（微电子学与固体电子学专业论文）pcr芯片的原理、方法和应用研究.pdf

中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研究 摘要 生物芯片是微电子学、物理学、材料科学、化学等与生命科学相交叉的高科 技，生物芯片的研究具有重大的基础研究价值和市场前景，各国政府的企业相继 投以巨资进行研究开发。聚合酶链式反应( p c r ) 微芯片是运用微电子机械系统 ( m e m s ) 技术在硅片或玻璃片等基片材料上加工一系列的微管道、微反应室及 微阀、微加热器、微传感器等功能单元，利用芯片集成度高和比表面积大的特性， 在芯片上实现快速p c r 扩增。与传统p c r 仪相比，p c r 微芯片具有体积小，反 应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成 化、结果可靠的优点。本论文的研究工作是中科院生命科学特别支持项目“微型 p c r 系统研制”中的重要组成部分。 本论文首先阐述了p c r 反应的原理和应用，在此基础上，围绕p c r 微芯片 的设计、制作和应用开展研究工作，完成了p c r 微流体芯片和p c r 微池芯片及 相应控温系统的设计和制作，并在此系统上实现了多种d n a 片段的扩增和在片 荧光检测，论文主要包括以下几个方面的研究内容： 1 首先阐述了p c r 反应的原理及其特点，然后对p c r 微芯片的原理、特 点、制作方法及其发展趋势进行了详尽的文献综述，最后概括了微全分 析系统的技术特点和发展趋势，并在此基础上提出了本论文的研究工作 思路。 2 根据p c r 微芯片的原理，对各种可能材料的特性进行了分析，设计了 多种结构的p c r 芯片及其相应的温度控制装置，包括石英玻璃微流体 p c r 芯片，石英玻璃p c r 微池芯片，硅一玻璃p c r 微池芯片等。采用 m e m s 技术完成了p c r 芯片的制作，并对制作工艺参数进行了优化， 最终完成的p c r 芯片内壁光滑，边界平整，温度控制准确，可满足实 验要求。 3 较为深入探讨了内壁表面处理、反应中酶的用量以及p c r 芯片结构等 多种条件对p c r 微芯片扩增效率的影响。通过优化各种条件，实现了 多个不同d n a 片段在同一芯片上的同时快速扩增，扩增速度是传统 p c r 仪方法的3 倍。 4 为了解决了微量p c r 扩增产物的检测问题，尝试了采用激光诱导荧光 中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和廊用研究 的在位检测的方法，最终通过扩增条件和荧光指示剂的优化，实现了 p c r 芯片扩增产物的在片检测，为下一步阵列式p c r 微芯片在基因表 达和功能基因组研究方面的应用打下了基础。 5 在分离式p c r 芯片和温控装置研制的基础上，提出了将温控装置集成 在芯片上的集成式p c r 微池芯片系统。己完成了集成式p c r 微池芯片 系统的总体设计，微反应腔的刻蚀，基片的键合，t i p t 合金微加热器和 微传感器在基片背面的制作等工作。目前正在进行集成式p c r 微池芯 片的封装，信号采集系统和温度控制程序的编写等工作。 通过本论文的研究工作，基本掌握了p c r 微芯片及其控温系统的设计、制 作和应用，初步体现了p c r 微芯片具有体积小、速度快、成本低的优点。同时 为微全分析系统的研究与开发打下了一个良好的工作基础，但要真正将微全分析 系统推向实际应用，还有很多基础性的研究工作有待于进一步的深入。 ! 里型堂堕堡主兰垡丝苎! 曼! 堇! ! 望堕竺：查垦塑窒里堕茎 一 a b s t r a c t m i c r op c r c h i ps y s t e m i sa n e w l yd e v e l o p e d r e s e a r c hf i e l dt h em i c r of u n c t i o n m o d u l e ，s u c ha sm i c r oc h a n n e l ，m i c r oc h a m b e r ，m i c r op u m p ，m i c r o h e a t e ra n ds e n s o r e t c a r em a n u f a c t u r e db yt h et e c h n o l o g yo f m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ( m e m s ) o nt h es u b s t r a t eo f g l a s so rs i l i c o n s op c rc h i ph a st h ea d v a n t a g e o f s m a l ls i z e ，h i 曲 e f f i c i e n c y ，l o wc o s ta n d s m a l lc o n t a m i n a t i o nc o n t r a s t i n gw i t ht r a d i t i o n a lp c r t h e r m o c y c l e r i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ep r i n c i p l eo f p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a n d d e v e l o p m e n to f m i c r o p c r c h i ps y s t e m a r ed i s c u s s e d t h e nt h em e t h o da n d a p p l i c a t i o no f p c rc h i pa n dd e t e c t i o n d e v i c ea r es t u d i e d an e wp c r c h i ps y s t e mi s a l s od e v e l o p e d p c ra m p l i f i c a t i o no fs e v e r a ld n a f r a g m e n t s i sr e a l i z e db yt h i sp c r c h i pa n d t h ep c rr e s u l t sc a nb ei ns i t ud e t e c t e db yl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e t h e t o p i c so f t h i sd i s s e r t a t i o na r ep r e s e n t e d b e l o w ： 1 t h e p r i n c i p l e a n dc h a r a c t e r i s t i co f p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na r er e v i e w e d t h e c l a s s i f i c a t i o n ，p r i n c i p l e ，c r a f ta n dt e n d e n c y o f p c r c h i ps y s t e ma r e d i s c u s s e d o nt h eb a s eo f i t ，s o m en o v e lp c r c h i ps y s t e m s a r ep r e s e n t e d 2 s e v e r a ld i f f e r e n tp c r c h i p sa n dt e m p e r a t u r ec o n t r o ld e v i c e s a r ed e s i g n e d i n c l u d i n gq u a r t zg l a s sm i c r o f l u i d i cp c r c h i p ，q u a r t zg l a s s m i c r oc h a m b e r p c r c h i pa n ds i l i c o n - g l a s sm i c r o c h a m b e rp c r c h i p t h ec h i p sa r e m a n u f a c t u r e db ym e m st e c h n i c sa n dt h ec r a f tp a r a m e t e r sa r eo p t i m i z e d t h ei n n e rs i d eo f m i c r oc h a m b e r si ss m o o t h ，f i a ta n ds t r a i g h t i t 诬g o o df o r t h e e x p e r i m e n t s 3 t h ei n f l u e n c eo f s u r f a c et r e a t m e n t ，p o l y m e r a s ea m o u n ta n dc h i ps t r u c t u r et o t h ec h i pp c rr e s u l t sa r es t u d i e d r a p i dp c ri nc h i pa n ds e v e r a ld i f f e r e n t d n a f r a g m e n t sp c r i no n ec h i pa ts a m et i m ea r er e a l i z e d t h es p e e do f c h i pp c r i st h r e et i m e so f t r a d i t i o n a lm e t h o d 4 c h i pp c r r e s u l t sc a r lb ei ns i t ud e t e c t e db yl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e t h i s m e t h o dr e s o l v e dt h ed i f f i c u l t yo f m i n i m a s a m p l ei ns i t ud e t e c t i o n 5 an o v e li n t e g r a t e dp c r c h i ps y s t e m w i t hm i c r oh e a t e r sa n dm i c r os e n s o r s o i lc h i pi sd e s i g n e dt h e p r o c e s s e so f p h o t o l i t h o g r a p h y ，w e te t c h i n g ， b o n d i n g a n dd e p o s i t i o no f t i p ta l l o yf u rm i c r oh e a t e r sa n ds e n s o r sh a v e b e e nf i n i s h e d n o wa s s e m b l y ，c i r c u i td e s i g na n d p r o g r a m m i n g f o r t e m p e r a t u r ec o n t r 0 1a r ei np r o c e s s i i i 垦! ! 兰堕堡：兰兰些丝苎! 坚兰生竺堕翌：查兰塑壁望翌塑 t h e s t u d yo f t h i sd i s s e r t a t i o ns h o w e d t h a tp c r c h i ph a ss o m ea d v a n t a g e ss u c h a s s m a l ls i z e ，h i 曲s p e e da n dl o wc o s t h o w e v e r ，m u c hw o r k m u s t b e d e v e l o p e d t o r e a l i z ec o n c r e t ea p p l i c a t i o no f i n t e g r a t ep c rc h i pa n d a s s e m b l es e v e r a ll a b o n c u p p a r t st of o r m am i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e mfu - t a s ) 生里型兰堕婴主兰些笙苎 ! ! 堡受! 塑堕墨：互鲨翌壁旦里兰l 一 第一章、绪论 1 1 引言 1 9 8 5 年，美国p e ，c e t u s 公司的人类遗传研究室m u l l i s 【1 等人发明了具有划 时代意义的聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ，使体外无限扩增核 酸片段成为现实。随后p e c e t u s 公司推出了第台p c r 热循环仪，使p c r 技 术的操作程序大大简化。p c r 技术很快在世界各国被广泛应用于基因研究的各 个领域，它对分子生物学及其相关学科的基础研究和诊断应用等方面产生了革命 性的影响。m u l h s 等因此项技术于1 9 9 3 年获得诺贝尔奖金。 随着后基因组计划的开展，需要大批量样品的快速p c r 扩增，同时生化实 验分离、分析领域的发展( 如毛细管电泳芯片的发明) 要求扩增仪器也相应的向 向微型化、集成化、便携化方向发展。9 0 年代初，m a n o r t h r u p 等 2 】采用微 机电加工技术( m i c r o e l e c t r o - m e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) $ ! j 作了p c r 芯片微反应 室，成功的实现了芯片上d n a 的扩增。p c r 微芯片是运用m e m s 技术在硅片 或玻璃片等基片材料上加工系列的微管道、微反应室等 3 - 6 1 空间结构以及微阀、 微加热器、微感应器等 3 - 4 , 6 1 控制结构，利用芯片集成度高和比表面积大的特性， 实现芯片上的快速p c r 扩增。与常规的p c r 扩增技术相比，p c r 微芯片技术 具有快速、高效、试剂消耗少、便于携带、集成密度高等优点，可广泛用于生命 科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域，是近年生命科学领域 的研究热点之一。采用m e m s 技术不仅可以制作出p c r 芯片，实现d n a 片段 的快速扩增，而且可将整个分子生物学的实验过程包括采样、稀释、抽提、进样、 扩增、分离、检测等集成在微芯片上，实现分析系统从样品处理到检测的整体微 型化、集成化与便携化，并最终实现微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ， n t a s ) 或称为芯片实验室( l a bo nc h i p ) 。 生里型兰堕堡主兰堡堡奎 ! ! ! ：查丛生堕里：立鲨翌些旦堡窒 一 1 2 聚合酶链式反应( p c r 反应) 的发展 聚合酶链反应或多聚酶链反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ，又称无细 胞克隆技术( “f r e eb a c t e r i a ”c l o n i n gt e c h n i q u e ) ，是一种对特定的d n a 片段在体外 进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞， 操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个d n a 分子扩增l o 7 1 0 8 倍，大大提高了d n a 的得率。因此，现己广泛应用到分子生物学研究的各 个领域。核酸体外扩增最早的设想由k h o r a n a 及其同事于1 9 7 1 年提出：“经过 d n a 变性，与合适引物杂交，用d n a 聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便 可克隆t r n a 基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时 ( 1 9 7 0 年) s m i t h 等发现了d n a 限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以， 使k h o r a n a 等的早期设想被人们遗忘。直到1 9 8 5 年，美国p e c e t u s 公司的人类 遗传研究室m u l l i s 等人发明了具有划时代意义的聚合酶链反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ，使人们梦寐阻求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现 实。其原理类似于d n a 的体内复制，只是在试管中给d n a 的体外合成提供一 种合适条件。开始是使用大肠杆菌d n a 聚合酶k l e n o w 片段来扩增人基因组中 的特异片段。但是，d n a 聚合酶在高温时会失活，因此，每次加热变性d n a 后 都要重新补加k l e n o w 酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了p c r 技术的应 用和发展。1 9 8 8 年e r l i c h 发现耐热d n a 聚合酶一- t a q 酶对于p c r 的应用有里程 碑的意义，该酶可以耐受9 09 c 以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使 p c r 技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，继而p e c e t u s 公司推出了第 一台p c r 热循环仪，使该技术的自动化成为现实。p c r 技术得以大量应用，并 逐步应用于临床。 1 2 1p c r 反应的原理 d n a 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链d n a 在多种酶的作 用下可以变性解链成单链，在d n a 聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配 对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，d n a 在高温时也可以发生变 性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制d n a 的 变性和复性，并设计引物做启动子，加入d n a 聚合酶、d n t p 就可以完成特定 旦型兰堕塑主兰些丝苎鉴! 至笪塑堕型：查鎏塑壁! 堕 基因的体外复制。 标准的p c r 过程分为三步： 1 ，d n a 变性( 9 0 6 c 9 6 。c ) ：双链d n a 模板在热作用下， 氢键断裂，形 成单链d n a 。 2 退火( 2 5 。c 一6 5 。c ) ：系统温度降低，引物与d n a 模板结合，形成局部 双链。 3 延伸( 7 0 。c 一7 5 。c ) ：在t a q 酶( 在7 2 左右最佳的活性) 的作用下， 以d n t p 为原料，从引物的57 端一3 端延伸，合成与模板互补的d n a 链。 每一循环经过变性、退火和延伸，d n a 含量即增加一倍。如图1 1 所示： d n a 蠢含豫镌式反应t p c r , 图1 1 聚合酶链式反应原理 1 2 2p c r 反应的相关技术 p c r 反应系统包括含有目的基因或序列的d n a 模板，对热稳定的d n a 聚 合酶，一对脱氧寡核苷酸引物、d n a 合成所需要的4 种脱氧核苷三磷酸以及保 主里型兰堕堕主堂垡丝苎! 坚查苎塑堕墨：查鳖塑生里堕塞一 证聚合酶催化反应的m 9 2 + 及缓冲液等。人工合成引物的序列设计是p c r 成功的 关键，一般两条引物的序列反应分别与欲获得的双链d n a 两条链3 端的序列互 补。先升高温度使模板d n a 变性、双链分开：再降低温度退火使引物与模板 d n a 配对互补结合：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下， 从引物3 ，羟基端开始，与模板d n a 上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的 d n a 链。其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的d n a 在f 一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍，而且很 快扩增的序列主要限制在所设计的一对引物规定的模板序列范围内，一般循环 3 0 4 0 次，按理论计算，目的序列可扩增2 3 0 2 4 0 倍，而实际上由于底物和引物的 消耗，酶的失活等因素，产物量并不是始终以指数增加的，但通常实验获得目的 序列1 0 6 - 1 0 8 倍的扩增产物并不困难，因而p c r 具有很高的灵敏度，由于引物与 模板的配对互补结合的特异性，因而p c r 也具有高度的特异性。所以可以方便 地用p c r 在成千上万的基因序列中获得只有极微含量的特定目的基因或序列， p c r 获得的目的序列产物连接在适当的载体上，转化受体细胞，经筛选就能得 到目的序列的克隆。 现在p c r 技术还在不断发展，己知部分序列或未知序列的基因有的也能设 计p c r 来扩增和克隆，模板核酸可用双链d n a ，单链d n a ，甚至r n a 。多重 p e r 技术可以在一个体系中同时扩增多个d n a 片段；荧光定量p c r 可以对扩 增过程实时监测，实现定量扩增；还有原位p c r ，反向p c r 等，相应用途和主 要特点见表1 1 。 表1 1 聚合酶链式反应相关技术 名称主要用途 ： 简并引物扩增法扩增未知基因片段 提高p c r 敏感性、特异性，分析突 巢居p c r 变 多重p c r同时检测多个突变或病原 宣里型兰堕堡主兰些笙壅 ! ! ! 苎! 堕堕型：复生塑些旦竺塞 一 扩增已知序列两侧的未知序列，致 反向p c r 产物突变 单一特异引物 扩增未知基因组d n a p c r 单侧引物p c r通过己知序列扩增未知e d n a 锚定p c r分析具备不同末端的序列 增效p c r减少引物二聚体，提高p c r 特异性 固着p c r有利于产物的分离 膜结合p c r去除污染的杂质或p c r 产物残留 表达盒p c r产生合成或突变蛋白质的d n a 片段 连接介导p c rd n a 甲基化分析、突变和克隆等 r a c e p c r扩增e d n a 末端 定量p c r定量m r n a 或染色体基因 原位p c r研究表达基因的细胞比例等 臆断p c r鉴定细菌或遗传作用 通用引物p c r扩增相关基因或检测相关病原 信使扩增表型分 同时分析少量细胞的m r n a 型( m a p p i n g ) 5 中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研究 1 2 3p c r 反应的应用 聚合酶链式反应的问世大大加快了各种生物基因组结构研究的进程。即使是 高度复杂的基因组，如果已知其任一区域侧翼的核瞢酸序列，即可应用此技术在 数小时内完成对该区域序列的特异性扩增。实际上，应用p c r 技术通过“拷贝 和连接”可以对任何d n a 进行操作。因此，p c r 技术在分子生物学、疾病诊断、 免疫学以及基因组工程等领域都有非常广泛的应用： 分子生物学：基因克隆；d n a 测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与 调控蛋白质结合d n a 序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成 基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性： 疾病诊断：细菌( 螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉 杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等1 ，病毒( h t l v 、 h i v 、h b v 、h p v s 、e v 、c m v 、e b v 、h s v ，麻疹病毒、轮状病毒、细小病 毒b 1 9 ) ；寄生虫( 疟疾等) ，人遗传病( l e s h - n y h a n 综合症、地贫、血友病、b m d 、 d m d 、囊性纤维化等) 等的基因诊断： 人类基因组工程：遗传图谱的构建( 检测d n a 、多态性或精子绘图1 ；物理 图谱的构建；测序，表达图谱构建； 免疫学：t 细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子 定量： 法医：犯罪现场标本分析； 古生物学：考古与博物馆标本分析； 动物学：动物传染病的诊断等： 植物学：检测植物病原等 1 3 p c r 芯片及其特点 “用更小的样品体积、更短的操作时间、更快的分析方法、并使用越来越少 的材料来完成更多的p c r 反应”闭，p c r 技术的发展趋势决定了微型化的p c r 芯片的出现。p c r 微芯片是运用m e m s 技术在硅片或玻璃片等基片材料上加工 一系列的微管道、微反应室等空间结构以及微阀、微加热器、微感应器等控制结 构，利用芯片集成度高和比表面积大的特性，实现芯片上的快速p c r 扩增。 中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研究 1 3 1p c r 芯片的特点 p c r 芯片是通过m e m s 技术在硅片或玻璃片等基片上集成微型化装置来完 成快速p c r 反应的芯片。 p c r 芯片与常规p c r 仪的对比； 1 整体性p c r 芯片操作系统采用基因扩增、结果分析一体化，操作简便： 传统的p c r 仪的基因扩增及结果分析分离，操作繁琐； 2 时间p c r 芯片系统只需十几分钟，而传统的p c r 仪需3 4 小时； 3 价格常用的p c r 仪价格为数万元乃至数十万元以上( 如p e 9 6 0 0 型p c r 仪需3 ( 2 0 0 万) 而p c r 芯片的成本应可控制在万元以下。 4 试剂传统p c r 仪对试剂用量有要求，1 5 微升以下就很难得到理想的扩 增结果，p c r 芯片可以扩增l o 微升以下的样品，这相应减少了试剂如t a q 酶的 用量，节省了宝贵的实验经费，也减少了废液污染。 5 结果获得方式传统p c r 仪需用常规电泳分析结果，步骤繁琐。p c r 芯 片可以与毛细管电泳芯片集成p c r c e 芯片系统，也可以用光纤光谱仪扫描，电 脑分析获得结果，操作简单，结果可靠。 由上可知，p c r 芯片与传统p c r 仪相比，具有体积小、反应速度快，操作 简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验经费、便于集成化、结果可靠的 优点。 1 3 2p c r 芯片的发展现状和展望 到目前为止基于芯片的p c r 技术主要有两种实现模式：一种是试剂在温度 循环变化的管道区间中连续流动实现p c r 扩增，称为连续流动p c r 微芯片；另 一种是试剂不动，而芯片腔体的温度迅速循环变化实现p c r 扩增，称为p c r 微 池芯片。前一种方式容易实现集成化，后一种方式的反应速度要比前一种快。 1 3 2 1 连续流动式p c r 芯片 连续流动式p c r 芯片使试剂在微管道中沿三个固定的温度区连续流动，每 流过三个温度区就完成一次温度循环，也就完成了一次扩增。连续流过所需次数 的温度区就可以达到所需要的放大倍数。这种方法的速度明显比反应腔式的速度 快，一个2 0 个循环的p c r 最快只需要1 5 分钟。这种方法的一个缺点是集成度 中国科学院硕十学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研究 无法提高，不能缩小的原因是试剂在三个加热区的停留时间必须足够长，因为连 续流动，所以在流速固定的情况下就要求流动长度足够长。但这种方法速度快， 一般为几分钟到二十分钟。 伦敦帝国理工大学的m a r t i nu k o p p 等研制了一种样品可在不同温度的恒温 区间内连续流动的p c r 芯片8 1 ( 图1 2 ) ，成功实现了一个1 7 6 b p 的d n a 片段的 扩增。芯片由石英玻璃组成，微通道用光刻腐蚀并键合的方法制的。三个温度区 ( 9 5 、7 7 。c 平 16 0 。c ) 由三个恒温铜块来实现，液体流动管道在玻璃上( 康宁0 2 1 1 玻璃) 刻蚀得到，由恒流泵驱动。其中刻蚀板和覆盖板的厚度均为o 5 5 u r n ，管 道与外部的接口由在覆盖板上钻的直径为4 0 0 u r n 的孔实现。标准毛细管( 内径 1 0 0 u m 外径，3 7 5 u m ) 用环氧树脂粘合在孔中。用基于p c 的l a b v i e w 控制的 注射泵( k l o e l m5 0 3 0 0 ，2 5 1 ) 来精确控制液体的流速。加热器的功率为5 w ，温度 由标准p i d 控制，温度传感器为固定在玻璃背面的p t 电阻。整个系统最快可以 在9 0 秒内完成2 0 个循环的p c r 扩增。 b8 避 p m d 万i 守 图1 2 连续流动p c r 示意图。 德国的i v o n n es c h n e e g a b 9 】等改进了这种微流体芯片。在这种芯片中，不仅仅 在硅面腐蚀管道，并且在玻璃的表面也腐蚀了管道。这样，在键合后，管道是椭 圆形的，具有更好的性能。另外为了减少不同温带间热的传导，在温带间，在硅 片上腐蚀了很深的槽，降低了热的传导。此夕 ，在硅片的反面还通过微细加工技 术集成制作了p t 加热片和热传感器。整个系统是通过p c 软件来控制进样、流动速 度和温带的温度的，见图1 3 。反应结果用电泳证明，成功的扩增了长度分别为 忡， 妇 、 ! 旦型堂堕堡主兰堡丝兰! 曼垦兰笪塑璺型：互鲨翌些里堕壅 0 6 b p 、3 7 9 b p 、7 0 0 b p 的d n a 片段。 【h 口一l 图1 3 微流体p c r 芯片系统 1 3 2 2 微反应腔式p c r 芯片 微反应腔式p c r 芯片又叫p c r 微池芯片，是用微电子加工技术( m e m s ) 在芯片上制作一个微小的腔体储存反应液，在外部或内部对它加热和降温来实现 温度循环。由于腔体的体积非常小( 几个微升) ，因此热容非常小，可以实现快 速地加热和制冷，并且有利于制作集成化的装置。 p c r 微池芯片的系统结构包括p c r 微反应池芯片、检测系统和温度控制系 统等几个部分组成。图1 4 是香港科技大学的a l e xi k l a o 1 0 1 等设计的p c r 微 池芯片系统的结构示意图。芯片固定在加热器上进行反应，反应图象由c c d 检 测器即时检测并将采集的图象传输给p c ，p c 通过软件分析将分析结果传输给控 制系统，控制系统根据传输来的信号控制加热器的电力系统，这样在各个系统的 互相协助下p c r 微池芯片进行温度可控的热反应。此外，反应过程也可以通过 集成在芯片上的微传感器直接检测，在控制系统、p c 的软件数据处理分析和电 力系统的协同帮助下控制微池内反应的温度。芯片的温度控制包括加热过程和散 热过程，由于硅的导热性能很好，因此芯片的加热效率很高，但散热降温速度缓 慢，要缩短芯片的温度控制时间关键在于良好的散热装置。通常的芯片都带有散 热装置( 图中没有显示) 。 中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研究 图1 , 4p c r 微池芯片的装置结构示意图 为了提高p c r 芯片的效率，现在研究集中在以下几个方面，快速的加热和 冷却装置、较高的温度稳定性和尺寸较小的便于集成化的装置。 微腔体由于体积小，加热片的升温速度可以很快，但降温缓慢，这是因为降 温过程是通过散热来完成的。因此降温己成为制约p c r 芯片反应时间的瓶颈。 为了提高降温效率，一方面是选用散热快的材料，另一方面是借助于冷却水或栅 状散热装置。y u c h = n gl i n 4 】用散热快的硅片为基片，盖片为p y r e x7 7 4 0 ，为了 便于样品的取出，微反应池设计成微管道式( 宽1 2 0 0 u m ，深2 0 0 u r n ，总长为2 5 c m ， 体积为6 0 u 1 ) 。整个装置还包括一个基于p c 的p i d 控制器，用来控制继电器， 风扇和热电偶冷却装置的能量供应( 图1 5 ) 。这三方面互相协作共同控制p c r 反应过程。温度由r t d ( p t l 0 0 ) 检测，通过转换器并经数据处理分析后又回到 了p c 。扩增丙肝相关基因片段3 0 个循环只要3 0 r a i n 。 图1 5 微反应池p c r 散热装置装置示意图 s p o s e r f “ 用淀积的方法在微芯片上集成微加热片和p t 温度传感器作为微控 中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研芄 温系统，而且在微反应腔的四周集成了气流室来降底温度( 图16 ) 。该系统的优 点是把加热，温度检测和冷却都集成在了一个芯片上，便于和其它芯片的集成。 图1 6 集成式p c r 微池芯片的典型结构 a ) 三维图，b ) 侧面图，c ) 放大的侧面图 j 且d a n i e l t l 2 1 的研究也采用微反应腔的形式，但它的加热和传感器以及溶剂 的封装都与s p o s e r 的不同。反应腔悬浮在四个梁上，这样与基底在空间上进行 温度隔离，它的体积为l u l 。在反应腔的周围是氮化硅网，氮化硅是亲水性的， 这样可以精确的确定反应腔的液面高度。反应腔用硅酮油密封，用来防止试剂的 挥发。它的加热器和传感器的结构与上两者不同，加热器和传感器都采用了p t 。 对于微腔体，由于表面积和体积比的增加，表面效应非常明显。所以必须进行表 面处理，首先用p e c v d 得到氧化膜，然后用b s a 浸泡，最后用水冲洗。这样 处理的结果使反应腔不会对p c r 抑制。 b c g i o r d a n o 用聚酰亚胺为材料制作芯片。这种塑料材料可以耐3 5 0 。c 的高 温，并且不吸收波长为6 0 0 3 0 0 0 r t m 的红外光。聚酰亚胺用激光切除加工处理， 制成体积为】7 1 1 1 的微反应腔。用5 0 w 的钨灯为红外光光源，聚焦加热( 这是一 种非接触式的温控方法) ，并用镀金的反光镜反射红外光来增加加热效率。温度 用集成在芯片上的t y p e t 微热电耦检测，红外光强通过a d 变换器由基于p c 的l a b v i e w 来调节。用该方法加热和降温速度都可以达到1 0 0 c s ，一个循环只 要1 2 s ，整含过程1 5 个循环只要2 4 0 秒。 a j i tm c h a u d h a r i i f 3 等利用液晶对微型p c r 微槽阵列的瞬态温度场进行了检 测。他们在1 1 0 m m ) 面热氧化 ( 2 ) 在氧化层上椽光刻腔 ( 3 ) 紫外光刻、显影、定影 ( 4 ) 用 i f 溶液腐蚀氧化层 ( 5 ) 用5 0 的k o h 低温腐蚀硅 ( 6 ) 去除光刻胶和氧化层 ( 7 ) 用p y r e x7 7 4 0 玻璃键尝 ( 8 ) 徽池内壁自然氧化 图2 1 3 硅一玻璃p c r 微池芯片制作工艺流程 图2 1 4 硅一玻璃p c r 微池芯片形貌 3 8 ! 里型兰堕堡主兰竺堡兰! ! 堡苎竺堕堕兰：查望塑壁旦! ! 茎 2 4 本章小结 本章讨论了p c r 芯片的设计思路和制作工艺。介绍了我们设计和制作石英 玻璃微流体p c r 芯片、石英玻璃p c r 微池芯片和硅一玻璃p c r 微池芯片三种 p c r 芯片及其温度控制装置的方法。在制作过程中，多采用比较成熟的工艺， 通过适当的优化，制作出了质量和性能比较令人满意的p c r 芯片和温度控制装 置。 参考文献 i m a n za b e c k e tb ( e d s ) m i c r o s y s t e mt e c h n o l o g yi nc h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c e ， b e r l i n ：s p r i n g e r , 1 9 9 9 ，3 - 4 2 d u f r yd c ，m c d o n a l dj c ，s c h u e l l e ro j a ，w h i t e s i d e sg m ，r a p i dp h o t o t y p i n g o fm i c r o f l u i d i c s y s t e m s i n p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ，a n a l c h e m ，1 9 9 8 ，7 0 ： 4 9 7 4 4 9 8 4 3 m a r t y n o v al ，l o c a s c i ol e ，g a l t a nm e ta l f a b r i c a t i o no fp l a s t i cm i c r o f l u i d c h a n n e l s b yi m p r i n t i n gm e t h o d s ，a n a l c h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ：4 7 8 3 - 4 7 8 9 4 r a m s e yr s ，r a m s e yj m g e n e r a t i n ge l e c 廿o s p r a yf r o mm i c r o c h i pd e v i c e s u s i n g e l e c t r o o s m o t i c p u m p i n g ，a n a l c h e m , 1 9 9 7 ，6 9 ：1 1 7 4 - 1 1 7 8 5h a d da g , r a y m o n dd e ，h a l l i w e l l 删，c ta l ，m i c r o c h i pd e v i c ef o rp e r f o r m i n g e n z y m ea s s a y s ，a n a lc h e r n ，1 9 9 7 ，6 9 ：3 4 0 7 - 3 4 1 2 6 s i m p s o np c ，w o o l l e ya t ，m a r b l e sr a ，m i c r o f a b r i c a t i o nt e c h n o l o g y f o rt h e p r o d u c t i o no f c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p s ，j b i o m e dm i c r o d e v , 19 9 8 ， 1 ：7 2 6 7 b e r t h o l da ，n i c o l al ，s a r r op m ，g l a s s - t o g l a s sa n o d i cb o n d i n gw i t hs t a n d a r d i ct e c h n o l o g yt h i nf i l m sa si n e r m e d i a t el a y e r s ，s e n sa c t u a t o r sa ，2 0 0 0 ，8 2 ： 2 2 4 - 2 2 8 8 印燕，吴冲岩玻璃与玻璃的静电键合，徽细加工技术，1 9 9 8 ，4 ：4 7 5 0 中国科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和堕旦粤堕 第三章、用p c r 微池芯片扩增d n a 片段 3 1 石英玻璃p c r 微池芯片温度控制程序的优化 石英玻璃芯片的温度控制是借助商用p c r 热循环仪进行的，由于玻璃导热 慢和空气散热的原因，石英玻璃p c r 微池芯片内的温度和p c r 仪所显示的温度 有很大的差别。为了测定芯片微池内的准确温度和温度变化的情况，我们用p t l 0 0 薄膜铂电阻测定了不同温度控制程序下e p p e n d o r f 管中，石英芯片内的温度一时 间曲线。具体方法是：将热电阻p t l 0 0 固定在e p p e n d o r f 管中和石英芯片微池内 等部位，用d t 9 2 0 2 万用表测定每个时间段的电阻，通过电阻。温度的公式转换 ( 见公式) ，并用e x c e l 软件绘图分析，最后获得了微池内准确的温度一时间 变化关系。 r f r o 1 + a t + b - f ( 0 。c 6 0 0 。c ) a = 3 9 0 8 0 2 10 3 c ：b = 。5 8 0 15 9 10 7 c 一2 由于玻璃导热慢等原因，芯片上的温度和p c r 仪所显示的温度有很大的区 别。为了测定芯片微池内的准确温度，用p t l 0 0 热电阻和万用表来测定芯片微池 内温度。在p c r 仪设定的程序下每十秒取一个读数，用e x c e l 绘制温度一时间 曲线。结果如图3 1 。 06 01 2 01 8 02 4 03 0 0 3 6 04 2 0 4 8 0 5 4 0 6 0 0 6 6 0 - - o - - 1 e p p e n d o r ft u b e 1 h 25 1 i d e + _ 3g r i d d l es l i d e 廿一4p c rc h i p 图3 1 常规温度控制程序下不同材料的温度曲线 图3 】中p c r 仪的温度控制程序是： 4 0 - 眠呲眠蚰纸m甑眦眠吼 pi甚2p d j 圉科学院硕士学位论文p c r 芯片的原理、方法和应用研究 9 4 1 2 ，5 m m ； f 9 4 c ，l m m ； 3 5 c 咄5 1 黧竺 图中，曲线1 是e p p e n d o r f 管的温度时间关系曲线，由于e p p e n d o r f 管与p c r 仪加样板充分接触，它的升温和降温时间都比较短，p c r 仪显示温度数值实际 上是模拟管中的温度，因此温度准确。曲线3 是p c r 仪的盖板( t h e s l i d eg r i d d l e ) 的温度一时间关系曲线，盖板放置在p c r 仪的加样板上，盖板的导热性能良好， 但由于盖板的升温和降温是通过与加样板的接触来进行传热的，结果表明，盖板 的导热性能很好，能达到p c r 扩增的变性温度( 9 46 c ) ，但由于空气散热性能不 佳，在规定的时间内