（分析化学专业论文）头发表面半胱氨酸分析方法研究.pdf

摘要 摘要 各种环境和物理化学因素对头发的损伤多从毛小皮结构中高硫蛋白组分的破坏开 始，并进一步引发头发整体抗拉、光泽度等性能的降低。有研究表明头发表面胱氨酸断 裂转为半胱氨酸是头发损伤的物质基础，因此研究头发表面半胱氨酸，有助于对头发损 伤机制的研究，为解决损伤头发的修复提供思路。在这个背景下，本文开展了如下工作： 1 参照文献研究了溶液体系中p h 、l 半胱氨酸( l c y s ) 与4 一氯一7 - 硝基- 2 ，1 ，3 苯 并噫二唑( n b d c 1 ) 的摩尔比、温度及反应时间等因素对n b d c 1 与半胱氨酸反应的影 响，并探讨了n b d c 1 衍生物的稳定性。结果表明，半胱氨酸与n b d - c i 之间的亲核取 代反应位点受溶液p h 影响；p h 3 0 时，反应生成了单一的n b d s c y s 衍生物。l c y s 与 n b d c i 摩尔比为l ：l 1 ：8 时衍生物为n b d s c y s 。实验结果表明反应时间越长，温度 越高，溶液吸光度就越大。本文选择温度7 0 反应时间7 0r a i n 作为反应条件。光照可 使n b d s c y s 发生进一步变化，而氧对该衍生物的影响较小。n b d s c y s 衍生物至少 能稳定一周。 2 研究头发表面半胱氨酸残基与n b d c i 的相互作用。采用荧光光度计对n b d c 1 处理冷烫头发表面进行荧光发射光谱扫描，结果表明荧光最大发射波长受n b d c 1 溶液 介质p h 的影响，p h 3 、p h 4 时头发表面荧光光谱k 一分别为5 1 6 n m 和5 2 1 n m ；且荧 光发射峰强度在p h 3 时最大。结合溶液体系半胱氨酸与n b d c i 反应的特点，推测p h 3 时n b d c 1 取代位点可能为头发表面半胱氨酸残基上巯基，衍生物结构可示为n b d s k 。 采用衰减式全反射傅立叶红外光谱法( a t rf t - 瓜) 对n b d c 1 处理冷烫头发表面进行 红外光谱扫描，结果显示介质p h 3 处理的发样红外光谱出现硝基对称伸缩振动峰，进一 步支持p h 3 时n b d c 1 与头发表面半胱氨酸发生特异性结合的结论。n b d c 1 浓度改变 对n b d c 1 与头发表面基团( 巯基或胺基) 反应的选择性无影响。 3 研究头发冷烫试剂巯基乙酸浓度与相应头发表面产生的半胱氨酸量之间的关系。 本文采用比浊法测定n b d c i 与头发表面半胱氨酸释出的氯离子，间接测定头发表面半 胱氨酸的含量。发现在l * o 、, 5 w t 巯基乙酸浓度范围内，头发表面由胱氨酸转化生成的 半胱氨酸的量呈正相关，相关系数r 2 = o 9 4 。本文测得未受损发样表面半胱氨酸的含量 为1 9 3 9 士1 6 9 9 m o l g ( n - - - 3 ) ，5 冷烫发样表面半胱氨酸的含量为6 3 3 2 _ - t ：6 5 9 1 t m o l g ( n - 3 ) 。 4 研究环境因素对头发表面半胱氨酸残基影响。本文对冷烫后空气中放置不同时 间的发样以n b d c i 溶液处理，头发表面的红外光谱以a t r f t - i r 表征。与未受损发样 以及冷烫后氮气保护发样比较，空气中放置冷烫发样出现胱氨酸单氧化物( r s o s r ) 反射峰，表明头发表面半胱氨酸残基发生进一步氧化。研究表明头发表面半胱氨酸氧化 反应动力学符合二级反应动力学，回归方程1 c = 0 1 2 4 4 + 0 0 0 0 1 0 5 t ( r 2 = 0 8 8 ) ，速率常 数k = 0 0 0 0 1 0 5 ( i t m o l t 9 4 ) s 1 。以头发表面s o 键吸收强度( t s o ) 与n 0 2 对称伸缩振动吸 收强度( i n 0 2 ) 之比值作为头发表面氧化程度的简单指标，研究u v b 辐射对冷烫头发的 氧化的协同作用，结果表明u v b 辐射显著地加速了氧化转化率。 关键词：头发表面，半胱氨酸分析，n b d c 1 ，比浊法 a b s t r a c t a b s t r a c t h i g h s u l f u rp r o t e i no fh a i rc u t i c l ec o u l db ed a m a g e dv a r i o u se n v i r o n m e n t a la n d p h y s i c a l - c h e m i c a lf a c t o r s t h e r e f o r e ，t h et e n s i l e ，g l o s sa n do t h e rp r o p e a i e so fh a i rw i l lb e s i g n i f i c a n t l ya f f e c t e db yt h e s ed a m a g e s s o m er e s e a r c h e r sh a v es h o w nt h a te y s t i n eo fh a i r c u t i c l em a y b et r a n s f e rt oc y s t e i n er e s i d u e s ，w h i l et h es hg r o u po fc y s t e i n ee x h i b i th i g h r e a c t i v i t y t h u s ，i ti si m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t ec y s t e i n eo nh a i rc u t i c l ew h i c hi sh e l p f u lt os t u d y o nt h eh a i rd a m a g em e c h a n i s ma n dp r o v i d es o m eh i n t sf o rr e p a i r i n gd a m a g e dh a i r s ot h i s p a p e ri n v e s t i g a t e ds o m ep r o p e r t i e so ft h ei n t e r a c t i o no fn b d c i a n dh a i rs u r f a c ec y s t e i n ea n d d e t e r m i n e dt h ec o n c e n t r a t i o no fc y s t e i n eo fh a i rc u t i c l e n l em a i nr e s u l t sw e r eg i v e na s f o l l o w s ： 1 s t u d y i n gs o m ei n f l u e n c ef a c t o r so nt h er e a c t i o no fn b d - c 1 、析t l lc y s t e i n ei ns o l u t i o n s y s t e ma c c o r d i n gt os o m em e t h o dd e s c r i b e di nt h el i t e r a t u r e ，s u c ha sp h ，t e m p e r a t u r e ， c o n c e n t r a t i o n ，t i m ea n ds t a b i l i 够o fr e a c t i o np r o d u c t t h e s er e s u l t sw o u l dp r o v i d es o m eh e l p f o rt h es t u d y i n go ft h er e a c t i o no fn b d c 1w i t hc y s t e i n er e s i d u ei nt h eh a i rs u r f a c e f o r m t h e s ee x p e r i m e n t s ，w ed e m o n s t r a t e dt h a tt h es i t ea t t a c ko fn b d c 1o nl c y s t e i n ew a s p h d e p e n d e n t ，a tp h3 0 ，t h ea b s o r p t i o ns p e c t r u ms h o w e do n ep e a ka t4 2 0 n m ，s u g g e s t i n gt h e f o r m a t i o no fas i n g l ed e r i v a t i v e ，p o s s i b l yt h en b d sd e r i v a t i v e t h em o l a rr a t i o no f n b d - c i l - c y s t e i n eo f8 ：1w a su s e di nt h i ss t u d yt od e t e r m i n et h eo p t i m u mr e a c t i o nt i m ea n d t e m p e r a t u r ef o rt h er e a c t i o no fc y s t e i n ew i t hn b d - c ia tp h3 0 t h ea b s o r b a n c ei n c r e a s e d w i t hi n c r e a s i n gi nt e m p e r a t u r ef o re a c hr e a c t i o nt i m et e s t e d h i g ht e m p e r a t u r ea n dl o n g r e a c t i o nt i m em a yl e a dt oe x c e s s i v ed e n a t u r a t i o no fa m i n oa c i d t oa v o i dt h i s ，r e a c t i o nt i m e a n dt e m p e r a t u r eo f7 0 m i na t7 0 w e r ea d o p t e d t h en b d - s - c y sc o n j u g a t eh a dp r o v e nt ob e r e l a t i v e l ys t a b l e ，t h es p e c t r u mo f t h ec o v a l e n t l y - a t t a c h e dn b dr e m a i nu n c h a n g e df o ra tl e a s ta w e e ko ns t o r a g ea v o i dl i g h t 2 1 1 l er e a c t i o no fn b d c i 、机t l lc y s t e i n er e s i d u eo fh u m a nh a i rw a si n v e s t i g a t e d 、析t l l a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o nf o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( a t rf t - i r 、a n d f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y 1 1 l er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e 天锄- m 双f r o mt r e a t e dh a i rs u r f a c e d i s p l a y e dr e ds h i f tw i t hi n c r e a s i n gp hb e t w e e n2 - 5a n dt h er e a c t i o no ft h ec y s t e i n ew i t l l n b d - c 1i s p h d e p e n d e n t a tp h 3 0 ，4 0 ，t h e 久啪m 瓢w a s5 16 n m ，5 21n mr e s p e c t i v e l y ； n b d m o d i f i e dd e r i v a t i v ew a se x p e c t e dt ob en b d s k t h et h i o lg r o u po fc y s t e i n eo ft r e a t e d h a i rc o u l db es u b s t i t u t e db yn b d - c 1 t h i ss u p p o s a lw a sf u r t h e rc o n f o r m e dw i t hn 0 2 s y m m e t r i cs t r e t c h i n gv i b r a t i o nw a sf o u n di nt h ea t rf t - i rs p e c t r ao fh a i rs a m p l e st r e a t e d 晰mn b d - c 1a tp h 3m e d i u m t h es e l e c t i v i t yo fr e a c t i o no ns u b m i t t e dg r o u p ( t h i o lo ra m i n e ) w a sn o ti n f l u e n c e dw i t hn b d c lc o n c e n t r a t i o n 3 t u r b i d i m e t r yw a ss e l e c t e da sa n a l y t i c a lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc y s t e i n ei n u n t r e a t e dh a i ra n dt r e a t e dh a i r t h em e t h o dw a sb a s e do nd e t e r m i n a t i o no ft h ec o n c e n t r a t i o n o fr e a c t i o np r o d u c tc 1 ，a n dt h e nd e t e r m i n e dt h ec o n t e n t so fc y s t e i n eo fh a i r i nv i r g i nh a i r , a c y s t e i n ea m o u n to f19 3 9 4 - 1 6 9 i _ t m o l g ( n _ 3 ) ；a n di nh a i rp e r m e db y5 w tt g a ，ac y s t e i n e a m o u n to f6 3 3 2 4 - 6 5 9 9 m o l g ( n - 3 ) w e r ed e t e r m i n e d t h e r ew a sac o r r e l a t i o n ( r 2 = 0 9 4 ) b e t w e e nt h ea m o u n to fc y s t e i n eo fh a i rs u r f a c ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h i o g l y c o l i ca c i di n a b s t r a c t t h er a n g ec o n c e n t r a t i o n1 5 w t 磁 4 t oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nc y s t e i n eo fh a i rs u r f a c e v a r i o u st i m eo fp e r m e dh a i rw h i c hs t o r a g ei na i rw e r et r e a t e db yn b d c i a n dt h e n t h eh a i r s u r f a c ew a si n v e s t i g a t e dw i t hf t i r c o m p a r a t i o no fv i r g i nh a i ra n dp e r m e dh a i rp r o t e c t e db y n i t r o g e n t h ef t i rs p e c t r u mo fh a i rs a m p l e ss t o r a g ei na i rs h o w nc y s t i n em o n o x i d a t i o n 耶1 e o x i d ek i n e t i c sw a sc o n f o r m e dt os e c o n d o r d e rr e a c t i o n 、a n dt h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a sl7 c = 0 1 2 4 4 + 0 0 0 0 1 0 5 t ( 髟= 0 8 8 ) ，r a t ec o n s t a n tk - - 0 0 0 0 1 0 5 ( p m o l g - 1 ) 一s - 1 w ec h o s et h er a t i oo f a b s o r b a n c ei n t e n s i t yo fs ob a n dt on o zs y m m e t r i cs t r e t c h i n gv i b r a t i o na b s o r b a n c ei n t e n s i t y f o rr e p r e s e n t a t i o nd e g r e eo fo x i d a t i o no fc y s t e i n e u v br a d i a t i o nw o u l da c c e l e r a t et h e o x i d a t i o no fh a i rs u r f a c ec y s t e i n er e s i d u e a l o n gw i t ht h et i m eo fu l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o n e x t e n d i n g ，t h ec o n t e n to f h a i rc y s t e i n er e d u c e d ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fo x y s u l f i d ei n c r e a s e d k e y w o r d s ：h u m a n h a i rs u r f a c e ，c y s t e i n ea n a l y s i s ，n b d c 1 ，t u r b i d i m e t r y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名： 查堕叠 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进, f i - g 佥索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、；1 2 编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：垄堕耸导师签名：塑整 规群年舢生 第一章绪论 第一章绪论 毛发是脊椎动物皮肤的附属纤维组织，不仅具有为动物身体抗寒和抗湿的生理功 能，而且有美化形象的重要作用。自人类文明起源，头发作为权利和美丽相貌的象征， 受到人类较多的关注 1 1 。近年来，越来越多的化妆品科技工作者开始关注有关头发表面 形态与物理性能方面基础研究，认为头发质量取决于头发结构和组分的完整程度【2 ，3 】；环 境和美发手段相关的物理化学因素可对头发结构和组分产生负面影响从而导致头发损 伤。 头发纤维是由角质蛋白、非角质蛋白、脂质、微量元素和多糖类物质组成，其中角 质蛋白约占6 5 至9 5 。头发毛小皮角质蛋白为高硫蛋白，约含1 1 至1 8 胱氨酸。具 有二硫键结构胱氨酸存在，赋予头发对环境、机械力及化学物质具有一定抗性l l 捌。各种 环境和物理化学因素对头发的损伤多从毛小皮结构中高硫蛋白组分的破坏开始，并进一 步引发头发整体抗拉、光泽度等性能的降低 3 1 。有研究结果表明 4 1 头发表面胱氨酸残基 因内二硫键断裂可转为半胱氨酸残基，而半胱氨酸化学性质活泼会进一步衍生化。分析 头发表面半胱氨酸残基，有助于头发损伤机制的研究，为解决头发损伤的修复提供思路。 1 2 头发的结构和组成 头发是复杂的生物纤维，它是由毛干和毛囊两部分组成。毛干可以分为毛小皮 ( c u t i c l e ) ，皮质( c o r t e x ) 和髓质( m e d u l l a ) 三层。毛小皮是毛干的最外层，由3 层7 层毛小皮细胞围绕着毛干呈瓦片状叠合而成，每个毛小皮细胞的厚度为0 3 j u n - o 5 j a m ， 长约5 l o l u n ，毛小皮层的总厚度为约3 1 x m 5 9 r n 。毛小皮亚结构又可分为a 层，上表皮， 外表皮，内表皮和内层，其中上表皮和外表皮内含有丰富的高硫蛋白，能抵御外界物理 和化学因素的影响。皮质紧密地围绕着髓质周围。皮质细胞的直径约为2 9 m - 3 9 m ，皮 质细胞由许多粗纤维，细纤维和原纤维组成。原纤维的直径仅2 x l o 3 岬是由2 3 股洳 螺旋的角蛋白组成；由许多原纤维形成直径为8 x l o 。3 岬的细纤维，再由大量细纤维构 成粗纤维。上述这些纤维均被包埋在由高硫蛋白组成的细胞基质中并组成非常紧密的纤 维素，其角蛋白的组分中，低硫蛋白占6 0 ，高硫蛋白占4 0 。皮质细胞的基质中含有 色素颗粒，色素颗粒的多少决定头发的颜色。髓质位于毛干的中心，由2 3 层多角形角 质化细胞组成。除髓质细胞的角蛋白结构为p 折叠外，毛小皮和皮质细胞的角蛋白结构 为甜螺旋1 2 刁j 如图1 1 所示。 江南大学硕士学位论文 5 0 - 1 0 0 u m 圈1 - l 头发纤维的示意图 r i g is c h e m a t i co f h a i r f i b e r $ w t l l l l h e 头发纤维的主要成分为角质蛋白( 约占头发湿重的6 5 9 5 ) 、非角质蛋白、脂质、 水、色素、微量元素和多糖类物质。构成角蛋白多肽链含量最多也最重要的组分是胱氨 酸，每个胱氨酸单元都是由2 个相邻的半胱氨酸通过二硫键连接组成的，不同层次结构 的胱氨酸的量很大程度上影响着头发的物理性能。胱氨酸含量高意味着含有丰富的二硫 键，使得头发具有很高的机械性能。表1 1 口- 5 ，”列出了毛小皮中各亚结构，及所含的胱 氨酸的量。 表】一1 胱氨酸在表皮层中存在的位置厦含量 t a b1 - 1 v a r i o u s l a y e r so f t h ec u t i c l ea n d t h e i r d e t a i l s 上表皮上覆盖着一层1 8 - 甲基二十碳烯酸( 1 8 - m e a ) ，组成了毛小皮细胞膜络合物 的b 层起着隔离润滑，疏水的作用。a 层含有丰富的胱氨酸( 一3 0 ) ，覆盖在每个细 胞的外面，a 层结构的高度缠绕使得它具有很强的机械韧性和化学弹性，并且在水中的 膨胀性是最小的。外表皮直接粘附在a 层，也含有高含量的胱氨酸( 1 5 ) 。在内层和 外表皮之间的内表皮中的胱氨酸含量较低( 一3 ) 。 头发结构的稳定性是多肽链之间各种作用力所决定。这些作用力包括：盐键、氢键、 二硫键、范德华力、共价多肽和酯键。 ( 1 ) 氢键( c - - on h ) 头发中含有大量的肽键，c o 和n h 2 ，氨基和邻近的羧基之间可形成氢键。虽然氢 键是一种微弱的相互作用，但由于一条多肽链中可存在的氢键数目很多，所咀它们也是 多肽结构上一个重要的稳定因素。 ( 2 ) 盐键( n h 3 + o o c 一) 第一章绪论 亦称离子键。在多肽链的侧链间存在许多氨基( 带正电) 和羧基( 带负电) ，相互 之间因静电吸引而成键，即离子键。在p h = 4 5 5 5 的范围内( 等电点) ，两者的结合力 最大。头发角蛋白强度的3 5 与盐键有关。这种键很易被酸和碱破坏。 ( 3 ) 肽键( 一c o n h 一) 两个氨基酸分子之间，以一个氨基酸的o c 羧基和另一个氨基酸的a 一氨基( 或者是脯 氨酸的亚氨基) 脱水缩合把两个氨基酸联结在一起所形成的酰胺键，即肽键。多个氨基 酸之间通过肽键这种重复的结构彼此联接组成了多肽链的主干。 ( 4 ) 二硫键( 一c h 2 s s c h 2 一) 亦称胱氨酸结合或二硫结合，是由两个半胱氨酸残基之间形成的一个化学键。它使 多肽链的两个不同区域之间能够紧密地靠拢起来。二硫键是一种结构上的要素，它能维 持分子折叠结构的稳定性。烫发水的原理即基于二硫键的还原断裂及其后的氧化固定反 应。 ( 5 ) 酯键( 一o c o 一) 含有羟基的氨基酸的羟基和另一氨基酸的羧基酯化所生成的酯键。 ( 6 ) 范德华力 多肽链之间有范德华力的联接，是分子间引力的作用，由于此引力很弱，通常可以 忽略不计。 li+i r14；卜署hw,n 宁h 茁h 2c h 2 h 卜一 i畸ii l n 羽眦h - n r 幸 h 七h r s , s - c h 幸r 甲彳眦hh 中 c i o m h - n o = c lll 图1 - 2 头发中键合结构 f i g 1 2b o n ds t r u c t u r eo fh a i rf i b e r 1 3 巯基化合物分析方法的研究进展 巯基( - s h ) 是细胞中化学活性很高的基团。生物体中存在许多蛋白质和非蛋白质 巯基化合物，如还原型谷胱甘肽( g s h ) 和半胱氨酸( c y s ) ，它们具有重要的生理功 能。目前已报道的测定疏基化合物的方法主要有高效液相色谱法、电化学方法、流动注 射化学发光法、毛细管电泳法、紫外可见分光光度法和荧光分光光度法。 1 3 1 荧光衍生试剂与荧光分光光度法 除个别氨基酸在紫外线的照射下会发出荧光，可以直接用荧光法进行检测，大多数 的氨基酸在紫外光照射下不会发出荧光，常采用荧光试剂衍生化检测具荧光活性的产物 1 9 1 。含巯基的氨基酸或多肽、蛋白质大多自身没有荧光活性且稳定性差 9 1 ，需要用具有 选择性的衍生试剂衍生化，生成具有强检测信号的衍生物来提高这些疏基化合物的稳定 性和检测灵敏度。根据含巯基氨基酸的独特结构，选择对巯基具有选择性反应的衍生试 剂，可以排除复杂体系中某些共存组分的干扰，达到选择性地检测巯基化合物的目的。 江南大学硕士学位论文 目前，已报道的巯基荧光衍生试剂按反应类型可分为巯基荧光生成试剂和巯基荧光标记 试剂。巯基荧光生成试剂是指试剂本身没有荧光或荧光很弱，与巯基化合物结合后生成 强荧光的产物，如邻苯二甲醛类和苯并呋喃活性卤类。巯基荧光标记试剂是指试剂本身 具有荧光团以及可以与巯基化合物作用的反应基团，且具有强的荧光，衍生后将其所带 的荧光基团转移到被检测物，如丹磺酰氮丙啶类和碘乙酰类。下面按反应基团分类，对 几种主要的巯基化合物的荧光衍生试剂及其在检测巯基化合物中的应用进行详细介绍。 1 芳香活性卤类 芳香活性卤类试剂的结构中直接连在芳香环上的卤原子，受环上其它取代基的影响 而有较好的活性，可以作为反应基团与巯基化合物发生反应，释放出氢卤酸。目前对这 类试剂的研究主要在以苯并呋喃类化合物( 苯并嗯二唑) 为母体的巯基衍生试剂的合成 及应用上。包括4 氯7 硝基2 ，l ，3 苯并曝二唑( n b d c 1 ) ，4 氟7 硝基2 ，1 ，3 - 苯并嗯二 唑( n b d f ) ，7 氟2 ，1 3 苯并嚼二唑4 - 磺酸铵( s b d f ) 和7 氟- 4 磺氨基2 ，l ，3 - 苯并嗯 二唑( a b d f ) ，它们的结构及与巯基化合物的反应见反应式( 1 1 ) 。 r s c h e m a t i c1 - 1 r e a c t i o no f n b d xa n dt h i o lg r o u p 荧光试剂n b d c 1 是稳定的无荧光淡黄色固体，易溶于有机溶剂。能与伯胺，仲胺， 也与其他化合物如苯胺类、酚类和硫醇类反应生成荧光衍生物，反应易在弱碱性条件下 进行。1 9 6 6 年，n b d c 1 首先由b o u l t o n 等人【l o 】作为合成4 氨基苯并呋喃时所生成的中 间产物合成出来的。1 9 6 8 年，g h o s h 和w h i t e h o u s e 1 1 】提出把n b d c 1 用作氨基化合物的 荧光标识试剂，并且指出n b d c i 与其他亲核试剂，尤其是巯基也能生成的荧光性衍生 物。n b d c i 可以用于生物样品中的巯基化合物的灵敏测定。b i r k e t t 等人l iz j 用n b d - c 1 标记研究了磷酸化酶b 和甘油醛3 磷酸化脱氢酶，并阐述了荧光性衍生产生的可能机理。 m i c h a e l ，t r e v o r 和k e i t h 等人【1 3 】用n b d c i 作为荧光标识剂标记木瓜酶、无花果蛋白酶 和菠萝蛋白酶的活性中心，光谱分析表明n b d c 1 与亲核试剂生成的是m e i s e n h e i m e r 型衍生物，并研究了p h 对反应的影响。n b d c i 与低分子量的c l 以烷基巯基化合物 反应生成的荧光产物的激发波长和发射波长分别在4 2 5 n m 和51 0 n m 。n i s h i k a w a 等【1 4 j 将它应用于高效液相色谱测定空气中的甲硫醇、乙硫醇等，检出限为p m o l 。试剂的优 点在于本身和它的水解物n b d o h 无荧光。h o l l y 和p o o l e i s 利用n b d c 1 的特殊性质 俘获了鼠伤寒沙门氏菌a h p c 过氧化物酶蛋白中的活性成分c 1 6 5 s 突变体中的次磺酸。 研究结果表明，n b d c 1 与蛋白酶中的巯基结合后最大吸收波长在4 2 0 n m 。a k i n y e l e 【l 6 】 建立了一种新的光度法测定了玉米和豆类种子里的半胱氨酸和半胱胺酸，这种方法是基 于在n a b h 脲素e d t a 水溶液中把胱氨酸还原成半胱氨酸，分析了还原产物与n b d c i 的衍生物。并探讨了影响n b d c i 与半胱氨酸反应的因素，如p h 、温度、浓度的配比 等，研究结果表明，n b d c 1 与半胱氨酸之间的反应产物形态由p h 决定。e 1 e m a m 等i l 7 j 4 第一章绪论 建立了基于药物赖诺普利上的巯基与n b d c 1 之问的反应，用光度法和反相高效液相色 谱仪分析定量测定了人血浆中过量药物赖诺普利的含量。t o y o o k a 等人【l 副合成了 n b d f 、s b d f 、a b d f 和d b d f ，研究了它们与巯基的反应，发现它们的反应活性 要更高。n b d f 可以与氨基，巯基和羟基反应，因此对巯基的选择性不好，主要用于氨 基的检测。d b d f 、a b d f 和s b d f 也能与巯基发生s n 2 亲核反应，实验发现，d b d f 对巯基的选择性不好。 2 芳香二醛类 芳香二醛类属于荧光生成试剂，试剂本身无荧光。在有氨基的存在下，芳香环上相 邻的两个醛基可以与巯基发生反应生成具有荧光的异吲哚类衍生物【9 j 。虽然o p a 很稳 定，但是它的衍生物稳定性较差【9 】。常用的芳香二醛化合物主要有邻苯二甲醛( o p a ) 及萘二甲醛( n d a ) 。o p a 最早是用来测定氨基化合物的。o p a 在过量2 巯基乙醇存在下 与一级氨基酸形成异吲哚类衍生物见反应式( 1 2 ) ，反应在碱性介质中常温下2 m i n 内 即可完成。 ( 卜2 ) s c h e m a t i c1 - 2 r e a c t i o no f o p aa n dt h i o lg r o u p m o p p e r i l 9 】用o p a 与巯基化合物反应后，采用柱前衍生后再梯度淋洗，分离了j1 2 种巯基化合物，检出限达到7 p m o l 2 n m o l ，并用于生理液、食物提取液中的巯基化合物 的测定。 3 卤代亚甲基类 卤代亚甲基类与芳基活性卤类一样，反应基团也是性质活泼的卤素原子。但不同的 是卤原子不直接连在芳环上，而是与芳环上的亚甲基相连。卤原子的孤对电子与芳环上 的电子没有产生共扼作用，因此这类试剂与巯基化合物的反应活性较芳基活性卤类高。 b i m a n e 类化合物是这一类中最常用的巯基衍生试剂。巯基化合物容易与b i m a n e 类化合 物发生亲核取代反应。它们的结构和与巯基的反应见反应式( 1 3 ) 。 o j l h 3 c 0 6 9 3 ，因此在置信水平0 0 5 下，可以认为各标准曲线之间 不存在显著性差异。 江南大学硕士学位论文 1 01 5乏0 c o n c e n t r a t i o no fc i 图4 - 1c i 的标准曲线 f i g 4 - 1s t a n d a r dc u r v eo fc h l o r i d e 4 3 结果与讨论 4 3 1 头发表面半胱氨酸残基生成量与巯基乙酸浓度的关系 2 5 按干发质量与溶液体积比为1 ：1 5 0 ，把头发放入1 o 、2 o 、3 0 、4 o 、5 0 、 6 0 、8 0 和l o w t 巯基乙酸溶液中，浸泡5 r a i n 使头发纤维角蛋白胱氨酸残基二硫 键断裂转为半胱氨酸。淋洗净头发表面残留巯基乙酸，用n 2 吹干头发，得发样 24681 0 c o n c e n t r a t i o no ft g w t 图4 - 2 在不同巯基乙酸浓度下头发表面半胱氨酸残基生成量 f i g 4 - 2a m o u n t so f e y s t e i n eo f h a i rs a m p l e st r e a t e db ys e r i o u sc o n c e n t r a t i o n so f t h i o g l y c o l i ca c i d ( 1 - - 6 p h ，8 0 ，1 0 p h ) 。n 2 气氛围保护发样。按方法4 2 3 测得v h 及上述 经冷烫发样表面半胱氨酸含量。测得未受损发样表面半胱氨酸的含量为 加 的 们 幻 佃 西iocitlc粤c口o oc一卫【。ji碍c 第四章头发表面半胱氨酸残基的分析 1 9 3 9 - 士1 6 9 9 m o l g ( n _ 3 ) ，5 冷烫发样表面半胱氨酸的含量为6 3 3 2 a ：6 5 9 i t m o l g ( n - 3 ) 。 头发表面半胱氨酸残基生成量与巯基乙酸浓度的关系如图4 2 所示。从图4 2 中可 以看出，从v h ，1 0 o 5 w t 巯基乙酸与头发反应后生成的半胱氨酸残基的量依次增多， 而当巯基乙酸的浓度达到8 ，1 0 时，半胱氨酸残基的量反而减少，可能是由于巯基 乙酸浓度过高，巯基乙酸向头发纤维内部扩散速率大于反应速率，导致还原程度反而不 高。巯基乙酸浓度在l o 旷5 w t 范围内，头发表面由胱氨酸转化生成的半胱氨酸的量与 巯基乙酸浓度成呈正相关，相关系数= 0 9 4 。 4 3 2 头发表面半胱氨酸氧化与氧化动力学 半胱氨酸的化学性质较活泼，环境或化学物质处理会使头发表面角蛋白胱氨酸二硫 键断裂转为半胱氨酸【3 8 】，后者易被进一步氧化至磺基丙氨酸【6 3 1 ，从而导致了角蛋白的结 构发生化学变化。有关半胱氨酸氧化动力学尚未见报道。 2 5 。c 按干发质量与溶液体积比为1 ：1 5 0 ，按4 2 3 方法处理头发，然后淋洗净头发表 面残余巯基乙酸。分别以氮气或空气吹干头发，按方法3 2 2 扫描发样红外光谱，并以 未处理发样为对照，结果如图4 3 所示。v h 为未处理发样，p h n 2 为在n 2 气氛中保护 的冷烫发样，p h 0 2 为空气中保存的冷烫发样。 p 卜q 唑 v h 3 8 3 0 0 02 5 0 0砌1 5 0 01 0 0 0 w 细朗哪由“ 图4 3 发样的红外光谱 f i g 4 - 3f t - i rs p e c t r u mo f h a i rs a m p l e so f v h ，p h n 2a n dp h 0 2 在头发的红外光谱图中1 0 4 0 c m d 和1 0 7 0 c m j 分别归属于s = o 和s - o 基团振动【3 9 j ， 1 0 4 0 c m 1 这个吸收带常被用来监测头发纤维被氧化的程度。头发中硫氧化物通常为磺基 丙氨酸( 磺酸基胱氨酸) ，胱氨酸单氧化物( r - s o s r ) ，胱氨酸二氧化物( r - s 0 2 s r ) 【4 1 1 。其红外吸收峰分别在1 0 4 0 c m - 1 ，1 0 7 5 c m l 和1 1 2 5 c m - 1 。从图4 3 中红外光谱比较得 出，p h n 2 与v h 中都只出现了磺基丙氨酸( 1 0 4 0 c m d ) ，而在p h 0 2 中同时还出现了胱 氨酸单氧化物( 1 0 7 4 c m 1 ) ，表明头发表面半胱氨酸残基在空气中被进一步氧化。 巯基乙酸处理发样以空气干燥，并置于空气环境，按时间0 h ，0 5 h ，1 h ，1 5 h ，2 h ， m5cgoo仁。芷参 江南大学硕士学位论文 3 h ，4 h ，6 h ，1 2 h ，1 8 h ，2 4 h 取样，测定头发表面半胱氨酸含量。头发表面半胱氨酸氧 化动力学如图4 4 所示。 o 0 1 5 0 o o 4 5 o | 0 1 4 0 o 0 1 3 5 q 0 0 1 3 0 o 0 1 2 5 0 0 1 2 0 o 0 1 1 5 51 01 52 02 5 髓m e h 图4 - 4 头发表面半胱氨酸氧化动力学曲线 f i g 4 - 4 o x i d a t i o nk i n e t i c st u l l eo f e y s t e i n eo f h a i rs u r f a c e 常温下考察头发表面半胱氨酸氧化反应。将测得即时头发表面半胱氨酸对时间t 分 别按零级，一级，二级，三级反应处理，相应的直线关系如表4 _ 4 所示。c 为头发表面 半胱氨酸含量( 1 a m o l g ) 。 表4 - 4 反应级数及相应的线性相关系数 t a b 4 - 4o r d e rr e a c t i o na n dc o r r e s p o n d i n go fl i n e a rr e l a t i o n s h i p 反应级数直线关系线性相关系数( r 2 ) 数据按二级反应拟合所得的相关系数r 2 值最大，表明头发表面半胱氨酸氧化反应 符合二级反应动力学。头发表面半胱氨酸氧化反应动力学符合回归方程1 c = 0 1 2 4 4 + 0 0 0 0 1 0 5 t ( r 2 = o 8 8 ) ，速率常数k = 0 0 0 0 1 0 5 ( 1 x m o l g q ) s 。 4 3 3u v b 辐射对头发表面半胱氨酸残基氧化动力学的促进作用 头发受到日光中紫外线的连续辐射，头发表面的角质会逐渐消失，露出皮质层纤维， 产生分叉和断裂，头发结构也相应的退化【2 , 6 4 1 。环境中对头发质量产生影响的因素是多 方面的，损伤可能是多种因素同时作用的结果。 2 5 ( 3 按干发质量与溶液体积比为1 ：1 5 0 ，把头发放入5 0 w t 巯基乙酸溶液中浸泡 5 m i n 使头发纤维角蛋白质胱氨酸残基二硫键断裂转为半胱氨酸。淋洗净巯基乙酸，头 发样本用n 2 吹干，并在n 2 氛围保护得发样。将此发样均匀铺展开，置于u v b 紫外灯 下照射，照射距离为8 c m ，按放置4 h 、