（遗传学专业论文）痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠神经毒性的机制研究.pdf

痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠神经毒性的机制 研究 中文摘要 研究生：陆军 导师：谢维( 教授) ，郑元林( 教授) 东南大学基础医学院 本文研究了痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠神经毒性的机制，实验分四个部分： 一、痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠的学习记忆行为研究 采用开场行为实验、避暗法实验、m o r r i s 水迷宫实验检测了连续饲喂含有2 胆固醇的食 物和饮用浓度为0 2 1 p p mc u s 0 4 的去离子水处理8 周的小鼠发现，共同处理组的小鼠被观察 到，其开场活性显著性下降( 尸 o 0 5 ) ；记忆保持潜伏期显著性减少( 砌0 5 ) ；空间学习记 忆能力显著性降低( p 0 0 5 ) 。 二、痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠脑部抗氧化水平的改变 在铜和胆固醇共同处理的小鼠上，检测其脑组织中的c u , z n s o d 活力和m d a 含量。发 现，共同处理组的小鼠脑组织c u , z n s o d 活力显著下降( 尸 o 0 1 ) ；m d a 含量显著升高妒 0 0 1 ) 。 三、痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠脑部a p pm r n a 水平的改变 利用原位杂交的方法检测铜和胆固醇共同处理的小鼠脑部a p pm r n a 表达的变化，同时 利用免疫组化方法检测了脑内a p 的沉积。发现，铜和胆固醇共同处理使小鼠脑部的a p p m r n a 表达显著性增加，促进小鼠脑部a p 沉积显著性增加( p o 0 0 1 ) 。 四、痕量铜离子诱导饲喂胆固醇小鼠脑部神经元细胞凋亡的研究 利用免疫组织化学方法检测了铜和胆固醇共同处理组的小鼠脑部的c a s p a s e 3 的活化，同 时利用t u n e l 染色法检查了铜和胆固醇共同处理的小鼠脑部神经元细胞的凋亡。发现，铜和 胆固醇共同处理使小鼠脑内c a s p a s e 一3 活化显著性增加妒 0 0 1 ) ，促进小鼠脑内神经元细胞凋 亡显著性增加( p 0 0 1 ) 。 以上研究结果为进一步的预防和治疗神经退行性疾病提供了理论基础。 关键词：学习记忆、铜、胆固醇、a p p 、a p 、细胞凋亡、神经毒性、抗氧化 m e c h a n i s mo f n e u r o t o x i c i t yi n d u c e db yt r a c e a m o u n t so fc o p p e ri nt h ec h o l e s t e r o l - f e dm i c e a b s t r a c t g r a d u a t es t u d e n t ：l uj u n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx mw e i ，p r o f e s s o rz h e n gy u a n l i n s c h o o lo fb a s i cm e d i c a ls c i e n c e ，s o u t h e a s tu n i v e r s i t y 硼= l em e c h a n i s mo fn e u r o t o x i c i t yi n d u c e db yt r a c ea m o u n t so fc o p p e ri nt h ec h o l e s t e r o l - f e d m i c ew a si n v e s t i g a t e di nt h ep r e s e n ts t u d y t h ee x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u ta sf o l l o w e d ： 1 e s t a b l i s h m e n to fm o u s em o d e lo ft r a c ea m o u n t so fc o p p e r - i n d u c e dn e u r o t o x i c i t yi nt h e c h o l e s t e r 0 1 f e dm i c ea n di t ss t u d yo fl e a r n i n ga n dm e m o r y i nt h eb e h a v i o r a lt e s t s w ef o u n das i g n i f i c a n td e c l i n ei n1 0 c o m o t o ra c t i v i t yi no p e nf i e l d t e s t ( p 0 0 5 ) ，ad e c r e a s el a t e n c i e si nt h es t e pt h r o u g ht e s ta n ds p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r yd e f i c i t s i nt h em o r r i sw a t e rm a z et e s ti nt h ec h o l e s t e r o l - f e dm i c ec o - t r e a t e dw i t ht r a c ea m o u n t so fc o p p e r , a s c o m p a r e dw i t hn o r m a lg r o u p 2 t h es t u d yo fa n t i o x i d a n ta c t i v i t yi nt h eb r a i no fc h o l e s t e r 0 1 f e dm i c et r e a t e dw i t ht r a c e a m o u n t so fc o p p e r w ee x a m i n e dt h ec u z n s o da c t i v i t ya n dt h em d a l e v e li nt h ec o - t r e a t e dm i c e 1 1 1 ec u z n s o da c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nt h eb r a i no fm i c ec o t r e a t e dw i t h c o p p e ra n dc h o l e s t e r o l ，a sc o m p a r e dw i t hc o n t r o l s ( p 0 01 ) ，w h i l et h em d a l e v e lw a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e di nt h eb r a i no f c o t r e a t e dg r o u p ( p 0 0 1 ) 3 t h es t u d yo ft h el e v e lo fa p pm r n ai nt h eb r a i no fc h o l e s t e r o l - f e dm i c et r e a t e dw i t ht r a c e a m o u n t so fc o p p e r 腑e x a m i n e dt h el e v e lo fa p pm r n ai n t h eb r a i no fm i c ec o t r e a t e dw i t hc o p p e ra n d c h o l e s t e r o lb yi ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，a n dt h ea c c u m u l a t i o no fa pb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( i h c ) f o l l o w i n gr e s u l t sw e r eo b s e r v e d ： 1 1 1 ea p pm r n al e v e li nt h eb r a i no fm i c ec o - t r e a t e dw i t hc o p p e ra n dc h o l e s t e r o ls h o w e da s i g n i f i c a n ti n c r e a s ea sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l s a n dt h ea c c u m u l a t i o no fa bw a sa l s o s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h eb r a i no fm i c ec o t r e a t e d 、析t hc o p p e ra n dc h o l e s t e r o l ( p 0 0 01 ) 4 t h es t u d yo fn e u r o n a la p o p t o s i si n d u c e db yt r a c ea m o u n t so fc o p p e ri nt h ec h o l e s t e r o l - f e d m i c e t h ea c t i v a t i o no fc a s p a s e 3i nt h eb r a i no fm i c ec o - t r e a t e dw i t hc o p p e ra n dc h o l e s t e r o lw a s e x a m i n e db yi h c ，a n dt h en e u r o n a la p o p t o s i sw a se x a m i n e db yt l 丌v e la s s a y f o l l o w i n gr e s u l t s w e r eo b s e r v e d ： 1 1 l ea c t i v i t yo fc a s p a s e 一3w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h eb r a i no fm i c ec o t r e a t e dw i m c o p p e ra n dc h o l e s t e r 0 1 t h ec o - t r e a t m e n to fc o p p e ra n dc h o l e s t e r o lc o u l da l s os i g n i f i c a n t l yi n d u c e n e u r o n a la p o p t o s i si nt h em o u s eb r a i n 砀u s 。t h e s er e s u l t sm a yl a yat h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a c ho fp r e v e n t i o na n d t h e r a p yo fn e u r o g e n e r a t i v ed i s e a s e s k e yw o r d s ：l e a r n i n ga n dm e m o r y 、c o p p e r 、c h o l e s t e r o l 、a p p 、a 1 3 、c e l la p o p t o s i s 、n e u r o t o x i c i t y 、 a n t i o x i d a n t a d ab a m p a p l p a p o e a p p c a d b s a c u ，z n ，一s o d c y p 4 6 e d t a c d n a d a b d d h ：0 d e p c d n a d n t p e c o l i d t t f a d g s k - 3b i c a d i h c l a c t l b m d a p a r p p b s p c r p m s f p s i p s 2 r o c k i r o s r t s p t b s t u n e l 符号、缩略语等专用术语注释表 a 1z h e i m e r sd is e a s e b e t a a m y l o i d a m p l i c i l l i n a m y l o i dp r e c u r s o r li k ep r o t e i n s a p o li p o p r o t e i ne b e t a a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n c a s p a s e - a c tiv a t e dd n a s e b o v i n es e r u ma l b u m i n c u - z ns u p e r o x i d ed i s m u t a s e c h o l e t e r o l 一2 4 s h v d r o x y l a s e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d c o m p l e m e n t a r yd n a d i a m i n o b e n z i d i n e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d ie t h y p y r o c a r b o n a t e d e o x v r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e s c h e r i c h i ac o l i d it h i o t h r e i t o l f a m i l i a la d g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 一3b i n h i b i t o ro fc a s p a s e a c t i v a t e dd n a s e i m m u n o h i s t o c h e m is t r y l e c i t h i nc h o l e s t e r o la c y l t r a n s f e r a s e l u r i ab e t a n im e d i a m a l o n d i a l d e h y d e p o l y ( a d p r i b o s e ) p o l y m e r a s e p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f l u o r i d e p r e s e n i l i nl p r e s e n i l i n2 r h o a s s o c i a t e dc o i l e d c o i lf o r m i n gk i n a s ei r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r e v e r s et r a n s c r i p ti o n s e n il ep l a q u e t r isb u f f e r e ds a l i n e t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e ( t d t ) 一m e d i a t e dd u t p n i c k e n d l e b e l i n g n e u r o f i b r ill a r yt a n g l e s m 阿尔茨海默症或老年性痴呆 b 淀粉样蛋白 氨苄抗生素 b 淀粉样前体类似蛋白 载脂蛋白e b 淀粉样蛋白的前体蛋白 c a s p a s e 活化的d n a 酶 牛血清白蛋白 铜、锌超氧化歧化酶 胆固醇一2 4 s - 羟化酶 乙二胺四乙酸二钠盐 互补d n a 3 ，3 一四盐酸二氨基联苯胺 双蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 三磷酸脱氧核( 糖核) 苷 大肠杆菌 二硫苏糖醇 家族型a d 糖元合成酶激酶36 c a d 抑制子 免疫组织化学 卵磷脂胆固醇乙酞转移酶 l b 培养基 丙二醛 多聚( a d p - 核糖) 聚合酶 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 苯甲基磺酰氟化物 早老素一1 早老素一2 活性氧自由基 逆转录反应 老年斑或b 一淀粉样蛋白沉 积斑 t r i s 缓冲生理盐水 脱氧核糖核苷酸末端转移 介导的缺口末端标记技术 神经元纤维缠结 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 e l 期：勿曙彩形 绪论 绪论 2 0 世纪的成就之一，就是人类的平均预期寿命都得到了延长，导致了世界上越来越多的 老年人享有高龄，这也标志着人口老龄化时代的到来。随着人口老龄化现象加剧，与老龄化 相关的疾病，如老年性痴呆( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 等患病率明显升高。a d 是一种慢性、进 行性神经系统变性疾病，其临床表现为进行性的记忆、理解、判断、定向等认知功能障碍， 精神行为异常以及生活自理能力减退，疾病后期出现严重痴呆，丧失生活自理能力，给家庭 和社会带来沉重负担，a d 己经继心脏病、肿瘤和脑卒中之后成为第四位的死亡原因。目前， 对该病的诊断和治疗没有理想的药物。对其发病机制和防治的研究己成为近年来世界各国关 注的焦点。虽然目前有关a d 的发病机制、以及诊断和治疗方面己经取得了很多成就，但仍 有许多方面还是处于未知状态有待于进一步探索。在新的世纪里，人类的生活水平和质量得 到了进一步的提高，揭开a d 发病机制之迷，科学有效地提出预防和治疗对策，已成为倍受 关注的科学前沿。当前以a d 发病机理为主轴，开展与其相关的基础理论研究及应用领域的 研究势必对进一步阐明其本质、预防和治疗老年性疾病有着深远的影响。近代医学研究表明 a d 的发病过程是一种非常复杂的生物学过程。在a d 病理学过程中，脑组织受到影响最大。 脑衰老( s e n e s c e n c eo f b r a i n ) 或脑老化( a g i n go f b r a i n ) 带来的学习记忆功能衰退最后导致老 年痴呆症已成为广泛重视的社会问题。老年人思维活动不敏捷甚至思维迟钝、注意力难以持 续集中、学习记忆能力减退等现象都是脑功能衰退的表现。如何在a d 发病早期作出正确的 诊断和治疗也需要对a d 的发病过程和发病机制开展大量的研究，防止a d 患者脑功能不断 恶化的研究不仅对神经生物学和脑科学的发展有理论意义，而且更有重大的社会效益。认识 脑、保护脑、开发脑潜能是当今世界各国的共识。在社会人口老龄化的今天，延缓脑功能衰 退，是脑保健的核心问题之一。 东南大学博士学位论文 文献综述 随着全世界人口的老龄化，a d 的发病率越来越高。全世界至少有5 , 0 0 0 万a d 病人。我 国a d 患者人数约为5 0 0 万左右。据统计，该病在6 5 岁以上人群的发病率为5 1 0 ，8 0 岁以 上人群的发病率为3 0 。阿尔茨海默病已经严重地威胁到老年人的健康，是最常见的神经系 统疾病之一，直接导致病人痴呆【l j 。a d 病人不仅给自己带来极大痛苦，而且给亲人和社会带 来严重的精神和经济负担，已成为医学和社会的世界性难题，引起了世界各国政府和科研工 作者的密切关注。目前阿尔茨海默病已经继心脏病、肿瘤和脑卒中之后成为人类的第四大杀 手。a d 的病理特征主要包括：( 1 ) d 淀粉样蛋白沉积斑或老年斑( s e n i l ep l a q u e ，s p ) ，s p 的核心 成分是不溶性的6 淀粉样蛋白( a d ) ，沉积于神经元外及血管外周，其周围存在水肿、营养不 良性轴索、轴突及树突、小角质细胞等。a b 在脑内沉积的范围与神经损伤、认知受损及记忆 缺失的程度相关。研究发现a d 的沉积是导致神经元变性和突触丢失的主要原因，并与学习 记忆以及a d 神经细胞凋亡有关【2 j 。( 2 ) 神经元纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e sn f t ) ，电镜检 查n f t 由成对的、约1 0 n m 的丝状螺旋神经纤维纠结而成。其主要构成蛋白是高度磷酸化的 微管相关蛋白_ 1 a u 蛋白【3 l 。( 3 ) 区域性神经细胞死亡，大脑皮层萎缩，以胆碱能神经元受损 最为严重，额颖区、海马前下脚受累最为明显【4 】。另外，老年性痴呆患者脑血管内常发生类 淀粉样物质沉积，还存在神经毡细幺幺- ( n e u r o p i lt h r e a d s ) 等。a d 的发病机制复杂目前还不是很 清楚，一般认为它属于复合疾病( c o m p l e xd i s e a s e ) ，即多种遗传基因和多种环境因素在疾病的 发生发展中共同起作用。目前已发现a p p ，p s 1 ，p s 2 ，a p o e 4 ，t a u 等基因和疾病的发生相关川。 但大部分a d 患者( 9 0 ) 没有这些基因突变，即主要由环境因素引起的l 副。无论是基因突变 a d 患者还是环境诱发的a d 患者，他们的共同点是脑部都有b 淀粉样蛋白的异常增加与沉 积。因此，a b 的代谢一直是a d 研究的重点。代谢涉及合成分解过程，相关基因以及影响它 们的一切因素。近年来资料表明胆固醇在a d 发病机制中是一个确定的危险因素。人们发现 血胆固醇高的老年人更易于患a d 【6 ，7 】，且中年有高胆固醇血症，那么以后更易患a d 引。降胆 固醇药物可减缓a d 认知障碍和影响a d 进程 9 1 ，服用抑制胆固醇合成的他汀类药物的人群， a d 的发病率明显降低【l o 12 1 。有趣的是，最近美国科学院院刊的报告指出，饲喂高剂量胆固 醇食物( 2 胆固醇) 的兔子再饮用含有痕量铜离子的水( 0 1 2 p p mc u 2 + ，低于环境规定的铜 污染的最低浓度1 3 p p m ) 脑部出现a d 的一些病理学特征l l3 。以前资料显示铜是生物有机体 必需的营养元素【i3 1 ，但是越来越多资料也指出铜作为引起体内自由基产生的金属离子之一， 也参与a d 的病理学发生发展的过程中i l4 。本文就a d 、铜、a p p 与胆固醇以及之间的关系 作一综述。 一、a d 的病理学特征 a d 的发病率在退行性疾病中位居首位，是一种渐进性的神经退行性疾病，为老年性痴呆 中最常见的病因。临床表现为：进行性认知功能下降，记忆和日常生活能力的丧失；晚期患者 甚至不能识别家庭成员。病变最易累及的区域是与高级认知功能相关的脑区，特别是新皮层 和海马。脑组织病理检查可见到大脑前叶、颞叶和顶叶部位组织萎缩：显微镜下，大脑皮层内 有大量神经纤维缠绕的斑块，其核心为淀粉样物质，主要为a b 小分子蛋白肽( a p p 产物) ，周围 有活化的星形胶质细胞和小胶质细胞。这些特征性病理改变包括：细胞外淀粉样蛋白沉积 ( s e n i l ep l a q u e s ，s p ；俗称老年斑) 、细胞内神经纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t s ) 、相关脑区 ( 基底前脑、海马和新皮层等) 内神经突触和锥体神经元消失等。n f t s 的聚集主要是由于微管 t a u 蛋白异常高度磷酸化；s p 的淀粉样沉积物主要成份是1 3 淀粉样蛋白( a p ) ，由淀粉样前体蛋 i 刍( a p p ) 分解而来，被认为在a d 的发病机制中起着十分重要的作用【l 引。 文献综述 二、a d 的遗传学和b 一淀粉样蛋白假说 a d 的遗传学可以被认为是种年龄依赖的模式，包括早发型( 年龄 6 0 岁) 的增加发病概率的遗传学危险因子【l 引。早发家族型a d ( f a m i l i a la d ，f a d ) 被确认与以下基因有关：位于第2 l 号染色体上的b 淀粉样蛋白的前体蛋白( b e t a - a m y l o i d p r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 基因、位于第1 4 号染色体上的早老素1 ( p r e s e n i l i n1 ，p s l ) 基因和位于 第l 号染色体上的早老素2 ( p r e s e n i l i n2 ，p s 2 ) 基因。这三个基因所引起的早发型a d 占所有早发 型a d 的4 0 1 1 7 j 。而a d 病人中绝大多数( 约为9 0 ) 为晚发型a d 病人。现已有超过3 6 种基因被 报道可能是晚发型a d 的危险因子，其中只有位于第1 9 号染色体_ l a p o e 基因的e 4 等位基因被 学术界一致确认为和a d 相关【l6 1 。另外，还发现几个其他基因的多态也可以引起a d ，但是还 没有确凿的证据。例如，编码仅2 巨球蛋白，一种大的金属蛋白酶抑制剂，它与晚发型a d 发病 有关。因此，a d 是一种受遗传因子和环境因子共同作用的多因子引发的疾病。但是，无论早 发型还是晚发型a d ，它们的一个共同特征是b 淀粉样蛋l 刍( b e t a a m y l o i d ，a d ) 在脑的特定区域的 异常聚集。这种异常聚集在细胞外形成老年斑，是a d 特征性的病理改变之一。a d 又是主要 来源于a p p j j i ：i 工代谢的途径。 三、a p 的生成 a b 肽首先从a d 和唐氏综合征患者的脑部老年斑纯化和测序获得【l8 1 9 】。它来源于其前体 物质d 淀粉样前体蛋i 兰t ( a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 经过水解产生的3 9 4 3 个氨基酸残基的 疏水性多肽，相对分子量约为4 k d ，三维结构呈b 型折叠，有很强的自聚性，易于形成难溶的 沉淀。a p p 是一种i 型跨膜糖蛋白，包含一长的细胞p i - n 端和一短的细胞内c 端，广泛分布于 体内各种组织，尤其以脑、肾、心脏及脾脏中含量较高。它属于多基因家族，它至少含有两 种别的同源形式，包括d 淀粉样前体类似蛋白1 和d 淀粉样前体类似蛋白2 ( a p l p l 和 a p l p 2 1 2 0 2 4 】) 。a b 是a p p 的跨膜区段，包括胞外2 8 个氨基酸和跨膜区1 5 个氨基酸。体内a p p 代谢加工可以经过两种水解方式产生两种不同的切割产物( 图i ) 。在生理条件下，多数a p p 在a 分泌酶作用下，在a b 的第1 6 位赖氨酸和第1 7 位亮氨酸之间发生裂解，产生分泌型0 【a p p s 及c 8 3 ；c 8 3 再在丫分泌酶作用下生成不完整的a d ，称作p 3 成分，0 【a p p s 、p 3 对机体是无毒的， 但是其生理作用目前还不清楚；极少部分a p p 在胞质溶酶体经p 一分泌酶先在a d 的氨基端裂解， 裂解成生成b a p p s 及c 9 9 ，c 9 9 再在丫- 分泌酶作用裂解为a b l 2 5 j 。在病理状况下，a b 的分泌量 可高于正常的4 1 0 倍。丫分泌酶催化位置的不同可产生由3 9 - 4 3 个氨基酸所组成的长度不同的 a b ，以a 1 3 4 0 和a 1 3 4 2 最常见。a d 几种形式中毒性较大的是a 1 5 4 0 和a 阱2 ，其中又以a 1 3 4 2 更容易 引起聚集，具有最强的细胞毒性【2 6 】。a p p f - - 圣过切割产生a d 过程中，p 分泌酶和丫分泌酶发挥了 重要作用，这两种酶实际上都是天冬氨酸蛋白酶，其理想的活性条件是偏酸性环境。丫分泌酶 在b 淀粉样蛋白产生中起非常重要作用，它决定了产生的a 1 3 4 2 在其中所占的比例；现在认为， 此酶至少p r e s e n i l i n 、n i c a s t r i n 、a p h 1 和p e n - 2 四种的跨膜蛋白组成1 27 。p r e s e n i l i n 且i 早老蛋 白，是y 一分泌酶的催化亚基，其成熟的形式存在于酸性的内吞体和质膜上。现已发现编码早老 蛋白1 ( p s l ) 的基因上的一百多个突变都能引起家族性老年痴呆【2 8 j ，其致病机制很可能是因为 突变体改如分泌酶活性，增力h a i m 2 产生的比例。 东南大学博学位论文 a p p ”_ t 雨 厂_ 二= 可曩昏丁 l e ：已u 。 b “ _ _ ： + + 坠竺些兰竺型掣 a b i c 一 图i ：a p p 6 9 5 蛋白结构域示意图 1 5 】 a a p p 6 9 5 结构域中肝磷j 目( h e p a r i n ) ，金属结合位点( c u ( i i ) ，z n ( i i ) ) ，磷酸化位点f p ) 和糖基 化位点( c h 0 ) 的相对位置，图中还显示了k p i ( k u n i t z 仲p r o t e i ni n h i b i t o r ) 共同序列和粘多糖硫 酸软骨素结合位点( c h o n d r o i t i ns o l p h a t eg l y c o s a m i n o g l y c a na t t a c h m e n ts i t e ，c s g a g ) ：b a p p 6 9 5 基因所含有的a 1 3n 端序列 四、a d 中的氧化应激 脑足身体中新陈代谢最旺盛的器官之一，在新陈代谢中需要消耗大量的氧气。一个睡眠 中的个体脑的氧气消耗量占有身体总需氧气量2 0 。无庸置疑，脑部维持和控制氧化平衡是 必须的，这个象其他器官一样也是被机体的抗氧化酶所调节。大量证据指出，在a d 患者脑部 这种正常的氧化代谢平衡发生了改变，氧化应激在a d 的发病机理中扮演重要的角色。一般来 说，机体内活性氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的化学来源是活性氧分子与氧化还 原金属铜和铁反应产生1 2 q i 。这些金属都含有多种化合价，可以进行氧化还原循环，活化氧分 子，这个原理在许多酶中得到充分利用。例如，铜蓝蛋白、细胞色素c 氧化酶和氨氧化酶p o 圳。但是这些氧化还原金属一旦失去正常调节，那么它们将不切当的与氧反应产生r o s 。这 时候，脑部葡萄糖6 磷酸脱氢酶活性增加口2 圳，亚铁血红素加氧酶水平也增加刚。出现的氧 自由基介导化学攻击导致自由羰基增加，脂质过氧化产物增加，蛋白质硝化产物和线粒体以 及核d n a 氧化产物增加。 由于上述的一系列的事件导致机体内广泛的脂质过氧化产物产生，已经发现a d 患者的脑 组织内含有高水平的丙二醛( m d a ) 和4 羟基壬烯醛( h n e ) i ”6 7 1 。这些醛类产物容易与机 体内的蛋白质、核酸和别的脂类分子发生亲核反应，研究发现a d 的脑组织内含有高水平的壬 烯醛( h n e ) 和蛋白质的结合物口6 ”l 。这些物质比自由基更危险，因为它们的半衰期更长， 容易从形成的部位扩散开去【帅】。众所周知，脑组织富舍不饱和脂肪酸，它们是高度易被氧化 物质，容易受到氧化攻击【4 l 】。总之，a d 患者脑部的醛类物质发起一系列的氧化事件导致细胞 功能紊乱乃至细胞死亡。有大量资料显示a b 可以产生这些自由基。 另一方面，蛋白质氧化产物的标志分子是蛋白羰酰基，它由活性氧直接攻击氨基酸链、 糖基链或者上面提到的脂质过氧化产物产生。高水平的蛋白羰酰基存在于a d 患者脑的额极、 海马和颢上中回，这很好的与a d 的组织病理学结合起来i ”4 ”。另外，a d 脑组织海马和新皮 层区内硝化的酪氨酸和交联酪氮酸也比正常的老年对照组高几倍”8 ”i 。在动物体中这些氧化 产物与氧化应激相关联”。通过对a d 脑部分离出的a b 分析拉现其组成的的甲硫氨酸被氧 化修饰为甲硫氨酸亚砜9 。5 4 j 。 文献综述 a d 患者脑部氧化应激的进一步证据是脑部的抗氧化酶活性也被调节。资料表明a d 患者 的脑部抗氧化酶，例如，超氧化歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 等，发生显著性改变【5 5 5 6 1 。这是机体保护机制对外来毒性物质的应答反应。另外，有大量证据显示，老年人服用抗 氧化剂，例如维生素c 、e 可以减少患a d 的风险胪7 1 。 五、a d 中的铜 铜是机体内许多氧化还原酶的必需成分，例如，电子传递链中的细胞色素c 氧化酶中含 有铜的结合位点；铜、锌超氧化歧化酶( c u ，z n ，s o d ) ，机体内抗氧化防御体系中的关键的 酶，也含有铜。但是，资料也显示，铜也参与a d 的病理学过程。 ( 一) 、脑部的铜 在血浆中，铜的含量是1 5 9 m ，而在脑脊髓液中铜的含量是7 0 9 m 。它绝大多数与蛋白质 紧密结合，而结合弱的铜浓度大约只有0 1 0 8 9 m ，尽管正常条件下，脑部细胞外的铜离子浓 度是o 2 1 7 9 m 5 8 螂j 。但是，在神经退行性疾病中这个值超过4 0 0 9 m 6 4 1 。另外，铜在脑的不同 区域含量是不同的，其中突触囊泡含量特别高。铜也主要与谷氨酸盐类神经元或者肾上腺素 类的神经元有关，特别是海马、嗅球和蓝斑【5 9 , 6 5 - 6 6 】。目前还不清楚中枢神经系统内的铜是如 何被运输的，但是铜的运输器三磷酸腺苷酶( a t p a s e ：a t p 7 a ，a t p 7 b ) 对铜的分配起到重要 作用【67 1 。实验研究发现a t p 7 a 和7 b 突变将导致神经退行性紊乱，分别患m e n k e s 综合征和 w i l s o n 病【6 引。 ( 二) 、铜与d 淀粉样前体蛋白( a p p ) 的关系 前面提到a p p 是跨膜糖蛋白，在其成熟过程经历选择性拼接，根据a p p 转录后剪接的不 同，产生的m r n a 可翻译生成多种亚型，如a p p 5 6 3 ，a p p 6 9 5 ，a p p 7 5 1 ，a p p 7 7 0 等，脑组织中 主要是a p p 6 9 5 圳。还发现a p p 的另两种同源形式a p l p l 和a p l p 2 ，a p p 和a p l p s 都含有a p p 绝大多数的结构域和基序，包括疏水膜和跨膜的结构域；n 、o 糖基化位点；金属结合结构域 和蛋白酶抑制结构域( a p l p l 没有) 。仅有a p p 含有a b 区域，才能被d 分泌酶和丫。分泌酶生成 a b 。因此，a p l p s 不能在a d 患者中导致a 1 3 沉积，但是它们是a p p 功能的补充。正常条件下， a p p 和a p l p s 功能还不清楚。但是一些证据也表明，它们可能具有抗炎的作用 7 0 - 7 3 j 。a p p 可 以结合铜改变a p p 的代谢和表达水平，最终导致神经毒性【7 2 , 7 4 - 7 9 】。而在无细胞的实验中，a p p 可以把c u 2 + 还原为c r ，导致神经元内的氧化应激增加r7 。7 1 。a p p 之所以有这种作用是它在 1 3 5 1 5 8 氨基酸残基区域有铜的结合结构域，这个区域序列与a p l p 2 有很高的同源性而a p l p l 没有( 图i ) 。在发现这个铜结合区域不久，人们又发现这个区域的1 4 4 位半胱氨酸残基是关 键点，它可以降低a p p 把c u 2 + 还原为c u + 的作用【7 7 t - 8 1 1 。当c u + 与a p p 形成复合物时，它们可 能参与把h 2 0 2 还原，在这个过程中形成a p p c u 2 + - o h 自由基的中间产物【7 4 一酬。文献认为1 4 4 位半胱氨酸残基与a p p 的1 3 5 1 5 8 其余的氨基酸残基结构与铜结合类似于铜与组氨酸残基结 合都能调节铜介导的脂质过氧化反应，也类似敲除a p p 基因的神经元发生神经元中毒现象【8 1 1 。 比较敲除a p p 基因的神经元与野生型神经元发现，野生型神经元容易受到生理浓度的铜的影 响，而别的金属没有这种现象。而在野生型神经元里增加的脂质过氧化反应很可能是铜介导 的氧化应激引起的。同样的现象也出现在含有完整的铜结合位点a p p l 4 2 1 6 6 的神经元和 a p p l 4 2 1 6 6 区域突变的神经元l s 。另外还发现成年小鼠的a p p 和a p l p 2 都可能参与组织中铜 浓度的维持【8 2 1 。与野生型小鼠相比，敲除a p p 基因的小鼠铜浓度在大脑皮层和肝脏出现显著 性增加。这些结果提示，a p p 家族基因调节铜的动态平衡，而a p p 和a p l p 2 表达调节铜从肝脏 和大脑皮层流出。由于a p p 和a p l p 2 运输铜的过程中产生活性氧自由基，这也直接与毒性联 系起来。这个也被最近发现证实，在真核细胞里c u 2 + 减少调节铜的吸收【8 引。资料也显示，铜 5 东南大学博士学位论文 也影响体外培养的细胞a p p 的加工过程，铜也可以减少a b 水平，铜增加促进是体a p p 分泌 增加【洲。 ( 三) 、铜、a b 和氧化应激 前面提到机体内的氧化还原活性的金属是由于它们都存在多种化合价，这便于在氧化还 原反应中的电子转移。而作为a d 的病理学发生发展中，a b 无疑是最重要的分子，资料已经 表明它也与a p p 一样是个金属蛋白，它与c u 2 + 、z n 2 + 和f e 2 + 离子具有高的亲和性1 8 副。而金属结 合的位点为6 号和2 8 号的氨基酸残基上。利用核磁共振技术揭示a 1 3 的6 ，1 3 ，1 4 号的组氨酸与 c u 2 + 结合【8 6 1 。a d 还可以还原c u 2 + 幕- i j f e 3 + 为c u + 和f e 2 + ，然后捕获分子氧产生自由基和h 2 0 2 【8 7 】。 资料证实产生的自由基去氧化3 5 号的甲硫氨酸残基，结果甲硫氨酸残基被正亮氨酸残基替代 8 8 9 5 】。另外，体外合成的人的a d 与铜结合时诱导其沉积【8 6 1 。a d 肽上的组氨酸残基对于a p 沉 积是相当重要的，当组氨酸突变或者被修饰时导致a b 沉积大量减少1 9 昏9 8 】。铜介导的a b 沉积与 别的金属不同( z n 等) ，这种作用条件是反应液p h 偏酸。铜的螯合剂能够减少a 1 3 沉积，这也 从反面说明铜对于a b 沉积是必需。 六、a b 的神经毒性作用 脑内的a d 是以单克隆、可溶性寡克隆、不可溶性寡克隆和不可溶性淀粉样纤维等形式存 在。可溶性寡克隆a 1 3 也具有毒性作用。a 1 3 在正常老年脑中也存在，它是机体细胞如神经细胞 和胶质细胞正常代谢的产物，不过a d 患者脑内，a 1 3 明显高于正常人。资料发现，在a p p 转基 因小鼠脑内明显的淀粉样斑块形成之前，小鼠已经出现了学习记忆功能的减退，将未聚集的 a b 进行大鼠脑室注射，也观察到大鼠出现学习记忆障碍，提示可溶性的a d 具有神经毒性作用。 在脑室内注射含有寡克隆和单克隆a b 的细胞液可以明显地抑制海马的长时程增强。如果 选择性降解单克隆a b 不能阻止海马的长时程增强受到抑制的现象，但是用丫分泌酶抑制剂处 理后，可以明显的降低寡克隆a p 的形成，海马的长时程增强被抑制的现象消失。在另一实验 中发现，在2 4 个月龄的a p p 转基因小鼠脑中突触前终末耗竭明显与可溶性a b 水平呈正相关， 这时已经出现了学习记忆障碍，这说明在a d 发病的早期还未出现明显的淀粉样斑块之前，学 习记忆功能的减退与可溶性a b 水平升高所引起的突触功能障碍密切相关【叫。在细胞学实验己 经证明，针对可溶性寡克隆a d 的抗体可以中和其毒性l l 删。这些证据均证明在a d 发病尤其是 早期主要引起细胞毒性作用的物质是可溶性寡克隆a d 。 七、a 6 神经毒性的机制 在a d 患者脑中神经元的丢失可能与脑部过量的自由基积累引起的氧化损伤有关【l o l - 1 0 5 1 。 前面提到机体脑部的自由基产生主要来自体内的过渡性金属铜和铁的代谢。尽管它们对于机 体是必需的，但是如果它们在体内没有被有效的调节，那么诸如羟自由基等有毒性自由基可 能被产生【2 9 1 。前面也提到在a d 脑中，金属的动态平衡发生显著性变化，这可能是a d 发病的 原因之一【10 2 1 。 体外已经观察到合成的a b 对于培养的神经元具有毒性，这可能的原因是a d 作为过氧化氢 酶的底物，被催化产生h 2 0 2 ，从而对正常的神经元产生的氧