（蔬菜学专业论文）茄子青枯病抗性鉴定和抗性基因的rapd标记研究.pdf

摘要 茄子青枯病( b a c t e r i a lw i l to fe g g p l a n t ) 是由r a l s t o n i as o a n a c e a l u m c o m b n o v 引起的世界性的细菌性土传病害在我国，发病地区主要集中在长江流 域。由于传统的抗病育种存在诸多弊端，而依靠现代生物学手段、通过分子标记 辅助育种来培育优良品种就成为防治该病的有效手段。 目前，茄子抗青枯病的研究步伐落后于同科蔬菜番茄、马铃薯等。为了探讨 茄子抗青枯病的遗传机制，加速茄子抗青枯病育种进程，本研究以感病品种北京 六叶茄纯系0 6 4 、马来西亚抗病半栽培种s ，及0 6 4 x s ，f ：代为材料，采用温室苗 期人工接种鉴定方法，对r 代植株进行了抗病性遗传分析，并利用群分法( b s a ) ， 借助r a p d 技术，对s 。的抗病基因进行了标记，取得了以下结果： l 、对0 6 4 、s ，以及0 6 4 x s 。r 代分离群体1 3 9 株植株进行了温室苗期人工 接种鉴定，结果表明，鉴定方法以伤根灌注法较为适宜：抗病亲本材料s 。的抗病 性由一对显性基因控制。 2 、对所提取的茄子幼叶总d n a 的质量及纯度的检测结果显示，c r a b 法更适 宜于茄子幼叶的d n a 提取。 3 、首次采用正交设计( l 。( 4 5 ) ) 对茄子p c r 条件进行了优化，优化体系为： ( 1 ) 反应体系：每一反应总体积为2 5 u i ，由1 0 xb u f f e r 2 5 u l ，t a q 酶( 2 u u 1 ) 0 5 u l ，d n t p ( 1 0 m m ) 0 6 2 5 u l ，引物( 0 4 u m ) l u l ，模板d n a ( 2 0 n g u 1 ) 2 u l ，m 9 2 + ( 2 5 m m ) 2 5 u l ，灭菌去离子水1 6 1 7 5 u l 组成。( 2 ) 扩增程序：9 4 c 预变性4 m i n ， 然后9 2 c 变性4 5 s ，3 6 退火3 0 s ，7 2 延伸7 5 s ，3 8 个循环，最后7 2 延伸 j s ，4 保存备用。 4 、以0 6 4 、s ，及其f 。代群体1 3 9 株植株为材料，利用群分法( b s a ) 进行抗 青枯病基因定位，通过3 0 0 个随机引物的p c r 扩增分析，发现1 5 6 的引物在双 亲问表现出多态性，找到了一个与茄子抗青枯病亲本s ，中的抗病基因紧密连锁的 分子标记$ 2 6 4 。( 该引物的碱基序列为c a g a a g c g g a ) ，该标记与s 。的抗病基因的交 换值为4 3 2 ，遗传距离为4 3 3 c m 。 关键词 茄子：抗病育种；苗期人工接种：抗青桔病基因：r a p d 标记 a b s t r a c t b a c t e r i a lw i l t ( b w ) o fe g g p l a n t c a u s e d b y 肋s t o n i a s o a a c e a r u m c o m b n o v i so n eo ft h em o s td e s t r u c t i v ed i s e a s e ss p r e a d i n gb ys o i li nt h e w o r l d t h i sb a c t e r i a ld i s e a s ei sp r e v a l e n to v e rt h ec h a n g j i a n gr e g i o ni n c b i n a d u e i n g t ot h e d i s a d v a n t a g e s o ft r a d i t i o n a l b r e e d i n g m e t h o d s m a r k e r a s s i s t e ds e l e c t i o nw o u l db ep a r t i c u l a r l ye f f e c t i v ef o r o u l t i v a t i n gn e ws p e c i e s t h a th a v ee f f e c t i v ea n d p o t e n t i a l l y s t a b l e r e s i s t a n c et ot h i sd i s e a s e b a s i cr e s e a r c h e so fr e s i s t a n c et ob wi n e g g p l a n tf a rl a gb e h i n dt h e s eo fr e s i s t a n c et ob w i ns a n l ef a m i l yv e g e t a b l e s s u c ha st o m a t oa n dp o t a t o i no r d e rt op r o b et h eg e n e t i cr e s i s t a n c ei a w t ob wi ne g g p l a n ta n dq u i c k e nt h eb r e e d i n go fr e s i s t a n c et ob w 。t h eg e n e t i c s t u d i e so nr e s i s t a n c et ob wa n dm o l e c u l a rm a p p i n go ft h er e s i s t a n c eg e n e w e r ec a r r i e do u t i nt h i ss t u d y ，a r t i f i c i a li n o c u l a t i o no ns e e d l i n gi ng r e e n h o u s e ，r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) a n db s a ( b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ) w e r eu s e dt o i d e n t i f yr e g i o n sa s s o c i a t e d w i t hr e s i s t a n c ei nd i p o i d e g g p l a n to nt h ef 2s e g r e g a t i n gg e n e r a t e df r o maf a m o u sh i g h l yr e s i s t a n t h a l f c u l t i v a t e ds p e c i es 3o fm a l a y s i a t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sh a db e e n d r a w n ： 1 a m o n g t h et h r e em e a s u r e so fd o r m a n c y b r e a k i n ga n dp r o m o t i n g s e e d i n g ，t h ee f f e c to fs o a k i n gs e e dw i t hg 凡( 1 0 0 m g l ) w a st h eb e s t 2 o b s e r v a t i o ni nr e s i s t a n c e t ob w o f 0 6 4 ( b e i j i n g s i x l e a f e g g p l a n t ) ，sa n d0 6 4 s 3f la n df 2p o p u l a t i o n so nt h eb a s i so fa r t i f i c i a l i n o c u l a t i o no ns e e d l i n gi ng r e e n h o u s es h o w e dt h a tt h em e t h o d o fr o o t c u t i n o c u l a t i o nw a sb e t t e ra n dt h er e s i s t a n c eg e n eo fs 3w a sc o n t r o l l e db y as i n g l ed o m i n a n tg e n e 3 f o rt h em e t h o d so fe g g p l a n t ( i m a t u r el e a f ) d n ae x t r a c t i o n ，t h ec t a b m e t h o dw a sb e t t e ra n dh a db e t t e rq u a l i t ya n dh i g h e rp u r i t y 4 l 1 6 ( 4 5 ) d e s i g nw a su s e dt oo p t i m i z et h er a p dp r o g r a mi ne g g p l a n t f o rt h ef i r s tt i m e t h eo p t i m i z a t i o nr a p dp r o g r a mi ne g g p l a n tw a s ：( 1 ) t o t a l g e n o m i cd n ao fe g g p l a n t ( 4 0 n g ) w a sa m p l i f i e d i n2 5u lr e a c t i o n v o l u m e se a c hc o n t a i n i n g1 0 b u f f e r 2 5 u 1 t a qp l o y r a s e ( 2 u u 1 ) 0 5 u l d n t p ( 1 0 u m ) 0 6 2 5 u l ，p r i m e r ( 0 4 u m ) l u l ，m g + ( 2 5 u m ) 2 5 u l ，p u r ew a t e r1 6 1 7 5 u i ( 2 ) p c rp r o g r a m ：9 4 cp r e d e n a t u r a t i o nf o r4 m i n ，9 2 cd e n a t u r a t i o nf o r 4 5 s ，3 6 a n n e a l i n gf o r3 0 s ，7 2 p r o l o n gf o r7 5 s ，3 8c i r c l e s ，7 2 p r o l o n gf o r5 s ，4 c f o re v e r 5 0 6 4 ，s 3a n drp o p u l a t i o no f0 6 4 xs 3c o n t a i n i n g1 3 9i n d i v i u a lp l a n t s w e r eu s e df o rm o l e c u l a r m a p p i n go ft h er e s i s t a n c eg e n eb yb u l k e ds e g r e g a n t a n a l y s i s 3 0 0d e c a m e rp r i m e r sw i t ha r b i t r a r ys e q u e n c e sw e r e c h o s e nf o r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na m p l i c a t i o n i tw a sf o u n dt h a tt h ep o l y m o r p h i s m b e t w e e nt h ep a r e n t sc o u l db ed e t e c t e db y1 5 6 o ft h ep r i m e ra n do n er a p d m a r k e r $ 2 6 4 7 ( t h es e q u e n c eo ft h ep r i m e r ：c a g a a g c g g a ) w a st i g h t l y1 i n k e d t ot h er e s i s t a n c eg e n eo fs 3w i t ht h eo v e r c r o s sv a l u eo f4 3 2 a n dg e n e t i c d i s t a n c eo f4 3 3c m k e y w o r d s e g g p l a n t ( s o l a r i u mm e l o n g e n al ) ：r e s i s t a n c eb r e e d i n g a r t i f i c i a li n o c u l a t i o no n s e e d l i n g ：r e s i s t a n c eg e n e t o b a c t e r i a lw i1t ：r a p dm a r k e r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 号牢w 时间： 如多年多月玎日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：j 牵式 时间： 如3 年月玎日 聊躲狮乙干 时间：伽) 年6 月砭如 缩略词表 b wb a c t e r i a lw i l t青枯病菌 c t a b c e t y l t r i m e t h y l - a m m o n i u m b r o m i d e 十二烷基三甲溴化铵 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 d n ad e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯吡咯烷酮 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r a p dr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a随机扩增多态性d n a b s ab u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s混合组群法( 群分法) s c a r s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f l e dr e g i o n 序列特异性扩增区域 r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片断长度多态性 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 c mc e n t i m o r g a n s 厘摩 f wf r e s hw e i g h t鲜重 gg r a m 克 g a 3 g i b b e r l l i n 3 赤霉素 m a sm a r k e r a s s i s t e ds e l e c t i o n分子标记辅助育种 文献综述 茄子( s o l a n u m m e o n e e n al ) 起源于印度北部【l l ，广泛分布于世界各地， 我国为次生分布中心，有一千多年的栽培历史。由青枯病菌( r a l s c o n i a s o a n a c e a ，l l mc o m b n o v ) 引起的茄子青枯病，在热带和亚热带地区己成为 影响茄子高产的主要障碍i “。各国科学家对青枯病菌以及茄子抗青枯病育种方 面作了深入的研究由于传统的抗病育种以表型选择为基础，杂种后代的抗病 筛选比较复杂，不但费时费力，抗性结果易受环境和生育期的影响，而且同时 难以对多个抗性基因进行筛选，严重地阻碍了抗病基因特别是数量抗病基因在 抗病育种中的应用，而采用现代生物学手段选育优良品种是防治该病经济有效 的手段。近年来迅速发展起来的包括r a p d 在内的分子标记技术，为抗病育种 提供了重要的辅助工具。现将有关进展综述如下： l 茄子青枯病研究进展 1 1 青枯病生理小种与菌系 细菌性青枯病最早报道于1 8 6 4 年。青枯病菌可侵染5 0 多个科的数百种植 物( 尤其是茄科植物) ，茄子青枯病是由青枯拉尔斯东菌( r a l s t o n i a s o l a n a c e a l - u m ) 侵染的一种细菌性土传病害l 。目前国际上公认青枯病菌有两 个亚分类，一是按不同来源菌株对不同种类植物的致病性差异，将青枯菌划分 为l 号小种、2 号小种、3 号小种和4 号小种；二是根据菌株对3 种双糖( 麦 芽糖、乳糖和纤维二糖) 和3 种已醇( 甘露醇、山梨醇和卫矛醇) 氧化产酸能 力的差异，将青枯菌划分为生化变种l 、生化变种2 、生化变种3 和生化变种 4 。通过大量菌株比较试验，证明l 号小种包含生化变种1 、3 和4 ，2 号小种 包含生化变种l 和3 ，3 号小种包含生化交种2 ，4 号小种包含生化变种4 。 通过对国内不同地区和不同植物上的大量研究，确认我国存在l 号小种( 包括 生化变种3 和4 ) 和3 号小种( 包括生化变种2 ) ，后者是危害马铃薯的优势小 种，而前者寄主范围非常广泛，可侵染茄科植物和其他植物。对茄子有致病性 的病原菌主要是l 号小种，l 号小种中不同寄主和不同来源的菌株在寄主范围 和致病性上还存在较大的差异，可将其分为3 7 个菌系，其中大部分的菌系对 茄子表现出强致病性”! 。 1 2 茄子青枯病诊断和检测方法 1 2 1 青桔病的诊断 般根据植株感病症状来诊断。茄子青枯病一般在进入开花期或座果初期 后显露症状，发病初期个别枝条的叶片或一张叶片的局部出现萎垂，后扩展到 整株枝条上。初呈淡绿色，随后变褐枯焦，病叶脱落或残留在枝条上。病株茎 表面没有明显症状，但将茎部纵剖则木质部呈褐色。这种变色从根颈部起可以 一直延伸到上面枝条的木质部。用手挤压病株茎的剖面，可见乳白色菌脓溢出 6 1 。 1 2 2 青桔病菌的检测 1 2 2 1 青枯病菌的菌种保存 青枯菌菌系分化复杂，从事各方面研究均需特定的菌株，而青桔菌在 保存过程中很易发生致病性变异而失去致病力门。故研究青枯菌的保存方 法以保持各菌株的固有特性是一项重要工作。有人曾提出将青枯菌在水中 常温2 0o c 条件下保存较好【5 1 。张长龄等8 i 利用1 0 年时间研究了3 种保藏方 法：安培管菌悬液保藏；斜面菌苔灌无菌水；斜面菌苔灌石蜡；保藏温度 分别为2 0 0 恒温、室温1 5 2 5 c 。试验结果表明：冰箱保藏青枯菌可存活 半年至一年；试管斜面灌水、灌蜡经l o 年保藏后仍存活：虽然突变型菌增 多，但仍有野生型菌落，灌蜡比灌水好。同时，该试验表明，正在试验用 的菌株不宜多次移植，某些菌株可在试管斜面上置冰箱短期保存，斜面灌 水、灌石蜡保藏亦可。若无冷冻干燥条件青枯菌在指形管水中保存较为方 便，以恒温2 0 c 最佳，无恒温条件的可在1 5 2 5 c 范围内室温贮藏。 1 2 2 2 青枯病菌的检测 检测青枯病菌的方法很多，如选择性培养基、生物测定技术、血清学 技术以及e l i s a ( 酶联免疫吸附法) 等。病原细菌在培养基上能生成氨， 不能产生吲哚，并能还原硝酸盐；不能产生酸，可以产生气体。病原菌在 1 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露酵等任何一种碳源中培养( 温度2 9 ，经7 2 小时后) ，生长特别好；在柠檬酸钠或甘油中次之：在醋酸钾或 淀粉中生长不好；硝酸钾等最差n 1 2 2 3 青桔病菌的接种 作物进行苗期青桔病抗性鉴定时主要采用3 种方法进行接种：针刺叶 脉法( 离体或不离体) 、浸根法和灌根法( 土壤中) ，后两者又分伤根和不 伤根处理。 1 2 2 4 茄子抗病性鉴定 接种后1 5 天按w i n s t e a d 和k e l m a n ( 1 9 5 2 ) 9 1 的分级标准进行抗病性鉴 定。分级标准为：o = 不发病；i = 1 片叶感病；2 = 2 或3 片叶感病；3 = 除顶端 2 3 片叶外其余叶片均感病；4 = 所有叶片感病：5 = 檀株完全死亡。病情指 数计算公式为：d i = 1 0 0 ( 病级该病级株数) ( 病级调查株数) ；植 株发病率：发病株数总株数1 0 0 。抗病划分标准为：抗病( r ) 病情指数 d i 4 0 。植物学性状观察项目主要有：植株长势、茎色、 果形、果色、结果类型、果柄刺等。 1 3 发病因素与传播途径 1 3 1 病菌越冬存活 病菌随病残体在土壤中越冬，翌年通过雨水、灌溉水及昆虫传播，至 今没有证据表明病原菌可以通过种子进行传播。有研究表明，小种l 号大 都是本地习居菌，土壤质地、水势、酸碱度、土壤含水量及有机质均可影 响病原菌的存活，且病原蘑在砂壤土中的存活期比在粘壤土中更长f 6 i 。 1 3 2 发病因素 青枯病是南方露地栽培和春季塑料大棚早茄子生产中的毁灭性病害。 田间调查表明，高温高湿、土壤连作带菌是茄子青枯病发生的重要条件， 尤其初夏大雨后骤晴，排水不畅以及钾肥不足利于病害流行。适于发病和 蔓延的土壤温度为2 0 2 5 c ，气温为3 0 3 5 c ，空气相对湿度为9 5 1 0 0 i ”i 。 1 3 3 桥梁寄圭( a i t e r n a t i v eh o s t s ) 在感病寄主缺乏的情况下，青枯菌可以侵入许多杂草和非寄主植物的 根部得以存活。这些杂草和非寄主植物就成了病原菌的桥梁寄主p t ，如茄 科、旋花科、天南星科、厝形科、菊科的部分植物等，它们作为病原菌的 庇护所而使病原菌度过不良的环境条件，这样就大大延长了病原菌在土壤 中的存活期，使得用短期轮作的方式防治青枯病难以奏效。 1 4 茄子青枯病的防治 14 1 栽培措施 3 14 1 1 轮作 青枯病菌的寄主范围较广，我国已报道的寄主有：番茄、辣椒、茄子、 烟草、甘薯、花生等2 0 多种作物。不少地区的种植经验表明，若采取与非 寄主作物轮作，特别是与禾本科如水稻进行水旱轮作，则可以大大降低土 壤中青枯菌的数量，因此也是防治青枯病较好的方法之一。轮作间隔期的 长短却因不同地区、不同作物而不同，一般需3 年以上的轮作。另外，在 栽培上注意科学管理，增施磷钾肥，避免偏施氮肥；进行蔚垄种植；建立 畅通的排灌系统，严防串灌、漫灌和渍涝；调节土壤酸碱度；清除田间病 残体、铲除田间杂草：降低田间湿度、及时防治害虫、采用嫁接法、培育 壮苗等对防治茄子青枯病也很有成效。至于药剂防治，其方法是进入座果 期或发现病株后用可杀得可湿性粉剂5 0 0 倍液或7 2 农用链霉素可湿性粉 剂4 0 0 0 倍液灌根，每7 1 0 天1 次，连续3 5 次m1 1 1 。 1 4 1 2 调节播种期 茄子青枯病属高温型病害，通常气温在3 0 3 7 c 时最有利于病害发 生；土壤温度也影响青桔菌存活，土壤温度低于2 0 c ，病害发生少，随着 温度升高，病害发生加重。因此，通过调节茄子的播种期，避过高温季节， 避开青枯病发病高峰，可以大大减轻青枯病的发生。 1 4 2 培育抗病品种 防治茄子膏枯病最根本的方法是培育抗病品种。目前，人们已成功地 利用不同的育种方法选育出抗性较强而稳定的品种，且已在生产上推广应 用。a s a o h 等将青枯病产生的导致萎焉的物质，加入形成茄子愈伤组织 或原生质体的培莽基中，经离体培养获得了茄子抗病植株。美国g o t h r w 等通过杂交育种和系统选育的方法获得了p 1 3 8 6 2 4 5 的自交后代抗病材料。 s a k a t a a y 通过研究获得0 8 3 9 抗性砧木f 1 2 】。s h e e l ak b 1 1 3 1 通过系内选择和 单株选择，获得了对青枯病有免疫力的s 一l 和对青桔菌有高抗性的 a n n a m a l a i 。a n o g 等利用野生材料作抗源，筛选出s a m 抗病品系。我国研 究人员在1 9 9 8 年对1 0 5 份茄子资源材料进行鉴定筛选，得到了抗青枯病材 料2 4 份，其中有t 6 份材料表现高度抗病i 。 另外，s a n k a r m 等对混合选择法、单株选择法、家系内选择法以及 单子传代法4 种选育法提高茄子青枯病抗性的效果进行比较，证明单子传 4 代法可有效地提高茄子抗病性。 1 4 3 生物防治 目前对生物防治研究得较多的是青枯菌本身的无毒突变体和多粘芽孢 菌( b u c i l l u sp o l y m y x a ) 和荧光假单胞杆菌( p s e u d e m o n a sf j u o r e s c e n s ) 等 4 6 j 。无毒突变体即无致病力青枯菌，这些无毒突变体可产生细菌素 ( b a c t e r i c i n ) 。细菌素是一种蛋白质或核酸抑菌物质，可对同种或近缘种 的细菌的不同菌株产生特异性的拮抗作用【1 6 1 7 l 。 不少人用产生的细菌素无毒突变菌株在温室防治番茄青枯病。康耀卫 等 1 8 1 采用转座子t n 5 诱变植物青枯菌胞外蛋白输出缺失突变体( 简称e e p ) ， 该突变体在缺失了许多胞外蛋白( 包括植物细胞壁降解酶、果胶酶和纤维 素酶类) 外输功能后，也失去了对寄主的致病力。该e e p 突变体a m 具有较 高的寄主亲和力，这为生物防治研究提供了较好的微生物资源。魏春妹等1 9 l 研究出了拮抗青枯菌9 0 b 。菌株模拟生产的发酵工艺。研究表明，该菌株 能够在植物体内繁殖，并有催芽、壮芽以及防治番茄、烟草青枯病的作用， 且防治效果达8 0 左右，增产效果达l o 左右20 1 。另外，链霉素、菌根 真菌、基因工程生防菌以及转基因植物工程等在番茄、马铃薯、烟草等作 物上研究颇多【7 一”。目前还没有以上这些方法应用于防治茄子青枯病的试 验研究报道。 1 5问题与建议 1 5 1 存在的主要问题 生物防治茄子青枯病的研究与报道较少；至今仍来构建出茄予青枯病 的抗性遗传模型，从而造成育种工作的被动性与盲目性，并使抗病育种年 限延长。另外，远缘杂交不亲和或杂种不育以及杂交后代幼苗生长势弱等 问题，使耐病或抗病砧木的应用存在一定的困难。生物技术辅助育种也还 未深入地应用于茄子青枯病的抗性育种工作中。 i 5 2 建议 在今后茄子抗青枯病育种中，应加强对抗性机制的研究，同时将生物 防治技术结合起来，以期取得较好的成效。 同时，可通过广泛搜集国内外抗病种质资源，借助各种育种手段，培 育茄子抗青枯病新品种。应充分利用筛选获得的抗病资源，借助常规育种、 杂种一代优势育种以及诱变育种等手段，创造茄子抗病突变体。采用体细 胞杂交、利用基因工程技术等手段获得抗病品种和转基因植株也是一条可 行的途径。如茄科作物的马铃薯抗青桔病植株是先从某些昆虫( 如天蚕、 家蚕、柞蚕、果蝇等) 体液免疫系统中分离出抗菌肽( 天蚕素、溶菌酶等) 等基因，然后将之导入马铃薯而获得的。通过马铃薯青枯病抗性转育的试 验，从筛选的几份抗青枯病的二倍体和四倍体基因型杂交后代中选育出了 抗性基因型。从遗传方式看，青枯病抗性是一数量性状，把具有较高抗性 同时产生2 n 花粉的二倍体基因型与不同倍性的母本杂交，如4 x 一2 x 和 2 x 一2 x ，再与常规的4 x - 4 x 杂交后代比较，认为转育青枯病抗性以4 x - 2 x 杂交方式更有效2 2 瑚1 。 另外，采用分子标记辅助等先进技术进行抗青枯病遗传分析和抗性鉴 定，以尽快弄清茄子青枯病抗性遗传规律，建立准确的抗病遗传模型，用以 指导育种实践。一些用传统育种方法难以进行选择的性状，可以用分子标 记技术进行有效的选择。这是因为，利用分子标记可将控制某一数量性状 的多个基因分割开来，转变为单基因形式，并进而分析各基因的单个效应 及其互作效应，这为利用分子标记对数量性状进行选择和最终对其进行遗 传操作提供了可能。目前，分子标记辅助的抗病育种，在番茄、马铃薯等 茄科作物上己得到应用【1 l t 2 卜2 5 1 。许多抗性基因的分子标记、克隆、基因产 物分析已获得成功。在茄子育种上，可通过分子标记技术对茄子青枯病的 抗性基因进行分子标记和定位，并对抗病基因进行有效转移和组合，这样 便可大大加速茄子抗青枯病育种进程。 2 r a p d 分子标记在蔬菜育种上的应用 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，随机扩增多态性d n a ) 是 w “l i a m s 和w e l s h 两个研究小组同时创建的一种运用随机引物扩增基因组 寻找多态性d n a 片段作为分子标记的新技术2 6 1 2 7 i 。r a p d 技术建立在p c r ( p o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 技术基础之上，它是利用一系列不同的寡 聚核苷酸为引物，对所研究的基因组d n a 进行p c r 扩增，扩增产物通过p a g e 或琼脂糖凝胶电泳分离，经e b 染色或放射自显影来检测扩增产物d n a 片段 的多态性。这些扩增产物d n a 片段的多态性反映了基因组相应区域的d n a 多 态性。由于r a p d 分子标记技术具有操作简单、快速、高效等优点，这一技 术己得到广泛应用。在蔬菜育种方面，r a p d 分子标记主要应用于以下几个方 面。 2 1 构建遗传图谱 遗传图谱可以为育种工作者提供关于某个物种的完整而又详细的基本 资料，易于对目的基因进行定位，并发现与该基因紧密连锁的分子标记，从 而使育种工作目的性更强，有效性更高。传统的形态标记和生化标记，由于 标记数量少，不能全面反映生物基因组的信息，局限性很大；同时由于这些 标记是基因表达产物，易受各种环境因素的影响，可靠性不高。r f l p 技术出 现后，这项工作才取得很大进展。但由于r f l p 技术要求高、费用大，较难 普遍推广。r a p d 技术不仅具有操作简单、费用低等特点，且产生的多态性丰 富，大量的r a p d 位点既可以使原有的根据形态学性状构建的遗传图谱或根 据r f l p 构建的遗传图谱变得更加饱和，加大定位基因的密度，也可以单独 构建连锁图。 目前已有番茄、马铃薯、辣椒、莴苣、甘蓝、胡萝h 、芥菜、豌豆、 黄瓜、白菜、芹菜、西瓜等约2 0 种蔬菜构建了遗传图谱，其中番茄、马铃 薯、甘蓝等蔬菜作物的图谱已趋于饱和。张鲁刚等【2 8 以芜菁和结球白菜杂 交的f 2 群体为试材，用8 4 个1 0 核苷酸随机引物，构建了白菜r a p d 遗传 图谱。该图谱覆盖基因组的1 6 3 2 4 c m ，标记间的平均间隔为1 6 5 e m ，其中 最长的连锁群为2 6 7 5 c m ，最短的连锁群为6 2 5 c m 。陈书霞等8 9 1 以芥蓝c 。 x 甘蓝秋。为杂交组合，利用3 0 0 个随机引物对两亲本进行r a p d 检测， 以f 2 作图群体为基础，构建了甘蓝的基本遗传图谱。该图谱由9 个主要的 7 连锁图构成，覆盖基因总长度约为5 5 5 7 c m 。t o s h i h a r uh a s h i z u m e 等1 3 0 】 用6 9 个r a p d 、1 个r f l p 、1 个同工酶和3 个形态学标记共同来构建西瓜 ( “ u u sl a n a t u s ) 的连锁图谱。该图谱覆盖了6 2 个位点，共5 2 4 c m ， 并发现外果皮颜色与2 个r a p d 标记紧相连，间距为5 c m ；果肉颜色与1 个 r a p d 标记相邻，间距为3 0 c m 。 2 2 种质资源遗传亲缘关系研究 种质资源遗传亲缘关系研究是蔬菜育种工作的重要组成部分，它可以 为亲本选配提供依据，并有效地预测杂种优势。同时一些原始品种或野生 品种以及一些异源品种中存在的某些优良性状对蔬菜品种的改良有着巨大 的潜力，因此，确定不同品种间的亲缘关系及其在进化上的地位，并有选 择的利用它们来改良蔬菜作物具有重要意义。r a p d 技术从o n h 分子水平反 映了基因组的多态性，更能准确揭示个体间的差异程度，判断品种间亲缘 关系的远近，通过测量品种之间的遗传距离，进行系谱分析和分类研究。 曲士松等p u 以2 0 份不同抱球方式的大白菜品种资源为材料，用2 个随 机引物进行了r a p d 分析。结果表明：“个品种具有明显的多态性差异。 叠抱类型的大白菜品种间的相似系数在2 6 4 5 8 3 2 3 9 5 之间，平均为 2 9 4 2 6 ；拧抱类型的大白菜品种间的相似系数在1 7 3 2 l 4 9 3 0 8 之间，平 均为3 0 2 0 4 ；合抱类型的大白菜品种间的相似系数在l 7 3 2 1 3 0 0 0 0 之 间，平均为2 3 6 6 0 。这些差异与不同白菜品种的来源地及定向培育有关。 研究结果对白菜远缘杂交育种具有一定的参考价值。封林林等1 3 2 l 利用r a p d 分析了3 5 个茄子品种的亲缘关系，发现供试的3 5 份材料大体分为4 个主 要类群。赵凌侠等1 3 3 l 用2 6 条随机引物对番茄属9 个种的1 3 份材料进行了 r a p d 分析，共检测到1 9 9 个位点，其中多态位点1 4 6 个，依此进行聚类分 析将番茄属分为4 个类群：遗传多样性均有野生类群大于普通类群的趋势， 说明野生类群中存在着更为丰富的有利于番茄遗传改良的变异类型。栾非 时等f 3 4 i 收集了我国4 3 个菜豆栽培品种，从r a p d 标记上进行了研究，结果 表明：蔓生种群分为五大类；矮生种群分为二大类；半野生种群分为二大 类，为我国菜豆种质资源的保存及培育优良品种工作提供了一定的理论依 据。 贾建航等【3 5 根据r a p d 结果将4 类紫菜的1 5 个无性系聚类为3 个类群， 此聚类结果与分类地位基本相符。张海英等1 3 6 i 用2 0 个l o 碱基引物r a p d ， 对多个生态型的黄瓜材料的遗传亲缘关系进行了聚类分析，将实验材料分为 3 个类型：华北类型、华南类型和欧洲温室类型，从而验证了传统的黄瓜地 域分类标准及黄瓜是遗传基础狭窄的蔬菜作物的论述。乔爱民等p 利用1 9 个有效引物扩增的2 4 0 条r a p d 标记带，建立了中国菜用芥菜1 6 个变种d n a 分子系统树图，并对芥菜遗传多样性的分子基础进行了探讨。陈文炳等f 3 8 j 利用r a p d 技术对魔芋属内野生种和栽培种共2 0 份材料进行基因组d n a 多态 性分析，划分为栽培种和野生种两个类群。其中，两份甜魔芋材料间没有差 异；花魔芋种内系统间差异最小；两个栽培种花魔芋和甜魔芋间亲缘关系最 近：栽培种与野生种间亲缘关系都较远。刘万勃等【3 9 l 利用r a p d 和i s s r 两种 分子标记技术对3 7 份甜瓜种质进行了遗传多样性研究，通过u p g 姒聚类分 析，将供试材料分为两大类群：野生甜瓜和栽培甜瓜，栽培甜瓜又分为厚皮 甜瓜和薄皮甜瓜两大亚群，各野生甜瓜种之间的遗传距离较大，这与其分类 地位基本一致。 2 3 品种( 杂种) 纯度鉴定 蔬菜品种的可靠性鉴定，对于推广优良品种、保护育种者和种植者的 权益都有重要意义。r a p d 分子标记可以在苗期对蔬菜品种及杂种纯度进行 快速、准确的鉴定。陈云鹏等l 柏i 运用5 个引物扩增的l o 条r a p d 特征带作 为组d n a 指纹，可区分所有供试7 个大白菜品种。庄木等认为利用r a p d 标记可在室内对甘蓝一代杂种进行快速、准确的纯度检验。宋洪元等1 4 2 l 利 用r a p d 标记对1 7 个结球甘蓝品种进行了分析发现利用其中4 个引物在1 7 个品种间所扩增出的多态性标记可将全部品种鉴别。栾雨时等”3 l 找到了能 用于鉴定番茄杂种l 柏：、k 纯度的r a p d 引物o p k l 4 。高蓝等【删找到了可用 于毛粉8 0 8 、毛粉8 1 8 和强选一号3 个番茄一代杂种纯度鉴定的r a p d 引物 s 。、s 。和s 。，其中s 1 3 。, 可用于区分3 个品种的父本和子代。李成伟等( 4 5 j 用r a p d 标记对辣椒种子的父本、母本及杂种一代进行分析研究，探讨了 r a p d 标记在蔬菜种子纯度鉴定中应用的可行性。黄三文等l 删筛选出了1 2 个稳定的r a p d 标记，可用于“中椒”系列辣椒的9 个杂交种的纯度鉴定。 刘富中等4 7 悃r a p d 技术建立了快速鉴定3 个甜瓜杂交种( 中密l 号、中密 2 号、中密3 号) 纯度的技术体系，并构建了其特有指纹图谱，为甜瓜品 种保护和杂交制种中纯度和真实性的快速准确鉴定提供了技术保证。 2 4 基因定位及分子标记辅助育种 传统的形态标记受环境影响较大，且数量十分有限，投入的人力、物 力非常大，却往往取得事倍功半的效果。因为有些性状( 如与果实、种子、 产量或品质等有关的性状) 早期无法看出来，有些性状( 如抗病基因的筛 选) 要进行接种甚至大田种植方可知晓。如果能够找到某一或某些重要性 状基因( 如抗性基因) 的连锁位点，就可以实现早期鉴定，大大加速异源 目标基因的转移与利用。 r a p d 技术是利用随机引物对整个基因组d n a 进行多态性分析，能在一 次反应中检测基因组的多个位点，因而可快速检测出两组d n a 样品间的多 态性差异，得到与差异区域连锁的d n a 标记，因此，利用r a p d 可定位某一 特定d n a 区域的特定基因。 分子标记辅助育种主要用于抗病和雄性不育育种中。首先，需找到与 目标性状连锁的分子标记，研究与目标性状连锁的分子标记的方法有3 种： 近等基因系法( n e a ri s o g e n i cl i n e s ，n i l ) 、分离群体分组分析法( b u l k e d s e g r e g a n ta n a l y s i s ，b s a ) 和作图法【艚1 。n i l 是通过多次回交筛选与目的 基因连锁的分子标记，这种方法用于除目标性状位点不同外，其余基因位 点都基本相同的品系。b s a 是将f 2 分离群体根据其表型分为两组，一组具 目标基因的性状( 如抗病) ，另一组不表现目标基因性状( 如感病) 。从每 一组中各随机选择一定数目单株，分别等量混合d n a ，形成两个类似近等 基因系遗传组成的d n a 库，进行库间多态性差异分析，并进一步对分离群 体的单株进行d n a 扩增，验证多态性是否真正与目标性状基因连锁，这种 方法在应用中越来越普遍。作图法是根据已有的连锁图进行标记，一旦发 现目标基因定位于某一染色体上，就可选择分散在该染色体上不同位点的 标记逐渐逼近，很快可以找到与目标基因紧密连锁的标记，这种方法往往 是目标基因图谱克隆的前奏1 。 现已通过r a p d 标记鉴定出一个甘薯根结线虫连锁抗性基因 ”l 和甘薯 f u s a l i u m a t e r f t f u m 基因 5 0 o 曾大兴等l 应用r a p d 技术鉴定了蔬菜上 的弯孢类炭疽菌。曹必好等l 咒采用r a p d 和b s a 法，找到了与红叶芥菜红叶 基因连锁的分子标记。许勇等 ”l 采用r a p d 和b s a 分析法，在西瓜上定位了 一个与耐冷基因连锁的分子标记o p g 。其遗传距离为6 9 8 c m ，为进一 步开展西瓜耐冷性育种分子标记辅助选择和耐冷基因克隆打下了基础。许 勇等1 5 4 】还采用r a p d 和b s a 分析法，进行西瓜野生种质资源p i 。抗枯萎病 基因连锁的分子标记研究，找到了一个与枯萎病连锁的分子标记 o p p o l 7 0 0 ，其遗传距离为3 o c m 。m i c h e l m o r e 5 5 1 用莴苣绵疫病抗性基因 d m 5 8 有分离的f 2 群体为材料，找出3 个多态性标记与d m 5 8 抗性基因连 锁。p a r a n l 5 6 i 用r a p d 技术定位了莴苣霜霉病抗性基因。邹继军俐运用b s a 法筛选到3 个与大豆灰斑病抗性基因连锁的r a p d 标记，其中引物o p s 0 3 扩 增片段0 p s 0 3 6 2 0 与抗病基因的遗传距离为8 7 c m 王晓武等p 剐利用r a p d 技术分析了青花菜与显性雄性不育甘蓝的回交 群体，获得了一个与显性雄性不育基因连锁的标记，并对这个标记在甘蓝 自交系中的多态性进行了初步分析。盖树鹏等【5 9 1 筛选出了可用于大葱胞质 雄性不育基因分子标记辅助育种，并能在所有供试材料中区分两种胞质的 r a p d 引物$ 2 0 0 2 o o 。 2 5 问题及展望 r a p d 分子标记具有其独特的优点，然而也存在其自身的缺陷【6 。其一， r a