（分析化学专业论文）多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究.pdf

摘要 生物传感器在临床、食品、环境等领域具有广阔的应用前景，近 年来发展迅速。在生物传感器的制作过程中，生物识别分子的固定是 一个十分重要的方面。目前所报道的固定方法主要包括吸附法，交联 法、共价键合法、包埋法等，其中高分子聚合物包埋法是一种重要的 固定方法。 电化学石英晶体阻抗分析( e q c 认) 技术通过快速测量石英晶体 电声阻抗而获取较全面的晶体谐振信息，从而可同步动态研究电化学 反应或过程的多种理化参数和材料学性质，如电极表面低至纳克级的 质量变化、溶液粘密度和修饰膜粘弹性等。本文在本实验室前面工作 的基础上，将这技术用于研究生物传感器制作过程中生物分子的固 定过程。主要内容如下： 1 综述了生物传感器的概念、构成和生物分子识别物质的固定方法， 以及电化学石英晶体微天平( e q c m ) 技术及其应用。 2 提出了一种多巴胺电氧化形成的聚合膜( p f d 0 ) 用于固定葡萄糖 氧化酶( g o d ) 的新方法。利用e q c i a 技术现场监测了中性水 溶液中( p b s ，p h7 o ) 聚合膜的生长以及g o d 的固定过程。通 过优化聚合溶液中磷酸缓冲液、多巴胺和g o d 三者的浓度，制 作了性能优良的p f d o g o d a u 电极用于葡萄糖传感检测。优化 条件下，该传感器的线性范围为o 0 5 91 1 1 m 、检测限为3 脚 ( s n = 3 ) 、响应时间在1 5s 内，并且稳定性良好。另外，我们利 用电化学和e q c i a 技术估算了固定化g o d 的有效酶比活性和酶 | 薹霎，萋未墼萎i | ；羹耋薹薹璧薹嚣匿。耋；璧塞：；苎三委量善i 薹萋委搿矍囊薹! ；j 誊蚤i i 主要害主要囊薹至蚕耋薹； a b s t r a c t b i o s e n s o r sa r ep r o m i s i n gb i o c h e m i c a la n a l y s i st o o l sf o rc l i n i c a l d i a g n o s i s a sw e ua sf i o o da n de n v i r o i l i l l e n t a l m o n i t o r i n g t h e i m m o b i l i z a t i o no ft h ei n v 0 1 v e db i o m o l e c u l e si st h e k e ys t e p i n c o n s t m c t i n gab i o s e n s o r t od a t e ，m a n yt e c l l i l i q u e sh a v eb e e nu t i l i z e df o r e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ， i n v o l v i n gp r o t o c o l s o fa d s o 印t i o n ， c o v a l e n t b i n d i n g ，c r o s s l i i 浓i n ga n de n 仃印m e n t a m o n gt h e m ，t h ee n t r 印m e n tw i t h p 0 1 y m e r sh a sb e c o m eap o p u l a rm e t l l o dt oj m m o b i l i z eb i o m o l e c u l e s t h ee l e c t r o c h e m i c a lq u a n zc 巧s t a li m p e d a l l c e a n a l y s i s q c i a ) p e r f o r m sas i m u l t a n e o u sa n dr a p i dm e a s u r e m e n to ft 1 1 ee l e c t r o a c o u s t i c i m p e d a n c ef o rt h ep i e z o e l e c t r i cq u a r t zc w s t a l ( p q c ) r e s o n a n c e ，w h i c h c a np r o v i d em u l t i p l ec h e m i c a 岫h y s i c a lp a r a m e t e r sa i l dm a t e r i a l r e l e v a l l t c h a r a c t e r i s t i c s d u r i n g a ne l e c t r o c h e m i c a l p e r t u r b a t i o n ， s u c ha s e l e c 打o d e m a s s c h a n g e sd o w nt ot h en a i l o 伊a m1 e v e l ， t h es o l u t i o n v i s c o d e n s i t y ，a n dt h ee l a s t i c i t yo fm o d i f i e df i l m s i nt h ep r e s e n tt h e s i s ，t h e e q c i a m e t h o dh a sb e e nu s e dt ot r a c kt h ep r o c e s s e so fi m m o b i l i z a t i o no f i i o l v e db i o m o l e c u l e sf o rc o n s 伽l c t i n gm eb i o s e n s o r s 1 t h ec o n c e p ta n dc o n s t r u c t i o no ft h eb i o s e n s o r s ， m a i n l yi n v o l v i n g i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sf o rb i o m o l e c u l e s ，a sw e l la st h ep r i n c i p l ea i l d 印p l i c a t i o n o ft h ee l e c 仃c h e m i c a l q u a i t zc 巧s t a l m i c r o b a l a l l c e ( e q c m ) ，h a v eb e e nr e v i e w e d 2 g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) w a sc o d e p o s i t e di n t oap o l y m e rg r o w n 矗o m o x i d a t i o no fd o p a m i n e ( d a ) a ta na ue l e c t r o d ei nan e u 仃a lp h o s p h a t e a q u e o u ss o l u t i o nf o rt h ef i r s tt i m e t h ee q c i am e t h o dw a su s e dt o m o n i t o rm eg o d - i m m o b i l i z a t i o np r o c e s s e f f e c t so fc o n c e n t r a t i o n so f p h o s p h a t eb u 虢r d aa i l dg o dw e r ei n v e s t i g a t e d ，a 1 1 dt h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o n sw e r ef o u n dt ob e2 0 om m p h o s p h a t eb u 行e r ( p h7 o ) ， 3 0 om md aa i l d5 o om gm l qg o d ag l u c o s eb i o s e n s o rw a st h u s c o n s t m c t e d ，a l l de f f e c t so fv a r i o u se x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r so nt h e s e n s o rp e r f b m a n c e ， i n c l u d i n ga p p l i e dp o t e n t i a l ， s o l u t i o np ha n d e l e c 仃o a c t i v ei n t e r f e r e n t s ，w e r ee x a m i n e d a ta no p t i m a lp o t e n t i a lo f o 6vv e r s u st h ek c l s a t u r a t e dc a l o m e le l e c 仃o d e ( s c e ) ，t h ec u r r e n t r e s p o n s eo fm eb i o s e n s o ri nt 1 1 es e l e c t e dp h o s p h a t eb u 妇f e r ( p h7 o ) w a sl i n e a rw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e 行o mo 0 5t o9m m ，w i t h al o w e rd e t e c t i o nl i m i to f3 m ( s n = 3 ) ，s h o nr e s p o n s et i m e ( w i t h i n 15s ) a i l dg o o da n t i i i l t e 疵r e n ta b i l i t y t h em i c h a e l i sc o n s t a n t ( 8 p p ) w a se s t i m a t e dt ob e9 6m m t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dg o o ds t o r a g e s t l b i l i t y ；i e 9 6 o fi t s i n i t i a l r e s p o n s ew a sr e t a i n e da r e r7 一d a y s t o r a g ei nt h es e l e c t e dp h o s p h a t eb u 丑b ra t4 。c ，a n de v e na r e ra n o t h e r t h r e ew e e k st h eb i o s e n s o rr e t a i n e d8 6 o fi t si n i t i a l r e s p o n s e i n a d d i t i o n ， t h e e n z y m a t i cs p e c i f i c a c t i v i t y a n de n z y m a t i cr e l a t i v e a c t i v i t y o ft h e9 0 di m m o b i l i z e di nt h ep 0 1 y m e r 行o md o p a m i n e o x i d a t i o n ( p f d 0 ) w e r ee s t i m a t e d 丘o mt h ee q c i am e t h o dt ob e1 4 3 l i r l jg “a i l d3 7 ，r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r el a r g e rt h a nt h er e l e v a n t v a l u e so b t a i n e d e x p e r i m e n t a l l yu s i n gp o l y ( d a m i n o p h e n 0 1 ) a n d p o l y ( n - m e t h y l p y l l r o l e ) m a t r i c e s ，s u g g e s t i n gt h a tt 1 1 ep f d oi sab e t t e r m a t r i xt oi m m o b i l i z eg o d 3 g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) w a sc o d e p o s i t e di n t oap o l y m e r 伊o w n 仔o m d o p a m i n eo x i d a t i o na ) a ) o nap m s s i a nb l u e ( p b ) m o d i f i e da m e l e c t r o d ei nn e u t r a lp h o s p h a t ea q u e o u ss 0 1 u t i o n t h ee q c i am e t h o d w a su s e dt om o n i t o rv a r i o u sm o d i f i c a t i o ns t e p si nc o n s 加】c t i n gt h e e n z y m ee l e c t r o d e a 舀u c o s eb i o s e n s o rw i t hg o o dp e r f o r m a n c ew a s m u sf a b r i c a t e d ，v i at h eq u a n t i t yo p t i m i z a t i o 羹篱百蒂雾；黉薹两| j 霪引蓁冀萋 苎喜鐾主蓁荣埋薹霎i 蓁戮簿燃主曼趔疆萎i 量冀；雾毒垮窆嚣剁荦e 蓁滢羹囊髫塾琶坷；l 攀薹i 蠢羹l 葡喜雾雾i 斟雾 霎螽薹篁魏! q i ；n 霎j 謦l l b yu s i n g q u a r t z c 眄s t a lm i c r o b a l a n c ei n t e r a c t i o nbe h a v i o r so fo n t oap h o s p h o l i p i d m o n o l a y e ra tt h ea i rw a t e ri n t e 血c e l a n g m u i r ， l9 9 3 ，9 ：5 7 4 5 7 6 8 4 yz h a n g ，q x i e ，s y a o i ns i t um o n i t o r in go fl y s o z y m ea d s o r p t i o no n t o b a r ea n dc y s t e i n e - o rl - o c t a d e c a n e t h i o l - mo d i f i e da ue l e c t r o d e su s i n ga n e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t z - c q s t a li m p e d a n c es y s t e m a n a l s c i ，2 0 0 0 ，16 7 9 9 - 8 0 5 8 5 yz h a n g ，q x i e ，yg u o ，x w a n g ，s y - a o as t u d yo na d s o r p t i o no f e l e c t r o g e n e r a t e d c y s t i n e p r e c i p i t a t eo n t oa ue l e c t r o d e u s i n g e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc 呵s t a li m pe d a n c es y s t e m c h i n c h e m l e t t ，1 9 9 9 ， 1 0 ( 1 2 ) ：1 0 5 7 - 1 0 6 0 8 6 q x i e ，c xi a n g ，y z h a n g ，yy u a n ，m l i u ，l n i e ，s y a o i ns i t u m o n i t o r i n go fg o l d s u r f a c ea d s o r p t i o na n da c i d i cd e n a t u r a t i o no fh u m a n s e m ma l b u m i nb ya ni s o i a t i o n c a p a c i t a n c e a d o p t e de l e c t r o c h e m i c a l q u a r t zc 呵s t a li mp e d a n c es y s t e m a n a l c h i m a c t a ，2 0 0 2 ，4 6 4 ( 1 ) ：6 5 - 7 7 8 7 q x i e ，x su n ，h l i u ，yz h a n g ，s 、，a o i ns i t ua c q u i s i t i o no fe q u i v a l e n t c i r c u i t p a r a m e t e r so fc r y s t a lr e s o n a n c ed u r i n gc o p p e rd e p o s i t i o na n d d i s s o l u t i o ni na c i d i cs o l u t i o nb ye l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a l i m p e d a n c e s y s t e m c h i n c he m l e t t ，1 9 9 9 ，1 0 ：7 3 - 7 6 8 8 q x i e ，j wa n g ，h l i u ，yz h a n g ，s y a o as t u d yo fe l e c t r o c h e m i c a l p r o c e s so ff e ( cn ) 6 3 - f e ( c n ) 6 4 。o ng o l de l e c t r o d eb ye le c t r o c h e m i c a l q u a r t zc r y s t a l i m p e d a n c e s y s t e m c h e m j c h i n u n i v ，1 9 9 9 ，2 0 5 4 9 5 5 1 8 9 q 多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究 第一章绪论 从1 9 6 2 年c l a r k 等研制出世界上第一个利用葡萄糖酶电极测定 葡萄糖的生物传感器以来，生物传感器就以其高灵敏度、高选择性、 分离过程和检测技术合为一体、不需要样品制备等特点而备受关注。 其发展迅速，已广泛应用于环境检测、临床医学检测、制药、工业过 程控制、化学物质安全性评价以及食品等诸多领域。 n o m u r a 等【2 j 首先研究了压电传感与电化学技术的联用，构成电化 学石英晶体微天平( e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc 叫s t a lm i c r o b a l a n c e ， e o c m ) 。因其对电极过程中电极质量变化的高灵敏度原位检测能力， 故自上世纪8 0 年代e q c m 诞生以来，备受电化学和电分析化学工作 者的瞩引3 1 。结合本文的研究方向，本章就生物传感器和e q c m 理论 及其应用作简要综述。 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器的定义和分类 所谓生物传感器就是由固定化的生物材料( 包括酶、抗体、微生 物等生物活性物质、) 与相应的转换器件构成的分析工具或系统。它利 用生物活性物质的分子识别功能，选择地测量另一方，这种敏感元件 称为分子识别元件。由于生物活性物质具有专一识别功能，从而使得 生物传感器具有较高的选择性，可以直接用于复杂样品进行检测。 按不同的分子识别元件，生物传感器可以分为酶传感器【4 ，5 | 、免 疫传感器【6 1 、酶免疫传感器【7 】、d n a 传感器【8 ，9 】、细胞器传感器 1 0 ，1 1 1 、 微生物传感器【1 2 】、组织传感器【1 3 】等。生物传感器利用适当的转换器件 硕士学位论文 可将生化信号转换成为定量的物理信号如电、光等，从而实现对特定 物质的快速检测。 按不同的转换器，生物传感器又可分为电化学生物传感器( 包括 电流型【14 1 、电位型【1 5 】、电容型 1 6 1 和场效应晶体管( f e t ) 生物传感器 旧等) 、光学式生物传感器f 1 8 ，1 9 】、压电晶体式生物传感器【2 0 】、热敏电 阻式生物传感器【2 1 1 等。 1 1 2 生物识别分子的固定化技术 生物识别分子的固定化技术是生物传感器制作过程中的关键技 术，它需要兼顾生物识别分子的活性和牢固性两个方面。因此生物识 别分子的固定化技术决定着生物传感器的灵敏度、选择性和稳定性等 主要性能。为使生物传感器的工作性能呈现良好的结果，其固定化技 术应满足以下几个条件：( 1 ) 固定化后的生物识别分子要保持良好的 生物活性；( 2 ) 固定化层具有良好的稳定性和耐用性；( 3 ) 减少生物固 定化层中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性；( 4 ) 生物 固定化层与换能器紧密接触，并能适应多种测试环境；( 5 ) 生物固定 化层最好具有一定的抗干扰能力。生物识别分子的固定化方法大致包 括以下四类：吸附法( a d s o r p t i o n ) 、共价键合法( c o v a l e n tb i n d i n g ) 、 交联法( c r o s s i n g l i n k i n g ) 和包埋法( e n t r a p m e n t ) 。分别依次介绍如 下： 生物识别分子的物理或化学吸附法是一种比较简单的固定化技 术，条件温和，能够保持生物识别分子较高的生物活性。该方法主要 是通过生物识别分子的极性键、氢键或疏水键作用，将其固定在不溶 性载体上【2 2 2 5 1 。吸附法的缺点在于生物分子与固定表面结合力弱，在 其表面不规则分布，使得生物传感器易发生生物分子的泄露，灵敏度 低，选择性差。 多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究 厚度剪切压电石英晶体频移蛳与晶体表面均匀刚性薄膜物质质量之 间存在线性关系，即著名的s a u e r b r e y 方程【4 9 】： 鲕= 一砺g z 砌阻慨触) “午一2 2 6 4 lo 9 2 锄伪 ( 1 一1 ) 式中而2 为晶体基频( h z ) ，蛳为晶体频移( h z ) ，4 为电极表面积 ( c m 2 ) ，风和硒分别为石英晶体的密度( 2 6 4 8gc m 。) 和晶体剪切模 量( 2 9 4 7 1 0 1 1gc m 1s 五) ，朋为刚性薄膜质量变化( g ) ，负号表示 质量增加导致频率下降。 早期学术界一直认为压电检测器只能应用于气相中【5 ，直到 1 9 8 0 年以后，才实现了压电液相稳定振荡并成功地用于分析化学领 域，从而开辟了液相压电传感的新领域，大大地拓宽了它的应用范围。 研究表明，压电晶体除了有灵敏的质量效应以外，还存在有更多的非 质量效应，如粘度、密度、应力、粘弹性、电导率、介电常数、表面 性状等介质或界面效应。k a n a z a w a 等人率先提出了描述p q c 谐振频 率与溶液粘密度关系的方程【5 l 】。此后，m a i t i n 等人提出了一系列质量 及液体负载同时影响的p q c 等效电路参数方程【5 2 】。根据m 狐i n 方程， 蛳、欲l 和缸l 都与( 仇7 7 l ) 2 的改变量线性相关。由于动态电阻和电导 半峰宽( 毓l ，2 ) 都能反映e q c m 振荡能量的衰减【3 1 ，因此，对其进 行分析，我们可使用如下方程估算净的液体负载效应【5 3 5 5 j ： 2 吐。6 晚姚欲儿= 2 啦。l = 一4 心。馘l 缸。矗瓦。一4 心。馘。( 1 2 ) 式中6 蛎l ，2 l ，鲕l ，欲l l 和1 l 分别是由于溶液的粘度( ，7 l ) 和密度 ( 仇) 的改变引起的虢l 2 ，矗，尺l 和三1 的改变值，其中l q 和石g 分别 为石英晶体在空气中的动态电感和谐振频率，k 为压电石英晶体的 弹性常数( 2 9 5 7 1 0 1 0n n l - 2 ) 。 方程( 1 2 ) 的意义明显在于如果实验中响应满足 2 础，。占瓴。彪欲。= 2 7 拙。= 一4 碰。馘舡。 瓦。一4 以。馘 ( 1 - 3 ) 那么，蛳，欲1 ，缸l 和6 虢1 2 应该完全受p q c 电极表面附近局 多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究 厚度剪切压电石英晶体频移蛳与晶体表面均匀刚性薄膜物质质量之 间存在线性关系，即著名的s a u e r b r e y 方程【4 9 】： 鲕= 一砺g z 砌阻慨触) “午一2 2 6 4 lo 9 2 锄伪 ( 1 一1 ) 式中而2 为晶体基频( h z ) ，蛳为晶体频移( h z ) ，4 为电极表面积 ( c m 2 ) ，风和硒分别为石英晶体的密度( 2 6 4 8gc m 。) 和晶体剪切模 量( 2 9 4 7 1 0 1 1gc m 1s 五) ，朋为刚性薄膜质量变化( g ) ，负号表示 质量增加导致频率下降。 早期学术界一直认为压电检测器只能应用于气相中【5 ，直到 1 9 8 0 年以后，才实现了压电液相稳定振荡并成功地用于分析化学领 域，从而开辟了液相压电传感的新领域，大大地拓宽了它的应用范围。 研究表明，压电晶体除了有灵敏的质量效应以外，还存在有更多的非 质量效应，如粘度、密度、应力、粘弹性、电导率、介电常数、表面 性状等介质或界面效应。k a n a z a w a 等人率先提出了描述p q c 谐振频 率与溶液粘密度关系的方程【5 l 】。此后，m a i t i n 等人提出了一系列质量 及液体负载同时影响的p q c 等效电路参数方程【5 2 】。根据m 狐i n 方程， 蛳、欲l 和缸l 都与( 仇7 7 l ) 2 的改变量线性相关。由于动态电阻和电导 半峰宽( 毓l ，2 ) 都能反映e q c m 振荡能量的衰减【3 1 ，因此，对其进 行分析，我们可使用如下方程估算净的液体负载效应【5 3 5 5 j ： 2 吐。6 晚姚欲儿= 2 啦。l = 一4 心。馘l 缸。矗瓦。一4 心。馘。( 1 2 ) 式中6 蛎l ，2 l ，鲕l ，欲l l 和1 l 分别是由于溶液的粘度( ，7 l ) 和密度 ( 仇) 的改变引起的虢l 2 ，矗，尺l 和三1 的改变值，其中l q 和石g 分别 为石英晶体在空气中的动态电感和谐振频率，k 为压电石英晶体的 弹性常数( 2 9 5 7 1 0 1 0n n l - 2 ) 。 方程( 1 2 ) 的意义明显在于如果实验中响应满足 2 础，。占瓴。彪欲。= 2 7 拙。= 一4 碰。馘舡。 瓦。一4 以。馘 ( 1 - 3 ) 那么，蛳，欲1 ，缸l 和6 虢1 2 应该完全受p q c 电极表面附近局 多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究 道，h e 等利用q c m 检测培养液化学性质的改变对大肠杆菌进行了 测定，检测范围为1 0 3 1 0 7 c e nn l l 。同时，也测定了细菌的生长速度 【1 09 1 。b a o 等基于培养液的凝固提出了一种测定细菌的方法，监测了 大肠杆菌和溶壁微球菌的生长过程1 1 0 ，1 1 1 1 。 1 3 本文构思 随着生物传感器研究的迅猛发展，各种生物识别分子的固定方法 被用于生物传感器的研究，其中利用高分子聚合膜包埋法固定生物分 子的报道屡见不鲜，但是寻找合适的高分子聚合膜，从而提高生物传 感器的性能，是当前研究的热点之一。另外，常规e q c m 大体上只 记录压电石英晶体( p q c ) 振荡频率的改变值，与之相比，电化学石 英晶阻抗分析( e q c i a ) 技术通过快速测量石英晶体电声阻抗而获取 更全面的晶体谐振信息，从而可同步动态研究电化学反应或过程的多 种理化参数和材料学性质，如电极表面低至纳克级的质量变化、溶液 粘密度和修饰膜粘弹性等。有鉴于此，在本研究室已有的研究工作基 础上，本文利用电化学石英晶体阻抗分析技术现场监测多巴胺电氧化 聚合膜固定生物识别分子的过程，并利用电化学和e q c i a 技术联用 估算固定化酶的比活性，拓展电化学石英晶体阻抗分析技术在生化分 析和研究中的应用。 硕士学位论文 第二章多巴胺电氧化聚合成膜过程中葡萄糖氧化酶的固 定及葡萄糖的检测2 1 引言 一直以来，基于固定化葡萄糖氧化酶(god)的葡萄糖安培传感 件下，god催化葡萄糖的氧化产生过氧化氢【5，112，113 1 ，同时，通过安 培法来检测所产生的过氧化氢，从而将电流的响应和葡萄糖的浓度关 联起来。通常，过氧化氢的直接电化学检测是在其氧化电位( 0 6vv s a a g c l ) 下进行的 蕈耋雾塞ii 翼葡；黍爹鋈型探璃蝗霎j 绍錾蟹班季l 翼瑟纵鍪羹幽墅；型冀；蠢笨扁型i 霆| 鬟羹丽i 羹囊| ；翼薹简 羹鲥涮蹩；燮鄹薹翼鸬胡薹萎；蓁羹；蚕篙拨墨筵鞋掌蘸蘩；翁蒯r 乍1 羹喇：嬲猫鬟琴鐾： 瞪艘唑蓊皑暴犁公竖琴一萋凌熊攀再裂舅酣墨! 漠东娄一冀l 蓁性 而况逦攀鲤爱蓦赛嚣用非导电聚合膜制作的生物传感器表现出很高的 重现性和快速的 响应时间，另外非导电聚合膜具有很好的选择透过性，能够限制抗坏 血酸，尿酸等的电化学干扰。非导电聚合膜在生物传感器方面已经得 到了广泛的应用，常见的非导电聚合膜包括：聚邻苯二胺【4 2 ，4 3 1 、聚酚 类【4 4 】、聚邻氨基苯酚【4 5 】、过氧化聚吡咯 4 6 1 等。另外黑色素类物质也 被应用于生物传感器的研究【4 7 】。 1 2 电化学石英晶体微天平( e q c m ) 1 2 1q c m概述 早在1 8 8 0 年，c u 盯i e 兄弟就发现某些晶体具有压电效应【4 8 1 ，压 硕士学位论文 f 瞎u r e2 - 1 s i m u l t a n e o u sr e c o r d so fc u r r e n t ( 晚蛳，r 1a n d6 蛎1 2d u r i n gp o t e n t i a l c y c l i n gi n2 0 om ma q u e o u sk 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 ( p h7 0 ) c o n t a i l l i n g1 5 0 ( a ) a n d3 0 0 ( b ) m md a 越m f ：2 0m vs 2 3 结果与讨论 2 3 1p f d 0 作为葡萄糖氧化酶的固定载体和p d a p 、p 佃的比较 图2 1 b 给出了在含1 5 0i i m 多巴胺的p b s ( p h = 7 4 ) 溶液中， 进行4 0 圈电位扫描期间，电流、蛳、欲，和6 酶l 2 的现场响应曲线。 电位区间为一0 6 0 6v 。从图2 1 a 中我们可观察到在第一圈正向扫描 的过程中有一个峰电位为0 1 7v 的氧化峰( p a 】) ，此峰为多巴胺氧化 为多巴胺醌的峰。同时，在接下来的反向扫描过程中，出现了两个电 流峰，它们分别是多巴胺醌和多巴胺色素的还原峰( p 。l 和p 。2 ) ，峰 电位分别为o 1 0v 和0 2 8v 。在第二圈的正向扫描过程中，出现了 一个新的氧化峰，峰电位为o 2 3v ( p a 2 ) ，该峰是由于还原了的多巴 胺色素又重新氧化而产生的。从图2 1 a 也可观察到在多巴胺氧化期 冀羹萋囊夔蓁 鏊篓篓雾i 羹垂荔妻耋i g 雾鏊冀冀蓁薹薹蚕雾雾冀鬻翥灞雾薹；i ；i 墼堕囊羹旧l 霈 冀毳篓鋈磊麓墼彝雾羹薹蓁鎏羹薹备藐谍羹些雾塞野黜需鏊羹薹型i 童莹i ； l | 萋i 基蠡翁黜畅鞘磊戳誊；萋弦韩羹喻雾雾翰趔崮一1 椎蓬平囊；蓁蓁萋 篓霰和符蓁髯蓬藤莆甄斧曼郇羹精紧钟一；囊妻妻蠢至羹疆一铟鋈鹈陲 | ；蠢萄崩姿薹鼙妻鸶耄囊妻荔i 量些萋带萋刑滋羹裂作鏊鋈喔二右鹾霎掺苤羹! 擎鳓鬟萋丽i 雾萎；莉雾薹莉篱鑫薹澎雾囊妻i 薹鬻霎般囊靠灌冀墼鋈 捕娑雾移鬟输毖鋈翼捌更雾萋俺差薹喜匿j 髻繁堡鬻饕掣；i j ；。默贼彭犁 争鍪箱碓生长霪醺萋时匪重复点季刖霎辇型饕超鬟鬻霎躔题婴鍪拟 羹羹薹妻稠磁菱鲥藿藩肾；i i i ：善i 芩_ 尺佩冀俪丽薹f 差臻釜礞舞；i ；i 。量? ! ! 萋l 落装葡薹薹丽螭罐羹烈幕冀；阵妻：笙妻摧腻震冀学曾堕壅羹誊 鲥憝舔矍羹雾垡蓁翼蓁蒹冀攀登雾；裂蓊錾葭强醐囊篓蔼零裂堕。 薹蓁霎銎雾| 囊雾鋈翅薹萋霞浮堪萄糊鬻冀霎靠琛磕i i | ! 塑鋈霪搴囊i 耄莺萎霎私絮塞 鞫雾斧堡挚葶蕈翌f 丛；鋈蠢羹耋霪ii 4 4 i 载链滗星垂翻 篓葡羹f x 多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究 作酶安培传感器 1 3 8 ，1 39 1 ，在本章中我们用p d a p 来代替p f d o 进行比 较，并讨论了它们在固定葡萄糖氧化酶的性能。我们在含有l o om m 邻氨基苯酚和5 o om gm l 1 g o d 的2 0 om mk 2 肿0 4 - k h 2 p 0 4 ( p h7 o ) 水溶液中利用循环伏安扫描( 0 o 9v 2 0m vs ，4 0 圈) 来制作 p d a p g o d a u 电极。类似的方法在不含有g o d 的溶液中制作 p d a p a u 电极。然后，根据s a u e r b r e y 方程求得用p d a p 固定的酶量 为o 9 8 0 “g 。p d a p g o d a u 电极响应的线性范围为o 0 5 0 6 om m 、 其斜率为o 5 6 肛am m 1c m 、线性相关系数为o 9 9 3 3 。如果将邻氨基 苯酚的浓度增大到3 0 删，同样的方法制作p d a p a u 电极和 p d a p g o d a u + 电极，计算得出固定化酶量为1 8p g 。然而，酶电极 对葡萄糖的电流响应却变得不明显。这些现象的出现与p d a p 的结构 有关，p d a p 是一种具有梯形结构的聚合高分子，所以在绝缘p d a p 聚合膜的形成过程中很容易发展成为一种紧密的网状结构，从而使得 葡萄糖和酶反应生成的h 2 0 2 很难透过，尤其在较高浓度下更有利于 形成一个相对较厚的聚合膜1 4 0 1 。相比之下，根据文献报道【9 9 ，1 3 0 ，1 3 1 l ， 人们利用扫描电子显微镜观察到p f d 0 是一种类黑色素的无定型沉 积物，即使它的膜相对较厚，也表现出良好的的透过性和高的抗干扰 选择渗透性，也就是说，相对较厚的p f d 0 膜制作的葡萄糖氧化酶传 感器表现出更高的灵敏度。另外，我们比较了p f d 0 和p d a p 膜对过 氧化氢的穿透性。首先在金电极上分别聚合p f d 0 ( 8 8 6 h z ) 和p d a p ( 7 3 2h z ) 膜，然后在电位为o 6v 条件下，检测两个电极分别对2 5 m m h 2 0 2 的电流响应，结果显示，前者的电流响应为9 6 5 a ，而后 者只有1 5 5 “a ，较厚的p d a p 不利于h 2 0 2 的穿透，相比而言，p f d 0 不但能够固定比较多的酶或其他生物分子，而且对h 2 0 2 的检测优势 也是显而易见的。 为和基于导电聚合膜固定酶的生物传感器比较，我们还制作了 硕士学位论文 p 脚g o d a u 电极( 见实验部分) ，该电极的灵敏度为9 3 3n a 伽。 c m 。另外，我们在含有3 0 om mn 甲基吡咯和5 o om gm l 1g o d 的2 0 0m m 的磷酸缓冲溶液中通过循环伏安扫描法( 0 0 9vv ss c e ， 2 0m vs 。1 ) 用p 但固定g o d ，所得葡萄糖氧化酶电极的灵敏度只 有1 2 4n ai i l 】1c m 。这与先前报道的吡咯g o d 安培生物传感器n a 级的饱和电流响应类似 1 4 l ，1 4 2 1 。以上结论都说明p f d o 是一种非常好 的固定g o d 基质，其原因为它对g o d 的高生物兼容性和h 2 0 2 良好 的透过性。 2 3 2 磷酸缓冲液、多巴胺和g o d 的浓度对g o d 固定和葡萄糖检测 的影响 为优化g o d 固定和葡萄糖检测的条件，我们对聚合池中的磷酸 缓冲液浓度、多巴胺浓度和g o d 浓度的影响作了研究。我们通过在 特定聚合溶液中( 见下文) 进行4 0 圈电位扫描( 一o 6 o 6v 2 0m vs 。1 ) ， 然后；利用每个酶电极在电位为o 6v 条件下，检测p b s ( p h7 0 ) + o 1 mk 2 s 0 4 的水溶液中的葡萄糖，并记录稳态电流( f 。) 。实验结果和讨 论如下： 图2 3 a 给出了磷酸缓冲液浓度的影响，在此保持多巴胺( 2 0 o m m ) 和g o d ( 5 o om gm l 。) 的浓度不变。结果表明，磷酸缓冲液 浓度在5 0 0 至2 0 oi l m 范围内时，良。随着磷酸缓冲液浓度的增加 而增大，再继续增加其浓度，f 。反而减小，同时，频率( 蛳p ) 和电 阻( 尺1 d ) 的改变也和电流响应改变类似。这些发现解释如下：随着 磷酸缓冲液浓度的增加，p f d o 的量越来越多，从而使固定的酶量也 增加，然而随着其浓度继续增加，由于磷酸阴离子的竞争共沉积，而 使得固定化酶的量和葡萄糖响应电流有一定程度的降低。因此，在本 章中我们选择浓度为2 0 om m 的磷酸缓冲液作为制作酶电极的条件 多巴胺电氧化聚合膜用作酶固定基质的压电电化学研究 j 、 ? 司 a 、 疋 司 01 53 0 c p b 4 56 07 5 m m 4 3 2 1 0 02 04 06 0 1 01 23 4 5 6 78 c 文，m mc g o o ，m m n 工 y 、 k p 司 f i g u r e2 3 e f | f e c t so fc o n c e n t r a t i o n so fp h o s p h a t eb u f f e r ( a ) ，d a ( b ) a n dg o d ( c ) i nt h e p o l y m e r i z a t i o nb a mo ni m m o b i i i z a t i o no fg o d f o rg l u c o s es e i l s i n g s t e a d y - s t a t ec u r r e n t s ( f s s ) w e r em e a s u r e da t0 6v ( v ss c e ) i n0 1 0mk 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 + 0 1 0mk 2 s 0 4a q u e o u s s o l u t i o n ( p h7 0 ) c o n t a i n i n gl o om mg l u c o s e t b t a if o r e a n d a f tc h a n g e si nt i l er e s o n a n t f r e q u e n c y ( 2 蛎) a n dm o t i o n a lr e s i s t a i l c e ( 尺1 ) f o rt 1 1 ec y c “cv o l t a m m e m cp o l y m e r i z a t i o n ( 4 0c y c l e s ) a r ea l s os h o 、v nh e r c ，s e et e x tf o ro p e r a t i o nd e t a i l s 乙一。 多巴胺浓度的影响如图2 3 b 所示，在此保持磷酸缓冲溶液( 2 0 o m m ) 和g o d ( 5 o om gm l 。1 ) 的浓度不变。结果表明，多巴胺的浓 度在5 o om m 至3 0 or i m 范围内时，f 。、酾p 和歙l p 随着多巴胺浓 度的增加而增加，再继续增加多巴胺的浓度，反而减小。这可能是由 于多巴胺浓度从5 0 0 增加至3 0 om m ，随着电流密度的增加，固定的 g o d 量也相应增加。然而，当多巴胺的浓度进一步增加时，p f d 0 膜沉积的速度也相应的提高，g o d 的补给滞后，固定的酶量也减小 了( 如图2 1 ) 。类似的现象已有报道1 4 2 1 ，所以我们选择响应电流响 最大时多巴胺的浓度，3 0 0m m 为最优条件。 图2 3 c 给出了g o