（无机化学专业论文）基于新型仿生材料作为固载界面构建的生物传感器的研究.pdf

：h j j i l a j i l l l l l f l i j i r l l l ij j i j i j f j jj j j j i l l l h l l l l i j l l 1 1 4 y 18 816 3 0 目录 摘要i a b s 田r a c t 。i i i 第l 章绪论l 1 1 生物传感器1 1 1 1 生物传感器的概念和原理1 1 1 2 生物传感器的发展历程1 1 1 3 生物传感器的分类3 1 1 4 生物活性分子的固定方法3 1 2 仿生材料在生物传感器中的应用4 1 2 1 仿生材料简介4 1 2 2 仿生材料在生物传感器中的应用4 1 3 本文研究思路5 第2 章手性磷酸锆血红蛋白金电极的安培型过氧化氢传感器的研究。6 2 1 引言6 2 2 实验部分：6 2 2 1 仪器6 2 。2 2 试剂7 2 2 3h 3 p m t a 及z r p m t 的合成7 2 2 4 传感器的制备7 2 3 结果与讨论7 2 3 1z r p m t 的傅立叶红外光谱分析7 2 3 2 紫外可见光谱分析。8 2 3 3 传感器的性能8 2 4 结论11 第3 章基于肠状二氧化锡纳米簇固载血红蛋白的酶型生物传感器1 3 3 1 引言- 。l3 3 2 实验部分l3 j 伊 j ，k j 3 2 1 仪器与试剂1 3 3 2 2 二氧化锡的合成1 4 3 2 3 传感器的制备1 4 3 3 结果与讨论1 4 3 3 1s n 0 2 的x r d 、t e m 及紫外可见光谱表征1 4 3 3 2p h 值对h b - s n 0 2 a u 修饰电极性能的影响：1 4 3 3 3h b - s n 0 2 a u 修饰电极的电化学特征1 5 3 3 4 实验条件的优化1 6 3 3 5 对过氧化氢的响应性能研究。1 6 3 3 6 干扰1 7 3 3 7 传感器的重现性和稳定性l8 3 4 结论18 第4 章基于石墨烯壳聚糖复合膜的新型电流型甲胎蛋白免疫传感器1 9 4 1 引言19 4 2 实验部分19 4 2 1 仪器与试剂：j 19 4 2 2c s g s 复合膜的合成。2 0 4 2 3 修饰电极的制备2 0 4 3 结果与讨论2 0 4 3 1 复合膜的表征2 0 4 3 2 电极修饰过程的电化学表征2 1 4 3 3 免疫传感器的电化学特性2 2 4 3 4 实验条件的优化2 2 4 3 5 免疫传感器的性能2 3 4 3 6 重现性，选择性和稳定性2 3 4 4 结论2 4 参考文献。：2 5 至| 【谢3 4 作者部分相关论文题录3 5 1 睡 j ： i 西南大学硕士学位论文摘要 基于新型仿生材料作为固载界面构建的生物 传感器的研究 无机化学专业硕士研究生吴宗方 指导教师刘昌华副教授 摘要 仿生材料是基于自然界中生物的特点或特性制备的具有特殊形貌或功能的材料。在很多 方面都有着重要的应用。因其具备良好的生物相容性，能使固定的生物活性分子保持良好的 活性，在生物化学方面也有着重要的应用。 基于直接电子传递的第三代电化学生物传感器是一种先进检验技术，它有很多的优点， 如体积小、灵敏度高、响应速度快、不需要对样品进行预处理、成本低廉等。因此，在医学、 军事、环境监测及食品安全等方面都有着重要的应用。而生物传感器制备的关键就是电极表 面生物活性分子活性的保持，因此，本文中利用了新制备的仿生材料优异的生物相容性制备 了一系列的性能优良的生物传感器，本文所做的具体工作如下： 1 手性膦酸锆血红蛋白金电极的安培型过氧化氢传感器的研究 共电沉积手性膦酸锆z r ( p 0 4 ) ( n 2 p 0 4 ) o 5 0 o ( h 0 3 p c h 2 n c h 2 s c 2 h 3 c o o h ) o 5 0 1 6 h 2 0 ( z r p m t ) 、血红蛋白( i - i b ) 于金电极表面，制备了安培型过氧化氢生物传感器。制备的生物传 感器对于过氧化氢( h 2 0 2 ) 有着良好的响应，检出限为1 6 x 1 0 - 7m o ll 1 ，线性范围为5 x 1 0 7t o o l l 1 1 2 x 1 0 4m o ll 1 ，相关系数0 9 9 ( s n = 3 ) ，且该传感器有良好的稳定性和较强的抗干扰能 力。 2 基于肠状二氧化锡纳米簇固载血红蛋白的酶型生物传感器 成功制备了一种全新形貌的二氧化锡一肠状二氧化锡纳米簇并将其应用于过氧化氢生物 传感器的制备。制备的二氧化锡展现出优异的生物相容性和对血红蛋白的吸附性能。以共电 沉积法，将二氧化锡和血红蛋白沉积到金电极上制成了性能优良的过氧化氢生物传感器。该 传感器对过氧化氢的还原有着灵敏的响应，响应线性范围为l x l 0 。5m o ll - 1 到1 6 x 1 0 - 2m o l l 1 ，最低检出限为3 5 x1 0 r 6m o ll 1 ( s n = 3 ) ，相关系数为0 9 9 ( n - - 2 3 ) 。传感器的选择性和重 现性同样令人满意。 3 基于石墨烯壳聚糖复合膜的新型电流型甲胎蛋白免疫传感器 制备了一种新型的无标记型免疫传感器来检测甲胎蛋白。制备过程是首先将壳聚糖，石墨 两南大学硕士学位论文 摘要 烯复合膜滴涂于玻碳电极表面，接着吸附纳米金，最后吸附甲胎蛋白抗体。这种方法简单快 捷，制备的传感器有很好的响应、选择性及重现性，检测范围为0 o l 到2 0n gm l - 1 ，最低检 测出限为3p gm l 1 ( 3 0 ) 。线性回归方程为i ( i r a ) = o 5 6 9 + 0 9 8 4c a f p ( n gm e 1 ) ，相关系 数为0 9 9 8 ，有一定的实际应用价值。 关键词：仿生材料生物传感器电化学生物相容性 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t j1 1 1 m u d v0 nn 0 v e ld l o s e n s o r sd a s e do nn e w 1 。 - l - l - j b i o n i cm a t e r i a l sa si m m ob i l i z a t i o ni n t e r i a c e p o s t g r a d u a t em a jo r i n gi ni n o r g a n i cc h e m i s t r yw u z o n g - f a n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rl i uc h a n g - h u a a b s t r a c t b i o n i cm a t e r i a l sa r eak i n do fm a t e r i a l sb a s e do nt h ei m i t a t i o no fe h a r a c t e r i s t i e so fn a t u r a l c r e a t u r e s ，w h i c hp o s s e s ss p e c i a lm o r p h o l o g i e so rp r o p e r t i e sa n dm a n ya p p l i c a t i o n s b i o n i cm a t e r i a l s c a nk e e pt h eb i o a c t i v i t yo fb i o l o g i c a lm o l e c u l e sd u et ot h eg p o dc o m p a t i b i l i t y , a n dc o n s e q u e n t l yb e w i d e l yu s e di nb i o c h e m i s t r y t h et h i r dg e n e r a t i o nb i o s e n s o rb a s e do nd i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ri sa na d v a n c e dt e c h n o l o g y , i t p o s s e s s e sm a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha ss m a l ls i z e ，h i g hs e n s i t i v i t y , s h o r tr e s p o n s et i m e ，n on e e df o r p r e t r e a t m e n to fs a m p l e s ，a n dl o wc o s t t h e r e f o r e ，b i o s e n s o rh a sw i d ea p p l i c a t i o ni nm a n yf i e l d s ， s u c ha sm e d i c a ls c i e n c e ，m i l i t a r y , e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ga n df o o ds e c u r i t y t h ek e yt ot h e c o n s t r u c t i o no fb i o s e n s o ri st h ep r e s e r v a t i o no ft h eb i o a c t i v i t yo ft h eb i o l o g i c a lm o l e c u l e s t h e r e f o r e ， s e v e r a lk i n d so fb i o s e n s o r sw e r ef a b r i c a t e du s i n gn o v e lb i o n i cm a t e r i a l s d e t a i l sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： p a r t1a m p e r o m e t r i eh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rb a s e do ne l e c t r o - c o d e p o s i t i o no fe h i r a l z i r c o n i u mp h o s p h o n a t e h e m o g l o b i no rg o l de l e c t r o d e an e wk i n d、o fm a t e r i a l - c h i r a lz i r c o n i u m p h o s p h o n a t e ( z r ( p 0 4 ) ( h 2 p 0 4 ) o 5 0 ( h 0 3 p c h 2 n c h 2 s c 2 h 3 c o o h ) o 5 0 。1 6 h 2 0 ) ( a b b r e v i a t e d a s z r p m t ) ，w a s e m p l o y e df o rt h ec o n s t r u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r in 乙m sa b s o r p t i o ns p e c t r ad i s p l a y e d t h a th e m o g l o b i n ( i - i b ) r e t a i n e di t sn a t i v es t r u c t u r ea f t e ri n t e r a c t i o nw i t hz r p m t , s h o w i n gt h a tz r p i v l t p r o v i d e dg o o dc o m p a t i b i l i t y c y c l i cv o l t a m m e t r ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tz r p m tc o u l dg r e a t l y i m p r o v et h ee l e c t r o nt r a n s f o r m a t i o nb e t w e e nt h em o d i f i e de l e c t r o d ea n de l e c t r o l y t e t h eb i o s e m o r w a s p r e p a r e db ye l e c t r o - c o d e p o s i t i n go fz r p m ta n d li bo n t og o l de l e c t r o d e ( a u ) ，t h i sm e t h o dw a s s i m p l ea n de a s y , a n dt h eb i o s e n s o re x h i b i t e dg o o dr e s p o n s et ot h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e w i t hl i n e a rr a n g ef r o m5 x 1 0 刁m o ll 1t o1 2 x 1 0 - 4m o ll 1 ，a n dd e t e c t i o nl i m i to f1 6 x 1 0 4m o ll - 1 ， c o e f f i c i e n tc o n s t a n to fo 9 9 ( s n = 3 ) ，t h es t a b i l i t ya n ds e l e c t i v i t yw e r ea l s og o o d p a r t2e n z y m eb i o s e n s o rb a s e do nh e m o g l o b i ne n t r a p p e di ni n t e s t i n e - l i k es n o zn a n o - e l u s t e r h i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t an e wm o r p h o l o g yo fs n o z , i n t e s t i n e - l i k en a n o - c l u s t e rw a se m p l o y e df o rt h ef a b r i c a t i o no f h y d r o g e np e r o x i d e b i o s e n s o r t h ep r e p a r e ds n 0 2e x h i b i t e de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t ya n d a d s o r p t i o no fh e m o g l o b i n , a n dt h eb i o s e n s o rc o n s t r u c t e db ye l e c t r o - c o d e p o s i t i n g o fs n 0 2a n d h e m o g l o b i no ng o l de l e c t r o d ee x h i b i t e ds e n s i t i v er e s p o n s et ot h er e d u c t i o no fh y d r o g o np e r o x i d e ， a n dt h el i n e a rr a n g ew a sf r o ml x l o 5m o ll 1t o1 6 x 1 0 。2m o ll - 1w i t hc o e f f i c i e n tc o n s t a n to f 0 9 9 ( n - 2 3 ) ，a n dt h e d e t e c t l i m i tw a se s t i m a t e dt ob e3 5 x1 0 击t o o ll 1 ( s i n = 3 ) t h es e l e c t i v i t y , r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yw e r ea l s og o o d p a r t3an o v e lh b e b f r e ce l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fa - f e t o p r o t e i n b a s e do ng r a p h e n e c h i t o s a nc o m p o s i t e an o v e ll a b e l - f r e ei m m u n o s e n s o rw a sf a b r i c a t e d f o rt h ed e t e c t i o no fa - f e t o p r o t e i n t h e c o n s t r a c t i o np r o c e s so ft h ei m m u n o s e n s o rw a sf i r s t l yc a s tc h i t o s a n g r a p h e n ec o m p o s i t eo nt h e e l e c t r o d e ，a n dt h e na d s o r b e dn a n o g o l dp a r t i c l e s0 1 1t h ec o m p o s i t e ，a n df i n a l l ya d s o r b e da - f e t o p r o t e i n a n t i b o d y t h i sm e t h o di sv e r ys i m p l ea n dt h ep r o p o s e di m m u n o s e n s o rp o s s e s s e dh i i g hs e n s i t i v i t y , g o o ds e l e c t i v i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y , t h ed e t e c tr a n g ew a sf r o m0 01t o2 0n gm l - 1w i t ha d e t e c tl i m i t o f3p gm l ( 3 0 ) ，a n dt h er e g r s s i o ne q u a t i o nw a s i ( p a ) = 0 5 6 9 + 0 9 8 4c a f p ( n gm l 吐) w i t ha c o e f f i c i e n to fo 9 9 8 ，s h o w i n gp o t e n t i a l 印p l i c a t i o ni nc l i n i c a ld i a g n o s i s k e y w o r d s ：b i o n i cm a t e r i a l s ；b i o s e n s o r ；e l e c t r o c h e m i c a l ；b i o c o m p a t i b i l i t y i v 西南大学硕士学位论文第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 生物传感器 生物传感器技术是工程技术领域中非常活跃的一个研究课题，它与很多学科交 叉，如生物芯片、生物信息学、仿生学、生物控制论、生物计算机等。它是一种先 进的检测装置，是发展生物技术不可或缺的一种手段。与传统的分析方法相比，它 有很多的优点，如体积小、灵敏度高、响应速度快、不需要对样品进行预处理、成 本低廉等。因此，在医学、军事、环境监测及食品安全方面都有着重要的应用。 1 1 1 生物传感器的概念和原理 1 9 6 2 年c l a r k 提出将酶和电极组装起来检测底物【l 】的构思之后，引起了研究者 们的关注。生物传感器的概念是由国际纯粹与应用化学联合会( p a c ) 定义的， 即为：一个独立的集成器件，能通过与换能器元件保持有接触的生物性识别成分( 生 化感受器) 产生特定的分析信息【2 】。生物传感器就是一种对生物性物质较敏感，并 能将检测到的生物信号转化为声、光或电信号来进行检测的一种装置。所以，作为 生物传感器必须具备三种基本功能：分子识别、信号转换以及信号处理。首先，是 关键部分的分子识别元件( 即感受器、感应器) ，是由具备分子识别能力的生物活 性物质或某些具有识别功能的类仿生分子构成( 如酶、激素、d n a 、抗体、抗原以 及动植物组织等) ，对被测定的底物有很高的选择性；其次是信号转换元件( 指变 化器或转换器) ，一般是一个独立的化学或物理敏感元件，可以把生物反应中产生 或消耗的化学物质或光或热等转变为信号；最后是信号处理器，把所得的信号经过 处理后在仪器上显示或记录下来。其机理如f i g 1 所示： 1 1 2 生物传感器的发展历程 生物传感器从它的技术特点上可以大致分为三代： 第一代：19 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s t 3 】把葡萄糖酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶中并加以 固化，然后把这种胶体固定于隔膜氧电极之上，制成了世界上第一支葡萄糖酶电极， 即第一支生物传感器，标志着生物传感器的诞生。但是由于检测方法受到溶解氧的影 响很大，因此制成的传感器的性能较不稳定，而且灵敏度也不高。更加突出的问题 是这种传感器的工作电位一般是在较负的电位区间，所以干扰物质的干扰现象也非 常明显【4 】。鉴于以上的原因，第一代传感器的应用受到了很大的限制，但是作为一 种新的检测生物物质的手段，还是引起了不少学者的研究兴趣。 第二代：从1 9 7 0 年以后，人们开始对第一代传感器进行了改进，研究出第二代 传感器。二代传感器产生的标志性事件是1 9 8 4 年a n t h o n yc a s s 博士发表的关于电子媒 西南大学硕士学位论文第1 章绪论 介体电极的研究报告【5 】。第二代生物传感器的技术特点是将电子媒介体( 如二茂铁 等) 和酶一起固定在电极表面制成的生物传感器【6 】。媒介体的引入，大大改善了酶 和电极之间的电子传递，促进了电子传递的速率，取代了以氧做中间体进行电子传 递的第一代传感器，克服了第一代传感器在高电位下带来的影响。与第一代生物传 感器相比，第二代的传感器的分析性能也得到了很大的提高。而对于第二代生物传 感器来说，电子媒介体的选择至关重要。作为一种理想的媒介体必须具备以下条件： 1 、媒介体和酶及电极之间的电子传递速率要快。2 、有很好的生物相容性。3 、还原 性的媒介体不易和氧发生反应。4 、工作电位不能高于氧的还原电位。5 、对溶液的 p h 有较强的耐受力。常见的一些电子媒介体，如铁氰化钾、甲基蓝、二茂铁等一般 对酶都有毒性，且容易被氧化，因此会在传感器的制备过程中引发一些问题，比如 污染电极、电活性物质干扰及测量电位选择困难等。 上 千扰物质 转换器 信号处理器 分子识别信号转换信号显示、记录 f i g 1 1t h ep r i n c i p l eo fb i o s e n s o r 第三代：第三代传感器的技术特点是将生物活性物质直接固定到电极表面，令 生物分子和电极之间进行直接电子传递。与前两代传感器相比，此类传感器不需要 电子媒介，无外加毒性物质，固定程序简化很多，是目前比较理想的生物传感器。 但这种传感器也存在着一些不足之处，比如由于酶或生物活性物质的活性中心被深 埋于分子的内部，因此活性中心与电极间的直接电子传递还比较困难，而且酶或生 物活性分子与固载基质共同固定到电极之后，往往会发生失活的现象。因此选取合 适的固载基质，使生物活性分子在固定到电极表面后仍能保持其活性就成了第三代 传感器制备技术中的关键。为了克服这些存在的问题，近年来学者们探索了多种材 2 t 奢 西南大学硕七学位论文第1 章绪论 料来固定生物活性分子并使之保持原有的活性。这些材料包括：金属纳米颗粒和非 金属纳米材料p 埘、天然高分子材料 9 1 、有机导电聚合物1 0 1 、介孔材料1 1 1 、凝胶溶 胶【1 2 1 、插层复合剜1 3 】等。 1 1 3 生物传感器的分类 从不同的角度分类，可以将生物传感器分为不同的种类，目前主要的分类方法有 以下几种： 1 、按照感受器中所使用的生物活性物质进行分类，可以分为酶传感器【1 4 1 、免疫 传感器f 1 5 】、d n a 传感器【1 6 1 、微生物传感器【1 刀及组织传感器【1 8 1 。其中，酶传感器是用 生物敏感材料做检测基元，通过与检测目标物质作用后产生可检测信号来实现对目 标物质的检测。免疫传感器是利用抗原与抗体之间特异性的免疫化学反应原理制成。 d n a 传感器是利用d n a 核苷酸序列的配对原理制成。微生物及组织传感器是通过将 生物敏感元件固定于电极表面，利用对特定物质的感应能力产生可检测信号为原理 制成。 2 、根据传感器输出信号的不同，又可以分为亲和型和催化型。亲和型传感器是 利用所固定的生物活性物质对检测底物的亲和或键合作用来进行检测。催化型生物 传感器利用了生物性催化剂的专一性或底物对它的抑制作用，引起信号相应的变化 来对底物进行检测。 3 、根据信号转化器的不同可以分为测光型生物传感器【1 9 1 、压电生物传感器 2 0 1 、 电化学生物传感器【2 1 1 、测热型生物传感器四等。 1 1 4 生物活性分子的固定方法 生物活性物质的固定是传感器制备过程中最重要的环节之一。目前所采用的固 定方法主要有：吸附法、共价键连法、包埋法以及交联法等。 吸附法，指的是利用固载基质的吸附能力、分子间范德华力、或静电吸附力等 将基质和生物活性物质固定于电极的方法。例如，m a n l ig u o 瞄】等人用层层自组装技 术( l b l ) ，将胆固醇氧化酶固定于碳纳米管上，进而制成了性能优良的胆固醇传 感器。 共价键联法是利用基质与被固定的活性物质间的共价键作用，而将活性物质固 定于电极表面的方法。例如，可以利用固定材料的氨基与酶结构中的羧基之间的共 价键作用来固定酶分子等。 包埋法是指将生物活性物质包裹于基质中( 基质一般为溶胶一凝胶类或具有空 间网状结构的物质) 从而固定于电极的方法。例如，p e n a - v a z q u e ze 【冽等人将微藻纤 维组织包埋于硅酸盐溶胶凝胶中制成了检测农用除草剂的生物传感器。 3 西南大学硕士学位论文第1 章绪论 交联法是指用交联剂( 如戊二醛) 将活性分子固定于电极表面的方法。例如， a b h i j i t h ，k s 2 s 】等人用戊二醛交联酪氨酸酶到电极表面，从而构建了用于检测茶多 酚的生物传感器。 另外，还有一种方法是电化学固定方法，包括电化学聚合和电化学沉积法。其 中，电化学聚合法是指在电解液中加入聚合物单体或者将聚合物单体与生物活性物 质一起加入到底液中，在恒电位或恒电流下进行氧化还原反应，就会在电极表面形 成聚合物膜，而生物活性物质由于静电作用或吸附作用被同时固定到电极表面。这 种方法相对简单，聚合物和活性物质的量可以通过聚合的时间来控制。此外，这种 方法还有一个好处就是能较好地避免活性物质的泄露。因此近些年来有不少学者应 用这种方法制备了性能优良的生物传感器，例如t o n g 等人在2 0 0 7 年利用此方法将 辣根过氧化酶固定在金电极表面1 2 6 j 。 电化学沉积的方法是利用被沉积底物在进行电化学氧化还原时在沉积底液中的 溶解度减小，进而在电极表面形成难溶性薄膜的性质来固定活性物质的方法。这种 方法在电极表面形成的膜受到p h 的影响较小，且对于要固定的生物分子有很好的包 裹作用，有效避免了外泄。目前电沉积主要应用于金属及其氧化物的沉积。有研究 者应用这种方法来沉积纳米金属，如将纳米金、纳米铂等制成生物传感器。 1 2 仿生材料在生物传感器中的应用 1 2 1 仿生材料简介 仿生材料学是源于生物材料学的一个新兴研究领域，是生物学、物理学、材料 学等学科的交x t 2 7 1 。它是用生物材料的观点来设计人工材料，并以实现特定生物功 能为目的来设计与制备的，涵盖了很多热点科学问题，如材料与生物体的相容性； 能量、物质和信息的传输和交换；材料与生物体复合体系的阶层结构与功能构建； 转基因植物与材料制备等。广义地讲，仿生材料是指模仿自然界中各种生物的特点 或特性而研制的材料。一般把模仿生命系统运行方式和生物材料所体现的结构规律 而研制的人工材料称作仿生材料。仿生材料在诸多方面都有应用，比如用仿生材料 制成骨骼材料来制成股骨头的仿生替代品，又如模仿荷花的自洁效应制成的仿生涂 料可以防尘、防油等。 1 2 2 仿生材料在生物传感器中的应用 对于生物传感器的制备来讲，就是模仿生物活性分子在体内的催化环境来达到 与之相似的效果。因此，传感器的构建实际上就是一个仿生环境创建的过程，在这 个过程中用到的固载生物活性分子的材料就可以被称为仿生材料。而这种仿生材料 在传感器上的应用主要体现在纳米仿生材料上。纳米仿生材料主要是指具有优良生 4 西南大学硕十学位论文 第1 章绪论 物相容性的纳米材料。纳米材料是尺寸在1 l o o n m 的材料，这种材料具有很多的优 点，比如小尺寸效应、表面界面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等性质， 因此在催化、半导体、医学等诸多领域都有着应用 2 8 1 。纳米材料也被广泛应用于传 感器的制备，比如俞汝勤 2 9 1 等人用纳米金将辣根过氧化物酶固定于碳瓷电极表面， 制成了性能优良的过氧化氢生物传感器。 利用纳米材料的小尺寸效应可以将生物活性物质很好地吸附并固定于电极表 面，并很好地起到电子传递的作用，而本身良好的生物相容性使固定于电极表面的 生物活性分子保持着良好的活性。因此，以纳米仿生材料制备而成的传感器具有良 好的性能，并能克服生物活性物质在电极表面失活、电子传递效率不高等问题。 1 3 本文研究思路 本文对不同纳米仿生材料的制备、在生物传感器中的应用、固定的效果以及被固 定的生物分子的活性保持方面做了以下研究： 1 为了研究手性纳米仿生材料在传感器上的应用，以无机磷酸锆为基本材料，l _ 半胱氨酸为手性源制备了手性膦酸锆，并将其应用于酶型传感器的制备。以手性 膦酸锆作为固载基质的传感器，酶在电极表面保持了良好的活性，制备的传感器 对过氧化氢的催化还原也有着良好的响应。 2 为了克服生物活性分子的失活以及固定方法的复杂问题，制备了一种新形貌的二 氧化锡纳米材料。这种二氧化锡有着肠形的簇状结构，以这种形貌的二氧化锡作 为固载基质，采用共电沉积的方法制备了电化学过氧化氢传感器。这种方法简单 快捷，并且很好地保持了酶本身的活性，所制得的传感器对过氧化氢的还原也有 ，着优良的响应。 3 为了研究纳米仿生材料与其它材料复合后的性能，制备了石墨烯壳聚糖复合膜 材料，并将其应用于甲胎蛋白免疫传感器的制备。所制备的复合材料很好地融合 了两种材料的优点，显示出了优良的导电性能和生物相容性，很好地保持了甲胎 蛋白抗原的活性，制备出的免疫传感器也有着优良的检测性能。 5 西南大学硕士学位论文第2 章手性磷酸锆血红蛋白，金电极的安培犁过氧化氢传感器的研究 第2 章手性膦酸锆血红蛋白金电极的安培型过氧化氢传感 器的研究 2 1 引言 当前，基于蛋白或酶与电极间直接电子传递的第三代生物传感器具有潜在应用。 同时，对于蛋白或酶的直接电子传递的研究也可为生物系统中酶的电子交换机理提 供模型p o 。3 1 1 ，引起研究者们的关注【3 2 4 2 】。尽管蛋白或酶的电子传递在生物系统中比 较快，但由于电活性中心被深埋，所以在电极表面的传递速度却很慢。为了能有效 地保持酶在电极上的活性并使酶在电极表面能有较快的电子传递速率，许多研究者 对一些固酶材料和固定方法进行了尝试和探索【4 3 却】，但这些方法往往会引起蛋白或 酶在电极表面的变性及不利取向。而在众多的修饰方法中，电沉积法是相对简单便 捷的技术，对于酶的损伤较小，在电极表面的吸附也很强【4 剐。 手性材料因其独特的性能而被广泛研究，并应用于生物系统、药物制备 4 9 j 、手 性识别5 0 1 、手性分离剐及分子印记【5 2 】等诸多领域。磷酸锆是一种层状多功能材料， 具备优异的质子交换能力，高热稳定性，酸碱稳定性【5 3 巧6 】。因为磷酸锆的诸多优点， 近年来对于手性膦酸锆的研究也被广泛关注。手性膦酸锆不仅具有磷酸锆的性质， 还体现出一些光学及吸波性能，并有在生物化学方面应用的潜力【57 1 。 l 半胱氨酸是一种含巯基的氨基酸，在很多方面都有应用，如蛋白合成，解毒 代谢等【5 引。拥有良好的生物相容性，能为酶提供较好的固定环境，并已广泛应用于 生物传感器领域。另外，它本身还是一种天然的手性分子，在手性合成方面也有应 用，可当做手性源。 基于手性磷酸锆在生物化学方面的应用潜力及l 半胱氨酸的固酶能力和良好 的生物相容性优点，首先以l 半胱氨酸为手性源合成了手性膦酸，再以共沉淀法合 成了手性膦酸锆( z m t ) 。用z r p m t 作为固酶基质，采用共电沉积的方法将其与 h b 沉积到金电极表面制备了过氧化氢生物传感器。此方法简单快捷，克服了酶在电 极表面的泄露问题，并很好地保持了酶的活性，所制备的修饰电极对过氧化氢的分 解具有良好的催化效果，展示出较低的检测限和宽检测范围，以及良好的选择性和 稳定性。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器 电化学表征使用的是c h i6 0 4 c 型电化学工作站( 上海晨华仪器有限公司) 三电 极工作系统，其中修饰电极作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为 6 西南大学硕士学位论文 第2 章手性磷酸锆血红蛋白，金电极的安培型过氧化氢传感器的研究 对电极。所有实验均在室温下进行。紫外可见吸收光谱使用的是u v - 2 2 0 5 型紫外可 见分光光度计( 日本东京岛津公司) 。傅立叶变换红外光谱使用的是n i e o l e t1 7 0 s x 型 红外仪( 美国密尔沃基麦迪逊公司) 。 2 2 2 试剂 血红蛋白( 耗牛血) 从s i g m a 公司购得。l 半胱氨酸和氧氯化锆从成都科龙化学 试剂公司购得。过氧化氢溶液h 2 0 2 ( 3 0 ，w v ) 从上海金鹿化工有限公司获得。其 他试剂均为分析纯。0 1m o ll - l 的不同p h 值的磷酸缓冲溶液是通过混合储存的标准 n a 2 h p 0 4 和n a h 2 p 0 4 溶液，用n a o h 和h 3 p 0 4 调制而成。全部溶液均用二次蒸馏水配 制。 2 2 3h 3 p m t a 及z r p m t 的合成 目标产物的前驱体手性n 膦酰甲基1 ，3 噻唑烷4 羰基酸( h 3 p m t a ) ，按文献制 备【5 7 1 。具体方法如下：将1 0m m o ll 半胱氨酸、1 1m m o l 甲醇溶液( 质量分数为3 6 ) 和1 0m l1 0t o o ll 1 的盐酸溶液混合后于室温下放置2 4 d x 时。接着将1 0 m l 盐酸 ( 6 0 m ) 和1 1m m o l 亚磷酸的混合溶液加入到上述溶液中，再将4 0m m o l 的甲醇溶液 ( 质量分数3 6 ) 逐滴加入其中。最后，回流5 分钟。产品用冷冻干燥法获得。 z r p m t 的制备是将0 1 7gh 3 p m t a 和0 2 5g * t 氯化锆分别加入到5m l - - 次蒸馏水 中，配置成溶液。将氧氯化锆溶液逐滴加入到h 3 p m t a 溶液中，有白色絮状物生成。 将溶液置于真空烘箱中7 0 0 c 干燥后即得。 2 2 4 传感器的制备 ， 金盘电极( 直径4m m ) ，首先在抛光板上以0 3i x r n 和0 0 5l x m 的氧化铝粉打磨至 镜面，接下来分别在水和乙醇中各超声5 分钟。再在0 5m o ll - 1n 2 s 0 4 溶液中于- 0 3v 至+ 1 5v 进行循环伏安扫描，直到得到稳定的循环伏安曲线。 1m l 的h b 溶液( 3m gm l 。1 ) 中加入3m gz r p m t ，超声2 分钟。h b z r p m t a u 电极 的制备是通过将金电极在上述溶液中于1 0 至1 2v 电位范围，扫描速度1 5 0m vs - i 循 环伏安扫描3 0 圈获得的。接着用二次蒸馏水冲洗修饰电极，除去物理吸附的h b 。最 后，将电极置于冰箱中4 0 c 保存备用。 2 3 结果与讨论 2 3 1z r p m t 的傅立叶红外光谱分析 f i g 2 1 为z r p m t 的红外光谱图，在3 0 0 0c m d 左右的峰属于c s 键的伸缩振动峰， 而在2 5 0 0c m 1 归属于l 半胱氨酸的s h 键的峰已经消失。这就说明手性结构已经形成 【5 7 1 。在6 5 0c m 1 的强峰属于z r - o z r 键的特征峰，这就说明了锆已被连接到了手性磷 7 西南大学硕士学位论文第2 章手性磷酸锆血红蛋白金电极的安培型过氧化氢传感器的研究 酸分子上。由以上信息判断，手性膦酸锆成功合成。 2 3 2 紫外一可见光谱分析 紫外- 可见吸收光谱是一种监测蛋白可能的构象改变的有效工具。f i g 2 2 显示了 ( a ) f i b 和( b ) h b z r p m t 的紫外可见光谱。从图中我们可以看到，血红蛋白本身的特 征峰在4 0 5a m 处，当z r p m t 与血红蛋白结合后吸收峰移动到了4 0 3n m ，但这样小的 变化并不会影响血红蛋白的活性。说明z r p m t 具有良好的生物相容性。 嚣 叠 暑 一 薯 警 是 扣 w a v e l e n g t h ( t u n ) f i g 2 1l r r i rs p e c t r ao fz r p m tf i g 2 2u v - v i ss p e c t r ao f ( a ) h b ，( b ) h b z r p m t 2 3 3 传感器的性能 2 3 3 1 检测电位的影响 检测电位的选取对于修饰电极的电流响应有着很大的影响。如果选择的电位过 高，那么检测的