ea m o a g e n em a y b ea p o w e r f u lm o l e c u l a r t o o l sf o rd e t e c t i n ga n da n a l y z i n ga m m o n i a o x i d i z i n gc o m m u n i t i e si ne n v i r o n m e n t k e yw o r d s ：n i t r i f y i n gb a c t e r i a e n r i c h m e n ta m o a g e n e p c r a m p l i f i c a t i o n 2 , 妨m a 。学硕_ _ = 论文 前言 随着全球经济的发展，环境问题逐渐成为人们关注的焦点，保护生态环境、 提高人们的生活质量已成为许多国家及国际组织的共识。在环境治理问题上，工 业污水处理足重要组成部分。氨氮是污水中的重要污染物，氨氮含量也是衡量污 水排放的重要指标，许多氨氮复合物对鱼类和某些水生生物具有毒害作用，未经 处理的工业和生活污水中的氨氮可以使水体富营养化，影响甚至破坏生态平衡， 从而引发一系列的环境和医学问题( h o v a n e c 等1 9 9 6 ；b u r r e l l 等1 9 9 8 ) 。 目前工业污水处理的一个重要方法是生物脱氮法。在生物脱氮法中由硝化细 菌完成的硝化反应是将氨氮从污水中去除的第一步，也是最为关键的步骤。硝化 反应实际上足一个主要由硝化细菌参与的连续的生物氧化反应过程，氨通过硝化 反应被氧化成为亚硝酸盐，随后亚硝酸盐又被氧化成硝酸盐。参与硝化反应的硝 化细菌是由两类在系统发生上无紧密关系的化能无机自养菌组成一参与氨氧化 的氨氧化细菌和参与亚硝酸赫氧化的亚硝酸盐氧化菌。1 9 3 0 年w t t h r m a n n 最先 提出以微生物细胞内物质作为脱氮还原硝酸盐供氢体的微生物生物脱氮法。随后 微生物脱氮研究进展很快，各种处理氨氮的设备和工艺不断出现，1 9 6 0 年前后， b r i n g m a n n 提出利用城市污水中的有机物作为反硝化细菌代谢反应所需碳源； 1 9 7 0 年后又相继出现了三、二和一级生物脱氮系统，这三种脱氮系统都需要在 硝化阶段投加碱，在反硝化阶段投机有机物，这使得生物脱氮系统的运行费用较 高；2 0 世纪8 0 年代，又产生了将反硝化设备放置在处理系统最前面的前置硝化 微生物脱氮法，又称为缺氧好氧生物脱氮法。以上这些生物脱氮过程都是使氨氮 经过典型的硝化和反硝化两个步骤才被安全地除去，所以这条途径也被称之为全 程( 或完全) 硝化一反硝化生物脱氮。但实际上氨被氧化成硝酸盐是由两类独立 的细菌完成的两个不同反应，应该可以分开，对于反硝化细菌，无论n 0 2 还是 n 0 3 - 均可以作为最终受氢体，因此整个生物脱氮过程也可以经n h 4 + 到h n 0 2 然 后到n ，这样的途径完成，1 9 7 5 年v o e t 首次提出短程硝化一反硝化生物脱氮 ( s h o r t c u tn i t r i f i c a t i o n d e n i t r i f i c a t i o n ) ，短程生物脱氮具有节省氧供应量、减少 投碱量、缩短反应时间、降低能耗和减少污泥生成量等优点( 袁林江等2 0 0 0 ) 。 虽然生物脱氮法有多种，但它们所具有的一个共同特点就是都要通过硝化 细菌( n i t r i f y l a gb a c t e r i a ) 将氨氮转化为亚硝酸盐或硝酸盐，这是生物处理氨氮 滤江大学硕- 论文 的最关键步骤。w a r i n g t o n 首先证实了硝化作用分两个步骤，并且证明整个反应 过程是【b 两种不同类型的细菌完成，随后w i n o g r a d s k y 等相继分离并命名了一些 硝化细菌种属。但由于硝化细菌为化能无机白养菌，它生长缓慢，分离、培养和 纯化十分困难，而且对环境因予的变化又极为敏感，所以尽管人们认识硝化细菌 已经有一百年多年了，但对它的研究进展却相对缓慢。 在微生物脱氮过程中，直接面临的一个重要问题就是硝化细菌的数量即硝化 菌的生长速率问题。由于硝化细菌数与硝化作用之间有直接对应关系，因此如何 提高硝化细菌的生长速率，短时间内获取大量高效的硝化细菌，是目前较为重要 的研究内容。我们通过探讨氨氮浓度、p h 、温度以及有机小分子对硝化细菌的 影响来优化富集培养条件，并在实验室中对生物硝化池活性污泥中的硝化细菌进 行富集培养，由于实验的最终目的是将硝化细菌应用于污水中氨氮的处理，所以 在实验过程中，尽可能地维持污水环境条件，即通过不断添加底物基质直接对活 性污泥样品进行富集培养，对富集效果利用m p n g r i e s s 法和m p n p c r 法以及 列硝化速率的测定等方法进行评价，同时我们还探讨了有机小分子物质对硝化细 菌生长的作用。 由于硝化细菌具有代谢效率低、产能少、生长速率慢、生物量小等生理特点， 传统的计数研究方法如选择平板计数法和m p n ( m o s t p r o b a b l e - n u m b e r ) 法( 许光 辉等1 9 8 6 ) 效率低、误差大；从形态结构、内膜排列等方面对硝化细菌菌群结 构、系统发育的研究需要对硝化细菌进行长时间的培养，而且分离困难；虽然免 疫检测法对研究硝化菌有较高的特异性，但首先需要获得抗体血清，所以工作量 巨大。近2 0 年来，随着分子生物学的飞速发展，特别是p c r 技术、分子杂交技 术和d n a 测序技术的广泛应用，使人们从分子水平研究硝化细菌成为可能，近 年来的研究表明，分子生物学技术的确是定性和定量研究硝化菌的一种快速高 效、准确简便的工具，同时它对于硝化细菌的种群组成，系统发育发生等方面的 研究也具有十分重要的价值。将氨氧化为亚硝酸盐的氨氧化细菌是硝化菌群的重 要组成部分，它的种类随生境不同而有所差异，氨氧化细菌的氨单加氧酶( a m o ) 催化氨氧化生成羟胺是硝化反应的第一步，a m o a 基因是编码氨单加氧酶活性多 肽位点基因，我们通过对已知的氨氧化细菌a m o a 基因进行序列比较分析，筛选 到了对p r o t e o b a c t e r i af 3 一亚纲的氨氧化细菌特异的引物，对氨氧化细菌的氨单加 渐江5 ( - 学硕士论文 ( a m o a ) 片段进行特异扩增，利用此引物对环境样品中的氨氧化细菌片段进行特 异扩增，山于a m o a 基因对于不同属的氨氧化细菌是不同的，即使对于相同属的 不同种出存在d n a 水平上的差异，所以可以将a m o a 基因作为有效的分子标记对 环境样品小的氨氧化细菌种群进行鉴定以及对系统发育进化关系进行研究，我们 所扩增的a m o a 基因片段为氨氧化细菌种群鉴定提供了种工具。 酒江夫学硕士论文 材料和方法 一、实验材料 ( ) 硝化细菌的富集培养 1 实验水样取自镇海炼化公司生物硝化池曝气塘 2 培养基 2 1 硝化细菌计数培养基 0 4 h 4 ) 2 s 0 42 9 ，k 2 h p 0 4 1 0 9 ，m g s 0 4 0 5 9 ，c a c 0 35 克，f e s 0 4 0 2g ， n a c l 1 2 9 ，用双蒸水溶解，调节p h 到7 2 ，定容至i l 高压蒸汽灭菌 2 0 分钟。 2 2 硝化细菌富集培养基 1 ) ( n 1 t 4 ) 2 s 0 45 9 ，c a c 0 35 9 ，n a c i2 9 ，m g s 0 4o 5 9 ，k 2 h p 0 4l g ，m n s 0 4 o o 】g ，f e s 0 40 0 4 9 ，用双蒸水溶解，调节p h 到8 0 ，定容至】l ，高 压蒸汽灭菌2 0 分钟。 2 ) 亚硝酸盐氧化细菌富集培养基： n a n 0 2l g ，n a c 0 3l g ，n a c l0 5 9 ，k 2 h p 0 4 o 5 9 ，m g s 0 40 5 9 ，f e s 0 4 0 4 9 ，用双蒸水溶解，调节p h 到7 7 左右，定容至1 l ，高压蒸汽灭菌 2 0 分钟。 3 试剂 3 1 硝化细菌m p n g r i e s s 计数试剂 1 ) g r i e s s 试剂：( a 液) 称对氨基苯磺酸0 5 9 溶于1 5 0 m 1 1 0 的稀醋酸 中； ( b 液) 称取0 1 9o 一萘胺于1 5 0 m 1 1 0 的稀醋酸中，倒入 2 0 m l h 2 0 中。 2 ) 二苯胺试剂：称o5 9 二苯胺溶于1 0 0 m l 浓硫酸中，倒入2 0 m lh 2 0 中。 32 硝化速率测定试剂( 刘成勤1 9 9 8 ；王广键1 9 9 8 ；王其宝1 9 9 4 ) 1 ) 氨氮测定：0 4 次氯酸钠溶液、1 亚硝基铁氰化钠溶液、5 水杨 浙江火学碗士论文 酸溶液：o 2 m o l ln a o h 溶液； 2 1 亚硝态氮测定：0 5 m m o l l 减红t 溶液、1 m o l l 盐酸； 3 ) 硝态氮测定：0 0 7 1 5 m l 硫酸肼溶液、l o g l 对氨基苯磺酰胺溶液、0l 乙二胺盐酸盐( n e d d ) 溶液、铜锌催化溶液； 33 m p n p c r 计数试剂 1 ) 酶及缓冲体系 5 u u lt a q d n a 聚合酶；2 5m m o l lm g c l 2 ，加拿大s a n g o n 公司产品，购 于上海生工生物工程公司； 2 1d n t p s ：1 0 m m o l ld a t p 、d g t p 、d c t p 和d t t p 的混合物； 3 ) 1 0 0 b pd n al a d d e r ：为m b if e r m e n t a s 产品，购白上海生工生物工程公 司，片段大小依次为1 0 3 l 、9 0 0 、8 0 0 、7 0 0 、6 0 0 、5 0 0 、4 0 0 、3 0 0 、2 0 0 、 1 0 0 、8 0 ( b p ) ： 4 )亚硝酸盐氧化细菌1 6 sr d n a 基因片段p c r 扩增引物： 57 一t t tt t tg a g a t tt g ct a g 一3 7 5 一c t aa a ac t c a a ag g aa t tg a 一3 此引物由美国赛百盛( s y b e r s y n ) 生物公司合成 ( 二) 氨氧化细菌a m o a 基因片段p c r 扩增 1 氨氧化细菌d n a自镇海炼化公司生物硝化池曝气塘活性污泥中抽提 2 所需酶及试剂 2 1 硝化细菌d n a 抽提所需要试剂 磷酸缓冲液：1 2 0 m m o l l ，p h 8 0 裂解液i ：0 1 5 m o l ln a c l ，01 m o l l n a 2 e d t a ( p h 8 0 ) ，使用时a n x , 溶 菌酶使其浓度为1 5 u g m l 。 裂解液i i ：0 1 m o l l n a c l ，0 5 m o l l t r i s h c i h 8 0 ) 和1 0 s d s 饱和酚：酚：氯仿：异戊醇：2 5 ：2 4 ：1 ；氯仿：异戊醇：2 4 ：l ( v v ) t e 缓冲液：2 0 m m o l l t r i s h c l ，1 m m o l l ( p h 8 0 ) 2 2a m o a 基因片段p c r 扩增所需试剂 t a qd n a 聚合酶5 u u l ，2 5 m m o l l m g c l2 ，加拿大s a n g o n 公司产品； 7 浙江大学硕七论文 d n t p s ：1 0 m m o l ld a t p 、d g t p 、d c t p 和d t t p 的混合物； 1 0 0 b dd n al a d d e r ：为m b lf e r m e n t a s 产品，购自上海生工生物工程公 司，片段大小依次为1 0 3 1 、9 0 0 、8 0 0 、7 0 0 、6 0 0 、5 0 0 、4 0 0 、3 0 0 、2 0 0 、 1 0 0 、8 0 ( b p ) ； a m o a 基因片段p c r 扩增引物： a m o a 一1 f ：5 7 g g gg 1 、tt c ta c tg g tg g t3 7 a m o a 一2 r ：5 7 c c cc t c ( g t ) g ( g c ) a a ag c ct t ct t c3 由上海生工生物工程公司合成。 二、实验仪器 d i i zd 冷冻恒温振荡器( 江苏太仓实验设备厂) 7 2 2 光栅分光光度计( 上海第三分析仪器厂) p i f 汁( m e t t l e rt o l e d o3 2 0p hm e t e r ) 3 0 3 a s 一2 型数显隔水式培养箱( 上海锦屏仪器仪表有限公司) i i 一9 2 微型混合器( 上海康达电子仪器厂) s c r 2 0 h a 超速冷冻离心机( h i t a c h i 产) g l 一1 6 1 3 高速台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) 电热恒温水浴锅( 上海医疗器材三厂) p c r 仪( p e r k i ne l m e rg e n e a m pp c r s y s t e m2 4 0 0 ) 冷冻循环水浴( p o l y s t a tc c l ，i t u h c r ) e p s o n 3 0 凝胶成相系统制冰机( h o s h i z a k i 产) d y c 型电泳转移仪( 江苏兴化产) h 6 微型电泳槽 m a 2 0 0 电子分析天平( 上海第二天平仪器厂) 超净工作台( 苏州净化设备厂) 电热手提高压蒸汽消毒器( 上海医用核子仪器厂) 三、实验方法 ( 一) 硝化细菌的富集培养 1 硝化细菌的富集培养条件的优化 虢江夫学硕士论文 1l氨氮浓度对硝化作用的影响 ( 1 ) 取曝气活化的活性污泥水样8 份，每份1 0 0 m l ，6 0 0 0r p m 离心1 0 分钟， 小心去i 二清； f 2 1 将8 份泥样分别转移到8 只2 5 0 m l 的锥形瓶中，加入等体积氨氧化细菌 培养基( 不含氨氮) ，加入经烘干处理的硫酸胺，使锥形瓶中的氨氮浓 度分别为5 0 、1 0 0 、15 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 r a g l ； ( 3 ) 将各瓶p h 调至8 0 左右后，放置到摇床上，1 5 0 r p m 、2 8 振荡培养， 每隔1 h 调节p h 值，4 小时后取样，测定其中的氨氮含量变化。 12p h 对硝化作用的影响 ( 1 ) 取曝气活化的活性污泥水样8 份，每份1 0 0 m l ，6 0 0 0r p m 离心1 0 分钟， 小心去上清； f 2 ) 将8 份泥样转移到8 只2 5 0 m l 锥形瓶中，用培养基( 含2 9 m 硫酸胺) 定容至1 0 0 m l ，用p h 计将p h 分别调至5 0 、6 0 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 、 90 、1 0 0 ： ( 3 ) 将锥形瓶放置到冷冻恒温振荡器上，1 5 0r p m ，2 8 。c 振荡培养，每隔半 小时调节p h 值，1 2 h 后取样l m l 6 0 0 0r p m 离一1 1 , 2 分钟，取上清测定氨 氮含量，计算氨氮含量变化情况。 1 3 温度对硝化作用的影响 ( 1 ) 取曝气活化的活性污泥水样5 份，每份1 0 0 m l ，6 0 0 0r p m 离心1 0 分钟， 小心去上清； ( 2 ) 将离心泥样转移到1 0 只2 5 0 m l 锥形瓶中，加入培养基( 2 9 i n 硫酸胺) 定容到1 0 0 m l ，调节p h 值到8 o ，分别将瓶置于1 0 。c 、2 0 。c 、3 0 。c 、 4 0 。0 、5 0 = 0 ，1 5 0r p m 振荡培养1 2 小时，中间每两小时调节一次p h 值； ( 3 ) 从每只三角瓶中取样l m l6 0 0 0r p m 离一1 1 , 2 分钟，取上清测定其中的氨 氮含量变化。 2 硝化细菌的富集培养及其效果评价 ( - 9 硝化细菌的富集培养 1 氨氧化细菌的富集培养 浙江大学硕- r 论文 ( 1 ) 耿2 份4 0 0 m l 活性污泥水样6 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，小心倾去上清， 用富集培养基把沉淀从离心管洗入1 0 0 0 m l 三角瓶，定容至4 0 0 m l ，其 一f 一瓶加葡萄糖2 0 r a g ，酵母膏2 r a g ；另外再取水样4 0 0 m l ，直接加2 克硫酸铵作为对照； ( 2 ) 放入恒温振荡摇床，1 5 0 r p m 、2 8 。c 富集培养，及时检测p h 值变化情况 并及时调节p h 到8 0 - 8 5 ； ( 3 ) 定期测定( 一般为两天一次) 其中的氨氮、亚硝酸态氮和硝态氮的变化 情况，并及时补充氨氮底物并更换富集培养基： ( 4 ) 富集6 周后取富集水样对富集效果进行评价。 2 亚硝酸盐氧化菌的富集培养 ( 1 ) 取2 份4 0 0 m l 水样6 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，小心倾去上清，用富集培养 基把沉淀从离心管洗入1 0 0 0 m l 三角瓶定，容至4 0 0 m l ，其中一瓶加有 机因子酵母膏2 m g ；另外再取水样4 0 0 m ! ，直接加0 4 克亚硝酸钠作为 对照； ( 2 ) 放入恒温振荡摇床1 5 0 r p m 、2 8 。c 富集培养，定期检测p h 值变化情况 并及时调节p h 至7 7 8 o ； ( 3 ) 定期测定( 一般为两天一次) 其中的亚硝态氮和硝态氮的变化情况， 及时补充添底物基质和更换富集培养基； ( 4 ) 富集6 周后取富集水样对富集效果进行评价。 ( 二) 富集培养的效果评价 1 m p n g r i e s s 法和m p n p c r 法 ( 1 ) 利用m p n g r i e s s 法对硝化细菌计数 用灭菌生理盐水对l m l 污泥水样进行l o 倍梯度稀释，依次得到l o 、 1 0 、1 0 31 0 、1 0 、1 0 、1 0 一、1 0 一、1 0 9 连续稀释度样品； 采用四次重复法，将上面各稀释度样品分别取l m l 接种到含9 m l 计数培 养基的试管中，2 8 暗培养1 4 天； 从每一稀释培养管中取出培养液2 3 滴滴加到白色比色板的凹槽中， 向每个凹槽中的培养液中滴加g r i e s s 试剂a 液和b 液各两滴，若变红 色，则说明有亚硝酸盐生成，若不变色，可另取培养液少许向里面滴加 浙江大学硕士论文 二苯胺试剂2 滴和浓硫酸2 滴，若有蓝色生成，则说明有硝酸盐生成， 无论变红还足变蓝均视为为阳性，如果红色和蓝色均不出现，则为阴性； 根据出现的阳性管数，得到m p n 数量指标，再根据这个数量指标查对 m p n 表，计数出每克污泥水样中硝化菌的数量。 ( 2 ) 利用m p n p c r 法对亚硝酸盐氧化细菌计数 对活性污泥水样中的总d n a 进行抽提，利用对亚硝酸盐氧化细菌1 6 s r d n a 特异结合引物进行p c r 扩增，结合m p n 法对污泥水样中的硝酸 细菌进行计数。 2 硝化速率的测定方法( 陈金声等1 9 9 6 ) ( 1 ) 氨氧化细菌硝化速率测定 耿6 0 0 m l 污泥水样，室温曝气2 0 分钟后，向其中添加固体硫酸胺0 3 克，搅拌混匀，调节p h 到8 0 ，立刻取水样过滤，记为0 时刻，将过 滤水样放于4 c 冰箱保存，然后对水样磁力搅拌和曝气处理，分别在 0 5 h 、1 5 h 、2 5 h 、3 5 h 分别取水样过滤，测定各时刻水样中氨氮含量 的变化，求出硝化速率。 ( 二) 、氨单加氧酶基因( a m o a ) 片段的p c r 扩增 1 活性污泥中总d n a 的提取 1 ) 耿活性污泥l m l 于微量离心管中，8 0 0 0r p m 离心收集菌体沉淀； 2 ) 小心去上清，向离心管中加入l m l 磷酸缓冲液，充分涡旋重悬沉淀， 8 0 0 0 r p m 离心5 分钟收集沉淀； 3 ) 去上清，向离心管中加人裂解液i2 5 0 u l ，充分涡旋后将离心管放置在 3 7 水浴中保温3 0 分钟； 4 ) 取出微量离心管，加入裂解液i i2 5 0 u l ，涡旋l o 秒钟，将其放入液氮中 5 秒钟后立即取出置于7 0 c 水浴1 分钟，重复冻融循环3 次； 5 ) 向离心管中加入饱和酚液5 0 0 u l ，充分涡旋，1 0 0 0 0r p m 离心1 0 分钟， 用移液器将上清小心完全地转移到另一干净的微量离心管中； 6 ) 向盛有上清的新管中加入酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 5 0 0 u l ，充 分涡旋，1 0 0 0 0r p m 离心5 分钟，将上清小心完全转移到另一干净的微 量离心管中； 浙江大学颧七论文 7 、i 向上清液中加入氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 5 0 0 u l ，振荡混匀，1 0 0 0 0r p m 离，1 1 , 5 分钟，取上清于新离一1 1 , 管中： 8 1 向盛上清液的离，1 1 , 管中加入4 0 0 u l 异丙醇，振荡混匀，2 0 。c 过夜沉降。 1 2 0 0 0r p m 离心1 0 分钟收集d n a 沉淀，小心弃上清，用2 0 0 u 1 7 0 乙 醇洗涤沉淀物，1 2 0 0 0r p m 离，i i , 5 分钟收集沉淀，尽可能地去除乙醇， 放于超净工作台自然风干； 9 ) 用1 0 0 u l t e 缓冲液溶解沉淀d n a ，放于4 。c 冰箱中备用。 2 a m o a 基因片段的p c r 扩增条件优化 1 )从镇海炼化硝化池曝气塘活性污泥中提取的d n a 作为模板，从 d n t p s 、引物、m 9 2 + 等方面对p c r 扩增体系进行优化，最后确定扩增 反应按照下面的反应体系进行 1 0 x p c r 反应缓冲液 3 0 u l 2 5m m o t l m g c 2 1 8 u l 10 m m o l ld n t p s0 6 u l 3 0 u m o l l 引物 0 3 u l 5 u u lt a q 聚合酶0 2 5 u l d n a 模板 2 u l 无菌去离子水 2 1 9 u l 反应总体积 3 0 u l 向p c r 反应管中加入3 0 u l 石蜡油后，在p c r 扩增仪上进行扩增反 应，热循环参数为：9 4 3 分钟；9 4 。c 变性1 分钟，6 0 。c 复姓1 5 分钟， 7 2 。c 延伸1 5 分钟；最后7 2 c 延伸1 0 分钟。共进行3 5 个反应循环。 2 1p c r 产物的电泳检测 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为1 ，含有 o 5 u g m l 溴化乙锭。凝胶加样缓冲液为0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖( w v ) 水溶液。电泳缓冲液为t b e 。1 0 v c m 电压下电泳4 0 分钟，在紫外灯下 观察p c r 扩增产物，在凝胶电泳图像处理系统拍摄并处理。 浙江- a 学硕士论文 、硝化细菌富集条件的优化 1 氨氮浓度对硝化作用的影响 结果 10 02 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 氨氮浓度( u g m i ) 图1氨氮浓度对硝化作用的影响 f i gi e f f e c to f n h 4 + no i ln i t r i f i c a t i o n 硝化作用的底物氨氮浓度的高低影响硝化反应速度，所以在对富集进 行条件优化时，我们探讨了氨氮浓度对硝化作用的影响，实验选择5 0 、1 0 0 、 1 5 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 m g l 氨氮浓度梯度，结果表明在5 0 0u g m l 左右， 氨氮硝化降解的速度最快。 2 p h 值对硝化作用的影响 = _ 3 删 堪 鞋 城 膈 456 7891 01 11 2 p h 图2p h 对硝化作用的影响 f i g 2e f f e c to f p ho nn i t r i f i c a t i o n 渤 姗 。 一【警一喇堪数酥城 浙江大学硕士论文 为了获得富集培养的最佳p h 条件，我们在实验室中测定了5 0 、6 0 、7 0 、 75 、8 0 、8 5 、9 0 、l o o 等8 个不同p h 值条件下( 其它条件相同，即氨氮浓 度为5 0 0 u g m l 、温度为2 8 v 年n1 5 0 r p m 振荡培养) 硝化作用情况。结果如图2 所示，在p h 50 1 0 0 范围内，氨氮降解变化呈现抛物线状：在p h 低于7 和高 于9 时，单位h ? f 日j ( 1 2 小时) 内氨氮降解变化较小，而在7 0 9 0 范围内，氨 氮降解量较大，其中在p i t 8 5 左右最大，所以我们在富集实验中选择的p h 值 为8 0 85 。 3 温度剥硝化作用的影响 3 0 。 ，、2 5 0 鼍2 。0 0 蚓1 5 0 琏 豢1 0 0 晡, 5 0 0 01 0 2 03 04 05 0 温度 图3 温度对硝化作用的影响 f i 9 3 e f f e c to f t e m p e r a t u r eo nn i t r i f i c a t i o n 图3 为温度对硝化作用的影响图，从影响曲线可以看出，在3 0 * ( 2 时，氨 氮降解最快，硝化作用最强，所以在实验过程中我们选择的温度条件是2 8 3 0 。 通过以上富集条件的优化并结合参考文献我们选择的富集培养条件为： 2 8 ( 2 3 0 o 、p h8 0 85 、不断补充富集培养基以提高底物浓度、1 5 0 r p m 振 荡暗培养。 二、硝化细菌富集培养效果评价 ( 一) 硝化细菌的富集培养 1 g r i e s s 法测定富集培养前后硝化细菌数量的变化 利用四次重复法对未富集水样和富集6 周后污水水样中的硝化细菌( 包括氨 氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌) 进行m p n 计数。结果如表1 所示，未富集 浙江大学硕士论文 和富集6 周后( 不添加和添加刺激因子) 的数量指标分别为4 2 2 、4 3 3 和 4 4 3 ，查m p n 指数表，得出每毫升未富集和富集水样中的硝化细菌的数量 分别为13 1 07 个、3 0 1 08 个、1 4 1 09 个。富集6 周后不添加刺激因 子和添加刺激因子的富集水样中( 每克湿泥) 硝化细菌的数量分别为未富 集水样的2 4 9 5 倍和1 1 2 5 陪，硝化细菌的数量显著提高。 表1硝化细菌m p n g r i e s s 法计数 t a b l e1 n i t r i f y i n gb a c t e r i ac o u n t i n gb ym p nm e t h o d s 术富集水样1 4 4 44444220 富集6 州水样1 444444444 3 l 入刺激幽了1 富集6 周水样1 4 4 444444 3 3 ( d ；d t l l u 激迭l 了) 卒自对照 1 4 0 2 富集培养前后硝化速率的变化 硝化速率测定 表2 富集前后样品硝化速率测定时n h 4 + - n 浓度( u 幽n 1 ) 变化 t a b l e2c h a n g e so f n h 4 + - nc o n c e n t r m i o nd u r i n gc a l c u l a t i n g n i t r a f i c a t i o nr a t e sb e f o r ea n da f t e re n r i c h m e n t l i i j | j 公式 n h 4 + - - n = n h 4 + - - n i ( o ) 一n f 0 1 为0 时刻氨氮浓度：k 为硝化强度 表3 1 k x x , ( n h 4 + 一nh 为t 时刻氨氮浓度；【n h 4 + 为时间) 处理数据，求出富集前后硝化速率( 见 丝丛堂丝兰丝 一 表3富集培养前后活性污泥硝化速率 t a b l e 3n i t r a f i c a t i nr a t e sb e f o r ea n da f t e re n r i c h m e n t 一一丽孺面_ 1 丽丽诹丽丽 u g ( n h 3 - n + ) m l h - i g m l l u g ( n h 3 - n ) g h - i ( 富集前) 污水原水样 3 4 2 00 9 0 8 3 7 6 9 ( 富集后) 没加有机物水样87 5 ( 富集后) 加有机物水样 4 7 8 2 0 0 8 4 0 0 8 7 1 0 4 1 7 5 4 9 6 6 从表2 和表3 可以看出。经过6 周的富集培养后，不加刺激因子和添加富集 刺激因子的富集水样的硝化速率分别为1 0 4 1 7 、5 4 9 6 6 u g ( n h 3 一n ) 。 g h 】1 ， 分别为未富集前培养的2 7 6 倍和1 4 5 8 倍，添加刺激因子的为不加刺激因子的 5 2 8 倍。 富集培养过程中氨氮含量的变化图 表4 富集过程三次更换培养基后n h 4 + - n ( u g m 1 ) 变化 t a b l e 4 c h a n g e so f n h 4 + - nc o n c e n t r a t i o na f t e r3t i m e sr e n e w i n g e n r i c h m e n tc u l t u r e 壁曼! ! 堕塑塑堕! ! ! 垒兰垒i l 曼型l l 对麒 小加刺激w 予第次换培养基 9 6 77 3 8 5 99 97 5 52 7 0 34 8 小刺激川了第：次换培养址9 4 82 3 6 8 754 7 73 92 9 l8 7 1 5 19 5 0 4 ：加刺激幽7 = 第三次换培养址8 5 23 1 5 8 05 i1 7 38 0 肌刺激凼子第一改换培葬基 9 2 69 2 8 4 32 97 5 646 8 3 5 5 46 2 4 9 45 43 8 63 8 52 4 31 4 血喇激吲于第二次换培养基 9 9 696 8 26 9 4 6 73 42 5 46 2 0 地捌燮幽王笙三丛壁塑菱婪 墼! ：i ! ! ! ! ：! ! 堕卫l 旦一 1 6 丝丛堂堕塑苎 一一 1 。o 器0 薯慧 盲6 0 0 囊裟 器i 。0 ： 1 0 0 o 幽4 三次更换富集培养基( 不添加刺激因子) 氨氮浓度变化 f i g4c h a n g e so f n h 4 + 一nc o n c e n t r a t i o nd u r i n gr e n e w i n gt h ee n r i c h m e n tc u l t u r e ( e m 、i c h m e n tc u l t u r ec o n t a i n i n gr i os t i m u l a t o r ) 0 0246 81 01 21 4 时间间隔( d ) 图5 三次更换富集培养( 加添加刺激因子) 氨氮浓度变化 f i g5 c h a n g e so f n h + - nc o n c e n t r a i i o nd u r i n gr e n e w i n ge n r i c h m e n tc u l t u r e ( e n r i c h m e n tc u l t u r ec o n t a j n i n gs t i m u l a t o r ) 7 啪 栅 咖 名3j一删鞋世腻酶 浙江夫学硕士论文 硝化作用的终产物为n 0 3 。，为了减少产物积累对硝化反应的抑制 作用，我们在富集实验过程中，选择更换培养基的方法来降低因产物积 累造成的抑制效应。图4 和5 分别为富集过程中3 次更换培养基后氨氮 降解效果图。从变化曲线可以看出，随着富集培养的不断进行，硝化作 用越来越快。以图5 为例，第一次更换富集培养基培养1 3 天时氨氮从 9 2 6 8 u g m l 降到2 4 3 1 3 u g m l ，第二次更换培养基后7 天从9 9 6 9 u g m l 降为0 ，第三次更换