（安全技术及工程专业论文）二氧化钛纳米颗粒的毒理学及生物学效应研究.pdf

a b s t r a c t n a n o s c a l et i t a n i u md i o x i d e ( t i 0 2 ) h a si n h e r e n tp h y s i c a la n dc h e m i c a la d v a n t a g e sw h i c h d e c i d ei t se s p e c i a lt o x i c o l o g yc h a r a c t e r s t i 0 2n a n o p a r t i c l e sm a ye n t e ri n t ot h es o i l ，a i ra n d w a t e r ，a n df i n a l l ye n t e ri n t oh u m a nb o d yb yv a r i o u sw a y s s o ，t h ee s t i m a t eo fs e c u r i t ya n d f a t a l n e s so ft i 0 2n a n o p a r t i c l e sh a sb e c o m et h en e wt o x i c o l o g i c a lt a s ki n21 c e n t u r y t h e p a p e rd i s c u s s e dt h et o x i ce f f e c t so ft i 0 2n a n o p a r t i c l e sa n dm i c o n t i 0 2o nm a m m a l sa n di t s s a f e t yt oa q u a t i c sv i at h es t y d yw i t l lm o u s ea n dd a p h n i am a g n a t h e m a i ns t u d yc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n si n c l u d i n g ： ( 1 ) t h es t u d yo nt o x i ce 髓c t so fn a n o - t i 0 2a n dm i c o n t i 0 2w i t hm i c e t h er e s u l t s h o w e da l li n d e x e so fn a n o 一10 m g k gb wg r o u pw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a no t h e r s ( p 0 01o r p 0 0 5 ) a l b ，t p ，a c pa n da l p o fn a n o lm g k gb wg r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l g r o u p ，m i c o n - 1 0 m g k gb wa n dm i c o n - l m g k gb wg r o u p s 俨 0 0 1o rp 0 0 5 ) a l po f m i c o n lm g k gb wa n dm i c o n 一10 m g k gb ww e r em a r k e d l yd i f f e r e n tf r o mt h ec o n t r o lg r o u p ， b u to t h e ri n d e x e so fm i c o n im g k gb wa n dm i c o n 一10 m g k gb wh a dn oo b v i o u sd i f f e r e n c e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h el u n gs c a t h ec a u s e db yn a n o t i 0 2w a sm o r es e r i o u st h a no n ec a u s e d b ym i c o n - t i 0 2 n a n o t i 0 2i n d u c e dt h ec h a n g eo fo s m o s i so fg a s b l o o db a r r i e ra n dl u n ge a r l y f i b r o s i s ，a n de x i s t e ds i z e d e p e n d e n c e ( 2 ) t h es t u d yo nu r g e n tt o x i ce f r e c t so ft h r e es i z e dt i 0 2n a n o p a r t i c l e s ( 5 士1 、2 5 - 4 - 5 、 10 0 士5 n m ) w i t hm i c e b l o o ds e r l l r ni n d e x e sa n dc o n t e n t so ft ii nb r a i n ，l u n g ，l i v e r ，k i d n e ya n d s p l e e nw e r em e a s u r e d t p ，a k pa n dl d hi n d i c a t e da l lt r e a t m e n t se x c e p tf o rh ig hd o s eo f 10 0 n mt i 0 2g r o u pm a yl e a dt od i f f e r e n td e g r e el i v e rd a m a g e t h r e ei n d e x e sa l l g r e a t i n c r e a s e da th i g hd o s eo f5 n mt i 0 2 ，i ti m p l i e dl i v e rd a m a g eo fm i c eo ft h i st r e a t m e n tm a yb e t h em o s ts e r i o u s m d a ，g s h - p xa n ds o ds h o w e d5 n ma n d2 5 n mt i 0 2 p a r t i c l e sl e d o x i d a t i v es t r e s sa tl o wa n dh i g hd o s e ，a n dt h r e es i z e dt i 0 2p a r t i c l e si n d u c e do x i d a t i v ed a m a g e a t “g hd o s e t i s s u ed i s t r i b u t i o no ft is h o w e d ：0 ) t h et i t a n i u mc o n t e n ti nb r a i ni n c r e a s e dw i t h d e c r e a s eo ft h ec o n c e n t r a t i o na n ds i z e ；i nt h e5 n ma n d2 5 n mt i 0 2n a n o p a r t i c l e st r e a t m e n t s ， e s p e c i a l l ya tm i da n dl o wd o s e ，m o r et i 0 2n a n o p a r t i c l e sw e r er e t a i n e di nl u n g ，a n dt i 0 2 n a n o p a r t i c l e sm o r ee a s i l yt r a n s l o c a t e dt oo t h e ro r g a n s ， s u c ha ss p l e e n ，k i d n e ya n dl i v e r t h i s m a yr e l a t et oa g g r e g a t i o nc h a r a c t e r i s t i co ft i 0 2n a n o p a r t i c l e s ( 3 ) t a k ed a p h n i am a g n a 硒m o d eb i l o l g yt os t u d yt h et o x i c i t ya f f e c to fn a n o t i 0 2a tt h et i m e o fi t sr e v e a l m e n t t h er e s u l ts h o w e d ，t h ed e a t hr e a s o nw a sd i f f e r e n c ea ti t sd i f f e r e n ts t a t e s w h e nn a n o t i 0 2w a si ns u s p e n d i n gs t a t e ，d a p h n i am a g n aw a sd i e db e c a u s eo fe a t i n gt o om u c hl l a n o t i 0 2o r a s p h y x i aa st h el o wo x y g e nc o n t e n t k e yw o r d s ：t i 0 2n a n o p a r t i c l e s ；a c u t et o x i c i t y ；b i o l o g i c a la f f e c t ；m o u s e ；d a p h n i am a g n a i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗墨墨太堂 或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：7 f 救j , ,签字日期：训尸年2 月 名目 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗墨墨盘望有关保留、使用学位论文 的规定。特授权墨盗墨墨盘望 可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：熬欠佬 导师签名： 签字日期：1 川年1 月彩日 签字日期：以嚼 第一章绪论 1 1 纳米毒理学的研究状况 1 1 1 纳米材料的性质 第一章绪论 纳米材料是指通过在纳米尺度内操纵单个分子、原子团或分子团，使物质成分重新 排列组合后制造出的新型物质材料，它的几何尺寸达到纳米级尺度。纳米颗粒是纳米材 料的一种，又称为超微颗粒，是指大小在l l o o n m 之间的粒子。由于粒径变得极小， 具有表面效应、量子尺寸效应、体积效应和宏观量子隧道效应，使颗粒的理化特性发生 了根本性的变化，由此产生许多优异的特性。如导电性能良好的铜在纳米级就不导电 了；二氧化硅陶瓷在通常情况下是很脆的，但当二氧化硅陶瓷颗粒缩小到纳米级时，脆 性的陶瓷竟然具有了韧性。由于比表面积的增大，使处于表面的原子数越来越多、表面 能迅速增大；由于原子配位不足及高的表面能，使这些表面原子具有很高的活性，极不 稳定，很容易与其他原子结合，使其在催化、吸附等方面具有常规材料无法比拟的优越 性。例如，金属纳米粒子在空气中会燃烧：暴露的无机纳米粒子会吸附气体，并与气体 进行反应；同时，由于较高的数量浓度和较大的比表面积，会使得纳米颗粒物在与细胞 和亚细胞成分相互作用时较大颗粒物具有更为明显的毒理特性，因此尽管纳米尺度颗粒 物在大气中的质量浓度很低，其毒理效应却不容忽视，并且在高污染事件中纳米颗粒物 还会有几倍的增长。美国r i c e 大学生物和环境纳米技术中一i l , ( c b e n ) 主任v i c k ic o l v i n 认为：纳米材料微小，有可能进入人体中那些大颗粒所不能到达的区域，如健康细胞； 在纳米量级，材料的性质会有不同的表现1 2 j 。 1 1 2 纳米材料的毒性效应 环境中的纳米颗粒并不是近年来纳米技术快速发展的产物，人类其实早与纳米颗粒 共存。汽车尾气、柴油机燃烧、矿物开发和生产等过程，都会产生大量的纳米粒子，据 估算，在大街上行走的人，每小时通过呼吸空气吸进的纳米粒子大约有1 亿个【3 】。近年 来由于纳米技术的快速发展，纳米材料将通过多种途径以各种各样的形式进入到人类的 生活和生存环境当中，甚至进入生物体。 一些流行病学研究发现，环境纳米颗粒与呼吸、心血管不良效应有关，可导致易感 人群发病和死亡。临床研究发现，纳米颗粒在健康人、哮喘患者和慢性阻塞性肺部疾病 患者的呼吸道均有较高的沉积率。 图1 1 是通过呼吸途径进入体内的纳米粒子沉积的部位【4 l 。数学预测模式表明( 图 1 2 ) ，人休息时用鼻呼吸，吸入的颗粒可在鼻咽部、支气管和肺泡分段沉积。首先由于 气流方向的改变、上呼吸道的生理解剖结构和粘液分泌，大于l o p , m 的粒子在鼻腔和上 第一章绪论 呼吸道沉积下来进而被排除体外。处于纳米尺度的颗粒在这3 个不同的呼吸部位内沉积， 8 0 的1 n m 粒径的颗粒会沉积在鼻腔内部，其余2 0 沉积在支气管内部，而不能到达肺 泡内，大约有5 0 的1 0 r t m 的粒子沉积在肺泡中，在鼻腔中的残留量相对比较少。肺泡 中沉积的粒子多处于5 n m 到5 0 n m 之间，沉积量超过肺泡的巨噬细胞吞噬能力之后，便 会导致肺泡中巨噬细胞的吞噬能力降低，影响肺的正常功能口j 。动物实验证明，纳米颗 粒能够诱发轻度但明显的肺部炎症及肺外器官效应。 圈1 1 吸入的不同尺寸颗粒物在 体内沉积位点 f i g i - 1p r e d i c t e d f r a c t i o n d e p o s i t i o no f i n h a l e dp a r t i c l e s i n m o p h a r y n g e a l ，t r a c h e o b m n c h i a l ，a n d a l v e o l a rr e g i o no f t h e h u m a nr e s p i r a t o t y t r a c td u r i n gn o s e b m a t h l n g 图i 2 不同粒径吸入颗粒在人呼吸道的沉积【4 l f i g i 一2 d e p o s i t i o no f i n h a l e dp a r t i c l e s i n t h e h u m a nr e s p i r a t o r y t r a c tv e r s t l s l h ep a x t l c l ed i a m e t e r 第一章绪论 除呼吸道外，水、食物、化妆品内的纳米材料可经消化道直接摄入，并主要通过派 伊尔通道转运到肠系膜，再到达全是器官。皮肤摄入是另个重要的暴露途径，表皮有 外角层、棘细胞层和基底细胞层组成，系真皮的保护层。真皮富含血供、巨噬细胞、淋 巴管、树状细胞和5 种神经末梢，皮肤破损成为大颗粒( 0 5 7 0r t r n ) 入口，但纳米颗粒( 1 9 m 的荧光珠) 在关节活动皮肤折曲时可穿过未破损的真皮，通过淋巴系统进入循环系统。 纳米颗粒与生物体中的细胞或蛋白质分子尺寸相当，甚至更小，在进入生物体后， 它们很容易与体内的蛋白质分子或亚细胞器相互作用，其所产生的化学和生物活性与化 学成分相同的常规的物质有很大不同。研究表明，一些人造纳米颗粒在很小剂量下容易 引起靶器官炎症；使机体产生氧化应激；诱发脑损伤；纳米颗粒还可以穿过细胞膜进入 细胞甚至聚集在细胞核和线粒体内；纳米颗粒的表面吸附力很强，容易把其他一些活性 物质带入细胞内；纳米颗粒尺寸越小其生物毒性有增大的趋势；纳米颗粒表面结构的轻 微改变将导致其生物效应发生巨变等一。 1 1 3 纳米材料的应用 二氧化钛( 又名钛白) 具有良好的物理化学稳定性( 1 0 0 0 0 c 煅烧后不熔于任何酸 和碱) 、折射指数高( 2 5 5 2 7 0 ) ，以及很强的白度、着色力( 11 5 0 1 6 5 0 ) 、遮盖力 ( 4 0 5 0g m 2 ) 、抗粉化等特征，被称为“颜料之王。在自然界中二氧化钛以锐钛矿 型( a n a t a s et y p e ) 、金红石型( r u t i l et y p e ) 和板钛矿型( b r o o k i t et y p e ) 三种晶体形式 存在，其中最为广泛使用的是锐钛矿及金红石，以单独使用或两者混合来作为工业颜料 ( 钛白粉) 、食品添加物( 已经美国f d a 食品检验中心认可) 、化妆品( u v 吸收剂) 等。 随着纳米技术的不断发展，纳米材料广泛应用于化工、光电、微电子学、分子组装、 传感器等各个领域。如将纳米二氧化钛粉体按一定比例加入到化妆品中，可以有效地遮 蔽紫外线；将金属纳米粒子掺杂到化纤制品或纸张中，可以大大降低静电作用。纳米微 粒还可用作导电涂料，用作印刷油墨，制作固体润滑剂等。 近年来，纳米二氧化钛更是以其优异的抗菌性能成为开发研究的热点之一，被应用 于水处理装置、医疗设备、食品包装、建材( 抗菌地砖、抗菌陶瓷、卫生设施、抗菌砂 浆、抗菌涂料等) 、化妆品、纺织品、日用品，以及家用电器( 抗菌不锈钢板、铝板等制 作的电冰箱、洗衣机内胆等) 等各个领域【6 】。正是由于纳米二氧化钛应用研究的广泛性， 使得众多的研究者、生产者、消费者都无法避免与其广泛接触1 7 】。 1 2 纳米二氧化钛的毒理学研究状况 由于其广泛使用，关于纳米二氧化钛的毒性研究相对较多，下面主要根据不同的染 毒方式综述了目前的纳米二氧化钛的毒性研究。 第一章绪论 1 2 1 鼻腔注射 在暴露过程中，吸入的纳米粒子在鼻腔中的转运可能有以下几种：种是经鼻咽部 进入呼吸系统，并进而进入血液循环：一种是穿过鼻黏膜沿着嗅觉神经轴突或者嗅觉黏 膜上皮通路进入到嗅球，并进一步转运到中枢神经系统中悼j 。因此，纳米二氧化钛颗粒 也可能经鼻粘膜吸收通过嗅觉神经系统进入大脑中，进而与神经元细胞相互作用对脑功 能带来一定的影响。w a n gj i a n g x u e 等哺j 用粒径为2 5 r i m ，8 0 h m ，1 5 5 n m 的纳米二氧化 钛，剂量为5 0 m g k gb w ，进行鼻腔注射，每隔一天注射一次，分别在第2 天，l o 天， 2 0 天，3 0 天用i c p m s 分析二氧化钛含量。发现暴露1 0 天后，脑部二氧化钛提高，2 5 n m 组高达( 10 5 9 3 士2 9 3 5 ) n g g ；到2 0 天随体内代谢二氧化钛含量缓慢降低，但仍保持较 高水平，2 5 n m 组二氧化钛含量降至( 6 5 4 7 士2 6 9 2 ) n g g ；暴露3 0 天，与2 0 d 相l l - - 氧 化钛含量变化不明显。由此，当暴露到2 0 d 时，脑中钛含量近乎达到平衡状态。这与其 脑切片的结果是一致的，并且脑中钛的含量明显高于肺组织，因此作者推断鼻腔滴注的 二氧化钛粒子有相当一部分是穿过鼻粘膜经嗅觉神经轴突转运到中枢神经系统中。 另外，w a n gj i a n g x u e 掣8 j 还发现当吸入的二氧化钛粒子进入脑后，可以激活脑中 的抗氧化系统，发生脂质过氧化和蛋白质氧化，脑细胞中乳酸脱氢酶大量合成，诱发相 应的炎性细胞因子的释放。但通过脑神经传递质含量的测定，发现2 5 n m 的粒子并没有 影响其含量的改变，而8 0 和1 5 5 n m 的影响相对较大。说明纳米二氧化钛粒子诱发的毒 性效应和二氧化钛颗粒的尺寸并没有明显的相关性，这与w a r h e i t 等1 9 l 的研究结果是一 致的。他们发现纳米和微米尺寸的二氧化钛颗粒诱发了同等程度的大鼠肺部炎症反应和 细胞损伤。 1 2 2 支气管注射 a f i a q 等i lo j 用支气管注入法研究小于3 0 m 二氧化钛( 用量2 m g ) 对大鼠的毒性时，发现 肺泡巨噬细胞的数量增加，同时细胞内的谷胱甘肽过氧化酶、谷胱甘肽还原酶、6 磷酸 葡萄糖脱氢酶、谷胱甘肽硫转移酶的活性均升高。但是，酶活性升高并没有阻止脂质过 氧化和过氧化氢的生成，这表明受到二氧化钛纳米颗粒作用时，尽管细胞启动自我保护 机制诱导了抗氧化酶的生成，却未能消除二氧化钛纳米颗粒产生的毒副作用。进一步的 研究观察到了纳米二氧化钛颗粒能够引起的一系列生物效应【1 1 , 1 2 】。2 0 r i m 的二氧化钛颗粒 引起了肺组织间质化并诱发炎症反应，使上皮组织的渗透性增加，肺泡灌洗液内生理指标 的变化与纳米颗粒的比表面积( 尺寸大小) 有关1 1 2 j 。同时纳米二氧化钛引起了支气管肺泡 灌洗液内蛋白质总量、乳酸脱氢酶及p 葡萄糖苷酸酶的活性普遍升高，而且比表面积一 效应曲线与实际的炎症情况有很好的相关性，这意味着二氧化钛纳米物质的生物效应与 尺寸效应有关1 1 1 。 r a h m a n 等【1 3 】在比较t 2 0 n m 的超细二氧化钛颗粒和2 0 0 n m 的细二氧化钛颗粒对原代 大鼠胚胎成纤维细胞的影响时发现，2 0 n m 的超细颗粒处理后的细胞，其微核数目显著升 高并引起了细胞凋亡。尽管对纳米颗粒引起的细胞凋亡的机理还不清楚，但据推测可能 是由于反应活性很大的纳米颗粒和细胞膜相互作用产生了活性氧物质，产生的氧化应激 4 第一章绪论 引起细胞膜脂质层的破裂，细胞内钙稳态失去平衡导致依赖于c a 2 + 浓度的核酸内切酶的 活化引起了细胞凋亡。 1 2 3 肠胃染毒 消化道摄入主要通过派伊尔通道转运到肠系膜，再到达全身器官。w a n gj i a n g x u e 等【1 4 j 用粒径为2 5 n m ，8 0 n m 和1 5 5 n m 的纳米二氧化钛，进行一次性灌胃染毒，剂量为5 9 k g b w ，观察1 4 天，测定各组织中二氧化钛的含量并进行组织病理学观察。结果表明，8 0 n m 二氧化钛在组织中的积累最多，特别是肝部( 3 9 7 0 4 + 1 6 7 0 1 n g g ) ，其次是肺、脾和肾； 2 5 n m 和1 5 5 n m 积累量相当，且均是脾积累最多，其次是肺和肾，肝部积累均相对较少 ( 1 0 6 3 - 4 - 7 8 n g g 和1 0 6 7 4 - 2 5 i n g g ) 。另外，血清中生化指标( a l t a s t ，b u n ，a n dl d h ) 的变化，也显示纳米二氧化钛颗粒导致显著的肝和肾损伤。这种现象说明，在生物体内， 二氧化钛主要被诱陷到网状内皮系统并通过肾排泄。脑部积累量均较低，且呈现粒径越 大含量越高的趋势。这与经鼻腔注射染毒3 0 d 的趋势类似。 在组织病理学观察中发现，暴露后小鼠有轻微的脑部损伤，海马神经元中有液泡， 并且8 0 n m 和1 5 5 n m 组比对照组多，这显示在脑组织海马中发生脂肪恶化。肾组织观察 发现，8 0 n m 组肾小管中有蛋白质流体，另外在1 5 5 n m 组，肾小球严重涨水。在肝组织 中，中央静脉周围有显著的水肿恶化，而且8 0 n m 和1 5 5 n m 组雌鼠暴露两周后，出现肝 细胞的多斑点坏疽。8 0 n m 组胃的绒毛膜层有一些炎症细胞，这可能是由于胃部二氧化 钛颗粒超载引起。除此之外，在心、肺、睾丸( 卵巢) 和脾组织中没有反常的病理学改 变。令人惊奇的是，2 5 n m 组和对照组相比，任何器官都没有显著的组织病理学的改变。 原因尚不清楚，详细的机制有待进一步研究。 1 2 4 腹膜注射 o l m e d od a n i e lg 等采用腹膜注射染毒研究粒径为1 l a m 锐钛矿二氧化钛对大鼠的毒 性作用，剂量为1 6 9 k gb w ，染毒后6 个月进行检测。发现。肾软组织有颗粒，并且肝和 肺中都有负载颗粒的巨噬细胞，但各组织形态学上没有变化。说明二氧化钛经腹膜注射 到大鼠后沉积的靶器官有明显的巨噬细胞活性，而且二氧化钛没有经历化学变化，如 t i 0 键没有破坏，并且从注射位置被分散。 有几种传输机制描述钛的传输，如以溶液或颗粒的形式通过血管系统分散；以单独 的颗粒或被吞噬的形式在巨噬细胞里通过淋巴分散；颗粒通过循环的单核细胞或微粒通 过血管系统分散到骨髓中。在o l m e d od a n i e lg 的研究中，一个可行的传输机制可能是 通过巨噬细胞。注射的二氧化钛可能被巨噬细胞吞噬，负载的巨噬细胞可能在淋巴系统 内从注射位置转移，并被释放出来，最终进入血液系统，并可以通过血浆蛋白传输。这 可以解释血样中吞噬单核细胞的出现。 进一步延长暴露时间，1 8 个月后进行检测，发现肝和肾中二氧化钛的存在没有引起 明显损伤，但肺中肺泡巨噬细胞明显增加。其主要原因是由于二氧化钛引起活性氧粒子 ( r o s ) 的产生，影响细胞的氧化代谢引起组织损伤，为减小组织损伤，巨噬细胞进行 自动调整，因此数量增加。虽然二氧化钛导致r o s 的产生，但注射后1 8 个月没有观察 5 第一章绪论 到组织损伤，可能是由于适应性反应。 另外，o l m e d od a n i e lg 等用同样的方法研究了金红石二氧化钛的毒性，发现注入后 6 个月，在巨噬单核细胞、血清和所有被检测器官的软组织中均发现n 。金红石二氧化 钛引起反应性细胞比例增加，但比锐钛矿二氧化钛处理后的增长小。虽然金红石二氧化 钛引起活性氧的增加，但并没有导致膜脂质的破坏。因此金红石二氧化钛比锐钛矿二氧 化钛生物反应性更小。 125 尾静脉注射 为了更简单的观察纳米颗粒在体内的分散，f u m i ow a t a r i 等经尾静脉向小鼠体内 注入3 0 n m 的二氧化钛颗粒，在注射后5 m i n 和3 h 用x s a m 分析发现，注射后二氧化钛 颗粒立刻从尾静脉分散到肺部，并随时间向肝和肾分散。 另外，f a b i a n 等”5 蚺2 0 - 3 0 r i m 二氧化钛通过尾静脉注入小鼠体内，发现二氧化钛颗 粒主要分布于肝和脾。 12 6 皮肤染毒 s 【 l e 毒n 隧 i f lu 驯g 03 hid1 t i m ea f t e ri j e c f i o n 囤1 3 各组织器官中纳米二氧化钛含量变化率 f i 9 1 3 c h a n g e o f e x i s t e n c er a t i oo f t l 0 2 p a r t i c l e s i ne a c h o g a l l w i t h t i m e 纳米二氧化钛因其良好的紫外光屏蔽功能，被广泛应用在化妆品中。m e n z e l 等i 使用与人体皮肤极为相似的猪背部皮肤研究了纳米二氧化钛粒子的皮肤渗透性。采用质 子激发x 射线荧光分析技术( p i x e ) 、卢瑟福背散射( r b s ) 技术观察了纳米二氧化钛 在皮肤中的分布情况，发现涂抹8 h 后，4 5 1 5 0n m 长、1 7 - - 3 5r t m 宽的纳米二氧化钛可 以通过皮肤的角质层进入到表皮下的颗粒层。并且通过扫描透射显微术( s t i m ) 和二 次电子成像( s e i ) 技术观察到二氧化钛纳米颗粒是通过皮肤细胞问的空隙进入的而非 毛囊孔。 t a n 等【l ”将含有8 超细微二氧化钛( 1 0 - 5 0r a n ) 的防晒产品在1 6 名志愿者的皮肤上 应用了2 至6 周，以研究其是否渗入皮肤。结果表明，皮肤的二氧化钛粒子有明显升高的 加 加 0 零、=oil目譬ou=3甚h瞄 第一章绪论 现象，首次提供了关于纳米级二氧化钛皮肤渗透的证据。s c h u l z 等1 1 8 j 和p l f i i c k e r 等i l 州应 用光电子显微镜后，认为二氧化钛( 2 0 - 2 0 0 n m ) 仅沉积在角质层的最外边，角质层的深 面和真皮层并没有检测到它的存在，纳米粒子不能渗入志愿者的皮肤。l a d e m a n n 等1 2 u j 报道在毛囊角质层和毛乳头处发现了防晒霜中的超细二氧化钛颗粒的沉积，但是这并不 能认为颗粒能穿透活皮肤组织。b e n n a t 等【2 l 】将水状和油状的二氧化钛用于评价其皮肤渗 透性，结果表明，油状的二氧化钛较水状的二氧化钛的皮肤渗透现象明显。目前还不能 确定二氧化钛纳米粒子可经皮渗透而产生毒性影响。 1 3 纳米材料对水生生态的安全评价 纳米二氧化钛与人群广泛接触的同时，也越来越多的进入到了水生生态环境中，可 以造成生态结构和功能的破坏，因而已受到国内外的广泛关注。对进入水环境的毒物通 常用藻类、鱼类、浮游生物、生物群落等作为受试对象进行其生物毒性的监测和环境安 全评价。 已有研究表明【2 2 1 ，不同的纳米材料水悬浮液对水生生物的毒性差异很大，如单壁 碳纳米管对斜生栅藻的毒性与纳米二氧化钛没有差异，但是单壁碳纳米管对大型蚤的毒 性却是纳米二氧化钛毒性的2 7 倍；同种纳米材料水悬浮液对不同生物的毒性也有明显的 差异，如纳米二氧化钛对斜生栅藻和大型蚤的e c s o 分别为1 5 2 6 2m g l 和3 5 3 0 6m g l 。由 于纳米二氧化钛兼有纳米材料的特性，又有特殊的光催化特性，因此在研究的同时也应 考虑环境因子对纳米材料的影响。 1 4 课题的研究内容和意义 人类接触外源化合物的方式主要为经鼻腔吸入、经口摄取、经皮肤吸收等，而纳米 材料的暴露则以经鼻腔吸入为最主要的暴露途径。关于纳米二氧化钛的生物学效应的研 究多集中在吸入后对生物体肺部的毒理学实验上，而对不同粒径和浓度二氧化钛纳米颗 粒经支气管注射的急性毒性和其进入生物体后在各组织器官的分布情况报道还很少。 本论文在查阅国内外对纳米材料的毒理学和安全性问题研究的基础上，重点探讨纳 米二氧化钛颗粒的支气管注射引起的急性毒性效应，尤其是通过各器官的氧化损伤、各 项生化指标的变化等几方面研究纳米二氧化钛对生物体的毒理学和生物学效应，具体分 为以下三部分： ( 1 ) 采用非暴露式支气管注射进入法研究纳米二氧化钛( 2 5 + 5 n m ) 和微米级二氧化 钛对小鼠肺组织匀浆液的各项组织生化指标( a l b 、t p 、a c p 、a l p ) 的影响； ( 2 ) 采用非暴露式支气管注射进入法研究三种粒径( 5 + l n m 、2 5 4 - 5 n m 、1 0 0 - a ：5 n m ) 纳米二氧化钛对小鼠组织器官的损伤及其分布情况； ( 3 ) 以大型蚤为模式生物，研究不同状态纳米二氧化钛对水生生物的急性毒性， 模拟纳米材料泄露的水体环境，初步评估纳米二氧化钛对水生生物安全性。 7 第二章纳米二氧化钛对小鼠的急性毒性效应 2 t 前言 第二章纳米二氧化钛对小鼠的急性毒性效应 随着纳米技术的飞速发展，进入到环境和生活中的纳米颗粒物越来越多。作为面向 2 l 世纪的新材料、新产品，纳米二氧化钛因具有良好的物理化学性质，已被应用于涂料、 油墨、塑料、橡胶、造纸和化纤工业等各个领域。在2 0 世纪7 0 年代末期，日本专利首次 公布制得二氧化钛的粒径范围为1 5 5 0n l l 。后来，清华大学朱永法课题组【2 3 j 用水热法合 成了孔径为3 1 8n l t l 的多孔纳米二氧化钛。随着纳米颗粒粒径的减小，其表面积会迅速 增大，纳米材料的生物和环境安全性研究成为一个亟需和迫切的问题 。 纳米颗粒的毒理学效应不仅与颗粒物的尺寸大小相关，而且与颗粒物的晶体形状和 表面积有很大的关系1 。一般说来，颗粒的粒径越小，表面积越大，颗粒的表面活 性也会有很大的提高，其生物学效应也发生相应改变。纳米颗粒带来的毒理学效应一般 与两个方面有关：一是颗粒的表面化学性质，如颗粒表面的可溶性成分和释放金属离子 的程度；二是由颗粒的尺寸租形状带来的机械性损伤。如果颗粒物完全不溶于生物 体液，在生物环境下不释放任何金属离子或可溶性成分，则其毒理学效应完全是因粒子 所引起的机械性损伤造成的。因二氧化钛分子特殊的表面电子结构，在溶液状态下其表 面很容易形成一层极性的水分子层，其颗粒物在机体内不具有可溶性，故纳米二氧化钛 颗粒的毒性很可能是由颗粒本身和其表面的活性物质决定的。已有研究表明。，纳米二 氧化钛一旦进入机体后，可以导致各个脏器不同程度的损伤，如对肺部的损伤表现为炎 症、纤维化甚至导致肿瘤的发生；纳米二氧化钛还可以导致血管内皮细胞的损伤，脑组 织的脂肪变性，肝脏水肿和肝小叶坏死，肾小球肿胀等；纳米二氧化钛进入细胞后，细胞 对它的清除能力会随着二氧化钛粒径缩小而下降，并且会对细胞造成细胞膜的破坏，细 胞核d n a 的损伤和断裂，以及有关蛋白质的含量和酶活性的变化。在我们前期的研究中 也发现纳米二氧化钛比微米级二氧化钛造成更严重的肺部毒性。 由于不同粒径的纳米颗粒可能导致其毒性存在较大的差异，因此，我们进一步选择 了三种不同粒径的纳米二氧化钛，采用非暴露式支气管注射一次性染毒，按照o e c d 4 2 0 的试验要求进行，研究不同粒径的纳米二氧化钛材料对小鼠的急性毒性和在体内的分 布，为进一步探讨纳米二氧化钛材料的毒性提供试验依据。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料来源及粉体悬液制备 纳米二氧化钛颗粒购自杭州万景新纳米材料有限公司，锐钛矿纳米二氧化钛颗粒粒 径为5 士l n m ，2 5 + 5 n m ，1 0 0 - 士5 n m ，纳米二氧化钛质量分数9 9 5 ；外观为白色粉末状 8 第二章纳米二氧化钛对小鼠的急性毒性效应 固体；p h 值6 - 8 ；含砷量姜0 5 p p m ，含铅量耋8 p p m 。三种颗粒的染毒剂量分别为0 0 5 m g k g b w 、0 5m g l ( gb w 、5 m g k gb w ，将三种颗粒配成生理盐水悬浮液，于高温下灭菌。 2 2 2 主要仪器及试剂 2 2 2 1 主要仪器 i c p o e s 等离子光谱仪：v a r i a n ，美国； 低温离心机：3 2 r ，厂家：h e t t i c h ( 德国) ； 其它仪器同第二章。 2 2 2 2 试剂 p r 氩气、p r 氮气，纯度为9 9 9 9 以上；总蛋白( t p ) 、碱性磷酸酶( u o ) 、乳 酸脱氢酶( l d h ) 、丙二醛( m d a ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 、超氧化物歧化酶 ( s o d ) 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；t i 标准，国家二级标准物质，编号： g b w ( e ) 0 8 0 6 1 4 ，购自上海市计量测试技术研究院提供；浓硝酸、h 2 0 2 均为分析纯。 2 2 3 实验动物及分组 健康雄性k m 小鼠，体重18 一2 2 9 ，购自天津医学院放射所实验动物中心，用小鼠 全价颗粒饲料喂养，自由进食与饮水。1 2 0 只小鼠随机分为1 0 组，9 个实验组，按照粒径 和浓度两个因素各设三个水平进行正交试验，粒径为5 - 4 - 1 、2 5 + 5 和1 0 0 - a ：5 n m ，浓度为 o 0 5 、0 5 和5 m g k gb w 各一组；以生理盐水作对照组，每组1 2 只。饲养条件控制在 ( 2 0 - a ：2 ) c ，相对湿度( 6 0 - j ：1 0 ) ，1 2 h 光照和黑暗循环。 2 2 4 染毒及取血方法 2 2 4 1 染毒方法 采用支气管注射一次性染毒，两小时后喂食和水，第1 4 d 用颈椎脱臼法处死小鼠。 具体染毒方法同第二章。 2 2 4 2 取血方法 用无水乙醚麻醉后，去眼球，通过眼静脉采集血样。 2 2 5 测定指标及方法 2 2 5 1 体重变化 染毒前和处死前分别进行称重。 2 2 5 2 血清生化指标 血样经3 5 0 0r p m 离心1 0m i n 后，取上清进行血清生化指标分析，t p 采用考马斯 亮兰显色法测定、a k p 采用4 氨基安替吡啉法、l d h 采用2 ，4 二硝基苯肼法、m d a 采 9 第二章纳米二氧化钛对小鼠的急性毒性效应 用硫代巴比妥酸( t b a ) 法、g h s p x 采用二硫代二硝基苯甲酸法、s o d 采用黄嘌呤氧 化酶法测定，具体步骤按照试剂盒提供的要求进行。 2 2 5 3 各脏器中钛含量的测定 每组随机取3 只小鼠，解剖取脑、肺、肾、肝和脾，称重，置锥行瓶中，加入3m l 的浓硝酸( 分析纯) 放置过夜，次日加入l m l 的h 2 0 2 。用电热板在1 8 0 。c 下消解，至溶 液为无色清亮。用2 的硝酸定容至5 m l 。用i c p o e s 测定t i 含量，采用标准曲线法 定量测定t i 含量，相关系数达到0 9 9 9 9 以上。 2 2 6 测定方法 采用s p s s l 6 0 统计学软件，各实验组和对照组之间比较用单因素方差分析。 2 3 结果与讨论 2 3 1 体重变化 表2 1 显示了小鼠染毒和处死前的体重变化情况，统计分析表明，与对照组相比， 仅5 n m 高浓度组体重显著降低( p 0 0 5 ) ，其它均不显著。这说明，本实验的染毒剂 量、粒径对小鼠体重的影响不大。 表2 1 纳米二氧化钛对小鼠体重变化的比较 注：代表与对照相比，差异显著( p 0 0 5 ) 2 3 2 小鼠血清生化指标 2 3 2 1 纳米二氧化钛对小鼠血清中t p 含量的影响 图3 1 是纳米二氧化钛对小鼠血清中t p 含量的影响。由图中可以看出，染毒剂量为 0 5 9 k gb w 时，与对照相比，三种粒径的纳米二氧化钛染毒组血清总蛋白含量均显著升 高( 尸 0 0 5 ) ；剂量为5 9 l ( g b w 时，- 与x c n 相比，5 n m - 氧化钛染毒组白蛋白含量显著 升高( p o 0 5 ) ，其它组没有明显变化。 1 0 第二章纳米= 氧化钍对小鼠的急性毒性效应 8 0 7 0 拿6 0 喾5 0 竺4 0 毫3 0 蹿2 0 1 0 凹2 - i 总蛋白含量 f i g2 - l c o m p a r i s o no f t pc o n c e n t r a t i o n i nb l o o ds l c 3 i m 口00 5 肝脏在蛋白质代谢过程中起重要作用，血浆内主要的蛋白质几乎全部由肝脏制造。 如白蛋白、脂蛋白、凝血因子和纤溶因子以及各种转运蛋白等均系肝细胞合成，当肝功 能受损时这些蛋白质便减少。y 球蛋白虽不是肝细胞合成，但肝脏功能受损时，如有炎 症时，y 一球蛋白可增多。测定血清蛋白水平，可了解肝脏对蛋白质的代谢助能。血清总 蛋白升高主要是由于肝脏有炎症时球蛋白增多所致，常见于肝硬化、慢性炎症时。血清 总蛋白含量降低则可能是由于肝脏受损，其合成蛋白的能力降低，常见于慢性肝脏炎症、 恶性肿瘤等。本实验中，中等剂量的三个实验组和高剂量5 m n 组血清t p 含量显著升高， 说明肝脏可能出现炎症。 2322 血清中a k p 含量的变化 图2 2 显示了染毒前后血清中碱性磷酸酶含量的变化情况。由图可知，与对照组相 比，5 r i m 和2 5 r i m 各个浓度的纳米二氧化钛染毒组和00 5 毋gb w l 0 0 n m 组碱性磷酸酶含 量均显著升高( p o0 5 ) ，其它组与对照相比没有明显变化。 蕊_ 一如 图2 - 2 碱性磷酸酶吉最 f i g2 - 2 c o n t e n t o f a k pc o n c e n t r a t i o n i n b l o o ds e l q l m + 组+ 霸上隧匪图貔矗隔弱点 砷蛎帅孙拓加惦仲0 0 一皇oon)扛世韬氅掣譬 第二章纳米二氧化钛对小鼠的急性霉性效应 血清中的a k p 主要来自骨骼，有成骨细胞产生，经肝胆系统进行排泄，所以当a k p 产生过多或排泄受阻时，均可使血中a k p 升高，临床上主要用于阻塞性黄疽、胆汁淤 积性肝炎、肝癌等疾病的诊断，患有这些疾病时，肝细胞过度制造a k p ，经淋巴道和胆 窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血液而引起血清a k p 明显升高。 本实验中5 n m 和2 5 n m 各组和00 5 9 k gb w1 0 0 n m 组小鼠肝部均受到不同程度的损伤。 2 32 3 血清中l d h 含量的变化 图2 - 3 显示了染毒后血清中乳酸脱氢酶含量的变化情况。由图可知，染毒剂量为 5 9 k gb w 时，与对照相比，5 n m 和2 5 n m 纳米二氧化钛染毒组血清中乳酸脱氢酶含量均 显著升高( p 00 5 ) ；除此之外其它组与对照相比没有明显变化。 ：。船盎然黧嚣。 口c o n t r o l 口00 5 日o5 l d h 是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一，广泛存在于心脏、肝脏、肺和机 体各组织中，组织一旦损伤血清l d h 即会升高。当机体的组织尤其是心和肺受到外源 颗粒物入侵后，很容易引发细胞的呼吸能力降低，出现无氧呼吸，导致l d h 升高。 w a r h e i t t g 研究组发现大鼠中期或长期吸入颜料级二氧化钍粒子后，肺泡灌洗液中都可见 l d h 的活性明显升高现象p 3 2 1 0 本实验中，通过非暴露式支气管一次性染毒方法使大 剂量的二氧化钛在小鼠肺中沉积，引起各脏器损伤，致使小鼠的肝和肺细胞的有氧呼吸 能力下降，高剂量时，5 n m 和2 5 n m 组血清中l d h 与对照组相比显著升高( p o0 5 ) ， 说明在此浓度粒径可能对小鼠肝和肺造成了严重损伤1 3 3 i 。另外，一些文献报道指出吸入 大量的粒子物质( 气溶胶或纳米颗粒) 引