（遗传学专业论文）狐米草耐盐机制的研究及其药用价值的初步分析.pdf

南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 摘要 盐渍化土壤是植物生长过程中最常遇到的自然逆境之一，全世界的盐土约占陆地面积 的三分之一。近年来，随着工农业的发展环境污染加剧，淡水资源日益匮缺，海平面不断 上升，陆地面积相对缩小，土壤盐渍化有日益加重的趋势。盐胁迫( s a hs 廿e s s ) 对植物的 不良影响主要包括离子毒害和离子吸收不平衡即营养亏缺，盐胁迫使植物的生长受抑制， 光合下降，能耗增加，衰老加速，生长量降低，最终导致植株因饥饿而死亡。根据植物对 土壤盐分的适应能力，可把植物分为盐生植物( h a l o p h u t e ) 和非盐生植物( g 1 y c o p h y t e ) 。 植物的耐盐性是由多基因决定的数量性状，是多种耐盐性状的综合体现。研究盐生植物的 耐盐机理，发现与植物耐盐相关的基因，对植物抗逆基因工程有重要的意义。 黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，主要存在于药用植物中，是有效 成分之一。黄酮在医学上有着广泛的应用，医学界普遍认为黄酮具有抗氧化性，能消除体 内过多的自由基，从而在抗衰老、抗肿瘤和治疗糖尿病方面有较大的医用价值。有关狐米 草中的黄酮成分提取的研究还未见报道。 本文以禾本科盐生植物狐米草( 跏州mp 纰坩( m t o n ) m u h l ) 为材料，采用m r n a 差异显示( d d r l 廿c r ) 、r a c e 、s d s p a g e 、n o n b e r n - b l o t 等技术，对狐米草耐盐机理在 生理和分子水平的研究；用分光光度法和高效液相色谱法( h p l c ) 测定总黄酮含量。 1 采用2 n a c l 、5 0 m m o l 几a b a 、1 5 p e g _ 6 0 0 0 三种不同胁迫条件下诱导狐米草胁 迫相关蛋白，利用s a s 软件进行逐步回归分析，筛选出了对狐米草抗胁迫生理有显著贡献 的蛋白。表观分子量分别为3 8 5 k d 、3 6 k d 、3 9 5 k d 和4 0 5 k d 的蛋白是在胁迫条件下诱导产 生的与抗胁迫能力有关的蛋白，可以缓解植物在胁迫条件下含水量、叶绿素含量的剧降， 或质膜透性的升高。首次发现表观分子量为3 9 5 k d a 的蛋白是一种尚未报道的胁迫相关蛋 白，对质膜透性有负贡献，当这蛋白增加时，质膜透性会降低。实验中还发现，狐米草经 过一定的胁迫预处理( 低浓度盐或a b a 处理) ，则能明显提高它的耐盐能力，说明狐米草 也存在交叉适应现象。 2 测定不同时间、不同浓度盐胁迫条件下，狐米草中渗透压调节物质脯氨酸、可溶性 糖和n a + 、k 十含量变化情况，以及活性氧清除酶系统中超氧化物歧化酶( s o d ) 和过氧化 物酶( p o d ) 及其同工酶活性，分析了狐米草这种耐盐性较高的盐生植物与一般盐生植物 的区别。在长时间高盐胁迫条件下脯氨酸和可溶性糖含量还有升高，说明它们在狐米草盐 t 南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 胁迫条件下的渗透调节中均起到重要作用。在盐胁迫条件下，狐米草叶片中的n a + 和k + 含 量均有所升高，且n a + ，k + 比值变化不大，说明狐米草中存在一种将细胞内过多的n a 十转化 为k 十的机制，从而保护植株不受过量n a + 的侵害。轻度盐胁迫下狐米草p o d 、s o d 等保护 酶活性明显提高，中、重度胁迫下其活性下降，但两种酶对盐胁迫的敏感程度不同。 2 利用m r n a 差异显示( d d r t p c r ) 技术对狐米草盐胁迫条件下的应答基因进行了 分析，发现多个在盐胁迫条件下表达量增加改变的基因片段。在二次p c r 和n o r c l l e m 杂交 排除假阳性后，发现了一个基因片段h 7 0 7 只在高盐环境中大量表达。通过5 一和3 一r a c e 得 到了该基因的全长( 1 7 7 9 b p ，g e n b a n k 登录号a y 4 9 4 0 8 4 ) ，命名为s a l t s 扛e s sr e s p o n s i v eg e n e l ( s r 9 1 ) 。对s r 9 1 的开放读码框( o r f ) 分析发现，它编码一个3 7 4 个氨基酸的蛋白质，分 子量大约是4 1 6 k d 。保守区( c d s ) 分析和三维结构预测( s w i s s m o d e l ) 表明该基【司编 码一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，分子进化分析表明它属于丝裂原活化蚤白激酶( m a p k ) 家族。该激酶家族成员在多种信号传递系统中起重要作用。m a p ( k m a p k k m a p k 级联途径与植物对干旱、高盐、低温、激素、创伤、病原反应等多种反应信号传递有关。 s r 2 1 可能与狐米草高盐胁迫信号传递途径有关。 3 首次从狐米草中分离出黄酮类物质。取狐米草干粉分别用水、5 0 甲醇、5 0 乙醇 和5 0 丙酮提取，比较黄酮得率，确定用乙醇回流法获得黄酮粗提液。通过条件优化，确 定溶剂乙醇的最佳浓度( 7 0 ) 、料液比( 1 ：2 5 ) 、浸取时间( 4 h ) 和回流提取次数( 2 次) 。 分别用分光光度法和高效液相色谱法测定黄酮含量，结果表明，狐米草中含有丰富的黄酮 类物质，1 9 狐米草干粉中含有黄酮类物质达到5 6 7 1 7 0 4 1 m g 。黄酮粗提液经大孔吸附树 脂纯化，得到精制液。产品中黄酮类物质纯度可达3 1 2 5 。通过测定不同批次，经过不同 处理的狐米草中黄酮类物质的含量，确定狐米草最佳收获时间与生长环境。 从本文的研究结果可以说明，狐米草作为一种盐生植物，有多种生理机制抵抗高盐胁 迫条件：有多种胁迫条件下诱导产生的与抗胁迫能力有关的蛋白，包括一个新报道的对质 膜透性有负贡献的3 9 5 k d a 蛋白；渗透压调节物质如脯氨酸、可溶性盐等起到重要作用；比 较稳定的n a + ，k + 显示体内存在一种将细胞内过多的n a + 转化为k + 的机制，从而保护植株不 受过量n a + 的侵害；活性氧清除系统中的有关酶类如s o d 、p o d 等，能够有效地清除活性 氧，减少活性氧对植株的侵害。利用d d r t - p c r 技术我们得到一个新的耐盐相关基因s 玛1 ， 它属于m a p k 激酶家族，可能和胁迫信号传导途径有关。这些新的发现，丰富了我们对植 物耐盐机制和信号传导的认识，为培育抗盐性能优良的植物新品系奠定了一定的理论基 1 i 南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 础。狐米草作为一种耐盐海滨牧草，对它的药用价值的研究也具有很高的理论意义和经济 价值。 关键词：狐米草耐盐信号传导黄酮类物质 i l i 南开大学博士研究生毕业论文英文摘要 a b s t r a c t h i 曲s a l i n h yi so n eo f 也em 旬o ra b i 嘶cs t r c s s e sw h i c hc o n s t r a i n t sc r o pp l a n tg r o 埘h t 0 da y ， n e a r l y2 0 o fm ew o r l d sc u h i v a t e d1 a n d sa 1 1 dn e a r l yh a l fo fa l i g a t e dl 趾d sa r ea 恐c t e d b y s a j i l l i t y - h lr e c e n ty e a r s ，t h es h a t i o nh a sg r o 州1w o r s eb e c a u s eo fs h o r co f 舶s h w a c c r ；t l l e 旬阻n s g r e s s i o na n dm ei n c r e a s e de n v i r o 姗e mp o l o n t h es a l t s t r e s sa 任b c t sp l a i l ti ns c v e r a l 、v a y ：i o i l i cp o i s o n ，m 姗r i t i o n ，o s m o s i ss t r e s s ，d e c r e a s e dp h o t o s y n t h e s i s ，c a u s i n g 印o p t o s i s ，a 1 1 d f m a l l yc a u s e 也ep l 趾tp e r i s h t h ep 1 姐tc 姐b cd i v i d c di nt w og r o u pb y 也ea b i l i t yo f s a l t t o l e r a n t ： h a l o p h ”ea i l d 舀”o p h ”e t h cs a l t - t 0 1 e r 趾c ei sap h e n o t ) ，p er e g l l l a t e db ym u l t i p l eg e n e sa i l di s c o m p o s e do f m u l t i p l es a n t o l e m n tp h y s i o l o 画c a ld h a r a c t e r s t h en a v o n o i d sa r em u l 廿t u d i n o u sc o l 曲lc o m p o 眦da n df o l l n d 呈nl o t so fh e r b s f l a v o n o i d s a r e 、i d e l yu s e di nm e d i c i n ef o rt h e i r 锄t i o x i d a t i o 玛w h i c hi sm o s tv a l u a b l ei 1 1a p o p t o s i sa n d c a n c e rr c s e 盯c h t h en a v o n o i d si n 印口r f 加日p d 招，醛h a v e n tb e e nr 印o r t e db e f o r c i nt h i sd i s s e r t 撕0 n ，d d r t - p c rs d s p a g e ，r a c e ，n o 汕e r n - b l o ta 1 1 dh p l cw e r e 钮1 p l o y c dt os n l d yt h em 0 1 e c u l a ra l l dp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s mo fs a l t - t o l e r a n c ea n dt om e a s u r e t h ec o n t e n to fn a v o n o i d si n 点矽“胛口册招，掰 印删伽口脚招珊w e r et r e a t e di nt h r e es t r e s sc o n m t i o n ：2 n a c l ，5 0 衄。儿a b a a 1 1 dl5 p e g 6 0 0 0 t h et 咖lp m t e i n sw e r ee ) ( t r a c t e da n dt 1 1 e n 神m y s i sb ys d s p ：a g e u s i l l gs a sw e d i d 啦m s t i ca n a l y s i sw h ht h ed a t a ，矗n 出n go u t 也em o s tc o i 灯i b 咖ep r o t d n st os a l t - t o l 髓a n c ei n 跏砌埘朋把耐w jf o u n d f o l l rk i n d so fp r o t e i i l s ，w h i c hm w sw e r e3 6 k d ，3 8 5 k d ，3 9 5 如姐d 4 0 5 k d ，w e r ei n d u c e db ys a l t - s 舡e s sa l l dw e r er e l a t e dt os a l t - t 0 1 e 啪c e n e s ep r o t c i n sa 1 1 e v i a t e d 也eo s m o t i cs t r e s s ，硼1 i c hm c l u d e dt l l es h 舡pd e c r e 够eo fc h l o r o p h y l la n dt h ed i s t u r b a n c eo f 也e i o l l i cb a l a n c e 1 1 1 ep r o t e i no f3 9 5 k dw a ss p e c i f i ca n df i r s tt or 印o r t nc o n t r i b u t e dn e g a t i v e l yt o t 1 1 em e m b r a l l ep e 瑚e a b i l 时t h ec o m e n tc h a n g e so fo s m o t i cr e g l l l 砷。r ，s u c ha sp r 0 1 i n e ，b e t a i n e ， f i m c t a 工l ，a 1 1 dn a + 瓜+ ，w e r ed e t e c t e db yv a r i o u se x p e r i m e n t s n l ee n 巧m ea 鲥v i t i e so fs o da n d p o d 吼d e rs a l t - s t r e s sw e r em e a s u r e db yt i i l l e t h c s ep h y s i o l o g i c a ld a t as h o wn l es 出t - t o l e r a n t i n c c h a n i s mo f 印州加dp 口胞埘h l1 0 n g t i m 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a p t a b i l i 够 m r n ad i 肫r e n t i a ld i s p l a yw a s 翩n p l o y e dt oa i l a l y s i sm es a l t t o l e 啪tr e s p o n s i v eg e n ei n 5 旭f 门口p 口把玎sa d dm a n yu p r e g u l a t e d 趾dd o w n - r e g u i a t e dg e n ef a g m e m s 、v e r ev e r i f i e db y s e c o n dp c ra n dn 0 n h e m - b l o t w ef o u i l dag e n ef r a g n l e n th 7 0 7w e r es p e c i f i c a l l y 廿a n s c r i p t e di n l l i 曲s a l 协耐u s i n g5 a n d3 r a c e 也ef u l l1 c n g t ho f h 7 0 7w a sa c h i e v e d ，w h i c hw a s1 7 7 9 b pa i l d n 锄e ds a l t - s 廿e s sr e s p o n s i v eg e n e l ( s 玛1 ) ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o a y 4 9 4 0 8 4 ) t b eo r fo fs 培1 e n c o d e sap r o t e mo f3 7 5 a a ，w h i c hw a s4 1 6 k di nm w t h ec o n s e c d _ d o m a i n sa 芏l d3 d s t m c t l l r ea n a l y s i si n d i c a l e ds 唱1e n c o d e sas e r 1 n l rk i m s e l i k ep r o t e i l l ，w h i c hc o n t a i na l l1 1 c o n s e r v e ds u b d o m a i l l si ns e r 门r h rk i l l a s e l i k cp r o t c i n 触i l y p h y l o g e n e t i ca 1 1 a l y s i si n d i c a t e dm 砒 s r 9 1b e l o n g st 0m a p k 姆m a p k sp l a yr 0 1 ei nm u l 邱l es i g n a lpa _ c l l w a y s t h em a p 斑【k m a p k k m a p kp 拙w a yp a r t i c i p a t e di nak ) to fs n s ss i 髓a lp a t b 、v a y ss u c ha sd ms a l i m t y ， c o l d ，h o r n l o n ea dp a 也o g e n y s r 9 1w a sb e l i e v e dr e i a 士e di 1 1s a n s 订e s ss i g n a lp a 也w a y w ef l r s te x 仃a c t e ds e v e m ln a v o n o i d sc o m p o u n d s 丘o m 印邪咖口朋把n s t h ep o w e ro fd r y 5 i 加r f f 以dp a 把珊w e r ed i p p e di nb yd i f f b r e n ts o l v e n t ，s u c ha sw a t e r ，5 0 m e t h m o l ，5 0 e 1 a n o l a n d5 0 a c e t o n et ov “u e l ce m c i e n c ya f e ro p t i n l i z i n gm ec o n d n i o n s ，t 1 1 ep r o t o c o i i s e x t r a c t e db y7 0 e m a n o l ，r a t i oo fs 0 1 m e ：s o l v e n ti s1 ：2 5 ，t h e 血n ei s4 ha n dr e p e a tc i r c 、瑚f 1 1 】e n c e f o r1t i l n e 1 1 1 ee 加a c t e dn a v o n o 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e ；印州加口脚招瑚h a sc r o s s - a d 印t 撕o n b yd d r t - p c rw ed l s c o v e r e dan e ws a l t - s c r e s s v t 南开大学博士研究生毕业论文英文摘要 r e s p o n s i v eg e n e1 ( s 唱1 ) ，w h i c hb e l o n g st om a p ka n dm a yp l a yr 0 1 ei ns a l t - s t r e s ss i g n a lp 甜】w a yt h e s ed a t a w e r eh e l p f u lf o re x p l a n a t i o no fp l a n ts a i t - t o l e r a n tm e c h a l l i s m sa i l ds i g n a jp a t h w a y t h es t u d i e so n 跏一拥口 p 嘣p 邶b e n e 丘tn o to n l yt op l 柚tp h y s i 0 1 0 西c a lr e s e a r c h ，b u ta l s ot oe c o n o m y k e yw o r d s ：印洲船口p 日耙埘 s a l t t 0 1 e r a n t s i 弘a lp a t l l w a y n a v o n o i d v i i 第一章狐米草胁迫相关 蛋白的诱导分析 与耐盐机制的初步研究 南开大学博士研究生毕业论文第一章 ) 上 j l 日l 舌 盐碱化土壤是植物生长过程中经常遇到的自然逆境之一，该问题在滨海地区表现尤为 突出。据统计，全世界的盐土约占陆地面积的三分之一，在我国，盐碱地规模相当大，1 亿公顷耕地中约有5 3 7 4 万公顷盐渍化土壤，另外还有4 4 0 & 8 万公顷的盐碱荒地分布于西 北、华北、东北及沿海等地区。除了沿海地区的氯化钠盐土外，许多内陆的干旱、半干旱 地区因不适当灌溉也形成了大面积的次生盐渍化土壤。近年来，随着工农业的发展环境污 染加剧，淡水资源日益匮缺，海平面不断上升，陆地面积相对缩小，壤盐渍化有日益加 重的趋势。改良盐渍化土壤，扩大盐渍地区的绿地面积，在沿海城市及广大缺水地区己成 为一项迫在眉睫的任务。 一、逆境的概念 在自然界中，植物的一生并非总是生活在适宜的条件下，经常会遇到冷、热、旱、涝、 盐碱和大气污染等不良环境。对植物生存与生长不利的环境因子统称为逆境( s r e s s e n v i r o m e n t ) 。逆境的种类多种多样，包括物理的、化学的和生物因素等，这些因素之间 可以相互交叉相互影响( 李合生，2 0 0 2 ) 。任何一种使植物内部产生有害变化的环境因子 又称为胁迫( s 骶s s ) ，如水分胁迫、温度胁迫和盐碱胁迫等。当植物受到胁迫之后而产生 相应的变化成为胁变( s t r a i n ) 。胁变既可以表现为物理变化( 如原生质流动变慢或停止) 又可以表现为化学变化( 代谢方向或强度) 。胁变的程度有轻有重：程度轻而解除胁迫后 又能复原的胁变称为弹性胁变；程度重而解除胁迫后不能复原的胁变称为塑性胁变。如果 胁迫急剧或时间较久会导致植物死亡( 白宝璋等，1 9 9 4 ) 。 2 图l 植物抵御逆境的方式 南开大学博士研究生毕业论文第一章 f i 9 1t h em e a n so fp l a n ta g a i n s tt h es t l e s se n v i r o n m e n t 二、盐害对植物的影响 盐胁迫主要包括离子毒害和离子吸收不平衡即营养亏缺，盐胁迫使植物的生长受抑 制，光合下降，能耗增加，衰老加速，生长量降低，最终导致植株因饥饿而死亡。从能量 代谢的角度分析，盐分胁迫下植物生长量减少的原因有三个方面：一是光合作用降低，碳 同化减少；二是渗透调节物质的合成和积累消耗大量能量；三是维持渗透势是一个耗能的 过程( x uyl ，e t a l ，1 9 9 0 ) 。土壤盐分过多，特别是易溶解的盐类( 例如n a c l 、n a 2 c 0 3 和n a 2 s 0 4 等) 过多时，对大多数植物是有害的，主要表现于以下几个方面： 1 吸水困难 土壤盐分过多，降低土壤溶液的渗透势，植物吸水困难，不但使植物种子不能萌发或 延迟发芽，而且使生长着的植物不能吸水或吸水很少，形成生理干旱状态。 2 膜损伤 研究表明，质膜膜脂物理状态改变可能是植物感受渗透胁迫的原初响应( q i uq s ， e t a 1 ，1 9 9 9 ) ，细胞膜是逆境对植物伤害的原初位点，质膜的伤害尤为严重。进一步研究表 明，植物在盐逆境中细胞内自由基代谢的平衡被破坏，从而有利于自由基的产生，过剩自 由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时导致植物 细胞死亡( g r e e n w a yh ，e t a l ，1 9 8 0 ) 。质膜在受到盐分胁迫后发生一系列的胁变，它的组 分、透性、运输、离子流率等都会受到影响而发生变化，损害膜的正常功能，进而影响细 胞的代谢作用，使植物代谢过程发生胁变，细胞的生理功能受到不同程度的破坏。 2 1 离子毒害 一般植物不能在高盐度盐渍化土壤上正常生长的原因之一是高浓度n a + 对植物的毒害 作用。高浓度n a + 可置换质膜和细胞内膜系统所结合的c a j 2 + ，膜所结合的离子中n a c a 2 + 比增加，破坏膜结构完整性及膜功能，致使细胞内k + 、磷和有机溶质的外渗，细胞k + n a + 下降，抑制液泡膜h + p p a s e ( 焦磷酸酶) 活性和胞质中的h + 跨液泡膜运输，跨液泡膜运输 的p h 梯度下降，液泡碱化，不利于n a + 在液泡内积累，从而加速细胞的衰老和死亡( 章 文华，1 9 9 3 ；钱骅，1 9 9 5 ) 。 2 2 活性氧伤害 1 南开大学博士研究生毕业论文第一章 “活性氧”是泛指那些含有氧原子但较氧具有更活泼的化学反应的氧的某些代谢产物 及其衍生物。当植物细胞中的氧浓度处于最高水平时，叶绿体和线粒体电子传递中泄漏的 电子都可能与0 2 反应生成活性氧，如：超氧阴离子( 0 2 ) 、羟自由基( 一0 h ) 和过氧化氢 ( h 2 0 2 ) ，此外，在光下叶绿素分子可将其激发能传递给0 2 而生成另一种形式的活性氧 单线态氧( 0 2 ) 。由于活性氧具有很强的氧化能力，对许多生物功能分子具有破坏作用。 在植物细胞的正常代谢过程中产生的活性氧如果在体内积累，则会对自身造成毒害，所以 植物具有一些清除活性氧的机制，这包括酶促防御系统如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧 化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a s a p o d a s p ) 、谷胱甘肽 还原酶( g r ) 和非酶促防御系统如谷胱甘肽( g s h ) 、抗坏血酸( a s a ) 、类胡萝h 素( c a r ) 、 维生素e 等，他们可有效地清除活性氧。 在盐胁迫等逆境条件下，光能利用和同化受抑制，植物体内活性氧代谢系统的平衡受 到影响，增加活性氧如0 2 。、h 2 0 2 、o h 的产生量，破坏或降低上述活性氧清除剂的结构、 活性或含量水平。体内活性氧含量增高能启动膜脂过氧化或膜脂脱酯化。膜脂过氧化分解 和膜脂脱酯化必然导致膜的完整性被破坏，差别透性丧失，电解质及某些小分子有机物大 量渗漏，细胞物质交换平衡破坏，进而导致一系列生理生化代谢紊乱，使植物受到伤害。 3 生理紊乱 盐分过多会使植物光合作用下降、呼吸作用不稳并积累有毒物质。盐分过多还影响碳 水化合物、蛋白质和核酸的代谢，盐害不是直接伤害，而是间接伤害，是由某一种或几种 代谢混乱而引起的( 李合生，2 0 0 2 ) 。 3 1 光合下降、能耗增加 在含盐量为o 3 5 以上时，盐渍土中大量的可溶性盐可导致土壤水势及水分有效性的 显著降低，使作物立苗困难。高盐造成的植物叶片气孔失水关闭，以保持叶内相对较高的 水势，严重阻碍了c 0 2 进入叶肉细胞内，从而降低了植物的光合作用。研究表明，n a c l 短期处理下，菠菜光合降低以气孔限制为主，而在长期处理下光合的非气孔限制增大( 卢 元芳等，1 9 9 9 ) 。 植物在逆境下生长发育需要额外的能量消耗，包括有机渗透调节物质的合成、离子主 动吸收、区域化分配以及盐诱导的代谢变化所消耗的能量。 3 2 营养亏缺( 养分离子吸收不平衡) 4 南开大学博士研究生毕业论文第一章 盐胁迫下，植物在吸收矿物元素的过程中盐离子与各种营养元素相互竞争而造成矿质 营养胁迫，打破了植物体内的离子平衡，严重影晌植物正常生长。植物体内养分离子的不 平衡是植物盐害的重要方面。高浓度的n a + 严重阻碍了作物对k + 和c a 2 + 的吸收和运输。盐 胁迫下造成养分不平衡的另一方面在于c l 抑制植物对n 0 3 i 及h 2 p 0 4 。的吸收，其原因可能 是这些阴离子之间存在着吸收竞争性抑制作用。 3 3 氮素代谢异常，产生氨毒害 在上述广泛的生理紊乱中，有人认为盐害主要是氮代谢紊乱所引起的。以棉花幼苗为 材料实验得知，盐害使得新合成的蛋白质减少，而贮藏蛋白质的水解速度增加，所以，体 内积累了较多的游离氨基酸，同时使生长受阻。进一步的研究表明，盐害对植物造成的影 响主要是氮素积累过多，比如在轻度盐渍土上生长的棉花，其叶片的氮含量是正常的两倍， 在重盐渍土上则为十倍。盐分过多促使蚕豆植株积累腐胺( p m r e s c i n e ，一种二元胺) 。腐 胺在二胺氧化酶( d i a m i n e0 x i d a s e ) 催化下脱胺，植株含氨量就增加，所以产生盐害( 潘 瑞炽等，1 9 8 5 ) 。 4 盐胁迫与植物的生长发育 盐度对植物的影响是一个很复杂的过程，通常盐度对植物的影响表现为渗透胁迫和离 子胁迫( g r e e n w a yh ，e t ，a 1 ，1 9 8 0 ) 。在适中浓度下，盐度的效应主要是渗透效应( m 1 m n sr ， c t a l ，1 9 8 6 ) 。在整株水平上，离子在植物体内增加是盐胁迫效应。植物对渗透和离子胁迫 的直观表现主要就是生长受抑，如：生长速度下降，幼苗的分生组织破坏，产量下降以及 营养失调等( z e n gl i n 舀1 e ，e t a 1 ，2 0 0 0 ) 。当植物被转移到盐逆境中几分钟后生长速度即有 所下降，其下降程度与根际渗透压呈正比，当胁迫解除时，生长立即恢复( m 咖sr ，e t a 1 ， 1 9 8 6 ) 。从生理生化角度可归结为3 个原因：( 1 ) 碳同化减少，( 2 ) 渗透耗能，( 3 ) 维持 能耗。大麦盐敏感品种( 李磊等，1 9 9 8 ) 在胁迫下根系活力变幅较大，生长速率明显下降。 羊革( 石德成等，1 9 9 8 ) 相对生长率随盐浓度增加而下降。在短期盐胁迫中，大麦叶片叶 绿素和叶绿体膜蛋白含量下降，气孔导度下降，在较长期盐胁迫下，叶肉导度和光合面积 下降是植物生长受抑的主要原因，叶肉阻力增加原因主要是离子浓度增加。盐胁追下叶片 中n a + 、c l 。浓度过高，虽然k + 、c a 2 + 含量下降，但阳离子总量明显升高。c l 浓度与光合抑 制相关关系r 2 = o 。9 2 6 ，因而减少盐离子特别是c r 在光合细胞中积累，有利于提高植物耐 盐性( 余叔文等，1 9 9 8 ) 。m 吼i l s r 等( 1 9 9 3 ) 认为，在长期盐胁迫下，植物生长抑制并不 是因为积累盐类从而降低光合作用或抑制某些酶活性造成的，而是成熟叶吸收并积累盐类 5 南开大学博士研究生毕业论文第一章 加速其死亡，而这些叶片的死亡使生长叶光合产物和激素的供应降低，从而导致生长抑制。 叶绿体是光合作用的主要部位，因此，盐胁迫下叶绿体的离子平衡，对于保持叶绿体 的光合作用是十分重要的。近年来，陆续报道一些耐盐植物如菠菜、甜菜、豌豆、大麦、 碱蓬和冰叶日中花等的叶绿体对盐离子具有高度的调节能力。在正常条件下，这些植物的 叶绿体所含有的n 矿、c r 浓度较整个叶片中的n r 、c 1 。浓度要高一些，即积累离子，但在 盐胁迫下，叶绿体内的n a + 、c l 浓度要比叶片中的浓度低很多，即排斥离子( 马立田，1 9 9 8 ) 。 盐抑制种子萌发的主要原因是降低水解酶，特别是c 【淀粉酶活性( 章文华，1 9 9 3 ) 。叶 淀粉酶是含c a 2 + 的金属蛋白，在糊粉层细胞租糙型内质网中合成，经高尔基体向胞外分泌。 酶的活化至少需结合一个c a 2 + 离子，c a 2 + 结合到酶上后明显改变了酶的三级结构。g a 促 进细胞对c a 2 + 的吸收，提高细胞质中c a 2 + 的浓度，并活化定位于内质网的c a 2 + a t p a s e 。 增加钙调素( c a m ) 水平，促进细胞质中c a 2 + 向内质网中运输。盐胁迫下作物种子a 一淀粉 酶活性可作为区别植物耐盐性的重要依据之一。外源c a 2 + 和g a 可增加种子中k + 积累，减 少n a + ，提高a 淀粉酶活性，缓解盐抑制种子萌发的效应( 章文华，1 9 9 3 ) 。 三、耐盐机理研究 1 耐盐植物分类： 根据植物对土壤盐分的适应能力，可把植物分为盐生植物( h a j o p h y t e ) 和甜土植物 ( g 1 y c o p h y t e ) 。在同一种植物的不同生育期，对盐分的敏感性也不同，种子萌发及幼苗时 很敏感，长大以后能逐渐忍受，开花期耐受力又下降。 植物抗盐的方式主要有避盐( s a l t a v o i d a n c e ) 和耐盐( s a l t t 0 1 e r a i l c e ) 两种。 1 1 避盐植物类型：指植物通过降低盐分在体内的积累来躲避盐害的发生。 ( 1 ) 泌盐植物( 排盐植物) ：植物吸收了盐分，但并不在体内积存而是通过特异机构 ( 盐腺和盐毛等) 主动地排泄到茎叶表面，而后冲刷脱落。这是盐生植物最常用的形式， 如柽柳( 豫m 甜扛_ s 肆) 、匙叶草( 口r f c p 鼢) 、碱茅( p “c c 胁p ? f 缸积幼耐( l ) p a r l ) 及狐米 草( 印甜砌阳招珊) 等，通过主动的大量的分泌盐分，防止体内过量的n r 、k ，、c l 等离 子的积存。 ( 2 ) 稀盐植物：通过大量吸水而把盐分稀释，降低盐分浓度而减少毒害。如藜科的 肉质化盐生植物就是这种类型，其生长速度多较快。 南开大学博士研究生毕业论文 第章 ( 3 ) 拒盐植物：这类植物对盐离子的通透性很低，通过细胞质膜的调节“拒绝”一 部分盐离子进入细胞，在一定盐浓度的土壤中，根系可主动不吸或少吸盐，如大麦和某些 牧草。植物拒盐主要是通过增加对二价离子( c a 2 + 为主) 吸收，减少一价离子( n a + 、k + 、 c l 。等) 的吸收来达到降低盐含量的目的。生产中多以钙盐浸种，可以提高植物的抗盐性。 1 2 耐盐植物类型：指植物通过生理或代谢的调节进行适应、忍受已进入细胞的盐分， 这种能力在提高植物抗盐性方面有着重要的意义。 ( 1 ) 聚盐植物：这类植物通过细胞的渗透调节作用把吸收的赫离子积累在液泡中， 并使之不再扩散出来，逐渐转化为无害物质，从而降低细胞的内水势防止细胞脱水，保证 植物的正常生长。这类植物多称为真盐生植物，其茎叶多肥厚，如盐角草、碱蓬等。某些 作物( 如小麦、黑麦等) 也具有这样的能力。 ( 2 ) 中生植物( 消盐植物) ：植物通过代谢产物与盐类结合，消除或减少盐离子对原 生质的破坏作用。许多中生植物均具有这种能力，在其细胞中发现广泛存在着能与盐离子 结合的清蛋白，通过其与盐离子结合，可有效的避免盐离子使原生质产生凝固。有些植物 还能形成大量的有机酸排出根外去中和根系周围的碱离子，降低危害。耐盐植物往往具有 一些盐应对酶系，盐胁迫发生时，该类酶系得到激活，特别是具有了水解酶活性，增加渗 透调节物质，提高植物耐盐能力。 2 植物耐盐机理 2 1 渗透调节 渗透调节能力是植物耐盐的最基本特征之一。与耐旱性不同，参与盐渍中植物渗透调 节过程的渗透调节物质基本上分为两大类，一是外界环境进入植物细胞内的无机离子，如 微生物和盐生植物中的k 和c r ，高等甜土植物的有机酸钾；二是在细胞内合成的有机溶 质。有机和无机渗透调节物质在植物对盐胁迫的适应中都有重要作用( h a l lj l ，e t a 1 ，1 9 7 8 ； z h a ok f ，e t a l ，1 9 9 3 ) 。虽然从能量消耗的角度看，积累有机溶质需要多消耗几十倍的能 量，但作为“亲和性溶质”，对于植物生存是必须的。植物受到渗透胁迫造成的不平衡， 通常在细胞内积累渗透保护物质( o s m o 口r o t e c t a i l t ) 以降低细胞的渗透势，由于它们不干扰 细胞内正常的生化反应，因此，将它们统称为相容性溶质( c o m p a t i b l es o l u t e ) ( b o l n e r t l j ， e t a 1 ，1 9 9 5 ) 。有机渗透调节物质大致可分为三类，即氨基酸及其衍生物( 如甘氨酸甜菜碱、 脯氨酸、甘氨酸、p 丙氨酸、t 氨基丁酸、苏氨酸等) 、糖类及其衍生物( 如山梨糖醇、甘 7 南开大学博士研究生毕业论文第一章 油、甘露糖醇、赤藓糖苷、异赤藓糖苷等) 和叔硫酰化合物( 如d 二甲基硫代丙酸) 。人 们设想利用分子生物学方法，改变甜土植物的代谢途径，诱导相容性溶质的生物合成，从 而提高非盐生植物抵御渗透胁迫的能力。 高盐环境下植物细胞中常积累一些小分子有机物如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等和多种无 机盐离子，以维持较高细胞质渗透压，便于植物在高盐条件下对水分的吸收。 2 1 1 脯氨酸 脯氨酸是植物对盐碱胁迫反应敏感的胁变指标，盐胁迫下脯氨酸含量升高。脯氨酸生 物合成速度受双功能酶p 5 c s ( i 二氢毗咯5 ，羧酸合成酶) 控制。s 嘶z h o vn 等( 1 9 9 7 ) 研究发现拟南芥( 爿阳6 耐劫s 捃腩f f 口n ) 中p 5 c s 是由调节基因a t p 5 c s l 和a t p 5 c s 2 编码 的，其中a t p 5 c s 2 在细胞分裂中负责合成p 5 c sm r n a ，在盐处理幼苗中p