（分析化学专业论文）水溶性cdte量子点与生物分子的偶合作用及机理研究.pdf

摘要 半导体量子点由于具有独特的光学特性，使其成为理想的荧光探针，在分子生物学 和生物工程学的超灵敏、多色和多组分检测，肿瘤靶向药物开发，药物筛选等领域，将 有广阔的应用前景。本论文集中在量子点与生物小分子的偶合作用及机理研究，主要研 究内容及结果如下： 1 以腺嘌呤和c d t e 为研究对象，通过荧光光谱、吸收光谱、红外光谱和透射电镜 等分析手段，探讨二者之间的相互作用机理及其影响因素，这对进一步研究量子点与生 物大分子( 如d n a ) 的偶合机制，拓宽和加深量子点在免疫检测等生物医学领域的应 用有着重要的指导意义。 ( 1 ) c d t e 量子点可以和腺嘌呤偶联，但反应条件对偶合物的荧光强度影响很大。 实验结果表明：c d t e 量子点与腺嘌呤偶联，在回流时间为1 h 时，生成的偶合物荧 光强度最强；中性反应介质中，所得的偶合物荧光强度高于酸性和碱性介质；体系保持 a d e n i n e c d t e 的配比在o 2 5 区域内，偶合物都能获得较强的荧光强度；当n a c l 浓度在 0 0 5m o l l 1 时，偶合物的荧光强度能达到最大值。 ( 2 ) 腺嘌呤、鸟嘌呤分别与c d t e 作用后，其偶合物的荧光强度均增加，其中腺嘌呤 与c d t e 量子点偶合物的荧光强度最大。将c d t e 、c d t e a d e n i n e 、c d t e g u a n i n e 偶合物 低温放置，c d t e a d e n i n e 偶合物的荧光强度自然衰减速度最慢，幅度最小，c d t e 本身 次之，c d t e g u a n i n e 最不稳定。由此得出，腺嘌呤与c d t e 间的氢键作用和配位作用对 偶合物的荧光强度影响很大。另外，c d t e 、c d t e a d e n i n e 、c d t e g u a n i n e 偶合物低温放 置，它们的波长变化趋势不明显。 ( 3 ) 通过红外光谱、t e m 、荧光光谱、吸收光谱、荧光倒置显微镜的对比分析，初步 阐明了腺嘌呤与c d t e 的作用机理。 2 以他莫昔芬( t f ) 为p g p 抑制剂，以盐酸多柔比星( d h ) 为抗癌药物，分别与不 同尺寸的量子点合成c d t e t f 探针和c d t e d h 探针，再以p g p 糖蛋白中的- - d , 段多肽 为研究对象，通过荧光光谱、吸收光谱和红外光谱分析，探讨c d t e t f 探针与多肽的相 互作用机理和c d t e d h 探针与多肽的相互作用机理。 实验结果表明：多肽能够加强c d t e t f 探针和c d t e d h 探针的荧光强度，而且最 大发射波长几乎不移动。c d t e t f 探针和c d t e d h 探针与p e p t i d e 的之间的相互作用， 主要是配位作用和氢键作用。 关键词：c d t e 量子点；腺嘌呤；他莫西芬；盐酸多柔比星；多肽 a b s t r a c t s e m i c o n d u c t o rq u a n t u md o t s ( q d s ) ，b e c a u s eo ft h e i ru n i q u eo p t i c a lp r o f i l e s ，a r e c o n s i d e r e dt ob ea i li d e a lf l u o r e s c e n c ep r o b e a p p l i e dt os u p e rs e n s i t i v ed e t e c t ，m u l t i c o l o ra n d m u l t i c o m p o n e n ta n a l y s i s ，t u m o rt a r g e tc e l lm e d i c i n es e l e c t i o na n dd e v e l o p i n gi nt h ef i e l do f m o l e c u l eb i o l o g ya n db i o e n g i n e e r i n g i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，w ef o c u s e do nt h em e c h a n i s mo f r e a c t i o nb e t w e e nc d t eq d sa n ds m a l lb i o m o l e c u l e s t h ed e t a i l e dc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： 1 i n t e r a c t i o nb e t w e e nc d t eq d sa n da d e n i n ei s i n v e s t i g a t e db yu s i n gf l u o r e s c e n c e s p e c t r a ，a b s o r p t i o ns p e c t r a , i n f r a r e ds p e c t r o m e t r ya n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yi n o r d e rt of i n dt h em e c h a n i s mo fq d s r e a c t i n gw i t hs o m eb i o m o l e c u l e ss u c ha sd n aa n d e n l a r g et h ea p p l i c a t i o no fq d si nb i o m e d i c i n ef i e l d ，e s p e c i a l l yi n i m m u n i t yd e t e c t c t i o n ( 1 ) c d t ec a nc o m b i n ew i t ha d e n i n em o l e c u l e ，t h er e a c t i o nc o n d i t i o nh a sg r e a te f f e c to n t h ep li n t e n s i t yo fc o n j u g a t e s i no r d e rt oo b t a i nh i g h e rp li n t e n s i t ya n dm o r es t a b l e c o n j u g a t e st h ec o n d i t i o ns h o u l db ec o n t r o l l e di na1 0 w e ri o n i cs t r e n g t hs o l u t i o n 1 e s st h a nlh r e f l u xt i m e ，n e u t r a lp ha n d0 2 - 5a sm o l a rr a t i oo fa d e n i n et oc d t e ( 2 ) t h ep li n t e n s i t yo fc d t e a d e n i n ec o n j u g a t ei st h eh i g h e rt h a nt h a to fc d t e g u a n i n e ， b o t ho ft h e ma r em o r et h a nt h a to fc d t ei t s e l f a f t e rs e v e r a ld a y su n d e rl o w t e m p e r a t u r et h e p li n t e n s i t yo fc d t e - g u a n i n ec o n j u g a t ea t t e n u a t e s s h a r p l yw h e r e a st h ep li n t e n s i t yo f c d t e - a d e n i n ed e c r e a s e ss l o w l y o n ec o n c l u s i o ni st h a tt h ec o o r d i n a t i o n ，h y d r o g e nb o n d i n g a n dc o n j u g a t e ds t r u c t u r eo fa d e n i n ec a nm a k e g r e a ti n f l u e n c eo nt h ep li n t e n s i t y i tc a na f f e c t t h es t a b i l i t yo ft h ec o n j u g a t e s a n dt h ep lp e a kp o s i t i o n so fc d t e a d e n i n e ，c d t e g u a n i n e c o n j u g a t e ，c d t eq d su n d e rl o wt e m p e r a t u r ea r ec o n s t a n t ( 3 ) t h em e c h a n i s mo ft h ec o n j u g a t i o nb e t w e e nc d t ea n da d e n i n eh a sb e e ni n v e s t i g a t e d b yt e m ，f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n dp h o t o l u m i n e s c e n c e ( p l ) ，i r ，u v v i ss p e c t r aa n a l y s i s 2 w eu s ed o x o r u b i c i nh y d r o c h l o r i d e ( d h ) a sd r u g ，t a m o x i f e n ( t f ) a sp g l y c o p r o t e i n i n h i b i t o rt oc h e m i c a l l ym o d i f yt h es u r f a c eo fo r a n g ea n dg r e e nc d t eq d s ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e rt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e np e p t i d eo fp - g l y c o p r o t e i na n dt w op r o b e s ( r e d e m i t t i n g c d t e d h ，g r e e ne m i t t i n g - c d t e t f ) w a sa n a l y z e db a s e do nt h er e s u l t so b t a i n e d f r o mi r ，p l ，a n du v - v i ss p e c t r a t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np e p t i d ea n dc d t e d hc a ne n h a n c et h ep li n t e n s i t y ，a n dt h e p e a kp o s i t i o no f c d t e d h p e p t i d ei ss t a b l e ，c o m p a r i n gt op u r ec d t e d h t h es a m et e n d e n c y c a na l s ob es e e nf o rp li n t e n s i t ya n dp e a kp o s i t i o no f c d t e - t f p e p t i d e i tm a yb er e s u l to f c o o r d i n a t i o na n d h y d r o g e nb o n d i n gb e t w e e np e p t i d ea n dc d t e d ho rc d t e t f k e yw o r d s ：c d t eq d s ；a d e n i n e ；d o x o r u b i c i nh y d r o c h l o r i d e ；t a m o x i f e n ；p e p t i d e i i 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：2 虽鲎蛹日期：丝颦：皇渔一 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东：l k n 范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：缓盈摇i 指导教师签名： 日 期：迦2 t 皇，和日 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 第一章引言 量子点通常指半径小于或接近其玻尔激子半径的纳米颗粒。半导体量子点是纳米尺 度原子和分子的集合体，一般粒径范围在2 - - 4 0 r i m 。半导体的费米能级位于价带和导 带之间( 图1 1 ) ，带边控制着其低能光学和电子行为，由于带边的态密度很小，当 半导体材料的体积减小时，在带边引起的态密度的变化会引起带隙宽度 ( b a n d g a p ) 的变化，从而导致物体光学和电子行为的很大改变，而且体积越小， 带宽就越大，所以半导体的光电性质在很大程度上依赖于材料的尺寸【1 七j 。 1 1 半导体量子点的特性i “1 1 l 1 1 1 量子尺寸效应 量子尺寸效应( q u a n t u ms i z ee f f e c t ) 又称量子限域效应，是指当粒子尺寸下降到一定 值时，金属费米能级附近的电子能级由准连续能级变为离散的分立能级的现象，由于半 导体纳米微粒存在不连续的最高被占分子轨道( h o m o ) 和最低未被占据的分子轨道 ( l u m o ) 能级，能隙随微粒尺寸减小而变宽并引起吸收光谱阈值向短波方向移动的现象， 也称量子限域效应。图1 2 显示了块体材料和低维材料中的电子态密度。随着材料尺寸 的降低，准连续能带逐渐消失，在量子点中出现完全分立的能级。 图1 1 半导体量子点的局域态密度 东北师范大学硕士学位论文 图1 2 块体材料和低维材料中的电子态密度5 】 1 1 2 小尺寸效应 当超细微粒的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等 物理特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏；非晶态纳米微粒的颗粒 表面层附近原子密度减小，导致声、光、电、磁、热、力学等特性呈现新的小尺寸效应。 例如，纳米微粒的光吸收显著增加；磁有序态向磁无序态、超导相向正常相的转变；声 子谱发生改变等，都是由于小尺寸效应造成的。纳米粒子的小尺寸效应为实用技术开拓 了新领域。例如，纳米尺度的强磁性颗粒( 氧化铁等) ，可制成磁性信用卡、磁性钥匙、 磁性车票等。又如：块状金的熔点为1 3 3 7 k ，而2 r i m 的金颗粒熔点为6 0 0 k 。 1 1 3 表面效应 表面效应是指纳米粒子表面原子数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后所引 起的性质上的变化。随着纳米粒子尺寸的减小，比表面积增大，表面能迅速增加，表面 原子百分数也急剧增加。图1 3 为表面原子数占全部原子数的比例和粒径之间的关系。 粒径为1 0 n m 时，表面原子数占全部原子数的比例为2 0 ，而当粒径降到l n m 时，比 例猛增至9 9 。 晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电 子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高， 它的增强使得其吸收带蓝移，荧光发射峰位也相应蓝移。 由于表面原子数相对增多，原子配位不足，导致大量不饱和键和悬键的产生，从而 引起原子表面能提高，使这些表面原子具有高的活性，极不稳定，很容易与其他原子结 合。例如，金属的纳米粒子在空气中会燃烧，无机的纳米粒子暴露在空气中会吸附气体， 并与气体进行反应。而且纳米粒子越小，其稳定性越差，表面效应就越显著。 2 东北师范大学硕士学位论文 粒径d ( n m ) 图1 3 表面原子数占全部原子数的比例和粒径之间的关系 1 1 4 宏观量子隧道效应 当微观粒子的总能量小于势垒高度时，该粒子仍能穿越这势垒的现象称为隧道效 应。近年来，人们发现一些宏观量，例如微颗粒的磁化强度，量子相干器件中的磁通量 等亦具有隧道效应，称为宏观的量子隧道效应。它与量子尺寸效应一起确定了微电子器 件进一步微型化的极限，也限定的采用磁带磁盘进行信息化的最短时间，将会是未来微 电子、光电子器件的基础。例如：在制造半导体集成电路时，当电路的尺寸接近电子波 长时，电子就通过隧道效应而溢出器件，使器件无法正常工作，经典电路的极限尺寸大 概在o 2 5 微米。目前研制的量子共振隧穿晶体管就是利用量子效应制成的新一代器件。 1 1 5 介电限域效应 介电限域是纳米微粒分散在异质介质中由于界面引起的体相介电增强的现象，当介 质的折射率比微粒的折射率相差很大时，产生了折射率边界，这就导致微粒表面和内部 的场强比入射场强明显增加，这种局域强的增强称为介电限域。半导体超微粒表面上修 饰某种介电常数较小的材料后，它们的光学性质与裸露的超微粒相比，发生了较大变化。 随着粒径的不断减小，比表面积不断增加，颗粒的性质受到表面状态的影响。与块状半 导体相比，在半导体颗粒的表面存在更多电子陷阱，电子陷阱对半导体的光致发光特性 起着关键的作用。当介电限域效应所引起的能量变化大于由于尺寸量子效应所引起的变 化时，超微粒的能级差将减小，反映到吸收光谱上就表现为明显的红移现象。 3 桨v暴丑g降隧箍剞莨娶隧陶僻 东北师范大学硕士学位论文 1 2 量子点的光学特性 1 2 1 紫# b - 可见吸收光谱 半导体量子点量子尺寸效应的存在，会导致吸收光谱随粒子尺寸的减小发生蓝秽5 1 z j 。当半导体量子点的粒径小于激子玻尔半径时，电子的平均自由能受小粒径的限制， 局限在很小的范围，空穴很容易与它形成激子，引起电子和空穴波函数的重叠，因此很 容易产生激子吸收带。随着粒径的减小，重叠因子( 在某处同时发现电子和空穴的概率) 增加，激子带的吸收系数也增加，即出现激子增强吸收并蓝移，这就是量子限域效应【l 】o 图1 4 为c d s 量子点的紫外可见吸收光谱，随粒子尺寸的减小，c d s 量子点的吸收带边 明显蓝移，同时可以观测到激子吸收峰的出现【12 1 。从表观上看，黄色的c d s 在其尺寸 减小到约2 2n m 时变为无色。一些具有代表性的半导体量子点，如c d s e 、c d t e 等都表 现出了这一典型的光谱和颜色特征【1 3 - 1 4 。值得注意的是量子点的化学组成和晶体结构不 随粒子的减小而改变，只是电子的能级结构发生了很大的变化。 p h o t o ne n e r g y e v 】 图1 4c d s 量子点的紫外可见吸收光谱 1 2 2 荧光光谱 量子点的光学性质源于量子点中电子和空穴的相互作用。半导体的价带填满了电 子，在价带和导带之间有一个禁带。当一束光照射到半导体上时，半导体吸收光子后价 带上的电子跃迁到导带，导带内的这个电子与价带内被留下的带正电的空穴就会靠库仑 作用力而形成一个类氢原子的束缚态，即电子空穴对，也就是激子。导带上的电子可 4 一，eu一。善=u。星奄ou co盖jo岩西 东北师范大学硕士学位论文 以再跃迁回价带，放出光子；也可以落入半导体的电子陷阱。当电子落入较深的电子陷 阱后，绝大部分以非辐射形式淬灭了，只有极少数的电子以光子的形式跃迁回价带，发 出荧光。当半导体中的电子陷阱较深时，量子产率就会很低。 许多半导体量子点能够发出激光诱导荧光，其发射光谱是可调的。通过改变量子点 的大小和组成，可使荧光颜色在近紫外到近红外之间变化l ”】。如图15 所示，不同大小 的c d s e 和i n p 量子点发射的荧光可以覆盖整个可见光范围并且随着粒子尺寸的减小， 荧光发射带蓝移；i n a s 量子点发射的荧光在近红外区【“】。半导体量子点可以被短于发 射峰的任何波长( 一般只要短1 0 n m 以上即可) 有效的加以激发，并具有窄而对称的发 w h t p h 日 图l5 小同大小的c d s e 、i n p 、i n a $ 量子点发射光谱图( c d s e 的粒径从右到左是：2i ， 2 4 ，31 t3 , 6 4 6n m ；h 1 p 量子点粒径从右到左是：3 0 ，35 ，46 n m ；1 1 1 a $ 量子点的 是28 ，36 ，46 ，6 0 n m ) 射光谱( 典型半导体量子点在可见光区的发射宽度为2 0 3 0r i m ) ，从而可使相邻探测通 道之间的干扰减至晟低。因此可用单一波长光源同时激发不同太小尺寸的量予点( 量子 点激发光谱为连续分布) ，使它们发射出不同颜色的光并可被同时检测。半导体量子点 为多电子体系，因此。荧光效率远高于单个分子，它在可见和紫外光区的吸光系数为 1 0 5 l t o o l 。c l n 。数量级，荧光寿命较长( 约为几百纳秒) 【1 ”。 1 3 量子点的制备 制备量子点的方法有很多，常见的方法有：水热法( 高温水解法) 、金属有机化学 法及在水相中合成量子点的方法。 131 水热法( 高温水解法) 水热法足以水为溶剂在高压反应釜内完成的反应。反应液需要装在一个聚四氟乙烯 的衬里内，在不锈钢的高压蕃内密封后放置在1 0 0 c 咀上的炉内反应完成。大多数情况 下，反应足在不加以搅拌的静置状态下完成。 东北师范大学硕士学位论文 1 3 2 金属有机化学法 金属有机化学法是最常用的一种合成半导体量子点的胶体化学方法，它是迄今为止 最成功的合成高质量量子点的方法，已成功地用于i i v i 族和i i i v 族半导体粒子的合成 1 8 - 2 1 】。该方法通常是在无水无氧的条件下，用金属有机化合物在具有配位性质的有机溶 剂环境中生长纳米晶粒，即将反应有机金属前驱体注入到高温( 2 5 0 3 0 0 ) 的配体溶 液中，这些前驱体就在高温条件下迅速热解成核，晶核在随后的时间里缓慢生长为纳米 晶，可以通过反应温度控制微粒的成核与生长过程。 1 3 3 水相法 水相反应条件温和、操作简单、毒性小无污染，更适合产品化生产。过去由于水相 合成法制得的半导体量子点量子产率低，尺寸分布宽( r s d 1 5 ) 【1 5 1 ，因此并没有受 到人们的重视。近几年来，对水相中性能优良的半导体量子点的需求日益增加。若将有 机合成法制得的半导体量子点转移到水相，其步骤比较繁琐，最重要的是处理后得到的 纳米晶水溶液的稳定性大大降低，最多放置2 个月就会出现沉淀【2 2 1 。因此人们想到了 直接在水溶液中合成量子点的方法，从而使水相合成法取得了飞速的发展。水相合成法 的基本原理是在水中加入稳定剂( 如巯基化合物等) 2 3 - 2 6 ，通过水相离子交换反应得到 量子点。与金属有机化学法相比，水相合成的粒子不需要相转移可以直接用于生物标记， 解决了量子点的水溶性问题，而且大大提高了量子点的稳定性，可以在暗处放置一年以 上。 在量子点的制备研究中，在水相中合成硫醇包裹的碲化镉量子点的方法是比 较成功的。1 9 9 3 年，t r a j i 等人使用3 一巯基一1 ，2 一丙二醇作为保护剂，使用 c d s 0 4 和n a h t e 作为前驱体制备了较窄尺寸分布的c d t e 纳米晶，其荧光量子产 率随着纳米粒子尺寸的降低而增加，粒径尺寸为2n m 的荧光量子产率达到了2 0 瞄川。w e l l e r ：j x 组使用硫醇作为保护剂，在含有镉离子的体系内通入h 2 s 、h 2 s e 或 h 2 t e 气体，然后使溶液回流一段时间，成功地制备了c d s 、c d s e 和c d t e 纳米晶 拉弘3 1 j 。图1 6 是用这种方法制备c d t e 量子点的反应装置示意图。这些反应需要加 碱来调节水溶液的p h 值，以便在体系中产生s 厶、s e 2 。和t e 2 。，从而生成相应的纳 米晶，这些纳米晶的尺寸可通过不同的回流时间而得到控制。g a o 等人使用镉盐 和n a h t e 作为前驱体，巯基乙酸作为保护剂，在室温的水相内成功合成了c d t e 纳米晶【25 | 。w e l l e r d , 组采用类似的方法，选择n a h s e 和n a h t e 为原料，用碱对 体系水溶液的p h 值进行调节，并通过选择不同回流时间制备了不同尺寸的纳米 晶 3 2 - 3 4 。2 0 0 3 年，吉林大学杨柏教授的研究小组在水溶性的c d t e 纳米晶的研究方 面取得了进一步发展。他们首先在室温下使用氯化镉和n a h t e 作为前驱体，硫醇 作为保护剂、水溶液p h 值为9 0 的条件下反应生成c d t e 纳米晶，然后将这些纳米 晶装入高压釜，在1 6 0 1 8 0 的温度下加热不同的时间，可制得不同尺寸的c d t e 纳米晶。开始在室温制得的纳米晶是没有荧光的，但是经过高压釜的水热反应， 其荧光量子产率大大提高，最高值可超过3 0 ，而且其尺寸可通过改变加热时间 而得到控制【35 1 。另外，他们将能发出明亮荧光的水溶性的c d t e 纳米晶通过一种表 6 东北师范大学硕士学位论文 面活性剂o v d a c 转移到可聚合的高分子溶液里，经高分子聚合后，形成透明的、 可发光的纳米晶聚合物的复合材料3 6 1 。和有机相反应相比【37 1 ，尽管发光量子产 图1 6 水相法制备c d t e 量子点的反应装置示意图 率低一些，但是，水相制备纳米晶的方法操作简单，可重复性高，不使用成本高、 危险性大的化学试剂，而且在反应过程中在碲化镉纳米晶表面天然地形成了一层 硫化镉保护层，其发光效率比较令人满意。不过，水相法不利于制备窄的尺寸分 布的纳米晶。 1 4 量子点的生物修饰 为了使量子点能够应用生物分析领域，必须使量子点与生物材料相连，所以首先对 其进行功能化修饰，目前主要采用以下方法实现量子点表面的功能化。 一、利用量子点表面的元素如z n 、c d 等与巯基之间强的络合作用力，使量子点与 巯基酸络合带上羧基，巯基酸可以是巯基乙酸、巯基丙酸、巯基丁二酸、6 ，8 一二巯基辛 酸等。1 9 9 8 年，n i e 等【3 8 j 利用巯基与金属锌离子络合带上羧基，改善了量子点的亲水性， 同时，羧基可以与带有胺基的生物分子进行连接( 如抗体，胺基化的p e g 等) ，如图1 7 ( a ) 所示。m i t c h e l l 等p 刿在量子点的表面修饰了巯基丙酸，然后再与4 ( 二甲基氨基) 。 吡啶络合，量子点的亲水性大幅度增加。也可以用含多个巯基的分子对量子点的表面进 行修饰，如用6 , 8 二巯基辛酸对c d s e z n s 表面进行处理，由于含有两个巯基，可使6 , 8 二巯基辛酸与量子点表面的结合作用更强，同时6 ，8 二巯基辛酸的分子较长，为量子点 与生物材料的连接提供了较长的连接臂，二者偶联更容易，且不会破坏所标记生物材料 的活性，还可以用含多个羧基的分子对量子点的表面进行修饰。n i e 等【4 0 】发展了一种可 以用来标记老鼠体内前列腺癌细胞的功能化量子点荧光探针。这种新型的功能化量子点 荧光纳米颗粒，首先包被了一层形成胶囊的t o p o 多聚链，接着在胶囊的表面修饰了用 7 东北师范大学硕士学位论文 于识别生物体特异性靶点的配体( 如肽、抗体和小分子抑制镕等亲水性物质) 并修饰 了可以提高量子点的分散性及生物相溶性的p e g ，如图17 ( b ) 所示。 、将量子点的表面包覆一层亲水性的无机物，然后在表面修饰卜可与生物材料连 接的官能团。a l i v i s a t o s 等 j ”将量子点的表面包上一层s i 0 2 后并片j 碱处理使量子点的表 面带上羟基，量子点具有较好的水溶性；然后再用砖烷化试剂3 - 氪基丙基三乙氧基硅烷 处理量子点，其表面连接t 氨基后再与生物素连接。利用生物素与链亲和素之间的特异 性结合，生物素标记的量子点特异性连接到链亲和素标记的鼠3 t 3 细胞的肌动缱蛋白 罔17 功能化的量子点荧光探针的结构 ( a ) 巯基乙酸处理后的z n s 包覆的c d s e 量子点与蛋白质以价键结合； ( b ) t o p o 、p e g 和用丁肿瘤识别的配体( 如肽、抗体和小分子抑制剂) 功能化的量子点 三、通过静电引力、氢键作用或特异的配体受体相互作用将生物分子结合在量子 点的表面叫。b a w e n d i 等口”用经二氢硫辛酸修饰的c d s e z n s 量了点与带有高电荷亮氯 酸拉链端基的一组分重组蚩白r 麦芽糖键合蛋白碱性亮氨酸拉链融台蛋白，m b p z b ) 进 行自组装，结果表明：量子点与m b p z b 之间发生了有效的非共价结合，而且每一个量 子点能够与几个m b p - z b 分了结合。新的复合物仍然保留了m b p z b 的功能，能够结合 到直链淀粉亲合树脂上，用水溶性的麦芽糖取代直链淀粉，结合以后，光致发光的量子 产率从未结台前的1 0 提高到了2 0 3 0 。g o l d m a n 等【4 2 1 将亲和素蛋白作为一种受体 蛋白与量子点连接，从而使量子点可以与生物素化的蛋白偶联。这种受体蛋白为将抗体 连接到量子点上提供了一种分子连接的桥粱，使抗体与量子点的偶联物能够应用于荧光 免疫分析，应用这种方法可以去检测毒素，如s e b ，c h o l e r a t o x i n 等。t o r i m o t o 等胂矬 行了c d s 量子点沿着双链d n a 组装的实验。他们用硫代胆碱对3 0 02 r i m 大小的c d s 量予点进行化学修饰，使其表面带正电荷，然后通过这些正电荷与带磷酸酯基的d n a 分子之间的静电作用，制备c d s 纳米粒子。透射电镜的观察结果显示，c d s 纳米粒子以 东北师范大学硕士学位论文 稠密的准一维形式排列，排列的线宽度相当于c d s 量子点的直径( 3 0 n m ) ，邻近粒子的 中心间距估计为3 5 n m ，近似于双链的1 0 个碱基对的长度。这为我们提供了一种用不同 大小、不同化学组成的纳米粒子进行组装的实验方法。 1 5 量子点在生物医学中的应用 由于生物体系的特殊性和复杂性，为了能测定更多的生物活性物质，对激光激发生 物荧光探针有很高的要求【1 6 1 。目前，应用最为普遍的荧光探针是有机染料，但是，它们 的激发光谱都较窄，所以很难同时激发多种组分；而其荧光特征谱又较宽，并且分布不 对称，这又给区分不同探针分子的荧光带来困难，因此要同时检测多种组分较为困难； 有机染料最严重的缺陷还有光化学稳定性差，光漂白与光解使每个染料探针能够发出的 荧光光子平均数量不可能太多，光解产物又往往会对生物体产生杀伤作用。利用半导体 量子点作为生物荧光探针就能较好的解决这些问题：i ) 与传统的荧光探针相比，量子 点的激发光谱宽，且连续分布。这使得单个波长可激发所有的量子点。在生物材料荧光 标记领域中的主要优点是可以使用同一激发光源同时进行多通道的检测。i i ) 量子点的 发射波长可通过控制它的大小和组成来“调谐”，因而可获得多种可分辨的颜色。如：紫 外一蓝光( z n s ，z n s e ) ；可见光( c d s ，c d s e ，c d t c ) ；近红外光( c d s h g s c d s ，i n p , i n a s ) 。 i i i ) 量子点发射光谱呈对称分布且宽度窄，半高峰宽( f u l lw i d t h sh a l fm a x ，f w h m ) 常常只有4 0n n l 或更小。这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，而发射光谱不出 现交叠，或只出现很少交叠，使所标记的生物分子的荧光光谱易于区分和识别。i v ) 与 有机荧光染料相比，量子点具有较好的光稳定性，不易被光解【5 l 】或漂白。荧光光谱几乎 不受周围环境( 如溶剂、p h 值、温度等) 的影响，它可以经受反复多次激发，而不像 有机荧光分子那样容易发生荧光漂白，量子点的发光寿命比普通荧光标记染料的寿命长 1 2 个数量级，量子点的荧光强度是罗丹明6 g ( r 6 g ) 的2 0 倍，稳定性是它的1 0 0 倍， 光谱线宽只有其三分之一。v ) 量子点具有很好的生物相容性，而有机荧光染料或镧系 配合物则不具有这种优越性。量子点优良的荧光性质使得它在生物荧光探针标记、荧光 能量转移等许多生物医学研究领域有着广泛的应用前景。 1 5 1 量子点标记d n a 和蛋白质 在标记d n a 和蛋白质方面，有许多突破性进展【1 6 3 8 ，4 4 巧1 1 。w h 等人 4 7 1 成功的用荧光 免疫法标记了细胞( 使用直径在7 4 l o n m 的量子点) ，用疏水的改良聚丙烯酸包被量子 点，使之与免疫球蛋白g 和链霉亲和素相结合，使其能准确的结合并标记在细胞表面蛋 白、细胞支架蛋白和细胞核内的蛋白质上( 图1 8 ) 。实验证明，对吸附肽和聚氧乙烯或压 缩进磷脂共聚物的胶囊内的量子点适当的标记是耐光的和无毒害的，显示出很高的特异 性( 对背景有非常少的非特异结合) 。现在使用的量子点主要是硒化镉( c d s e ) 核心和硫化 锌( z n s ) 外层组成的无机胶状纳米水晶半导体。这种小微粒的吸收光谱非常广，从紫外 到可见光。波长由粒子的大小和组成决定，粒子越大波长越长。量子点在有外壳的时候 可以溶于水( 硅酸或某些连接因子如：巯基乙酸、d h l a 等) 。 9 东北师范大学硕士学位论文 在j s w 酊的实验中【4 ”，d h l a 包被的量子点标记的海拉细胞持续生存了一个多 星期( 量子点和细胞都具有活性) 。通过2 步来实现量子点标记。第一步，使b i o t i n y l a t e d 基本抗体和量子点与抗生物素蛋白结合，第二步在连接的基础上经由重组g 肽建立抗 生物素蛋白桥。研究人员的数据表明不同颜色的量子点( 5 2 0 5 7 0 n m ) 标已不同的细胞很 容易分辨，非特异结合也很小。l i n g e r f e l tbm 等口”利用c d s e z n s 量子点标记的方法 进行免疫分析，成功的完成了b 型葡萄球菌肠毒素的测定检测的灵敏度为1o t l g m l1 。 匿匿匿匪 图18 量子点与荧光染料a l e x a 4 8 8 分别标记核抗原和微管 1 5 2 量子点在肿瘤中的应用 w u 等1 4 ”证明了量子点标已抗体能特异识别亚细胞水平的分子靶点。他们用量子点 标记的羊抗鼠i g g 作为二抗，结合抗乳腺癌人表皮生长因子受体d 的单克隆抗体 ( a n t i h e r 2 ) ，观察到了乳腺癌细胞表面的h e r e 。用抗牛物素蛋白交联具有不同发射光谱特 征的量子点，配合生物素标记的二抗和特异性单抗，可同时识别细胞表面的h e n 和核抗 原，也能同时识别胞质微管蛋白和核抗原。与自机荧光染料a 1e x a 4 8 8 比较，量子点发射 的荧光强日不被激发光淬灾。w a n g 等1 5 3 1 辩i 最大发射波长为6 0 5 n m 的量子点柬检测各类型 样本卵巢癌中癌抗原1 2 5 ( c a l 2 5 ) 的表达。结果发现量子点信号与传统的异硫氰酸荧光素 ( f i t c ) 荧光染色信号相比，所有的量子点标记的信号都比荧光标记的信号强。连续长达 l h 的激光激发没有引起量了点信号荧光漂白，而f 1 t c 荧光染色信号很快就发生了漂白， 且2 4 m i n 后就消失了。h o s h i n o 等”“将量子点标汜后，在鼠的活体内寻找t 淋巴瘤也获得 了成功。这些结果都提示量子点可咀作为种新的高效稳定的荧光标记物用于肿瘤的研 究中。 n a t u r e 杂志2 0 0 4 年报道了运用量子点来检测前哨淋巴结的新方法。前哨淋巴结活检 是判断肿瘤是否向其他部分扩散的至关重要的第一步。然而目前这种活组织检查的方法 也会碰到困难，外科医生很难找到前哨淋巴结，所以第一次切除几乎是完全肓目的，必 须要求经验非常丰富的外科医生进行。k i m 及其同事”5 1 发现，使用量子点( q d s ) 标已 前哨淋巴结，即使通过i c m 的组织，医生也能看清楚淋巴结，准确地指导手术，同时确 保前哨淋巴结的完全消除。k i m 等将o p m o l 的红外荧光】i 型量子点( t y p e i i n i r q d s ) 皮内 注射小鼠的左爪，t y p e l l n i r q d s 进入淋巴管，5 r a i n 后可以看到图像：注射1 的经典蓝 染料异硫烷蓝，发g l t y p e i n i p q o s 与异硫烷蓝定位在同一淋巴结，说明t y p e l i n i ro d s 一霸 东北师范大学硕士学位论文 可以准确定位前哨淋巴结。t y p e i i n i r q d s 同样可以用于大型动物。将4 0 0 p m o lt y p e i i n i r q d s 皮内注射到猪腿部，医生可以通过观察淋巴液流动，而准确找到前哨淋巴结位 置。图像显示，淋巴管从注射部位分叉，最后融合到前哨淋巴结处。整个前哨淋巴结定 位过程只需3 - - 4m i n ，而且可以观察到全过程。因为事先就可以定位，这种监测可以减 小因寻找前哨淋巴而被迫扩大的切口，而且组织中含前哨淋巴结的可能性增加了。研究 切除组织结果显示，t y p ei i n i r q d s 完全位于前哨淋巴结内，且被限制，不会到达前哨 淋巴结以外的部位。t y p e i i n i r q d s 具有肉眼可视性，外科医生可以直接观测到整个前 哨淋巴结标记的全过程。t y p ei i n i r q d s 前哨淋巴结标记技术必将引起外科肿瘤手术的 革命。 1 5 3 量子点在靶向药物开发方面的应用 靶向给药系统( t a r g e t e dd r u gd e l i v e r ys y s t e m ，t d d s ) 指一类能使药物浓集定位于病变 组织、器官、细胞或细胞内的新型给药系统。理想的t d d s 应在靶器官或作用部位释药， 同时全身摄取很少，这样，既可提高疗效，又可降低药物的不良反应。特别在恶性肿瘤 的治疗上，靶向药物的重要性显得更加的突出。药物研究者致力于开发出能靶向定位杀 灭肿瘤细胞而不伤害正常组织细胞的药物。量子点具有优越的荧光性能、生物兼容性以 及可修饰性，在靶向给药系统的研发上具有广阔的前景。通过量子点的应用，我们可以 开发和筛选出以载体、抗体、受体、配体等介导的具有高特异性的靶向体系，然后将这 个体系加载到药物上，形成具有良好靶向性的药物。a k e r m a n 等【5 6 】运用量子点探索体内 靶向标记的可能性。他们用可减少网状内皮系统非特异吞噬的聚乙二醇包裹c d s e z n s 量子点后，分别与可标记肺血管内皮细胞、肿瘤组织血管以及肿瘤组织淋巴管的3 种肽 段结合。然后，将靶向多肽修饰的量子点通过静脉注射至癌变小鼠体内，一定时间后荧 光成像观察，发现多肽指向的肺内皮细胞和肿瘤血管及肿瘤淋巴管均富集有相应的量子 点。通过这种技术，氨基酸可以将抗生素引导到特定位置，实现药物的靶向治疗。 量子点除了上述这些应用外，量子点在标记细胞结构和受体分子、活细胞成像和示 踪、药物筛选等方面有着重要的应用。 1 6 本论文的立题意义 基于半导体量子点独特的光学性质，及其在发光二极管、场效应晶体管、太阳能电 池、激光，特别是生物医学领域的广泛应用，对量子点的研究一直是国内外学者的研究 热点。本课题通过对生物小分子与量子点的偶合研究，不仅发现了新的量子点稳定剂， 获得性质稳定、光学性能良好的新型探针，可直接用于某些特异性细胞或组织的标记和 识别，拓展了量子点的应用；还通过对生物小分子与量子点的偶联机理的研究，有助于 生物大分子与量子点偶联机理的探讨，使量子点更加有效的用于免疫检测等医学领域。 另一方面，本课题从研究p g p 糖蛋白介导的多药耐药机理入手，利用水溶性量子点 和p - g p 抑制剂及抗癌药物分别形成荧光生物探针，从而考察p 印糖蛋白、p g p 抑制剂 东：l k i j t 范大学硕士学位论文 和抗癌药物三者之间的相互作用情况。量子点的特殊光学性质使我们能在分子水平上深 入弄清p - g p 介导的多药耐药机制，为寻找新型高效低毒的p g p 抑制剂的研究提供科学 依据；同时搞清p g p 糖蛋白上抗癌药物的作用点位，为增加抗癌药物对肿瘤细胞的敏 感性，提高肿瘤化疗效果具有重要意义。 1 2 东北师范大学硕士学位论文 第二章c d t e 量子点与腺嘌呤之间作用机理研究 2 1 引言 量子点是基于i i 一族( 如c d s e ，z n s ) 、一v 族