（微生物学专业论文）利用乳酸乳球菌acma蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 本研究利用乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 全长肽聚糖水解酶a c m a 及其氨基 末端结构域作为锚定单元，分别在乳酸乳球菌和大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 中构建 了一个功能性展示外源蛋白的细胞表面展示系统，并对该系统展示活性进行了初步 的分析研究。 利用实验室筛选鉴定的一株乳酸乳球菌菌株m b l 9 1 作为出发菌株，通过克隆该 菌株携带的肽聚糖水解酶基因a c m a ，并经测序分析后，构建全长a c m a 与咖的融 合基因，再连接于经部分改造的大肠杆菌乳酸乳球菌穿梭载体p m g 3 6 k ，构建得到 重组质粒p m b l 3 7 ，然后经电转化导入乳酸乳球菌野生型菌株a s1 2 8 2 9 后，筛选得 到重组菌株m b l 3 7 。经s d s p a g e 验证，重组菌可表达分子量约7 4 k d 的融合蛋白， 与预期大小一致；并通过流式细胞免疫技术检测到细胞表面荧光，说明a c m a 将g f p 成功定位于乳酸乳球菌细胞表面。在此基础上，通过克隆了枯草芽胞杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 的p 一葡聚糖酶基因g 如，经测序分析后用于替代重组质粒p m b l 3 7 中的咖 而构建得到重组质粒p m b l 3 8 ，通过d n s 法测定所得到的重组菌株m b l 3 8 的全细 胞葡聚糖水解酶酶活力为1 2 u m l ，较出发菌株具有明显水解酶活性。 鉴于a c m a 蛋白的氨基末端结构域与一种业已被研究证实、并广泛应用的革兰氏阴性菌细 胞表面展示系统的运载蛋白一来自于丁香假单胞菌( p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ) 的冰核蛋白( i c e n u c l e a t i o np r o t e i n ，i n p ) 的氨基末端结构域具有一定程度上的相似性，为了进一步研究来自于革 兰氏阳性菌的a c m a 是否在革兰氏阴性菌中也具有细胞表面的定位活性，以期扩大其应用范围， 本研究进一步扩增得到a c m a 基因n 端结构域，并利用绿色荧光基因g f p 作为报告基因，通过构 建融合基因a c m a n g f p 以及a c m a g f p ，并连接至大肠杆菌表达载体p t r c h i s - c ，分别获得重组质 粒p m b l 3 1 ( 含珊4 嘶咖) 和p m b l 3 2 ( 含a c 洲g p ) ，再将重组质粒转入大肠杆菌受体菌j m l 0 9 后，分别得到重组菌m b l 3 1 和m b l 3 2 。将重组菌株诱导表达后，分别经过荧光显微镜镜检检 测融和基因荧光活性、特异性蛋白酶及s d s 敏感性试验、细胞分级分离后样品的w e s t e r n - b l o t 分析、特异g f p 二抗荧光标记的流式细胞仪检测分析等实验，证实了g f p 蛋白在大肠杆菌受体 菌j m l 0 9 细胞表面的定位。在此基础上，将所克隆的枯草芽胞杆菌葡聚糖酶基因g 厶代替g ：p 而构建重组质粒p m b l 3 3 ( 含a c m a n g l s ) 和p m b l 3 4 ( 含a c m a g l s ) ，在j m l 0 9 细胞内进行了诱导 表达，通过d n s 法测定重组菌m b l 3 3 以及m b l 3 4 的全细胞酶活性，结果显示重组菌株具有明 显的全细胞水解酶活性( 酶活力分别为2 5 u m l 和1 9 u m 1 ) 。本研究在国内外首次证实来自革兰 氏阳性菌的肽聚糖水解酶a c m a 具有在革兰氏阴性菌的大肠杆菌中的细胞表面定位和展示外源 蛋白的活性，且截断的、仅保留其n 端结构域的a c m a - n 具有比全长a c m a 更强的表面展示活 性。 关键词：细胞表面展示，肽聚糖水解酶，葡聚糖酶，乳酸乳球菌，大肠杆菌 利用乳酸乳球菌a c m a 蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究 a bs t r a c t f o rf u n c t i o n a l l ys u r f a c ed i s p l a yo ff o r e i g np r o t e i n s ，i nt h i ss t u d y , t h ef u l l l e n g t ha n d t h en t e r m i n a ld o m a i no fan - a c e t y l m u r a m i n i d a s ea c m af r o ml a c t o c o c c u sl a c t i s w e r e r e s p e c t i v e l ye m p l o y e da st h ea n c h o r i n gm o t i ft oi m m o b i l i z et h eh e t e r o l o g o u sp r o t e i n so n t h ec e l ls u r f a c eo fll a c t i so re s c h e r i c h i ac o l i ，a n dt h es u r f a c ed i s p l a ye f f i c i e n c i e sw e r e p r e l i m i n a r i l yi n v e s t i g a t e d n en a c e t ) 7 l m u r a m i n i d a s ee n c o d i n gg e n ea c r aw a si n i t i a l l yg e n e r a t e db yp c r m a n i p u l a t i o nf r o mll a c t i sm b 191 aw i l d - t y p es t r a i nt h a tw a sn e w l yi s o l a t e da n d i d e n t i f i e di nt h i sl a b o r a t o r y , f o l l o w e db ys e q u e n c i n ga n dc o n s t r u c t i o no fac h i m e r i cg e n e o f a c m a g f p ”t h r o u g hac - t e r m i n a lf u s i o ns t r a t e g ya tw h i c ht h eg r e e nf l u o r e s c e n tg e n e ( g y p ) w a sp o s i t i o n e di nt h ed i r e c td o w n s t r e a mo fa c m ai nac o n t i n u o u se n c o d i n gf r a m e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m b13 7w a so b t a i n e db yl i g a t i n gt h ec h i m e r i cg e n eo f a c m a - g f pi n t op m g 3 6 k ad e r i v a t i v eo ft h ep r e v i o u sec o l i - ll a c t i ss h u t t l ee x p r e s s i o n v e c t o rp m g 3 6 eb yi n s e r t i o no fa na d d i t i o n a l k a n a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ，a n da r e c o m b i n a n tll a c t i ss t r a i nm b13 7w a sd e r i v e db yt r a n s f e r r i n gp m b 13 7i n t oall a c f i s w i l d t y p es t r a i na s1 2 8 2 9 s d s - p a g ea n a l y s i sc o n f i r m e d 血a tt h ea c m a g f pf u s i o n p r o t e i nw a se x p r e s s e dw i t ht h ep r e d i c t e ds i z eo f7 4k di nt h er e c o m b i n a n tl l a c t i sc e l l s r o wc y t o m e t r ya n a l y s i so ft h ei m m u n o l a b e l l e di n t a c tc e l l sf u r t h e rc o n f i r m e dt h a tg f p w a si m m o b i l i z e d o nt h eo u t e rm e m b r a n e f u r t h e r m o r e ， a6 7 2b po f e n d o - b e t a - l ，3 - 1 4 - g l u c a n a s ee n c o d i n gg e n eg st h a tw a sp c r a m p l i f i e df r o mb a c i l l u s s u b l i t i sb f 7 6 5 8 ，w a su s e dt os u b s t i t u t et h e 咖g e n ei nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m b 13 7 ， a n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m b13 8w a st h u so b t a i n e d ，f o l l o w e db yt r a n s f e r r i n g p m b 13 8i n t oll a c t i sa s1 2 8 2 9t og e n e r a t et h er e c o m b i n a n ts t r a i nm b 13 8 a sar e s u l t a w h o l e - c e l lc a t a l y t i cc a p a c i t yo fg l u c a n a s ei nm b13 8w a sf o u n dw i t har e l a t i v eg l u c a n a e a c t i v i t yo f12u m l i nv i e wo ft h ef a c tt h a tt h en t e r m i n a ld o m a i no fa c m aw a ss t r u c t u r a l l ys i m i l a rt o t h a to fi c en u c l e a t i o np r o t e i n ( i n p ) ，ap r e v i o u s l yd e m o n s t r a t e da n c h o r i n gm o t i fi n p s e u d o m o n a ss y r i n g a ea n dh a sb e e nw i d e l yu s e di nav a r i e t yo fg r a m n e g a t i v es t r a i n s ，t o e v a l u a t ei ft h eg r a m p o s i t i v eb a c t e r i a d e r i v e da c m ac o u l db ea l s of u n c t i o n a li n g r a m n e g a t i v eb a c t e r i as y s t e m s ，t h en t e r m i n a lo fa c m aw a sp c r a m p l i f i e d ，a n dw a s u s e dt oc o n s t r u c taf u s i o ng e n eo fa c m a n g f p s i m i l a r l y , t h ef u l l l e n g t ha c m aw a sa l s o u s e dt oc o n s t r u c tt h ef u s i o ng e n eo fa c m a g f p t h ef u s i o ng e n ea c m a n g 勿a n da c m a g f p w a si n s e r t e di n t ot h eec o l ie x p r e s s i o nv e c t o rp t r c h i s cf o rc o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n t p l a s m i dp m b 131a n dp m b13 2 ，r e s p e c t i v e l y , a n dt w or e c o m b i n a n ts t r a i n sm b 131a n d m b l 3 2w e r ef u r t h e ro b t a i n e db yt r a n s f o r m i n gp m b l 3 1a n dp m b l 3 2i n t ot h ee c o l i r e c i p i e n t 盯江10 9 t h es u r f a c ei m m o b i l i z a t i o nt h ee x p r e s s e df u s i o np r o t e i ni nt h e r e c o m b i n a n tec o l ic e l l sw e r em u l t i p l yv e r f i e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n ，p r o n a s ea c c e s s i b i l i t ya n ds d ss e n s i t i v i t ya s s a y s ，w e s t e r nb l o ta n a l y s i so ft h e 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 s u b c e l l u l a rm e m b r a n ef r a c t i o n s ，a n df a c sa s s a y so fi m m u n o 1 a b e l l e di n t a c tc e l l s o nt l l e b a s i so ft h i s ，t h er e c o m b i n a n ts t r a i n sh a r b o r i n gp m bl3 3a n dp m b13 4w e r ec o n s t r u c t e d b ys u b s t i t u t i o no ft h e 咖g e n ei nt h ep m b l 3 1a n dp m b l 3 2w i t hg sg e n e b yt h e i n d u c i b l ee x p r e s s i o no f t gt h er e c o m b i n a n tec o l is t r a i n se x p r e s s e dt h ea c m a n g l so r a c m a g l sf u s i o ng e n e s ，s h o w e da na p p a r e n tw h o l e c e l lg l u c a n a s ea c t i v i t yc o m p a r e dt ot h e c o n t r o ls t r a i n t om y k n o w l e d g e ，t h i si st h ef i r s tr e p o r tt h a td e m o n s t r a t e dt h et r u n c a t e d n - t e r m i n a ld o m a i no fa c m ac o u l ds e r v ea st h ef u n c t i o n a la n c h o r i n gm o t i ft od i r e c tt h e c e l ls u r f a c ei m m o b i l i z a t i o no ft h ef o r e i g n p r o t e i ni ne c o l is t r a i n k e yw o r d s ：c e l ls u r f a c ed i s p l a y ；n a c e t y l m u r a m i n i d a s e ；g l u c a n a s e ：l a c t o c o c c u s l a c t i s ；e s c h e r i c h i ac o l i i 利用乳酸乳球菌a c m a 蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究 a m p b s a b p c h e s c p c t a b d 1 盯p e d t a f f c s g f p g p i g r a s m d 咿 邛t g k d a o d o m o r f p c r p i c s d s s d s p i a g e s t e t e 田巳m e d t r i s 缩略语表 a m p i c i l i n b o v i n es e r u ma l b u m i n b a s ep a i r 2 ( n c y c l o h e x y l a m i n o ) e t h a n es u l f o n i ca c i d c y t o p l a s m i cf r a c t i o n c e t y l t r i m e t h l e t h y l a m m o m u mb r o m i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d f l u o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t e r g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n g l y c o s y lp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l g e n e r a l l yr e g a r d e da ss a f e i n n e rm e m b r a n ef r a c t i o n i c en u c l e a t i o np r o t e i n i s o p r o p y l d d l t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o d a l t o n o p t i c a l d e n s i t y o u t e rm e m b r a n ef r a c t i o n o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r i o ri n f o r m e dc o n s e n t s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s o d i u mc h l o r i d et r i se d t a t r i se d t a t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e t r i ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年月日 杜创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 查小竿 时间：2 。8 年6 月1 2 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定竹，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签等：蓟、寄 导师签名：t - 奄 签名日期：2 0 0 8 年6 月1 2 日签名日期：2 0 0 8 年6 月1 2 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 屑倒十学位论立 i 前言 11 微生物细胞表面展示技术研究进展 1 11 微生物细胞表面展示技术简介 表面展示技术是最近二十年来发展起来的新兴基因工程技术，包括噬菌体表面展 示技术，杆状病毒表面展示技术，昆虫表面展示技术，细胞表面展示技术等。它的 基本原理是将外源蛋白融合到与细胞外表面共价结合的锚定单元上，通过细胞锚定 单元所采用的分泌转运机制将外源蛋白运送到细胞表面，外源蛋白与锚定尊元以融 合方式固定在病毒衣壳表面或细胞表面，同时外源蛋白保持相对独立的空间结构和 生物活性。外源蛋白的这种定位表达不仅可以使所锚定的反应在细胞表面直接发生 而提高反应效率，并且可以克服某些大分子底物不能穿越细胞膜而进入胞内以及 某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端，而且还可以使产物的提取 纯化过程简化( g e o r g i o ue ta l ，1 9 9 7 ；l e e e ta l ，2 0 0 3 ) ，因而在许多生物技术领域展现出 良好的应和用发展前景。细胞表面展示体系通常是以构建由运载蛋白( c a r r i e r p r o t e i n ) 与乘客蛋白( p a s s e n g e rp r o t e i n ) 所组成的融合蛋白的方式来实现的，其中 运载蛋白起着将乘客蛋白引导并锚定于细胞表面特定部位的作用。 细胞表面展示技术主要是指以细菌、酵母等单细胞微生物作为表面展示的基质， 它们具有易培养生长快，产量高等优点。自从1 9 8 5 年s m i t h 首次提出噬菌体展示 技术( 王建龙，2 0 0 5 ) 以后，有大量的表面展示技术的文章报道。研究人员利用表 面展示技术进行了工业酶的展示活菌疫苗的丌发，单克隆抗体片断的筛选，构建 多肽文库，生物修复等方面的应用。 目前，国外已报道丁利用细胞表面展示技术束进行活体疫苗开发( s t e i d l e re ta l ， 2 0 0 0 ；m a u r i e l l oe ta l ，2 0 0 4 ) 、蛋白质及多肽文库筛选( k i me ta l ，2 0 0 0 ；b o d e re ta i ， 1 9 9 7 ) 、抗体合成( f r a n c i s c oe ta l ，1 9 9 3 ) 、作为生物吸附奇崃清除环境中有毒化合物 和重金属离子( m u l c h a n d a n ie ta l ，1 9 9 9 ；b a ee ta 1 2 0 0 0 ) 及作为生物反应器( s h i b a s a k i e ta l ，2 0 0 1 ) 等方面的尝试( 图1 1 ) ，新的应用途径仍在不断地发掘之中。 “。d v “，j 二j = c n d o m l l n e s 一一i s n go fp e p b d e l i b mr i e 5 口h t m u t a t i 。nd m e c b 图1 - 1 微生物细胞表面展示的应用( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) f i g 1 - 1 a p p l i c a t i o n s o f m i c r o b i a lc e l ls u r f a c e d i s p l a y 铲一 f k 利用乳酸乳球菌a c m a 蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究 1 1 2 运载蛋白 细菌细胞表面展示所用的运载蛋白需要具备四个条件( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ：( 1 ) 含有能够使得蛋白前体穿过细胞内膜的信号肽或者转运信号；( 2 ) 含有使得融合蛋 白固定于细胞表面而不会被解析的较强的细胞膜锚定模体；( 3 ) 与乘客蛋白构成融 合蛋白后，性质稳定且其定位特性不会改变；( 4 ) 能够耐受细胞周质空间或培养基 中的蛋白酶作用。另外，确定运载蛋白上用于与乘客蛋白融合的位点也非常重要， 该位点会影响运载蛋白的定位、稳定性、以及翻译后修饰等特性，乘客蛋白只有融 合在运载蛋白位于细胞表面的区域，才能被成功的展示在细胞表面。目前有多种方 法来确定载体蛋白位于细胞表面的区域，包括与己知结构的蛋白进行同源性的比较 来确定或者利用计算机软件分析蛋白质序列亲疏水性确定其位于细胞表面的区域 ( s u z u k ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 1 3 乘客蛋白 表面展示的乘客蛋白是根据应用的目的来选择的。不同的乘客蛋白与相同的运载 蛋白融合后可能在同一宿主有不同的定位( s t a t h o p o u l o se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。乘客蛋白的结 构和氨基酸序列对融合蛋白的分泌和展示也有重要的影响，n g u y e n 等( 1 9 9 5 ) 报道 当乘客蛋白含有四个苯丙氨酸时，因为不能有效分泌而不能在细胞表面有效展示， 但当这四个苯丙氨酸被去除或者用丝氨酸替代后，该乘客蛋白能被成功的表面展示。 但是这种替代氨基酸的办法应该慎用，因为氨基酸的改变可能使得蛋白质的生物学 功能完全丧失或改变。 1 1 4 微生物细胞表面展示体系的种类 1 1 4 1g 细菌表面展示体系 g 菌细胞包被结构复杂，由细胞质膜、间质空间、细胞外膜组成。乘客蛋白要成 功在细胞表面展示必须依次穿越细胞质膜、间质空间以及细胞外膜。g 。细菌表面展 示系统中用到的运载蛋白包括外膜蛋白( f r e u d le ta 1 ，1 9 8 6 ；s c h o r re ta 1 ，1 9 9 1 ； m a r t i n e a ue ta 1 ，1 9 8 6 ) 、脂蛋t 刍( t a y l o re ta 1 ，1 9 9 0 ；c h a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ；f u c h se ta 1 ， 1 9 9 1 ) 、附属结构蛋白( k u w a j i m ae ta 1 ，1 9 8 8 ) 、自我转运蛋白( k l a u s e re ta 1 ，1 9 9 0 ；v m l s e ta 1 ，2 0 0 0 a ；m a u r e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 、s 层蛋白( b i n g l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 等。 g 。细菌表面展示体系所采用的运载蛋白和乘客蛋白的融合方式分为三夹板式融 合、n 端融合、c 端融合。 “三夹板 融合式是最常见的一种方式，它主要适用于三种蛋白：外膜蛋白、附 属结构的亚基蛋白以及s 层蛋白。在构建这类载体时，必须首先确定运载蛋白的空 间结构，判断该蛋白的表面暴露位点，然后再通过基因操作手段将外源d n a 序列 定点插入到运载蛋白的基因序列中，从而得到融合基因。融合基因的表达则产生融 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 合蛋白。融合蛋白必须按照运载蛋白的结构信息折叠成与野生型运载蛋白相类似的 结构，并正确参与随后的表面结构的组建过程，才能达到展示乘客蛋白的目的。 许多革兰氏阴性菌的外膜蛋白都可以用这种“三夹板 融合的方式来携带乘客 蛋白。大肠杆菌的l a m b 蛋白便是一个典型的例子。l a m b 是大肠杆菌外膜上的麦 芽糖和麦芽糖糊精的选择性通道，也是x 噬菌体的感染位点( n i k a i d oe t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 人们已经利用l a m b 的表面暴露位点展示了多种多样的蛋白或多肤，其中有来自脑 膜炎奈瑟氏球菌( n e i s s e r i a m e n i n g i t i d i s ) 、金黄色葡萄球菌( s t e i d l e r ，1 9 9 3 a ) 以及乙肝 病毒( c h a r b i te t a 1 ，1 9 8 7 ；1 9 8 8 ；m a r t i n e a ue t a 1 ，1 9 9 1 ) 的抗原表位，也有多聚组氨 酸肚( s o u s ae t a 1 ，1 9 9 6 ) 和蛋白质文库( b r o w n ，1 9 9 2 ) ，还有人和酵母的金属硫蛋白 ( s o u s a ，1 9 9 8 ) 等。除l a m b 外，大肠杆菌的其它外膜蛋白，如o m p a ( m e j a r ee t a 1 ， 1 9 9 8 ) 和p h o e ( a g t e r b e r ge t a 1 ，1 9 9 0 ) 的某些表面暴露位点也是引入外源序列的合适 位点。在其它革兰氏阴性菌中，这类运载蛋白也较为常见，如鼠伤寒沙门氏菌 ( s a l m o n e u at y p h i ) 的夕 , 膜蛋白o m p c ( p u e n t ee t a 1 1 9 9 5 ) 和霍乱弧菌( i r b r i oc h o l e r a e ) 的外膜蛋白o m p s ( l a n gk o r h o n e nc t a 1 ，1 9 9 7 ) 等。 革兰氏阴性菌的表面附属结构( 如鞭毛、菌毛等) 的组成蛋白也是构建展示载体 的好材料，而且也都基本采用“三夹板式融合法。大肠杆菌的主要鞭毛蛋白f l i c 可以展示来自金黄色葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白和来自小肠结肠炎耶尔森氏茵 ( y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a ) 的胶原蛋白粘附素等，因此可以用来研究粘附素与其受体间 的相互作用关系( w e s m d u n d w i k s t r o m ，1 9 9 7 ) 。大肠杆菌的菌毛蛋白p a p a 能够展 示金黄色葡萄球菌蛋白a 的i g g 结合区域，因此可以用来研究菌体细胞的i g g ，一 结合活性( s t e i d l e re t a 1 ，1 9 9 3 b ) 。大肠杆菌的其它菌毛蛋白如f i m h ，f i m a 和c l p g 等可以展示多种生物的抗原表位( p a l l e s e n ，1 9 9 5 ；s t e n t e b j e r g o l e s e ，1 9 9 7 ；v a r t a n i a n e t a 1 ，1 9 9 4 ) 。以s 层蛋白为运载蛋白的展示载体也首先在革兰氏阴性菌中构建成功。 革兰氏阴性菌中展示载体的第二种构成方式是c 端融合式。此时，运载蛋白的 n 端必须具有表面定位的功能，能够将c 端的序列引导到细胞表面。丁香假单胞菌 ( 洋丁香叶斑病假单胞菌，p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ) 的冰晶核蛋白( i c en u c l e a t i o np r o t e i n ) 便是一个典型的例子。冰晶核蛋白是一种外膜蛋白，常见于欧文氏菌属( e r w i n i a s p p ) ，假单胞茵属( p s e u d o m o n a ss p p ) 和黄单胞菌属( x a n t h o m o n a ss p p ) 等植物病原菌 中，它可使超低温的水分子结晶为冰核，从而冻伤植物。它的n 端具有与真核生物 表面蛋白类似的g p i 锚着点，这在原核生物中是罕见的。它的中央区段是一些等级 重复序y 0 ( h i e r a r c h i c a l l yo r g a n i z e dr e p e a t e ds e q u e n c e ) ，可作为冰核形成的模板与水分 子有序结合，使水分子排列成冰核态的结构( g r e e ne t a 1 1 9 8 5 ) 。目前，冰晶核蛋白 己被成功地用来展示人t 淋巴细胞c d 8 的表面蛋白的部分序列( k i m e t a 1 ，1 9 9 8 ) 、 枯草芽胞杆菌的梭甲基纤维素酶( c a r b o x y m e t h y l c e l l u l a s e ) ( j u n ge t a 1 1 9 9 8 b ) 以及运动 发酵单胞菌( z y m o m o n a sm o b i l i s ) 的果聚糖蔗糖酶( l e v a n s u c r a s e ) o u n ge t a 1 1 9 9 8 a ) 等。g e o r g l o n 及其同事构建的l p p o m p a 组合式展示载体也是以c 端融合的方式挂 利用乳酸乳球菌a c m a 蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究 接乘客蛋白的( d a u g h e r t ye t a 1 1 9 9 8 ；f r a n c i s c oe t a 1 1 9 9 2 ；g e o r g i o ne t a 1 1 9 9 6 a ) 。该载体 的l p p 部分来自于大肠杆菌的主要脂蛋白l p p ( 1 i p o p r o t e i n ) ，包括l p p 的信号肤和它 的前九个氨基酸残基。o m p a 部分则为大肠杆菌外膜蛋白o m p a 的4 6 1 5 9 区域( 第 4 6 位氨基酸残基和第1 5 9 位氨基酸残基之间的区域) ，或者为o m p a 的4 6 6 6 区域 ( 第4 6 位氨基酸残基和第6 6 位氨基酸残基之间的区域) 。l p p 部分负责将重组蛋白分 子引导到菌体外膜的内表面，o m p a 部分则负责将外源序列引导到外膜的外表面 ( g1 3 ) 。已被l p p o m p a 组合式载体成功展示的外源序列有单链抗体文库 ( d a u g h e r t ye t a 1 ，1 9 9 8 ) ，内酞胺酶( g e o r g i o ue t a 1 ，1 9 9 6 a ；f r a n c i s c oe t a 1 ，1 9 9 2 ) 以及有 机磷水解酶( k a n e v ae t a 1 1 9 9 8 ) 。 在革兰氏阴性菌中构建展示载体的第三种方法是n 端融合式。这一方式适用于 那些c 端有表面引导及定位功能的蛋白分子。肽聚糖结合型脂蛋白( p e p t i d o g l y c a n a s s o c i a t e dl i p o p r o t e i n ，p a l ) 便具有这一特征，它们的c 端能与肽聚糖层紧密结合，n 端被脂类修饰后与外膜相互作用。f u c h s 等( 1 9 9 1 ) 将这种脂蛋白n 端的半胱氨酸去 除后，代之以甘氨酸，然后再在其上游( n 端) 融合了一段鸡溶菌酶的特异性单链抗 体，从而实现了这一单链抗体在大肠杆菌细胞表面的功能性表达。 奈瑟氏茵( n e i s s e r i as p p ) 的垮a 蛋白酶( k ap r o t e a s e ) ( j o s ee t a 1 ，1 9 9 6 ) ，志贺 氏菌( s h i g e l l as p p ) 的v l r g 蛋白( s u z u k ie t a 1 ，1 9 9 5 ) ，以及大肠杆菌的粘附素a i d a i ( m a u r e re t a 1 ，1 9 9 7 ) 等则为另一类c 端有表面引导定位功能的蛋白分子。这几种蛋 白的共同特征是：它们的c 端序列为p 一折叠桶( p - b a r r e l ) 结构，称为p 区( p d o m a i n ) 或p 核心( p c o r e ) 。这个p 桶结构可帮助n 端的蛋白序列穿越菌体外膜。在某些蛋白 酶，如大肠杆菌的外膜蛋白t ( o m p t ) 的作用下，这类蛋白在中部发生蛋白水解作用， 把n 端序列释放到胞外去，使之成为胞外蛋白。因此在以这类蛋白为基础而构建展 示载体时，必须选用o m p t 突变株( ( o m p t ) 作宿主。目前，己经利用淋病奈瑟氏球菌 ( g o n o r r h o e a e ) 的i g a1 蛋白酶的a 区展示了霍乱毒素的b 亚基( j o s e 等，1 9 9 6 ) ，利 用弗氏志贺氏菌的硒的p 区展示了麦芽糖结合蛋i 兰t ( m a i e ) 和碱性磷酸酶( p h o a ) ( s u z u k ie t a 1 ，1 9 9 5 ) ，利用大肠杆菌的a i d a i 粘附素的p 区展示了霍乱菌素b 亚 基和一个五肽( m a u r e re t a 1 ，1 9 9 7 ) 表1 - 1 g 。细菌内表达的表面展示体系( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) t a b l e1 - 1r e p r e s e n t a t i v ed i s p l a ys y s t e m sf o rt h ee x p r e s s i o ni ng r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a 4 e c o f fp a l ( 1 7 3 娩) 抗_ 阿拉特津抗体片ec o l i 生物传感d h i l l o n 烈a l ， s p a b 姑构域7 圳 g f p - k 。麟 和胁盯 蓉测单个a 2 0 0 2 0 k i 州 士出懿厶 g f p p 5 3 4 氨基酸的 c 末端融合 82 ” e ，c o l i 蚧州。6 5 a a ， 胁盯 淼解篇m 洲”1 2 3 a a )r 工例阡7 叶 植物螯合剂( 4 0 删 生物吸附 2 0 0 0 p 。e d m ：抗原，。全 噬菌体抗2 0 0 0 篇翥茹嚣e c o l i 葆蒜r s h ia n ds u ， 外的结构域( 2 3 9 勰)e ”一 ， g f p ( 2 3 9 驯 e f f 改进报告 j u n 9 2 0 0 1 c t a 1 ， p s e u d o m o n a ，s 妙砌g 伽r 厅。r ，孔n “ ” 基因效率 磊9 “9 6 8 b 一。 i n p ( 3 6 k d a ) c m c a “3 3 k d a e 蒯弱i 催盖。e ta l i ( 4 2 4 a a ) e c o i l 翼用果聚舢k i m l ， 甓= 警变体文库鲫批一茎白质进k e t 叱 妈3 妨： 掣篡瑚2 0 0 0 h b s a g 1 6 8 a a ) c o l i j e o n 。g e t a 1 ， ( e ：7 1 = ， ec o l it r a t c 拍s k 。幻。p h ( 3 6 5 a a ) e c o l i 一 耋翥篷化c ，9 h 鲫a n g 就札 h b 妇 痞苗l o , 2 0 0 0 c o l i c h a n g a n de e c o l i n 僦r h o ( 7 5 胁丘 “田 挈酬， 三夹板式融合 b e n e e - j 0 n e s 蛋白 e f f 蛋白质转x u 柚dk ， ( 1 , 3 叠b 咖r i o ) c h o o m p s 多聚组氨酸肽链 2 0 0 0 。 5 利用乳酸乳球菌a c m a 蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究 缩写：a d x ，牛皮质铁氧还蛋白；c a b s ，流式吸附筛选；c t x b ，霍乱毒素b 亚基；e e t i i i ， e c b a l l i u me l a t e r u m 胰蛋白酶抑止剂i i ；p a l ，肽聚糖相关脂蛋白：c m c a s e ，羧甲基纤维素酶； i - i b s a g ，乙肝病毒表面抗原：f n b p a ，纤维结合素结合蛋白a ；g f p ，绿色荧光蛋白；h m t ，人 金属硫蛋白；y m t ，酵母金属硫蛋白；p ed i i i