（遗传学专业论文）叶绿体发育的细胞学观察以及相关基因的定位.pdf

上海师范大学硕士学位论文 中文摘要 绿色植物的光合作用是地球上一切有机体生存和发展的能量来源。叶绿体的正常发 育是植物进行光合作用的前提条件，这一过程需要核基因组和叶绿体基因组编码的蛋白 共同参与。目前光合作用以及叶绿体的发育己成为植物基因功能基因研究的一个重要方 向。 水稻是研究高等植物的模式植物，也是研究叶绿体发育的好材料。本文通过对正常 水稻叶绿体进行电镜观察，把叶绿体发育过程大体分为三个阶段：前质体时期、类囊体 单片层形成期和基粒形成期。然后以1 3 个射线诱导获得的水稻白化突变体为材料，根 据正常叶绿体的发育过程，对这些突变体的叶绿体进行观察，大体分为4 类。并对其中 一个水稻白化突变体o s a l b 2 3 进行了深入分析。 电镜观察发现水稻白化突变体o s a l b 2 3 叶绿体发育缺陷，内部缺少正常类囊体的片 层结构。遗传学分析表明该突变体属于单位点隐性突变。利用图位克隆的方法，我们将 基因定位于水稻第二条染色体上分子标记r 2 m 5 0 1 和r 2 m 5 0 2 之间约2 8 0k b 范围内。 通过生物信息学软件预测，这段区间包括6 个叶绿体蛋白基因。 另外我们还以拟南芥的一个子叶黄化突变体e c l - 2 6 3 为材料，以图位克隆的方法进 行基因定位。遗传学分析表明该基因属于单位点隐性突变。最终将e c l - 2 6 3 定位于第一 条染色体上f 4 h 5 和a f l 2 间约1 0 1k b 范围内，目前这项工作还在进行之中a 关键词：叶绿体；图位克隆：分子标记；水稻：拟南芥；白化 上海师范大学硕士学位论文 _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ - _ - - - _ _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ h _ _ _ _ _ _ _ _ h _ 一 a b s t r a c t p h o t o s y n t h e s i so fg r e e np l a n ti st h em a j o rs o u r c eo fe n e r g yw h i c ho r g a n i s m s0 ne a r t hr e l yo n t h eb i o g e n e s i so fc h l o r o p l a s tf r o mp r o p l a s t i di st h ep r e r e q u i s i t eo fp h o t o s y n t h e s i s t h e c l d o m p l a s td e v e l o p m e n tr e q u i r e sc o o r d i n a t e de x p r e s s i o no ft h en u c l e a ra n dt h ep l a s t i d g e n o m e t h ei n v e s t i g a t i o no fp h o t o s y n t h e s i sa n db i o g e n e s i so fc h l o r o p l a s th a sb e e nf i n i m p o r t a n ta s p e c to ff u n c t i o n a lg e n o m i c s r i c ei st h em o d e lc r o pf o rg o n ef u n c t i o nr e s e a r c h ，a n di ti sag o o dm a t e r i a lt oi n v e s t i g a t et h e b i o g e n e s i so fc h l o r o p l a s t u s i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，w eh a v eo b s e r v e dt h ed e v e l o p m e n t p r o c e s so fr i c ec h l o r o p l a s t s b a s e do no l l rr e s u l t ，t h eb i o g e n e s i so fc h l o r o p l a s tw e r ed i v i d e d i n t ot h r e es t a g e s ：t h es t a g eo fp r o p l a s t ；t h eb i o g e n e s i so fs i n g l et h y k o i da n dt h eb i o g e n e s i so f g r a n a a l s oat o t a lo f1 3a l b i n or i c em u t a n t sw e r ea n a l y z e d ，a n dt h e s em u t a n t sw e r ec l a s s i f i e d t ot h ef o u rg r o u p sb a s e do nt h ei n f o r m a t i o na b o v e o n eo ft h em u t a n to s a l b 2 3w a sf u r t h e r m a p p e dt or i c ec h r o m o s o m e u n d e re l e c t r o nm i c r o s c o p e ，w ef o u n dt h a tr i c ea l b i n om u t a n to s a l b 2 3h a dn ot h y l a k o i di n s i d e t h ec h l o r o p l a s to n l yw i t hs o m ee m p t yv e s i c l e s g e n e t i c sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ep h e n o t y p e w a sc o n t r o l l e db yas i n g l er e c e s s i v el o c u s u s i n gm a p b a s e dc l o n i n g ，o s a l b 2 3h a sb e e n m a p p e dt oar e g i o no f2 8 0k bb e t w e e nm o l e c u l a rm a r k e r sr 2 m 5 0 1a n dr 2 m 5 0 2o n c h r o m o s o m e2 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h i sr e g i o nc o n t a i n e ds i xg e n e sw h i c h p r o d u c t sw e r et a r g e t e dt oc h l o r o p l a s t i na d d i t i o n ，a i la r a b i d o p s i sm u t a n tn a m e de c l 2 6 3w a ss t u d i e d g e n e t i c sa n a l y s i ss h o w e d t h a tt h i sp h e n o t y p ew a sc o n t r o l l e db yas i n g l er e c e s s i v eg e n e u s i n gm a p b a s e dc l o n i n g ， e c l - 2 6 3h a sb e e nm a p p e dt oar e g i o no f1 0 1k bb e t w e e nm o l e c u l a rm a r k e r sf 4 h 5a n da f l 2 o nc h r o m o s o m e1 t h ef i n em a p p i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i sh a sb e i n gu n d e r t a k e n k e yw o r d s ：c h l o r o p l a s t ；m a p b a s e dc l o n i n g ；m o l e c u l a rm a r k e r ；r i c e ；a r a b i d o p s 妇t h a l i a n a ； a l b i n o 上海师范大学硕士学位论文 第1 章文献综述 光合作用是绿色植物利用太阳能，同化二氧化碳和水合成有机物并释放氧气的过 程。它被称为“地球上最重要的化学反应”，是地球上一切生命生存和发展的根本源泉。 光合作用在绿色植物特有的细胞器一叶绿体( c h l o r o p l a s t ) 中进行。但叶绿体除了进行 光合作用外，还参与其他生物代谢如脂肪酸和色素的合成、氨基酸以及次生代谢物质的 合成等( m u l l e t1 9 8 8 ) 。目前叶绿体以及光合作用相关基因的功能研究，己成为当前植物 基因功能基因组学研究的一个重要方向。 1 1 叶绿体形态结构和功能 叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5 1 0 儿m ，短径2 - 4p m ，厚2 3i t m 。叶绿体是双层 膜结构，外膜透性大而内膜具选择性。叶绿体内部基质( s t r o m a ) 主要含有与碳同化相关 的酶、叶绿体d n a 和蛋白质合成系统以及一些淀粉粒等物质，呈高度流动性。基质里 有许多由单层膜包被，沿叶绿体的长轴平行排列的类囊体( t h y l a k o i d ) 。两个以上的类囊 体垛叠在一起形成基粒( g r a n a ) 。贯穿在两个以上基粒之间的没有发生垛叠的类囊体是基 质类囊体，构成内膜系统的基粒片层( g r a n al a m e l l a ) 。由于相邻的基粒由基质类囊体相 连，类囊体实质上是一个相互贯通的封闭系统。光能转化为化学能就是在类囊体上进行 的，因此类囊体膜亦称光合膜。类囊体膜的主要成分是蛋白质和脂类。类囊体膜的内在 蛋白主要有细胞色素b 6 f 复合体、质体醌( p q ) 、质体蓝素( p c ) 、铁氧化还原蛋白、 黄素蛋白、光系统i 、光系统i i 复合物等( d a v i d 等2 0 0 1 ) 。光合作用可以分为三大步： 原初反应、电子传递和光合磷酸化、碳同化。它们互相配合最终有效的将光能转化为化 学能。前两步属于光反应，在类囊体上进行，把光能转化为活跃的化学能，形成a t p 和n a d p h 。碳同化属于暗反应，在基质中进行，是不需要见光的酶促反应，利用光反 应产生的a t p 和n a d p h 还原c 0 2 将活跃的化学能转化为稳定的化学能，储存于有机物 中。 上海师范大学硕士学位论文 1 2 叶绿体的半自主性 叶绿体具高效转录、转泽的特点用以合成大量的酶、组成电子传递链以及合成固定 二氧化碳所需的成分。叶绿体具有自身的d n a 和蛋白质合成体系，为半自主性细胞器。 拟南芥的叶绿体基因组编码8 7 个叶绿体蛋白，约4 2 5 5 个叶绿体蛋白由核基因组编码 ( a b d a l l a h 等2 0 0 0 ，f r i s o 等2 0 0 4 ) 。大量的蛋白质是由核基因组编码，在细胞质游离的 核糖体上合成，然后运送到叶绿体发挥其特有的功能。这些蛋白质在在运输以前，与分 子伴侣( h s p 家族) 结合而保持前体蛋白质处于非折叠状态。大多前体蛋白n 端有一段信 号序列称为导肤、前导肽或转运肽( 1 e a d e rs e q u e n c e 、p r e s e q u e n c e 或t r a n s i t - p e p t i d e ) ，完 成转运后被信号肽酶切除，成为成熟蛋白完成后转译。转运到叶绿体内膜和类囊体的前 体蛋白含有2 个n 端信号序列，第1 个被切除后暴露出第2 个信号序列，将蛋白运输到 叶绿体内膜、类囊体膜、类囊体基质中。蛋白质的输入是一个耗能的过程，能量的来源 为水解a t p ，叶绿体蛋白的跨膜运输如图1 1 所示。t - d n a 插入获得的突变体a t h s p 9 3 植株矮小有白化表型，叶绿体发育不正常，表明该基因影响叶绿体的发育( c o n s t a n 等 2 0 0 4 ) 。 由于叶绿体在形态结构、化学组成和遗传体系等方面与蓝细菌相似，人们推测叶绿 体可能也起源于内共生的方式，由寄生在细胞内的蓝藻演化而来( r u j a n 等2 0 0 1 ) 。随着 拟南芥和水稻全基因序列的测序完成以及生物信息学软件的不断开发( e m a n u e l s s o n 等 2 0 0 0 ；w e s t e r l u n d 等2 0 0 3 ) ，大大的促进了叶绿体蛋白质功能和编码基因的研究，为阐 明叶绿体的演化、发育和功能奠定了基 i 出( l e i s t e r2 0 0 3 ) 。 图i - 1 叶绿体蛋白跨膜运辅 上海师范大学硕士学位论文 1 3 叶绿体的发育、转化及增殖 叶绿体是由直径约0 2 - 0 5u m 的前质体发育( b i o g e n e s i s ) 而来。前质体( p r o p l a s t ) 大多存在根和芽的分生组织中，由双层膜包被，没有类囊体只含有d n a 、淀粉粒、脂肪 粒以及一些成份未知的泡状结构。叶绿体发育时首先前质体的体积开始膨胀，当其直径 约达到1 0m 左右时内膜开始向基质凹陷形成一些小泡，正常光照条件下这些小泡数目 增多并相互融合形成片层结构，多个片层平行排列形成基粒，最终发育成叶绿体。而在 黑暗条件下，叶绿体内部小泡融合速度减慢，形成一种三维网状结构一原片层，此时的 质体称为黄化体( e t i o p l a s t ) 。黄化体再转入正常光照条件时，它的网状结构弥散形成类囊 体，进一步发育出基粒成为正常的叶绿体( g u t i & r e z n a v a 等2 0 0 4 ) 。随着细胞的不断分裂， 叶绿体需要合成新的类囊体膜以及光合作用相关的蛋白，才能正常发育( v o t h k n e c h t 和 w e s t h o f r 2 0 0 1 ) 。由于类囊体膜是由在叶绿体内膜上合成的脂类组成，而叶绿体内膜和 类囊体膜之间由基质隔开，新合成的脂类需要一种运转体系才能到达类囊体( a n d e r s s o n 矛d s a n d e l i u s2 0 0 4 ) 。 质体之间可以相互转换。前质体在植物的储藏器官如块根块、茎中发育成白色体 ( a m y l o p l a s t ) 主要作用是储藏淀粉。叶绿体也可以转化为有色体( c h r o m o p l a s t ) ，当果 实发育成熟时，果皮颜色由绿变红就是叶绿体内部的叶绿素分解转化为胡萝h 素，类囊 体片层结构瓦解，叶绿体转化为有色体。图1 2 为高等植物质体之间的转化过程。 叶绿体靠分裂而增殖，这种分裂是通过中部缢缩而实现的( l e e c h1 9 7 6 ；p o s s i n g h a m 等1 9 8 8 ：w h a t l e y1 9 8 8 ) 。在植物发育前几天可以观察到很多细胞内的叶绿体呈哑铃型； 另外从菠菜幼叶含叶绿体少且每个叶绿体d n a 多，而老叶含叶绿体多且每个叶绿体 d n a 少的现象也可咀看出，叶绿体是以分裂的方式增殖的。成熟叶绿体正常情况下一般 不再分裂或很少分裂。 上海师范大学硕士学位论艾 圈1 - 2 植物质体转化过程 1 4 植物叶绿体功能基因研究进展 随着拟南芥突变体库的建立，人们发现很多方法筛选与叶绿体形成和功能相关的突 变体。这些筛选参数多集中于突变体色素的改变及叶绿体荧光的改变等。 迄今已经从多种植物如玉米、烟草、番茄、拟南芥和水稻中分离出了叶绿体发育的 不同阶段受阻的突变体( r a p p 和m u l l e t1 9 9 1 ；h a n 等1 9 9 3 ：m e u r e r 等1 9 9 6 ；r o y 和b a r k a n 1 9 9 8 ：w a n g 等2 0 0 0 ) 。很多核基因和叶绿体基因都可以影响叶绿体的发育，其中有些基 因是直接影响类囊体的形成，有些基因是通过调节重要的代谢途径来影响质体发育。类 囊体是进行光合作用的场所，含有光合作用主要的蛋白，它的形成与光系统i i 的发生以 及光合作用密切相关( v o t h k n e c h t 和w e s t h o f f 2 0 0 1 ) 。拟南芥中，玩叩编码的蛋白影 响叶绿体发育早期内膜凹陷形成的小泡这一过程( k r o l l 等2 0 0 1 ) ，而t h f l 编码的叶绿 体蛋白影响小泡相互融合成类囊体，该基因的敲除导致植株矮小且叶片出现花斑表型 ( q i n 等2 0 0 4 ) 。烟草中编码质体r n a 聚合酶亚基的基因r p o 突变，可导致花斑叶片的 表型( d es a n t i s 等1 9 9 9 ) 。i m 基因编码一种定位于质体中的交替氧化酶，影响光合作用 的电子传递，该基因突变也可以导致叶片出现花斑表型( c a r o l 等1 9 9 9 ) 。p a c 基因突变 导致拟南芥出现白化表型，叶绿体内部只具单片层的类囊体结构，叶绿素和类胡萝h 素 合成量低f r e i t e r 等1 9 9 4 ) 。通过转座子插入得到白化突变体a p 9 2 的质体空泡化类似于前 质体，推测该基因编码的蛋白在叶绿体的发育过程中起重要作用( m o t o h a s h i 等2 0 0 1 ) 。 4 上海师范大学硕士学位论文 c h e n 等利用图位克隆分离出叶绿体发育相关基因e g y l ，该突变体类囊体的数量少，光 捕获蛋白复合物含量少，经分析e g y l 编码一种与不依赖a t p 的金属蛋白酶( c h e n 等 2 0 0 5 ) 。g e r d e s 等发现a l b 4 编码的蛋白定位于类囊体膜，突变体a l b 4 的叶绿体体积比野 生型大但类囊体数量少，推测该基因是叶绿体正常发育所必需的( g e r d e s 等2 0 0 6 ) 。 叶绿素是参与光合作用的重要色素，其合成途径受阻也可以产生明显叶色表型。一 般认为水稻叶绿素合成缺陷突变体的叶绿素含量低，叶绿体发育有缺陷。叶绿素和类胡 萝h 素属于类异戊二烯( i s o p r e n o i d ) ，植物通过细胞质中的二羟甲基戊酸合成途径 ( m v a ) 途径和质体中的甲基苏糖醇磷酸酯途径( m e p ) 途径来合成叶绿素的前体物质 异戊烯基焦磷酸酯( i p p ) 和甲基丙稀基焦磷酸酯l d m a p p ) 。这两种物质互为同分异 构体，可以在细胞质和质体中转运。m e p 途径主要合成的类异戊二烯与m v a 途径稍有差 别，植物叶绿体中的叶绿素和类胡萝h 素主要通过质体m e p 途径合成。其中单萜、二萜 和特定的倍半萜可以吸引传粉昆虫、参与抵御病菌侵染：叶绿素和类胡萝h 素是光合色 素；质体醌参与组成光合传递链；m e p 途径的合成产物中还有赤霉素、脱落酸和细胞分 裂素等植物激素。图1 3 为植物体内类异戊二烯的合成途径。目前国内外已经报道了大 约7 0 个叶绿素合成缺陷突变基因( 黄晓群等2 0 0 6 ) 。拟南芥基因c l a l 编码m e p 合成途径 中第一个酶d x s 合成酶( e s t e v e z 等2 0 0 0 ) 。g u f i & r e z n a v a 等分离出了叶绿素m e p 合成途 径中的c b 4 ；j 1 c l b 6 两个白化突变体，它们的叶绿素含量明显低于正常野生型；c l b 一4 编 码h d s 合成酶( h y d r o x y 一2 一m e t h y l 一2 - b u t e n y l4 - d i p h o s p h a t es y n t h a s e ) 该突变体叶绿体内 部具有单片层；c l b 一6 编码m e p 途径中最后一个酶i d s 合成酶( i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t e s y n t h a s e ) 其叶绿体结构类似于前质体，内部无片层结构( g u t i r r e z n a v a 等2 0 0 4 ) ，它们 的突变都可导致叶绿素不能正常合成，叶绿体发育有缺陷。 由细胞核基因转录转译而来的叶绿体前体蛋白在n 端具有信号肽，主要由叶绿体外 膜及内膜上的转位因子复合体( t r a n s l o e o nc o m p l e x ) 运输到叶绿体内。这些复合体成员中 位于叶绿体外膜称为t o c 蛋i 刍( t r a n s l o c o na tt h eo u t e re n v e l o p em e m b r a n eo f c h l o r o p l a s t s ) ， 内膜的称为t i c 蛋i 刍( t r a n s l o c o n a t t h e i n n e r e n v e l o p e m e m b r a n e o f c h l o r o p l a s t s ) 。对这些复 合体成员的研究已有十分大的进展，至今为止已发现近1 0 个蛋白质，但至今仍不清楚这 些蛋白如何协调组合将前体蛋白送入叶绿体。a t l l f c l l o 与拟南芥核编码的叶绿体蛋白组 装运输有关，该基因间接的影响叶绿体发育( i n a b a 等2 0 0 5 ) 。类囊体蛋白是由核基因组 和叶绿体基因组共同编码，核编码的蛋白利用n 端信号肽序列，引导蛋白质跨膜运输到 叶绿体基质。目前发现4 种机制引导蛋白跨膜运输：自发插入、依赖s e c 跨膜运输途径 5 上海师范大学硕士学位论文 ( ac h l o r o p l a s ts e cr _ ( 1 e p e n d e mp a t h w a y ) 、叶绿体信号识别颗粒c p s r p ( a c h l o r o p l a s ts i g n a l r e c o g n i t i o np a r t i c l e ) 、利用膜问电化学梯度跨膜途径。叶绿体内部的c p s r p 5 4 蛋白与 c p s r p 4 3 蛋白结合，k l i m y u k 等发现c a o 基因编码植物特有的c p s r p 4 3 蛋自，该突变体色 素结合天线蛋白含量减少，叶绿体发育缺陷( k l i m y u k 等1 9 9 9 ) 。 多数与叶色相关的基因也可能编码叶绿体蛋白，立 1 m u n e k a g e 等分离的突变基因为编 码细胞色素b 6 腹合体中的p e t 蛋i 刍( m t m e k a g e 等2 0 0 1 ) 。a l b 3 编码一种与酵母o x a l 蛋白 同源蛋白，其可能参与光捕获色素结合蛋白的转位( j i a n g 等2 0 0 2 ) 。v a r o t t o 等从t - d n a 突变体库中分离到白色叶片的突变体，该突变体光系统i i 的量子产额降低，经研究这是 由于核编码的个金属离子转运蛋白i r t l 突变造成的( v a r o t t o 等2 0 0 2 ) 。叶绿素荧光蛋白 缺陷的突变体 c ，的叶绿体基因编码的蛋白存在缺陷，目前为止已有多个眦膑变体基因 被克隆，这些基因分别参与类囊体的形成、蛋白质转运以及m r n a 的加工翻译( m e u r e r 等1 9 9 8 ) 。 有关质体分裂的突变体也被相继分离。质体的分裂是一个多基因控制的复杂过程， 在拟南芥中发现一些细胞中叶绿体数目不正常的突变体，如卯c ( p y k e l 9 9 9 ；l e e c h1 9 9 4 ； r o b e r t s o n 等1 9 9 6 ：m a r r i s o n 等1 9 9 9 ) 。一些与细菌分裂基因高度同源的基因如n 蛆家族， 参与拟南芥的质体分裂。m z 家族有两类基因，都是由核基因编码。一类凡f z 基因编码 的蛋白定位于叶绿体内；还有一类如f t s z l - - 1 、f t s z 2 - - 1 它们编码的蛋白没有信号肽序 列，定位于细胞质中，这类基因的突变导致叶绿体数目大幅度减少( k e v i n 等2 0 0 0 ； k a t h e r i n e 等1 9 9 8 ) 。r a y n a u d 等发现了一个新的叶绿体分裂的机$ 0 ( r a y n a u d 等2 0 0 4 ) 。 有关叶绿体和核问信号传导的研究也相继取得较大的进展，质体到核信号传导受阻 的一些相关突变体也被分离。如g u n ，c u e ，r a y 等这些突变体的相应的基因参与金属卟 林的代谢、转运或其他代谢( m o l l e r 等2 0 0 1 ；s t r e a t f i e l d 等1 9 9 9 ；d a v i s 等1 9 9 9 ) 。 水稻由于具有较小的基因组、建立了比较完善的转化体系及与其他单子叶植物有较 好的共线性等特点，已经成为单子叶植物研究的模式植物。水稻基因组中基因总数在 4 6 5 6 万之间，其中4 8 5 3 个基因和叶绿体的发育有关( e r i k 等2 0 0 4 ) 。尽管已经发现 很多水稻白化突变体，有关水稻中白化基因克隆的报道较少。k u s u m i 等获得了一个条 斑叶片的突变体t c m 2 4 8 ，经分析认为控制该表型的是一个隐性基因，但是目前还未克 隆出该基因( k u s u m i 等2 0 0 0 ) 。o s c h l h 是通过t - d n a 标签法获得，该基因编码的蛋白 为m g 叶鳌合酶，它可能参与叶绿素的生物合成( j u r l g 等2 0 0 3 ) 。g o t h a n d a m 等用r n a i 上海师范大学硕士学位论文 的方法分离出了与叶绿体发育相关的基因o s p p r l ，该基因的敲除导致水稻叶片白化 f g o t h a n d a m 等2 0 0 5 ) 。 q 堕坌堕趔婪“匿堕趟唑 1 5 图位克隆研究进展 萎 艘 一磊f p y r u 。a i e 一、 v x s 图1 - 3 植物类异戊二烯的台成途径 1 5 1 图位克隆原理以及流程 图位克隆( m a p - b a s e dc l o n i n g ) 也称定位克隆( p o s i t i o n a lc l o n i n g ) ，最先由1 9 8 6 年 剑桥大学的a l a nc o u s l o n 提出。其基本的原理是：功能基因在基因组中都有相对较稳定 的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁 的分子标记筛选d n a 文库( 包括y a c ，b a c 等) ，构建基因所在区域的物理图谱，再 通过染色体步查( c h r o m o s o m ew a l k i n g ) 逼近目的基因或通过染色体登陆( c h r o m o s o m e l a n d i n g ) 方法，找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。 图位克隆技术是近几年随着各种分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种新的 基因克隆技术。目前克隆基因的途径有两种，正向遗传学和反向遗传学途径。前者是依 据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的，而反向遗 上海师范大学硕士学位论文 传学则着眼于基因本身。图位克隆技术属于前者，利用这种方法分离基因是根据目的基 因在染色体上的位置进行的，无需知道基因的d n a 序列，也无需知道其产物的表达情 况。该技术通过连锁分析排除其他基因将目的基因定位在一个与其紧密连锁的分子标汜 上，然后进行分离。图位克隆技术主要包括4 个基本环节( 图1 - 4 1 ： ( 1 ) 目的基因的初步定位：筛选与目标基因连锁的分子标记，并利用分子标记在一个目 标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内。 ( 2 ) 目的基因的精细定位：初步定位的目的基因两侧的分子标记，鉴定更大群体的单 株来确定与目的基因紧密连锁的分子标记。 ( 3 ) 构建目的基因精细的物理图谱：确定目的基因区域的近似的物理距离和遗传距离 的比值( k b c m ) ，构建目的基因的物理图谱，这为以后该基因的克隆奠定了基础。 ( 4 ) 筛选e d n a 文库并通过遗传转化试验验证目的基因的功能：把候选基因序列与现 有己知功能基因序列数据库进行同源性比较，推断其功能，比较候选基因序列在 野生型与突变型之间的差异，确定在二者之间变异的c d n a 序列通过转化候选基 因，进行遗传互补实验最终鉴定基因。 絷色体步移 图l - 4 圈位克隆基本流程 呻缔迸基瑚缩+ 序，口，卜析畸 变 库功_ 鉴定 1 5 2 图位克隆研究进展 传统克隆分离基因的方法很多，如功能克隆和近年来发展起来的表型克隆等。由于 功能克隆要求清楚地了解其基因产物，表型克隆技术又普遍存在着重复性差、假阳性高 等缺点极大地限制了其广泛应用。然而新近发展起来的图位克隆技术则能很好地解决这 一问题。图位克隆技术在植物的基因克隆中有很广阔的应用前景，做为通用的基因识别 途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高精度遗传图谱、大尺度物理 图谱、大片段基因组文库和基因组全序列为图位克隆的广泛应用铺平了道路。而d n a 芯片或微列阵与s n p 和e d n a 相结合在基因的定位、筛选和鉴定方面具有无比的优越 r 丹且再 酣 - 理 一 蝴 一 丹u 再 一 一 # 叭 上海师范大学硕士学位论文 性，相信能大大提高图位克隆的效率。图位克隆技术首先被用于模式植物拟南芥上，据 预测拟南芥中形态突变约2 5 0 0 3 7 5 0 个，已经鉴定了6 0 0 多个占总数1 5 - 2 5 ，其中1 3 是通过图位克隆技术鉴定的。g i m u d a t 等成功地克隆了与拟南芥种子形成和发芽相关的 脱落酸信号传导基因a b l 3 ( g i r a u d m 等1 9 9 2 ) 。g i b s o n 等克隆到拟南芥脂肪酸脱饱和 基因酶基因f a d 3 ( g i b s o n 等1 9 9 4 ) 。n a k a j i m a 等分离出编码定位微管蛋白基因即r ， 该基因可以影响细胞生长( n a k a j i m a 等2 0 0 4 ) 。z h a n g 等克隆出了与拟南芥内部免疫相 关的基因s n c l ( z h a n g 等2 0 0 5 ) 。m a r t i n 等克隆出影响拟南芥提前开花基因e s d l ，该 基因编码与肌动蛋白家族同源的蛋白( m a r t i n 等2 0 0 6 ) 。还有许多被克隆的基因涉及到 模式植物水稻以及大麦、甜菜和番茄等农作物的抗性基因。可以说抗性基因的克隆，基 本上代表了图位克隆在基因克隆技术上应用的最新进展。 水稻基因组中基因总数在4 6 5 6 万之间，但目前只明确了其中l 万多个基因的功 能。在水稻中利用图位克隆已克隆到的基因包括：x a 2 1 ( l h 等1 9 9 5 ) 、d a w f l ( y o s h i m u r a 等1 9 9 8 ) 、p i b ( w a n g 等1 9 9 9 ) 、h d 3 ( m o n n a 等2 0 0 2 ) 、印1 7 ( y a m a n o u c h i 等2 0 0 2 ) 等。y o s h i m u r a 等克隆出了水稻抗百叶枯病基因x a l ( y o s h i m u r a 等1 9 9 8 ) 。t a k a h a s h i 等分离出与水稻光周 期敏感性相关基因h d 6 ，该基因控制数量性状，编码c k 2 蛋白激酶的q 亚基( t a k a h a s h i 等2 0 0 1 ) 。h a g a 等分离出水稻趋光性信号传导途径相关基因c 7 p ，该基因不仅影响胚 芽鞘的趋光性还影响生长素的侧向运输( h a g a 等2 0 0 5 ) 。近几年我国在图位克隆植物基 因方面取得很大进步。中科院遗传所李家洋实验室己成功克隆拟南芥代谢型细胞死亡突 变基因r o o d l ，并证明该基因编码脂肪酸合成通路前期合成酶( m o u 等2 0 0 0 ) 。l i 等分 离出了在水稻厚壁组织和维管束细胞内表达的基因b c l ，该基因影响植物组织抵抗机械 损伤的能力( l i 等2 0 0 3 ) 。z h a n g 等克隆出了编码水稻木质素合成途径中苯丙烯盐脱氢 酶的基因g h 2 ，该基因突变导致水稻中木质素不能正常合成( z h a n g 等2 0 0 6 ) 。中科院 上海植生所的q u 等克隆出水稻光谱抗性基l 天| p i 9 ，该基因编码富含亮氨酸重复序列蛋白 ( o u 等2 0 0 5 ) 。z h u 等发现了水稻第一茎节伸长的突变体并克隆出突变基因e u ，该基 因编码细胞色素p 4 5 0 单加氧酶，能使赤霉素环氧化并大量积累于第一茎节( z h u 等2 0 0 6 ) 。 鉴于各种植物的抗病虫基因和其他基因对于我国科研工作和农业生产都具有特别重要 的意义，图位克隆对于分离这些基因必将发挥重要的作用。 上海师范大学硕士学位论文 第2 章水稻叶绿体发育以及突变体叶绿体电镜观察 2 1 试剂与仪器 2 1 1 主要试剂 ( 1 1 固定液- 磷酸缓冲液配成2 5 戊二醛溶液，p h 调成7 4 ( 2 ) 磷酸缓冲液：o 。2m 磷酸氢二钠3 6m l 与0 2m 磷酸二氢钠1 4 m l 混合均匀 ( 3 ) 锇酸：磷酸缓冲液配成2 溶液 ( 4 ) 包埋剂：德国m n a 2 5 l m l ，日本d d s a 2 8 5 m l ，环氧树脂e p o n 一8 1 24 6 m l 固化剂 d m p 3 00 1 5 m l ，混合均匀 f 5 ) 染色剂： a 醋酸铀配成1 2 饱和水溶液 b 柠檬酸铅溶液：柠檬酸三钠0 8 8m l ，硝酸铅0 6 6m l ，1 m 氢氧化钠 4 m l ，混合均匀后定容至2 5 m l 。 2 1 2 主要仪器 ( 1 ) h i t a c h ih 一6 0 0 型透射扫描电镜 ( 2 ) 瑞典u l t r a c u t - e 型切片机 ( 3 ) 瑞典u l t r a t r i m 修块机 2 2 材料与方法 2 1 1 实验材料 上海师范大学硕士学位论文 2 1 1 1 正常野生型水稻 水稻种子大且萌发过程明显，是一种很好的电镜观察叶绿体的材料。野生型粳稻品 9 5 2 2 ( o s a t i v a j a p o n i c a ) 在3 0 萌发3 天后转到正常条件下生长，培养温度( 2 6 2 ) ，光照强度2 0 0 0l x ，光照时i n l 2h 。第4 天开始每天取水稻顶端叶片2 3 r a m 2 置于固定 液中，抽气后- f ：4o c 条件下固定一周左右，经处理用透射电镜观察。 2 1 1 2 突变体水稻 通过2 8 0g y 的帕c oy 射线照射粳稻品种9 5 2 2 ( o t i v a j a p o ”i c a ) 我们得到1 3 株白 化突变体。分别取其m 2 代种子，于相同条件下萌发2 0 天左右，待白化苗长至4 - 6c m ， 按上述方法取材固定进行电镜观察。 2 1 2 水稻叶片电镜切片制各方法 ( 1 ) 取新鲜水稻叶片组织2 - 3m m 2 ，迅速放入l m l 固定液中。针筒抽气( 除去细胞液泡内 空气) 至材料沉入固定液中，于4 条件固定一周左右。 ( 2 ) 吸出固定液，用1m l 磷酸缓冲液( 4 保存p h = 7 - 2 ) 冲洗3 次。 ( 3 ) 吸出磷酸缓冲液，加5 0 0 “1 锇酸过夜染色。 ( 4 ) 磷酸缓冲液洗去锇酸，开始以下酒精脱水过程： 3 0 ! q 塑i n 一5 0 ! q 塑i 旦一7 0 ! q 匹也8 0 1 5 照也9 0 1 5 m 也 9 5 ! 盟也1 0 0 j q 盟i n1 0 0 3 垒堕i 环氧丙烷2 q 也也环氧丙烷2 q m i l ，吸出环氧丙烷，加入混合 好的包埋剂+ 环氧丙烷( 体积比1 ：3 1 过夜。 ( 注意：7 0 酒精脱水以前的步骤都在4 c 条件下，以后步骤在常温下进行) ( 5 ) 吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+ 环氧丙烷( 体积比1 ：1 ) ，过夜。 ( 6 ) 吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+ 环氧丙烷( 体积比3 ：1 ) ，过夜。 f 7 ) 在橡胶小板上加入纯包埋剂，把材料分别移入空格内并摆放整齐，过夜。 ( 8 ) 把橡胶小板置于6 5 条件下聚合4 8h 。 ( 9 ) 包埋好的样品经钻石刀切成7 5r t r f l 薄片后，置于2 0 0 3 0 0 目铜网上。 ( 1 0 ) 醋酸双氧铀染色5m i n ，重蒸水漂洗2 次，柠檬酸铅染色2m i n 。 f 1 1 ) 利用透射电镜观察。 上海师范大学硕士学位论文 2 3 结果与讨论 2 3 1 正常水稻叶绿体发育的电镜观察 我们以野生型粳稻9 5 2 2 为材料，对整个萌发过程中叶绿体的发育情况进行了透射 电镜观察如图( 2 1 ) 所示。从萌发3 天后开始，每天取材后立即置于固定液中。第1 次取 材在萌发第4 天( 图a ) ，通过电镜可以观察到前质体中间缢缩正在进行分裂，此时每 个细胞内只有1 2 个前质体且体积很小。第2 次取材( 图b ) ，可以观察到细胞分裂后前 质体体积迅速增大，在内膜周围形成许多小空泡，但内部没有形成类囊体片层，只有一 些淀粉颗粒和脂肪颗粒，这时的叶绿体还处于前质体时期。第3 次取材( 图c ) ，前质 体中问已经出现单个片层结构。图d 、e 、f 、g 是类囊体片层的积累和叠加成基粒类囊 体的过程，这一过程大概需要5 7 天。在取材十天左右( 图h ) ，叶绿体已经基本发育 成熟，可以很清楚看到起叶绿体内部的基粒以及相互连接的类囊体片层。 根据以上电镜观察结果我们把水稻叶片叶绿体发育过程大体分为三个阶段，1 前质 体时期：前质体内没有片层结构，但可以观察到在内膜周围有许多小泡形成。2 类囊体单 片层形成期：小泡相互融合形成了单个片层。3 基粒形成期：多个片层平行排列，最终 形成基粒。 ( a 2 00 0 0 ：b 1 50 0 0 ；c 2 0 0 0 0 ；d 1 50 0 0 ；e 1 50 0 0 ：f 1 50 0 0 ：g x i70 0 0 ；h 1 70 0 0 ) 网2 - 1 水稻叶绿体发育电镜照片 上海师范大学硕士学位论文 2 3 2 突变体水稻叶绿体电镜观察 通过以上对正常水稻叶绿体发育的电镜观察，我们又对1 3 个水稻白化或黄化突变 体进行了电镜观察。根据结果，这些白化突变体的叶绿体分别在处于发育不同时期，大 体分为以下4 类：1 ) 以4 7 2 、4 0 2 、1 4 4 为代表。它们的叶绿体可以观察到双层膜以及类 似于原质体的泡状结构，但是内部缺少类囊体。推测这些基因突变发生于叶绿体发育早 期，其叶绿体停滞于前质体阶段。2 ) 以3 7 、7 6 、2 7 6 、2 9 5 为代表。它们的叶绿体在内 膜周围形成许多空泡并且可以观察到淀粉粒和脂肪粒，但是还没有形成类囊体片层结 构。3 ) 以1 6 2 、2 7 2 、1 8 9 、3 4 1 为代表，在其内膜周围出现了单片层结构，推测这些基 因突变导致叶绿体发育停滞在片层结构叠加的过程中。4 ) 以4 1 3 、4 2 8 为代表，其叶绿 体内部出现类囊体结构，但类囊体片层数量少且片层之间距离较大，叶绿体中出现了许 多空泡。图2 2 为1 3 个水稻突变体叶绿体的电镜照片。 图2 - 2 水稻叶色突变体叶绿体电镜j i i 片( w 为野生型，其余为突变体) 匕海师范大学硕士学位论文 第3 章控制水稻叶绿体发育基因o s a l b 2 3 的定位 3 1 试剂与仪器 3 1 1 主要试剂 dna分子量标准takara 琼脂糖o x i d t r i s 饱和酚 鼎国 所有引物序列生工 d n t p 鼎国 t a q 酶 天为时代 其它无机盐和常用化学试剂为国产分析纯试剂 3 1 2 主要仪器 微量可调移液器( p i o 、p 1 0 0 、p 2 0 0 、p 1 0 0 0 ) h z 9 2 1 1 k 型光照培养箱 g i s 凝胶图像处理系统 p t c 1 0 0p c r 仪 电泳槽 电泳仪 f c l 0 4 电子天平 5 4 15 - d 型高速离心机 4 5 0 0 型数码相机 3 1 3 所用软件及网站 ( 1 ) 软件：p r i m e rp r e m i e r5 , 0 设计引物 ( 2 ) 网站：h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v 德国e p p o n d o r f 上海恒科 天能t a n o n 美国 天能t a n o n 天能t a n o n 国产 德国e p p o n d o r f 日本n i k o n 上海师范大学硕士学位论史 3 2 材料与方法 3 2 1 水稻突变体的获得 通过2 8 0g y 的6 0 c oy 射线照射水稻粳稻( o s a t i v as s p j a p o n i c a ) 品