（遗传学专业论文）螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究.pdf

i i ；。靴 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：农铸痰签字日期：加肜年_ 6 月干日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社 用于出版和编入c n k i 0 卜 ： j ： 卜 ：j ： i ， o n m 0 j ”_ - ：6 1 0 6 2 06 3 06 4 06 5 06 ? 6 7 06 -。，” ” ”1 一 ： + j j 。一：j 囊0 。0 乏匦坐旦受塑( 堡妇| ，j ? 0 一。 ? ，一t _ ，“j“、，l。j ”t ：。 图2 4 细胞上清液的荧光光谱 f i g 2 - 4 f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r ao f t h es u p e m a t a n to f t h eb r o k e ne c o l ic e l l s ( 1 ) a e f ：( 2 ) a ：( 3 ) e c o l i b l 2 l 3 讨论 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑三大 因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件，以获得最满意的表达效果。 本实验使用的表达载体分别是p e t - 2 4 a ( + ) 和双克隆载体p a c y c d u e t - 1 ，这 两个载体启动子均为t 7 1 a e 启动子，具有不同的抗生素标记和能够相互协调的 复制子，可以在宿主菌中共同表达。p a c y c d u e t 1 其中具有两个多克隆位点， 这两个位点具有相互独立的蛋白表达起始子和终止子。目的基因受噬菌体t 7 启 动子转录及翻译信号控制。强大的t 7 启动子完全专一受控于t 7 r n a 聚合酶， 而高活性的t 7r n a 聚合酶合成m r n a 的速度比大肠杆菌r n a 聚合酶快5 倍， 当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过t 7 表达系统，几乎所有的细 胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞 总蛋白的5 0 以上，保证了克隆的所有基因的快速高效表达。另一方面，非诱导 条件下，该表达系统可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，这有助于避免 i t , 重组菌生长前期高表达对菌体生长的影响，使菌体在诱导前充分生长，提高收获 螺旋藻藻蓝蛋白的白催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 时的生物量，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。 作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响。如果菌株内源 的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株 往往成为理想的起始表达菌株。本实验选用b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株，该菌株可用于高效 表达克隆于含有噬菌体t 7 启动子的表达载体的基因。 通过添加诱导剂来控制目的基因的表达目前是在大肠杆菌中克隆表达重组 蛋白的常用策略，可将表达过程分成目的蛋白表达前期和表达期两个阶段，使得 细胞资源不会过早地应用于外源基因的表达，兼顾到菌体生长和目的蛋白表达两 方面的要求。受半乳糖调节的l a e 及其衍生启动子是大肠杆菌表达系统中常见的 表达调控元件，i p t g 作为一种半乳糖类似物，是该类启动子最常用和高效的诱 导剂。在准备诱导之前，菌体正处在对数生长期，如果不改变原有培养条件而加 入诱导剂，则几乎所有细胞资源都用于表达目的蛋白，会产生许多错误折叠的非 活性蛋白，因而需要先调整环境条件，降低培养温度，再进行诱导；另外大肠杆 菌的各项生理活动都是在各种酶的催化作用下进行的，诱导温度过低也不利于菌 体生长和产物合成，经过对实验条件的摸索，最终确定在2 8 c 进行诱导。 本实验克隆了在大肠杆菌体内表达出有荧光活性的螺旋藻藻蓝蛋白a 亚基所 需要用到5 个基因：藻蓝蛋白a 亚基基因c p c a ，裂合酶基因c p c e f c l c p c f ，亚铁血红 素氧化酶基因h o x l 和铁氧蛋白氧化还原酶基因p c y a 。将h o x l f t 毒l p c y a 连接到载体 p e t - 2 4 a ( + ) 上得到载体p e t - h o x l - p c y a ，将c p c a 连接至1 p a c y c d u e t - 1 的第一个表达 框中得到载体p a c y c d u e t c p c a ，将c p c e 、c p c f 错f ：接到载体p a c y c d u e t c p c a 的第 二个表达框中得到载体p a c y c d u e t c p c a c p c e - c p c f 。p c r 电泳结果以及最后的测 序证明了三个表达载体在d n a 水平上正确的。最后通过电击法共转化得到两个 表达菌株：表达菌株a ( p a c y c d u e t - c p c a 及p e t - h o x l - p c y a ) 和表达菌株a e f ( p a c y c d u e t - c p c a - c p c e - c p 诹p e t - h o x l - p c y a ) 。 重组实验结果表明，表达菌株a e f 表达出了有荧光活性的藻蓝蛋白，菌体颜 色呈现蓝色，证实在螺旋藻裂合酶c p c e 和c p c f 的催化下得到了具有荧光活性的 螺旋藻藻蓝蛋白a 亚基。同时我们也发现无裂合酶催化的表达菌株a 的菌体也呈 现一定的蓝绿色，但是颜色比较淡。s d s p a g e 电泳结果两个菌株均表达了目的 蛋白，而且从图谱上看，表达菌株a 所表达出的蛋白量比表达菌株a e f 的多； 白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 w e s t e r nb l o t t i n g 检测结果表明两个菌株表达出的a 亚基与天然的藻蓝蛋白具有相 同的抗原性。这些结果我们推测表达菌株a 也表达了有荧光活性的藻蓝蛋白。 在以往研究中提到藻蓝蛋白a 亚基具有自催化作用，但是a - 8 4 的自发连接却 缺乏特异性，底物p c b 在自发连接过程中多数已经被氧化成18 1 ，1 8 2 二氢胆绿素 ( a r c i e r odm ，e ta l ，1 9 8 8 ) 。但是陈芳等( 2 0 0 6 ) 在进行鱼腥藻p c c 7 1 2 0 藻蓝蛋 白伍亚基体内重组研究时，发现没有裂合酶催化的表达体系与有裂合酶催化的表 达体系相比产生了0 2 的有光学活性的藻蓝蛋白。 荧光光谱分析结果显示，在5 9 0 n m 的激发波长下，表达菌株a 和a e f 的荧光 发射峰一致，均在6 3 8 n m 左右，这说明两个表达菌株都表达了有荧光活性的藻蓝 蛋白，表达菌株a 表达的藻蓝蛋白在a 亚基上结合的色基与有裂合酶催化的表达 菌株a e f 的一样，都是藻蓝胆素p c b 。但是表达菌株a 荧光强度( 6 6 3 7 ) 远远低 于表达菌株a e f ( 1 9 2 6 ) ，而且从s d s p a g e 电泳结果显示表达菌株a 所表达的藻 蓝蛋白旺亚基的量多于表达菌株a e f 的，虽然本实验没有从荧光激发光谱计算表 达菌株a 的自催化比例，但上述结果可以证明藻蓝蛋白a 亚基有一定的自催化作 用，在无裂合酶c p c e 和c p c f 的存在下，也能合成有光学活性的螺旋藻藻蓝蛋白q 亚基，但是自催化能力比较低，这同时也证明螺旋藻藻蓝蛋白a 亚基与其色基结 合主要依赖于裂合酶c p c e 和c p c f 的催化作用。 g u a n 等人( 2 0 0 7 ) 利用一个载体的多基因组合生物表达，证明s y n e c h o c y s t i s s p p c c 6 8 0 3 裂合酶c p c e 和c p c f 可以催化螺旋藻a 亚基与色基的结合。本实验证实 了螺旋藻的裂合酶c p c e 和c p c f 在催化螺旋藻藻蓝蛋白仅亚基与色基结合中的作 用，迸一步充实了人工合成有荧光活性螺旋藻藻蓝蛋白的途径。 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 第三章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白p 亚基在大肠杆菌中的重组表 达及其分析 藻蓝蛋白的p 亚基各在其8 2 位和1 5 3 位的半胱氨酸残基处通过硫醚键共价结 合了一个藻蓝胆素p c b 。相比较藻蓝蛋白a 亚基的裂合酶c p c 脚f 的发现，藻蓝 蛋白p 亚基的裂合酶发现较晚，现在已有一系列相关酶陆续被发现。 j o h n 等( 2 0 0 2 ) 在研究肌m y e ad i p l o s i p h o n 的操纵子过程中，推测c 硝可能是 藻胆素与脱辅基蛋白结合的裂合酶。s h e n 等( 2 0 0 6 ) 通过同源性分析在聚球藻7 0 0 2 中发现了一个与c p e t 碾 源性较高的基区l c p c t ，进一步研究发现c p c t 能够催化p c b 与藻蓝蛋白1 3 - 1 5 5 位半胱氨酸的连接。关翔宇( 2 0 0 8 ) 通过同源性分析在 s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 中发现了与s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 0 0 2 同源的基因 s l r l 6 4 9 ，并证实其能够催化螺旋藻藻蓝蛋白d 1 5 3 位与p c b 的连接。 z h a o 等通过同源性分析证实7 盔a n a b a e n as p p c c7 12 0d p 与基因c p e t 同源的基 因c p e s ( a i r 0 6 1 7 ) ，它的表达产物c p e s 能够催化藻蓝蛋白8 4 位半胱氨酸与p c b 的连接。关翔宇( 2 0 0 8 ) 通过将c p e s 的基因序列在s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 基 因组中进行b l a s t p 中得到具有高度同源性的基因序列s l r 2 0 4 9 ( c p c s ) ，并证实 c p c s 能够催化螺旋藻藻蓝蛋白p 亚基8 2 位半胱氨酸与c p e b 的连接。 s h e n 等( 2 0 0 8 ) 在s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 0 0 2 通过同源性分析发现了与 f r e m y e l l a 由加垂炳d 以的印岱同源的基l 玉t c p c s - i 、c p c u ；f i d c p e v ，并通过构建三者的 突变株，c p e v 并不是色基裂合酶，而印c l 和印c 噻因的产物c p c s l 和c p c u 作 为异源二聚体一起发挥作用，催化p c b 与藻蓝蛋白p c y s 8 4 位的共价结合形成有 光学活性的藻蓝蛋白。这一结果与z h a o 等人关于c p e s 和关翔宇等a 关于c p c s 单 独具有的催化作用不同，推测可能在a 万口6 口p 加s p p c c7 1 2 0 和s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 中，c p e s 和c p c s 分别作为同源二聚体发挥作用。 为了探索螺旋藻藻蓝蛋白p 亚基合成的分子机理，本实验将上述发现的裂合 酶c p e t 、c p c s ( 6 8 0 3 ) 、c p c u 、c p e s ( 7 0 0 2 ) 分别用来催化p 亚基与p c b 的结合，比 较了它们的催化效果，从而为在水稻中构建最佳的表达载体提供依据。 1 材料和方法 1 1 藻种、表达载体、菌株以及生化试剂 3 7 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 种s p i r l z l i n a p l a t e n s i s f a c h b 3 1 4 、s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 、s y n e c h o c o c c u s s p p c c7 0 0 2 以及菌株e c o l id h 5 a 、e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 为本实验室所保存，表达 载体p a c y c d u c t 一1 购自n o v a g e n 公司、p e t 2 4 + ) 由池振明教授惠赠。生化试 剂详见第二章1 3 。 1 2 常用溶液的配置 1 2 1 培养基 1 2 1 1a + 培养基 a + 培养基 成分浓度( g l )成分浓度( g l ) n a c l1 8 o o c a c l 2 0 2 7 n a n 0 3 1 0 0 f e c l 3 。6 h 2 0 3 8 9 x 1 0 3 n a - e d t ao 0 3k c l0 6 0 m g s 0 4 7 h 2 0 5 o o n a 2 c 0 3 o 0 2 k h 2 p 0 4 0 0 5 t r i s h c i ( p h 8 2 ) 1 0 0 10 0 0 x 微量元素a 5l m lv i t a m i nb 1 24 x l 矿 微量元素a 5 成分浓度( m g l )成分 浓度( r a g l ) z n s 0 4 7 h 2 0 o 2 2 h 3 8 0 3 2 8 6 c u s 0 4 5 h 2 0 o 1 m n c l 2 4 h 2 0 1 8 1 n a 2 m 0 0 4 。2 h 2 0 o 3 9 c o ( n 0 3 ) 2 6 h 2 0 o 0 5 1 2 1 2 其它培养基 z a r r o u k 培养基、b g 1 l 培养基以及l b 培养基详见第二章1 4 1 。 1 2 2 其它溶液 基因组提取相关溶液、抗生素及诱导剂母液详见第二章1 4 2 与1 4 3 。 1 3 实验方法 1 3 1 表达载体的构建 3 8 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 以s p z r , t i n ap l a t e n s i sf a c h b 3 1 4 基因组d n a 为模板克隆基因c p c b ，以 s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 基因组d n a 为模板克隆基因c p c s ( 6 8 0 3 ) ，以 s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 基因组d n a 为模板克隆基因c p c u 、c p c s ( 7 0 0 2 ) 、c p c t 。 将c p c b 连接到p a c y c d u e t - 1 的第一个表达框中得到载体p a c y c d u e t - c p c b ，分 别将c p c s ( 6 8 0 3 ) 、c p c u 、c p c s ( 7 0 0 2 ) 、c p c u + c p c s ( 7 0 0 2 ) 、c p c t 连接到载体 p a c y c d u e t - c p c b 的第二个表达框中得到载体p a c y c d u e t - c p c b - c p c s ( 6 8 0 3 ) 、 p a c y c d u e t - c p c b c p c u , p a c y c d u e t - c p c b - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、p a c y c d u e t 吒p c b c p c u - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c t 。 表达载体p e t - h o x l - p c y a 由第二章中构建。 1 3 1 1 藻丝的培养和收集 s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 品系在a + 培养基中于2 5 1 2 下培养，光照周期为 1 2 l 1 2 d ，光照强度为4 0 u m 0 1 m - 2 s 一，5 - 6 天后生长至对数生长后期 ( o d 5 6 0 = 0 8 1 o ) ，7 0 0 0 r p m m i n 离心收集藻丝，备用。 1 3 1 2 基因组d n a 的提取 s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 基因组d n a 的提取方法详见第二章1 5 1 2 。 1 3 1 3 目的片段的制备 1 3 1 3 1 引物设计 从美国国立生物信息中心( n c b i ) 数据库t h t t p ：w w w n c b i n l m r f o a g o v o 获取 s p i r l d i n ap l a t e n s i s 的c p c b 基因的序列“d q 4 0 6 6 7 1 1 ”，序列长为5 1 9 b p ，获取 s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 的s i r 2 0 4 9 ( c p c s ) 基因的序列“b l a d 0 0 0 2 2 2 ”，序列长为 5 7 9 b p ，获取s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 的c p c u c p c s ( 7 0 0 2 ) 、唧瑾因的序列 e u l 4 5 7 3 2 1 ，“e l l l 4 5 7 3 1 1 ”、“e u 3 6 4 7 7 0 1 ”，序列长分别为5 5 2 b p 、5 9 7 b p 、 6 0 0 b p ，由此设计引物，见表3 1 。 表3 1 扩增各基因片段所需的引物信息 t a b 3 1d n a s e q u e n c eo f p r i m e r so f u s e dt h r o u g h o u tt h ep r o c e d u r e s 基因引物引物序列酶切位点 c p c b - 1 c g c g g 刀c c g a t g t t t g a t g c c t t c a c cb a m h i c p c b c p c b - 2 a c g g c 刀c r l 钢r r i a g g aaa c t g c t g c a g c a g cs a e l c p c s ( ( 1 ，、，1 门j ，l 竹个 n 几 ，、 个 个 ，、，、a 个一门 nn 一11 1 3 9 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 c t n g c g g a t g c c 7 0 0 2 ) c c g c 刀0 酬g c t a t c a c t a c c a a c c g c t a a t a g c p c s - 2 x h o i c g t a a a g a g g a a g 么陀7 1 a a g g a g a t a t a c c a t g g a t g c c p c s - 3a g l i i c p c s ( a a t g g a a t t c t t t c g c 6 8 0 3 ) c c g c 刃删g c t a t c a c t a c c a g c c a c a a a a t t c p c s - 4 x h o l g t t c g a c g g aa 订c c 么脚g g a l 气：r c a a t g c c t t i a r c c p c u - 1 n d e l ， c a t c c p c u c g g a a g 4 粥丌c a c m 帆g t t a c t g g c l l a g c p c u - 2b g i i i c g g a c g g aa r r c c 么刚粥a t g t c c c a c t c t a c c g a t c p c t - i n d e l g c c c c p c t c g g a 彳g 么陀丌c a c 丑钢_ i a a t g g g a r r g aa c t t c p c t - 2b g l i i c c c c a g 1 3 1 3 2 聚合酶链式反应( p c r ) 扩增基因片段 各基因扩增的反应体系除了模板，其他与第二章1 5 1 3 2 基因c p c a 的反应 体系相同。基因c p c b 的模板是s p i r # l i n a p l a t e n s i s f a c h b 3 1 4 基因组d n a ，基因 c p c u , c p c s ( 7 0 0 2 ) 、c p c t 的模板是s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 ，基因c p c s ( 6 8 0 3 ) 的模板是s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 基因组d n a 。各基因的反应条件如表3 - 2 。 表3 2 各基因片段的p c r 反应条件 t a b 2 - 2t h ep c rc o n d i t i o i l s 基因反应条件 c p c b9 4 预变性5 m i r a3 0 x ( 9 4 5 0 s ，5 9 5 0 s ，7 2 5 0 s ) 7 2 8 m i n c p c s ( 7 0 0 2 )9 4 预变性5 m i n ；3 0 x ( 9 4 5 0 s ，6 2 3 5 0 s ，7 2 5 0 s ) 7 2 8 i i l i n c p c s ( 6 8 0 3 )9 4 c 预变性5 m i n ；3 0 x ( 9 4 。c 5 0 s ，6 0 8 c 5 0 s ，7 2 c 5 0 s ) 7 2 8 m i n c p c u9 4 预变性5 m i n ；3 0 x ( 9 4 4 c 5 0 s ，6 0 8 5 0 s ，7 2 。c 5 0 s ) 7 2 8 m i n c p c t9 4 c 预变性5 m i n ：3 0 x ( 9 4 。c 5 0 s ，6 0 5 0 s ，7 2 5 0 s ) 7 2 8 m i n 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 1 3 1 3 3p c r 产物的回收 参照第二章1 5 1 - 3 3 。 1 3 1 4p c r 产物与载体的连接 参照第二章1 5 1 4 的方法，构建重组载体p m d l 8 t e p c s ( 7 0 0 2 ) ， p m d l8 t - c p c b ，p m d i8 t - c p c s ( 6 8 0 3 ) ，p m d l8 t - c p c u , p m d l8 t c p c t 1 3 1 5 感受态细胞的制备 参照第二章1 5 1 5 。 1 3 1 6 连接产物的转化、阳性克隆的筛选及鉴定 参照第二章1 5 1 6 1 3 1 7 目标质粒的制备 1 3 1 7 1 质粒提取 分别将含有重组质粒p m d l 8 t - c p c s ( 7 0 0 2 ) ，p m d i8 t - c p c s ( 6 8 0 3 ) ， p m d l 8 t - c p c b ，p m d l 8 t c p c u ，p m d l 8 t c p c t 以及载体p a c y c d u e t 1 的甘油茵 接种于5 m l l b 培养基中，3 7 ( 2 振摇培养过夜。 按照质粒提取试剂盒的说明书进行操作，提取完毕后，进行琼脂糖凝胶电 泳检测。 1 3 1 7 2 各个目标质粒的制备 按照第二章1 5 1 7 2 表达载体p a c y c d u e t - c p c a 的制备方法，制备表达载体。各 表达载体的质粒图谱如图3 1 ，酶切位点示意图如图3 2 ，酶切体系( 2 0 m ) 如表 3 - 3 。 表3 3 酶切体系 t a b 3 - 3t h es y s t e mo fd o u b l ed i g e s t i o n 编号编号编号 d d h 2 0 1 2 山d d h 2 01 1 m d d h 2 0 1 1 肛l 1 0 x kb u f f e r l m 1 0 x hb u f f e r 2 山 1 0 x hb u f f e r 2 p l 质粒d n a5 m质粒d n a 5 山质粒d n a5 1 x l b a m h i 1 m n d e i l l x la g i i il l x l s a c i 1 山 b g l l i 1 1 t l x h o l l 山 各编号对应的质粒如下：o ) p m d l8 t - c p c b ，( 勘p a c y c d u e t - 1 ，( 鄙a c y c d u e t - c p c b ， p m d l 8 t - c p c u ，p m d l 8 t - c p c t ，p m d l 8 t - c p c s ( 7 0 0 2 ) ，p m d l 8 t - c p c s ( 6 8 0 3 ) ， p a c y c d u e t c p c b - c p c u 。 图3 - 1 表达载体质粒图谱 f i g 3 1t h em a p o fv e r t o r 4 2 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 b a r n h is a c i 叮印c b b a m h i ( 3 r c p 国 b a r n h i 旰c p 国 b a r n h i s a c i n d e i s a d b g li i x i - i o l s a d b g l l l x h o l ( 5 p c b _ tc p 弘t c p c s ( 7 0 0 2 r b a m h i ( 6 下c p c b b a r n h i n d e i s a c ln d e l 图3 - 2 各表达载体的酶切位点示意图 f i g 3 - 2t h ed i g e s t i o ns i t e so fe x p r e s s i o nv e c t o r s x h o i ( 5 ) p a c y c d u e t - c p c b - c p c u - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、( 6 ) p a c y c d u e t - c p c b - c p c t 1 3 2 表达菌株的构建 将1 3 1 7 制备的六个表达载体分别与表达载体p e t - h o x l - p c y a j 葱过电击法共 转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，得到表达菌株，各菌株具体信息见表3 4 。 表3 - 4 表达菌株相关信息 t a b 3 - 4i n f o r m a t i o no ft h ee x p r s s i o ne c o l is t r a i n s 序号表达菌株名称表达载体 b p a c y c d u e t - c p c bp e t - h o x l - p c y a b u p a c y c d u e t c p c b - c p c up e t - h o x l - p c y a b s ( 7 0 0 2 ) p a c y c d u e t - c p c b c p c s ( 7 0 0 2 )p e t - h o x l - p c y a b s ( 6 8 0 3 ) p a c y c d u e t - c p c b c p c s ( 6 8 0 3 、)p e t - h o x l - p c y a b u s ( 7 0 0 2 ) p a c y c d u c t c p c b c p c u - c p c s ( 7 0 0 2 )p e t - h o x l - p c y a b t p a c y c d u e t - c p c b c p c tp e t - h o x l - p c y a 4 3 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 1 3 2 1 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 方法参照第二章1 5 2 1 1 3 2 2 质粒提取与纯化 分别将含有表达载体p a c y c d u e t c p c b 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c u 、 p a c y c d u e t - c p c b - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c s ( 6 8 0 3 ) 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c u - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c t 的甘油菌接种于5 m l l b 培养基中，3 7 振摇培养过夜。 按照质粒提取试剂盒的说明书进行操作，最后一步用灭菌的超纯水洗脱。 提取完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。 1 3 2 3 质粒的电转化、阳性克隆的筛选及鉴定 方法参照第二章1 5 2 2 。 1 3 3 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 方法参照第二章1 5 - 3 。 1 3 4 重组蛋白的表达检测 方法参照第二章1 5 3 1 和1 5 3 2 。 2 结果与分析 2 1 表达载体的构建 2 1 1 重组子的p c r 检测 表达菌株构建过程中盼重组子均是由p c r 检测筛选阳性克隆，通过比较电泳 结果中基因片段的大小，确定重组子构建的成功。以号表达菌株b t 的构建为 例，通过酶切克隆载体p m d l 8 t - c p c b 与p m d l 8 t - c p c t , 分别c p c b 和c p c t 基因片段， 其在电泳图谱中的位置与实际大小一致( 如图3 3 ) 。通过p c r 检测表达菌株b t 的c p c b 、c p c t 和h o x l 基因，电泳结果发现这三个基因均扩增得到，证明两个表达 载体p a c y c d u e t - c p c b - c p c t 和p e t - h o x l - p c y a 均已成功转入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中( 如图3 4 ) 。 2 1 2 测序验证 对五个克隆载体的测序结果进行分析证实所扩增的五个基因片段的序列无 误。而后面的表达载体的测序结果进一步证明所构建的表达载体均含有相应的基 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 因，且位于正确的阅读框内。 1 虱3 - 3 p m d l 8 1 匐粥8 与p m d l 脚确酶切检测图谱 f i g 3 - 3e n z y m a t i cc l e a v a g e 粕a l y s i so fp m d l8 t - c p c b a n dp m d i8 t - c p c t 1 、4 t r a n sd n am a k e ri i ：2 、3 b a m h l s a c l 双切p m d l8 t - c p c b ；5 、6 n d e l b g li i 双切 p m d l8 t - c p c t 图3 _ 4 表达菌株b t 的p c r 检测电泳图 f i g 3 - 4a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so f p c rp r o d u c t e so f b t 1 t r a n sd n am a k a r l l ；2 c p c b ；3 c p c t l4 h o x l 2 2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 经i p t g 诱导后，空白的大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 没有没有产生任何颜色的改变， 而所有的表达菌株均出现了不同的颜色变化。表达菌株b 和b u s ( 7 0 0 2 ) 的蓝色 最深，说明这两个菌株表达了大量的有荧光活性的藻蓝蛋白p 亚基( 如图3 5 ) 。 4 5 图3 5 经诱导后不同的表达菌株呈现不同程度的蓝绿色 f i g 3 5t h ed i f f e r e n te c o l ic e l l sa p p e a r sd i f f e r e n tb l u e - g r e e nc o l o r sa f t e ri n d u c e d o e c o l ib l 2 1 ；1 b ；2 b u ) 3 b s ( 7 0 0 2 ) ：5 b u s ( 7 0 0 2 ) ； 图3 - 6 经诱导后不同的表达菌株呈现不同程度的蓝绿色 f i g 3 石t h ed i f f e r e n te c o l ic e l l sa p l a r sd i f f e r e n tb l u e - g r e e nc o l o r sa f t e ri n d u c e d o e c o l ib l 2 1 ；1 b ；4 b s ( 6 8 0 3 ) ；5 b u s ( 7 0 0 2 ) ) 图3 7 经诱导后不同的表达菌株呈现不同程度的蓝绿色 f i g 3 7t h ed i f f e r e n te c o l ic e l l sa p p e a r sd i f f e r e n tb l u e - g r e e nc o l o r sa f t e ri n d u c e d o e c o l ib l 2 1 ；1 b ；2 b u t 3 b s ( 7 0 0 2 ) ：4 b s ( 6 8 0 3 ) ；5 b u s ( 7 0 0 2 ) ；6 e c o l ib l 2 1 2 3 重组蛋白的荧光光谱性质 在5 9 0 r i m 激发波长下，空白的b l 2 1 ( d e 3 ) 没有任何峰，各个表达菌株出现不 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 同强度的发射峰，发射峰的位置均在6 3 5 衄左右( 如图3 8 ，3 9 ) ，其相关数值见 表3 5 。荧光强度最强的两个表达菌株为b 和b u s ( 7 0 0 2 ) ，两者相差不大；荧光强 度最弱的为菌株b s ( 7 0 0 2 ) 和b t 。 0 置 u 确 q k o 暑 陶 6 锄 6 加6 啪 w a v e l e n g t h ( n m ) n m 。 图3 8 细胞上清液的荧光光谱 f i g 3 8 f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p u ao f t h es u p e m a t a n to f t h eb r o k e ne e o l ic e l l s 1 b ；2 b u ；3 b s ( 7 0 0 2 ) ；4 b s ( 6 8 0 3 ) ：5 b u s ( 7 0 0 2 ) i 7 e c o l ib l 2 1 u 盘 3 矾 2 o 三 函 1 w a v e l e n g t h ( n m ) 啪 图3 9 细胞上清液的荧光光谱 f i g 3 9 f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r ao f t h es u p e m a t a n to f t h eb r o k e ne c o i lc e l l s 1 b ：6 b t ；7 e c o l ib l 2 1 4 7 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 表3 5 细胞上清液的荧光光谱相关数值 t a b 3 - 5f l u o r e s c e n c ed a t ao f t h es u p e r n a t a n to f t h eb r o k e ne e o l ic e l l s 序号表达菌株名称 e m ( r i m )荧光强度 b6 3 5 61 1 1 5 b u 6 3 5 66 0 5 1 b s 7 0 0 26 3 5 44 6 1 3 b s 6 8 0 36 3 5 48 1 6 9 b u s 一7 0 0 26 3 5 2 ， 1 l o 1 b t6 3 5 65 2 7 1 3 讨论 在第二章中我们已成功获得了具有荧光活性的藻蓝蛋白a 亚基，这证明我选 择的表达体系是正确的，所选择的表达载体、宿主菌株和表达诱导条件均是合适 的。因此，本章实验参照上述体系，构建了不同的表达菌株来获得有荧光活性的 藻蓝蛋白d 亚基。 本实验克隆了钝顶螺旋藻( s p i r l d i n a p l a t e n s i sf a c h b 3 1 4 ) 的藻蓝蛋白p 亚 基基因印扭，裂合酶基因c p c t 、c p c u 和c p c s ( 7 0 0 2 ) 均来自s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 0 0 2 ，而另一裂合酶基因c p c s ( 6 8 0 3 ) 来自集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 。将 基因构建到表达载体p a c y c d u e t - 1 中，得到表达载体p a c y c d u e t - c p c b 、 p a c y c d u e t c p c b - c p c u 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、p a c y c d u e t c p c b - c p c s ( 6 8 0 3 ) 、p a c y c d u e t - c p c b - c p c u - c p c s ( 7 0 0 2 ) 、p a c y c d u e t - c p c b c p c t 。经过p c r 电泳检测以及测序证明上述载体在d n a 水平上正确的。最后将其分别与第二章 构建的表达载体p e t - h o x l - p c y a 共转化得到表达菌株b 、b u 、b s ( 7 0 0 2 ) 、b s ( 6 8 0 3 ) 、 b u s ( 7 0 0 2 ) 和b t 。 通过分析表达菌株b u 、b s ( 7 0 0 2 ) 、b u s ( 7 0 0 2 ) 的荧光光谱结果，可以看到 三者的荧光发射峰基本一致，均在6 3 5 n m 左右，说明三者体内均表达了有荧光 活性的藻蓝蛋白。荧光强度却不相同，b u 与b s ( 7 0 0 2 ) 的荧光强度相差不大，二 者均远远低于菌株b u s ( 7 0 0 2 ) 的荧光强度。这说明聚球藻7 0 0 2 的裂合酶c p c u 与c p c s ( 7 0 0 2 ) 能够催化藻蓝胆素p c b 与藻蓝蛋白d 亚基的结合，而且是作为异 源二聚体一起发挥作用的，单独的裂合酶c p c u 与c p c s ( 7 0 0 2 ) 对p c b 与d 亚基 的结合作用不大。 4 8 螺旋藻藻蓝蛋白的自催化重组及藻蓝胆素裂合酶功能比较研究 通过分析表达菌株b s ( 6 8 0 3 ) 、b s ( 7 0 0 2 ) 、b u s ( 7 0 0 2 ) 的荧光光谱结果，可以 看到三者的荧光强度相差很大，b s ( 6 8 0 3 ) 的荧光强度比b s ( 7 0 0 2 ) 的多3 0 左右， 差不多b s ( 7 0 0 2 ) 的两倍，而又比b u s ( 7 0 0 2 ) 低3 0 左右，差不多b u s ( 7 0 0 2 ) 荧光 强度的三分之二。这说明集胞藻6 8 0 3 的c p c s 裂合酶可以作为裂合酶单独催化d 亚基与色基的结合，而聚球藻7 0 0 2 的c p c s 裂合酶则不可以，只能是与c p c u 结 合在一起发挥作用。但是集胞藻6 8 0 3 的c p c s 裂合酶对钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的 催化效率却没有聚球藻7 0 0 2 的c p e u c p e s ( 7 0 0 2 ) 的高。 通过分析表达菌株b 与b t 的荧光光谱结果，可以看到表达菌株b t 的荧光强 度极低，没有发挥催化作用。这与s h e n 和关翔宇等对c p c t 的研究结果不一致， 可能聚球藻7 0 0 2 的c p c t 裂合酶有其作用专一性，不能够催化藻蓝蛋白p 亚基与 p c b 的结合