（遗传学专业论文）粗山羊草hmw谷蛋白新亚基编码基因的分离表达及其遗传转化研究.pdf

首都师范大学博十学位论文 摘要 小麦近缘种粗山羊草( 彳瞎筘纽埘幽越2 n _ 2 x _ 1 4 ，d d ) 是普通小麦d 基因组供 体，存在广泛的高分子量谷蛋白亚基( h m w g s ) 等位变异，是小麦品质改良的重要基因 资源。分离克隆这些基因不仅可以为小麦的品质育种提供具有自主知识产权的基因资源、 拓展遗传基础，而且有望为研究六倍体小麦的起源和进化提供有用的信息和证据。本研究 从粗山羊草中分离鉴定了3 个新的h m w g s 基因，并进行了异源表达、系统进化分析、 翻译后修饰鉴定以及植物双元表达载体构建和烟草转化，主要结果如下： 1 粗山羊草h m w 谷蛋白新亚基基因的分离与原核表达 以粗山羊草t d 8 1 和t d l 3 0 为材料，通过s d s p ：a g e 、h p c e 、r p h p l c 和 m a l d i t o f - m s 鉴定了两对新的g 协j dh m w 谷蛋白亚基组合，分别命名为l d x 5 1 + 1 d y l o 1 和l d x 5 1 1 + 1 d y l 2 1 。采用a s p c r 方法，分离克隆了1 d x 5 气、1 d x 5 1 和 1 d y l 2 1 气亚基的编码基因，分别为2 4 8 7 b p 、2 5 3 2 b p 和1 9 4 7 b p ，编码8 2 7 、8 4 2 和6 4 8 个氨 基酸。d n a 序列及推导氨基酸序列具有典型的h m w g s 的序列结构特征，而且1 d x 5 私 亚基重复单元更接近一致序列，相对变异率较低，主要体现在每一重复单元的平均变异数 和重复单元发生变异的频率上。j d u 和儿盼推导蛋白分子量与质谱测定分子量非常 一致，而肛珍j 2 j 推导蛋白分子量与质谱测定分子量则相差很大，远远超过误差允许范围。 设计2 对不含信号肽编码区的引物，分别特异扩增基因儿w 、h 5 j 和佃，j 2 j ， 然后与原核表达载体p e t 3 0 a 相连，三个基因在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 中均得到了高效 表达。s d s p a g e 分析表明，基因儿晒和d 西表达蛋白与种子中相应的谷蛋白亚基 迁移率相同，确证所克隆基因确实为所鉴定新亚基的编码基因。但同时发现几个含有j d d 的重组质粒表达出一个迁移率超前的小蛋白，而且n 端测序表明大肠杆菌中表达蛋白与相 应种子蛋白氨基酸序列相同。这几个重组质粒的测序结果显示，在大肠杆菌中j d 酊基因 内发生了1 8 0 b p 的缺失和一个提前终止密码子的突变，由变异了的基因序列推导的蛋白分 子量与表达的小蛋白在s d s p a g e 上的迁移率也非常相符。这一结果首次提供了谷蛋白亚 基编码基因重组克隆发生变异的直接证据，变异发生的分子机制可能是由于链内不合理重 组( i 1 1 e g i t i l n a c cr e c o m b i n a t i o n ) 的发生，这种机制很可能对谷蛋白亚基基因新的等位变异 的产生发挥重要作用。而j 功，j2 j 基因序列原核表达结果则显示表达蛋白较种子内相应 亚基s d s p a g e 迁移率稍快。 首都师范大学博十学位论文 2 6 协j d 谷蛋白亚基编码基因系统进化分析 分别采用n e 铆o r l 【分析、n c i 曲b o r - j o i n i n gh 和同源树构建对g m j d ，和g 觑一，d 2 位点等位变异间的系统进化关系进行分析，结果表明，d 乃，j d ，j 脚j 和d 妇2 均 处于源节点，代表比较原始的基因序列，这暗示六倍体小麦至少起源于4 个独立的杂交 事件。n e m o r k 、耐g h b o r - j o i n i i l g 恤e 和同源树分析结果相互吻合，表明普通六倍体小麦d 基因组是多起源的。结合多起源假说与不合理重组的分子机制，提出了g m j d 一位点等位 变异可能的产生途径：9 个已克隆的d x 亚基基因由比b 巧，j d _ ，j d x j 和，d x 2 2 分 化而来。特别地，比眈2 基因可能早先就存在于租山羊草中( 也可能由粗山羊草中一个 更原始的基因衍生而来) ，在某一时期通过某种罕见的远交或异型杂交转移到普通小麦中。 由于j d 珐2 基因内5 6 1 b p 的长正向重复序列可能发生不合理重组，产生了类似j d 刀基 因，该基因在小麦进化过程中通过点突变、非均等交换等事件，进而产生了j d 刀2 基因。 3 谷蛋白亚基l d y l 2 1 f 翻译后修饰分析 鉴于1 d y l 2 1 亚基质谱测定分子量与基因推导蛋白分子量的巨大差异和s d s p a g e 的反常电泳现象，采用液质联用技术对其进行了蛋白翻译后修饰的鉴定。理论上1 d y l 2 1 亚基含有1 3 个精氨酸和7 个赖氨酸，且精氨酸和赖氨酸均不与脯氨酸相连，经t r y p s i n 充 分酶解后，应该产生2 1 个不同的肽段，实际鉴定唯一肽段数是1 2 个，蛋白鉴定覆盖率最 高1 9 8 。虽然离国际认可的蛋白覆盖率还有一定差距，但从l d y l 2 1 气亚基翻译后修饰位 点预测结果看，很多可能性高的修饰位点所在的肽段可能还没有得到很好的鉴定，所以仍 不能排除该亚基存在某种程度的翻译后修饰( 如糖基化和磷酸化等) 的可能。而且我们发 现另一材料t d 8 7 中较1 d y l 2 1 气亚基s d s p a g e 迁移率稍快、m a l d i t o f m s 测定分子 量相差很大的1 d y 亚基，其编码基因序列却与，功，j 2 ，叶完全相同；又考虑该基因序列原 核细胞表达蛋白较种子蛋白l d y l 2 1 气亚基迁移率稍快、烟草种子胚乳表达蛋白与1 d y l 2 1 亚基迁移率一致、免疫反应性相同的事实，我们认为t d l 3 0 中l d y l 2 1 气亚基存在翻译后 修饰的可能性较大，进一步的鉴定还在进行中。 4 谷蛋白基因植物双元表达载体的构建及其烟草转化 针对克隆基因d n a 序列特点，构建了两种植物双元表达载体p b l l 2 1 p v p l g l u 和 p b i n h p g l u t ，经一系列中间载体和最终载体的酶切鉴定，证明表达载体的构建完全正确。 载体p b i n h p g l u t 的构建，精心选择经试验验证了其驱动活性的胚乳特异性启动子，选择 添加h m w 谷蛋白亚基基因和大部分洲谷蛋白亚基因内部均不含有的五妇i 和砌li 内 2 黄帮耨蓖大学辩士学餐论交 切酶位点，并将目的谷鬣白藏蕊编码基因的调控蹬于d n a 区内，从而使这一裁体在槭 物滚赞转豫孛爨蠢镶夫熬缆势。缀瓣农转蘩奔导濑草时纛转豫结果表甥，j 脚f 2 j 罄因鼹 溺鼙静予瓤巍牵褥蜀成翡表途，表达蛋鑫每联) 1 3 0 穗建嚣鏊爨蠢耱鞫熬s d s 魏g 嚣迁移 率，且h m l 肌g s 多克隆抗体w e s t h e mb l o t d n g 检测为阳性，不仅i 正明所克隆l d y l 2 1 飞溉 鏊壤码蒸避鼹正溃蛙，露量验诞7 掰擒建羧髂的窍效瞧，菇下一步，l 、麦豹遗传转纯葵定了 蘩璃。 关键潺：糕虫羊莓，糍势子爨答蛋巍鞭基，a s p c 瓤系统遴化，舅源袭达，遴转转化 3 首都耀藏大学簿士譬僚论文 a b s t r a c t 1 ew h e a ts t o r a g ep r o t e 砖，e s p e c i a l l ym e n l p o s i t i o 璐a i l dc o n t e mo fl l i 醇m o l e c l l l 越 w e i g h tg h n e n i ns u b u n i t s ( h m w g s ) p l a yi m p 0 蛐tr o l e s i i lm en o i l rp m c 龋s i n g 锄d b r 豫d m a 妇毽q u a l i t p f e v i o l l s 洫v 酬g a 主至。叛ss 幻w c d 瓤a l 壤eg 鼹e l 主c 垂b 瑚矗撕o fh e x a p l o i d w b e a 主w a sl i m i t o dw 毫a e a s 搬钮譬w e 托e x l e n s i v e 蠲e | i cv a d a 芏i o 璐o f 薹m w g si nw h e a tr e | a t o d s p e c i 髓，蛐c h 龋4 珂q 芦触螂如玎t h e r e f o r c ，m o l e c m 甜c l o i l i n g 锄dp i l y l o g e n 耽i ca n a l y s i so f n o v e lh m w 西u t e n i ns u b u n i lg e s 舶mw h e a tf e l a h 通s p e c i e sw o u l d 舳to n l yp r o v i d ep o t c r i t i a l d 至芏eg 鼹e 揩s o 毽f e 嚣细w h e a lq 瑚l 毋i 辍p v 锄锶耄b 氍蠢s 。o f f 酝潞e 凡l 嚣甄麟a 宅i o 珏鑫砖 群v i d e n c e 矗”f h n h c r 瑚d e r s t a n d i n gt l l e 谢g i na n de v o l u t o no fh e x a p l o i dw h e a t t h j sw o r k i n d u d c dg e l l ed o l l i n 吕h e t e r o 舯0 _ 吣e 】【呻s i o l l ，p o s t _ 打a l l s l a t i o n a lm o d 饱鼢t i o n s ，p h o l o g c i l e t i c 8 嚣蠢y s l s 藏o v e l ( 并珈j 纛l d l e s 蠹豫l 么 i z e 秽细嫩蕊彗糠颧l l 鑫谬e x p 粥蝣淞v e e 耗i r c o n s 锕b c b o na n d 戗m s f o 曲删册o f t o b a o c 0 、i mc l o n e d 斟u t e n i n 飘删t sg e n e s t h em a i nr e s u l t s o b 诅i n e dw e r e 髂f o l l o w i n 黟： 董1 s o l 嚣蛀e 瓤蠢珏纛蠢e 重e l 够霎f e 珏。疆se 漂萎 r e s s i 蛆o f 魏o v 畦薹薹溅、v 瘿珏重e 魏i 糕莓珏b 珏珏耋耋 g e n e si n e 留l z a 四s 女口搿s 础筇 1 w op a i r so fn o v e lh m wg l u t _ i l ls t l b 吼i t si n 彳曙恸幻础曲“( 2 i l _ 2 x = 1 4 ，d d 【) t d 8 l a 戚程 1 3 0w 黜逆鞠| i 曩繇b ys 蚤s - p a g 魏鼯一珏p 王黼d 疆a d l 一釉孓m s 鞠d 纛械萨a l 舔嚣 l d x 5 私+ l d y l o 1 a n dl d x 5 1 幸t + l d y l 2 1 气，f c s p e c t i v e ly 矾l ec o d m gg e n e so f1 d x 5 事： l d x 5 1 轳，a n dl d y l 2 1 叶w e i s o l a t e db ya s - p c ra i l dt h ec o m p l e t eo r f sw e r eo b t a i n e d t h e 醛o o 璐i s 撼o f2 4 8 l b p 黼c o 醢喀am a 氛糯p r o t e 融o f8 2 7f e s i d u e sw i t h 撮ed e d u c 砖燧o f 8 5 ，7 8 2 d aw 撕l ej d 娃j n 两s 鼯2 5 2 6 b p 鞠e o d i n g8 4 2 潞i d u e sw i m8 7 ，6 6 3 d a ，锄d j 研j 2 j 叶c o m p r i s e s1 9 4 7 b pe 1 1 c o d i n g6 4 8r e s i d u e sw i m6 7 ，3 4 7 6 d a 1 1 1 e 删c l t i d ea c i d s e q u o 嚣a n dd e d u c c da 粥i n oa d ds e q u c l l c e sh a dt y p i c 8 lc h a r a c t e r so f l m wg l u t e 砖n s d b u n i t s 羽馐e 科e 豫g e 藏瓣溉o f v 越黼毽p 嚣辩p 龆磁盘勰d 攮em 髓珏蠹e q 氍鞋c yo f v 鑫基黼l 谢括o f s u b l 】l l i t1 d x 5 飞w e r cr c l a t i v 移l yl o w e r i n d i 硎n gt h a ti t s r e p e a ll h l i 忸w a sc l o s c r t ot l l e 璐e n s u s t h ed e d u c e d 聪8o f m a n h e 掣o t 嚣m se n c o d e db y 艇h 5 锄dj h 5 j w 村ec o m i s t t w 潍l l l o d 娃e 嚣矬i # 磅凇班) l - 约孓m s ，w 毯l e 鞋撑d 珏c 。l 磊磊o f j 三珍经j 1w 嬲溅斌b 榭 m 孤l 量哦d e 敝瓶n e db ym a l d i t o f m s 1 1 1 f n o v dg 馏髓泌tj d 履j 一黼d “珍j 2 j h a db o 删t t e dt og e n b a l i i c 而ma c c 髂s i o nn 瑚曲e 撙d q 6 8 1 0 7 6 ，d q 6 8 1 0 7 7 锄dd q 6 8 1 0 7 9 1 咖p 舔薯o fd i t i a 圭蛳m e f sw # 糙如s 主驴e dc o 蝴n g s i 黟越强c o 馥塔d o m a 遮t o a m p l 洚豇w ，j d 照j 一黼dj 缈珏z 专g 麟e s ，| 量l ep c 疑p r o d u c sw f ec l o n i n 泌娃蝣b a c 融i a | 。x 呻s i o nv 槲o rp e ”o a 黼dm ch y b r i dv c c t o r sw e r c 仃黼s f o 曲e di i l t o 最，fs 枷nb l 2 1 ( d e 3 ) 4 黄煞褥范久学薄士学鬣论文 p 毛秘s e x 泌s 至。魏o f 氆e 撤。瓣瞄o 廷姆o f 您晒妒a 稚d ? 秘霞j ，黝d 强t e 矗n i n 采s 锶u 鞠c 池g n 矗锄e dt l l e 榭峨黼蛀e i t i 嚣o f 幽e 脚。黼v o lg 铋躐黼e f 燃蛀n 璐强s e v e 斌h y b 薹童dc l o n 嚣o f j 昼西一g e n ee x 彬e s 嚣。d 勰i l k 黜a 珏嚣p 堇鼬f e l 撕v et o 也0 魏嫩h 髓t i cs u b 蕊tp 糖s 鳓毡s e e d p r o t e i l l s ，w l l i c hw 勰c o n f i r n l 槲t o l t c d 飙i mal o n gd e l e 柱o no f1 8 0 b pt h 3 u 曲i l l e g i t i m a f e i _ e c o 氆慨i o 琏癌sw d l 鑫sa 掘- 蠹黼es 幻pc o 文m 勤锄a 垃。赫。豫ed 锯i v e d 黼嗣e e u l a rw 萌鬈黼o f & 辨器硅即融l 璃勰w 葫l 测溉融舔氇瓤辫迸to fs 黼- 熟g 嚣熊8 l y s 强( 埝i 廷v 麟谚两罄 p r o v i d c dt l i ed i f e c te v i d 铋c e 向r 谢西b l ef 嘲m b i n 锄tc l o n c sa i l db r o u 曲to u tm ep o s s i b l e m e c h a m 锄o fi 1 1 e 蝣t i m a t e b i n a l i o nf o rt h i sv 棚a i i o n ，w h i c hm a yp m “d eu s e f h l 壤f o 凇a 蛀豫o f 董l | j 嚏h 嚣i 蜮痨姆i 蜘磐珏弛菇懿嚣盛ev 蕊氍i o 羲s 矗n 硅攮蠢f 科。量喇o n 鑫秽d 主f j 蓉g 哇潍。l | w a si 撼鞠鲥棘嚣锈戤畦瓣壤辫髂s e d 即蜮矬龋船箩i 王f 哗露e n # o r 手搦群v 藤巍蓊蛀y 趣s | 薯巍秘 l d v l 2 1 翱酗滴t 爵o m 朝) 1 3 0o ns d s ，p a g 狂 2 。| 蠢y 孙g e 魏e 髓霉纛魏冀每s i so 薹6 酝- j 晷鑫簸琏l e s n el 咖o r k ，脯g h b a 喇o i n i n g ea n dh o m o l o 西c a l 靠锵、) l 惴n s 衲c t e dt oa n 8 l y s e 也e p 姆i o g e 粥& 尊l 蜒娆o f 毯晒j _ d 蠲e l 眠飘l e 嚣辩 毽n s 锰矗圭c d 聩l 氇tt 沁j z 耘，l ! 囊六 默溉芋，越遗簌酝z r 辩簧嚣e 嫩鑫鼯蘸鞲i 氇溶拄强醇w o 露瓣迭铡啊攀蜒埝锈e 蕊i 璩辩。鼓赫c 鹤娃s o ft l l eo t h 钟勰* j m ，a l l e l e si l l 吐l ea s s o c i a t c ds t a r 。l i 妯p h y l o g c n y 1 m er e s u l _ 【so fn 嘶 r o r l 【， n 秭j 出b o r - 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砖鹳棼l l i 秘一辨r f o 蝴a l l c el i q u 主矗曲f o m a | o 铲a p h y 董i ) l l a 嘲n gb ye l e c 拄d s 黟馥yi o 蛙z a 蛀。珏 掰鹪s 犟e c 拉。徽铆辩p - 差p 沁e s i - m s ) w e f e 辨f 疑n 蕊协e 蹿l o 糟t h cp o 辩蚋n s l a 矗a | m o d i f i c a 【i o 趟i n1 d y l 2 1 气s u b u m t 。h lt h ml d y l 2 1 s u b u n i t n 城n e d1 3 心a n d7 砷 5 蔷都鄂藏天学蹲七学经论文 r c s i d u 鹤，彻da b s e i l c eo f 加移p r ob o n d s ，t h u 8m ep r o d u c t i o no f 2 1 仃y p t i cp 印t i d 鼯w a se x p e c t e d t l l ee s l - m sa 堇l a l y s 趣o fl d 了1 2 。l 飞扛y p 如d i g c s tr e 蛐h e d 溉t 圭l ei d e n t i 最c a t i o no f1 2i n c o m p l e t e 瑚随u e 脚酗慨诚c h w a s l e s s 氆a n 5 静o f t h a t 证氆e o 秽a l 氇o u 垂穗e f a 蹦招g a v e 镄e h i 疹e s t s e q u e l l c cc o v 科a g co f1 9 8 l 鹤st l l a nt l l ea c o 印t c dc o v e m g e ，m ec c r c a i np o s t - t r a i l s l a t i o n a l m o d i 嚣c a i o 掰翎c h 豁掣y c o s y l a t i o n 曲dp h o s p h o 叫a t j o n sc 勰n o tb en l l e do u t m o 瑚v m e l 璐幽强i 耄o fa 珏。睦疆c 然s i 鼹霹) 8 7 ，诫i 馥m o ￥磁i 盛| l yl h 或群黼s d s 一豫g 毯鞠鑫h 醴a l a r g e l y 锄a l l e r 铀d e t e r n l i n e db ym a l d i - t o f m sm a l lld y l 2 1 s u b u i l i t ，h 甜t l l e 曲s o l m c l y s a m ee l l c o d i n gs 叩e c e s 勰j 伽j 2 j g e n e w ea l s of o u n dm a ta l t h o u 曲t l i ee x p r e s s e dp r o t c i no f j 暑箩旺j g 蹦eo r f 遮是鑫m o v 旌s l i 荫鞋yl 蠹l 镡墩a 纛l d y l 2 1 t 翱b u 瞌幻l l 薹翰1 3 0 ，氐 钍p 溺s e dp f o 绷no f 出e 砦镦l ei n 毒0 b a c c o 鞠d o s p 嘲! l lh a dt l j es a m em 曲 l 矗ya n di m m 珊i t y 嬲 1 d y l 2 1 1s u b 喇t 劬mt d l 3 0 s ow es p e c l l l a t e dn l a tc c r t 抽p o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o 璐 w e 羚m o s tp o s s 棘y 麟s i 赋畦瓤l d y l 2 1 气s u b 豫娃o f t d l 3 0 4 c o n s n m c t i o no fp l a n tb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o rc o n t a i n i n gg l u t e n i ns u b u n i t g e n e sa n dt r a n s f o r m a t i o no ft o b a c c 0 骶醛藤o f 疼越挂b i 娃蝌e x 黔s 摊v 咖蹲1 1 2 l p 垤l g l 挂鞠d 筘戮静- g l 订w 瓣 c o t l s 协】c t e db a s e do n 锄a l y s i so f 娜d e o t i d ea c i ds e q u 蹴c 妫c h 盯a c t 既as e r i 嚣o f i d e l l t i f i c a t i o no f m i d t e l l n 柚d a 1v c c t o 堋b y 跚i t a b l ed i 髑o r e n tr e s 砸蹦o ne l l z y m e s 嘲o w c dt l l a tn l ev e c t o 堪 潍妇l e 童主鳓w 8 s 囊s o l u l 霉l y 粼c e s s 蠡l 黼d 溅f e 髓e 删越l y 童h e 恻蜘f 筘 王p g 峨w h i 馥 捌8 c e d 国e 触静e tg 髓e 瑚d 描h er e g u j 辐蝴o f 嘲e 删f i 铡e n d o s p e j 嘲一s p e c i 蠡c 辨删o w 班c h 卵p e l l d c dt h er e s 砸c t i o ns i t e s 爿砌i 孤d 0 聊ib e s i d e5 a n d3 o ft h et a r 辨tg l u t c l l i ns u b u l l i tg e n e ， 搬e 蜀咯la n d 琢珥is i t e s 搬v en o tb e e nf o u n d 诳a l lp u b l i s h e dh m w g sg e sa n dm o s t l m w g sg 瞄c s ，甄穗e 嘲。辩，w 越c hp l a c e d 垃圮越lo p 酬i o n 曲m 妇攥b e 洙e 癌地l 被8 n d 啦辫 b o r d 锄o f t _ d n a ，h a d 胖a tp r c d o m i n a l l c oi np l a i l t 仃a n 8 f o f i i l a t i o n t h er c s t l l t so f 打a n s f o 咖a t i o n o ft o b a c c 0 】a m i 船m e d i 8 酬b y 彳舒必酣船慨牌加粥国潮凇s 1 1 0 w e dm a t 趣m e 翎d o s p 黜o f l 曲a o 孕瞄e 疆多2 t j 跋帮嘲舔鑫辨e 至纛w 毯吐殛ds i | 难斑掇曲i l i 锣w i 蠡l d y l 2 1 气鞴艮珏曩 麟能l 曲e d 右o mt d l 3 0 向r m e 肋o r e w e s t l i 啪b l o 壮i n gs h o w o dt h a tt 量坤c x p r e 鼯e dp r o t e i na n d 。x t r a c c c d1 d y l 2 1 气劬u 础矗d mt d l 3 0a l ls 咖n 百yh y 黼d i z ew i m1 1 帕m l l l t i d o n a la l l t i b o d i 鹤 嶝i 鞋s 童珏l 删番豫癌n 蚰鞠i 镪，w | 畦馥菇蠡渤醯氇e 黜搬鼹垃c i 鞋璐o f 畦臻矗o v e | g e 辩j 三珍，2 j 鼢d t i l e v a l 趟i 秽o f m e p l a n 婚i l l a 猡积p 糟s s i o l lv e c 幻 k e yw o r 幽：喇琵筘触嚣馥蕊h m w 蘑m e 嫡ls u b 蜮t s a s - p c 粒p h y l o 擘e n c t i ce v o l u 蛀。趣 轴煳g 朗。黼糊c p f 锚盎o n ，喾嘲d 畦c 溉璐恕燃a 主至o n 矗 首都师范大学博十学位论文 英文缩写 2 一d e a c n a p a g e a s - p c r c a p s d 1 r r e s l m s h p c ei h m w g s i e f h l d e l s i p t g l m w g s m a l d i t o f - m s p c r p v d f r p h p l c s a s d s p a g e s n p t f a x g a l 英文缩写词表 英文全称 t w o d i m 锄i o n a lc l 咖p h o r 嚣 a c e t o n i 砸l e a c i dp o l y a c r y l a m i d eg e ld e 咖p h o r 鹤i s a l l e l e _ s p e c 墙cp c r 3 一c y c l o h e x y l 锄i n o l - p r o p a n e s u l f b n j ca c i d d i t l l i o t h r e i t o e l e c s p r a yi o n i z a t i o nm 豁ss p e c 昀m e 时 l l i 曲p 幽衄a n c ec 印i l a r yc l e c p h o r e s i s h i g l lm o l e c i l l a rw e i g l l t 酉m e n i ns u b 啪i t i s o e l e c 缸cf o c 啷i g i h 略鳅i o n s d e l c t i o n s i s o p f o p y lp 一一n l i o g a l a c t o p y r a n o s i d e l o wm o l e c u l a rw c i g h t 四u t e i l i ns u b u n i t m 秭x 豁s i s t e dl 船e rd e r p t i o n i o n i z a t i o nt i m eo f n i g h tm 觞ss p e c t r o m e 时 p o l y m 耐s ec h a i l lr e a c t i o n p o l y v i n y l i d en u 嘶d e r c v e f s e d p h a s el l i g hp e r f o r n l a i l c e l i q u i dc l l l _ 0 m a t o 鲫h y 3 ，5 - d i m 砒e x y c i l m 锄i ca c i d d i 啪d o d c c y ls u l f a t ep o l y a c r y i 锄i d eg e l e l e c 讯 p 1 1 0 f 龉i s s i n 垂c _ n u d c o t i d cp o l y m o r p i l i s i i l s 仃i n u o r o a c e t i ca c i d 5 b r o m o 4 d 1 1 0 r o 3 一砌o l y l b d g a l a c t o s i d e i o 中文全称及注释 双向凝胶电泳 乙腈 酸性聚丙烯酰胺凝胶 等位基因特异p c r 3 环己氨基一l 一磺酸基丙烷酸 二硫苏糖醇 电喷雾离子化质谱 高效毛细管电泳 高分子量谷蛋白亚基 等电聚焦 插入缺失 异丙基硫代b d 半乳糖苷 低分子量谷蛋白亚基 基质辅助激光解析电离飞行 时间质谱 聚合酶链式反应 聚偏二氟乙烯 反相高效液相色谱 3 ，5 二甲氧基4 羟基肉桂酸 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰 胺凝胶电泳 单核苷酸多态性 三氟乙酸 5 溴- 4 _ 氯- 3 吲哚- b d 半乳糖苷 首都师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 琢彳玉j 乏 日期叼年月日 首都师范大学学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位 论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容 编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文 在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：缘彳= 白炎 日期跻稠日 首都师范大学博士学位论文 1 前言 文献综述 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，其面积和产量均占世界第二位，我国的小麦面 积、总产和消费量则居世界首位。小麦种子营养丰富，蛋白质含量高，是人类重要的植物 蛋白质来源，约占谷物蛋白质的3 8 4 ，而且小麦种子所含氨基酸种类较多，尤其含有人 体所必需的赖氨酸，还含有脂肪、维生素及各种微量元素等成分，符合人体生理需要，对 人体健康有益，在许多国家，它作为能量和蛋白来源构成了人类膳食的主体部分。世界上 有4 3 个国家( 约占3 5 4 0 的人口) 以小麦为主食。小麦对气候和土壤的适应能力非常强， 分布极广，南至4 5 。s ( 阿根廷) ，北至6 7 。n ( 挪威、芬兰) ，无论山地、丘陵、平原、 沙土和粘土均有种植。小麦之所以在世界各地成功种植和发展，最重要的原因是小麦面粉 具有独一无二的加工特性，那就是小麦面粉加水和面形成面团后可产生有弹性的网状结 构，适于制作成多种专用食品，如面包、面条、饼干、糕点、馒头等，是制作食品最丰富 的作物之一，也是其他作物所不可比拟的。小麦的这种特殊的和面加工特性主要是由小麦 种子贮藏蛋白的结构和特性决定的( w r i 西e y ，1 9 9 6 ) 。小麦种子贮藏蛋白占种子蛋白的一 半左右，贮藏蛋白特有的多聚体结构赋予了面团非同寻常的弹性和延展性，这允许面团发 酵过程中捕获二氧化碳和不同食品所需要的粘弹性，正是面团弹性和延展性之间的平衡决 定了面团最终的加工品质。 生产上发挥作用的普通面包小麦( 乃f 打c m4 部打w 卅l ) 和硬粒小麦( 7 加苫池册s s p 如m ) 都是异源多倍体，分别含有三套( a a b b d d ) 和二套( a a b b ) 基因组，小麦的 这种遗传构造是非常重要的，它是植物长期进化、环境影响和人类选择的结果，小麦的各 种品质性状其实就源于其基因组上各个相关基因的表达及其对环境的应对。 2 0 世纪8 0 年代以前，由于我国人口压力大，小麦育种和生产往往只追求产量而忽视 了对籽粒加工品质的改良，从而造成生产上的主栽品种品质普遍较差的局面。随着食品工 业的发展、人民生活水平的提高和小麦消费向多元化方向发展，以小麦面粉为主要原料的 各种精致面食和方便食品的消费需求剧增，小麦生产出现了结构性过剩，优质麦供不应求 的迫切局面，品质改良的重要性日显突出。因此小麦种子贮藏蛋白研究受到了人们的广泛 重视。 l 首都师范大学博十学位论文 2 栽培小麦的起源与进化 小麦属于禾本科( p o a c e a e ) 、小麦族( m f i c 鲥口咖研d ，f ) 、小麦属( z 埘c 蜊l ) 。 人类祖先最初利用小麦是采食野生种的子实，后来将采食剩下的子实进行人工种植，又经 过长时间驯化才出现了栽培种。小麦演化为农作物的最初阶段，大约出现在距今1 0 0 0 0 年 前地中海东岸的“新月沃土”地带。至今土耳其、叙利亚、伊朗等地还分布有一定数量的 乌拉尔图小麦( 丁“m ，m 砌“用) 、野生一粒小麦( r 历d ，l d c d “ms s p 幻印比“m b d 栅) 、 栽培一粒小麦( r 胧d ”d c c 删l ) 、野生二粒小麦( z 击删b 白鲫1 ) 、栽培二 粒小麦( z 硪彻删s 拍“p 6 f ) 等原始种。现在世界上广泛栽培的普通小麦( z 口嚣打蝴) 是六倍体，地中海沿岸、印度、以及美国北部大平原一些地区也种植一些四倍体硬粒小麦 ( f 劬蝴s s p 击删巩) 。纵观世界各地的多倍体栽培小麦，四倍体小麦主要有圆锥小麦 ( fm 馏胁册包括硬粒小麦和通心面小麦，基因组从b b ) 和提莫菲维小麦( f 砌2 9 加卵州 基因组a a g g ) ；六倍体小麦主要有普通栽培小麦( z 口甜f f w 埘) 、密穗小麦( z 聊班肋珂) 和斯卑尔脱小麦( z 妒p 加) ，基因组为从b b d d ，以及茹科夫斯基小麦( l 拍幽嘶f ) ， 基因组a m a 。! a a g g 。 遗传学研究表明多倍体小麦的进化有两大世系：f 伽删d 堋( a a b b ) 和z 口嚣打w m ( a a b b d d ) 为一个世系，l 砌l 础p p 哺( a a g g ) 和l 拍砌妙( a n a ”a a g g ) 为 一个世系( h u a l l g 等，2 0 0 2 ) 。对普通六倍体小麦( z 口嚣f 肌朋) 的起源和进化，科研工 作者从各个角度进行了研究。根据这些研究，人们推测六倍体普通小麦的起源和进化经过 了两个重要步骤：野生的乌拉尔图小麦( z “m r m ，a a ) 作父本与未知的b 基因组的祖先 可能是拟斯卑尔脱山羊草组类型( a 印p 加洳s s ) 杂交，并双二倍化( 锄p h i p l o i d ) 形成 原初四倍体小麦( a a s s ) 。该原初四倍体小麦遗传不稳定。有一定不育性，并向两个方 向进化：一是s 基因组经结构分化而形成g 基因组，即形成提莫菲维小麦( 从g g ) ，提 莫菲维小麦再与坡埃奥梯库姆小麦又称野生一粒小麦( r 研硎d 伽l ms s p 幻f 洲埘， a “a “) 杂交从而形成茹科夫斯基小麦( a m am _ a a g g )( d v o f 吉k 等，1 9 9 3 ) 。另一是原 初四倍体小麦s 基因组进化为b 基因组，产生一个四倍体新生种野生二粒小麦偶 幽c c d 豇蛔，a a b b ) ，野生二粒小麦进化为栽培种小麦如硬粒小麦( zm 鳓删s s p 咖r 堋， a a b b ) ，四倍体栽培小麦再和粗山羊草( 爿矗缸淞曲以d t d t ) 杂交形成有壳的六倍体祖先， 后进化为斯卑尔脱小麦( z 口船f 舭册s s p 妒e 加，从b b d d ) ，六倍体普通小麦( z 口甜玎y 研l l a a b b d d ) 又由它进化而来，这第二次杂交发生于8 0 0 0 l o 。0 0 0 年前的西南亚 2 首都师范人学博士学位论文 ( m c f a d d 饥和s e a r s ，1 9 4 6 a ，1 9 4 6 b ；k e f b e r 和r o w l a n d ，1 9 7 4 ：j a 髂k a ，1 9 8 0 ：d v o r 酞等， 1 9 9 8 ；h u 锄g 等，2 0 0 2 ) 。近年来在序列比较分析、系统进化分析和地理生物学等方面的 研究认为小麦的这种异源六倍体化过程可能不止发生一次，而可能是不同个体问多次偶然 杂交和基因交流的结果，换句话说就是，六倍体小麦的起源供体四倍体和二倍体可能都不 止一个( d v o r 矗k 等，1 9 9 8 ；a l l 曲y 等，1 9 9 9 ；h u 粕g 等，2 0 0 2 ；y 龇等，2 0 0 3 a ；g u 等， 2 0 0 4 ；g i l 铝和b r o w n ，2 0 0 6 ) 。当然科研人员也提出这些在基因水平表现出的等位变异 多样性也可能暗示栽培二粒小麦经过了至少两次的驯化过程，并涉及到不同基因型的不同 野生种，或者也可能一次驯化后又接受了其他野生型基因型个体的基因渗入( a l l a b y 等， 1 9 9 9 ) 。但是对六倍体小麦的多倍体化目前还存在很多争论，如z o h a r y 和h o p f ( 2 0 0 0 ) 、 a 1 1 d r e w s ( 1 9 6 4 ) 认为小麦的六倍体化只发生在亚洲，欧洲斯卑尔脱小麦应来源于亚洲斯 卑尔脱小麦，可能与面包小麦拥有共同的有壳祖先( s i e d l e r 等，1 9 9 4 ) ，也可能是另外一 次独立的杂交过程形成的( d v o r 矗l 【等，1 9 9 8 ) 。b l a 仕盯等( 2 0 0 4 ) 则提出欧洲斯卑尔脱 小麦是由四倍体小麦向脱粒六倍体小麦逐渐进行基因渗入形成的，反对有壳祖先和独立杂 交