（环境工程专业论文）镍及其螯合物对甲烷发酵的影响及机理研究.pdf

生物可利用性，使得产甲烷菌提高了抵抗硫化物毒性的能力，从而在与硫酸盐还原菌的 竞争中更占优势。但当硫酸盐浓度达到5 0 0 0m g l 时，产甲烷过程被严重抑制，n t a 的 添加并未对产甲烷过程起到促进作用，同时，硫酸盐还原过程也受到抑制。 ( 4 ) 为了解n t a 在连续运行的反应器系统中的施用效应及影响机理，论文研究了 向连续运行的槽式搅拌反应器( c s t r ) 系统中添加n t a 后反应器的运行效果、反应器 系统中微量元素n i 的形态变化、辅因子f 4 3 0 、c o m 浓度与污泥产甲烷活性的关系，并 运用荧光原位杂交( f i s h ) 技术解析了产甲烷菌群的变化。结果表明：在有机负荷为 3 9 l d 、进水c o d 为4 5 0 0m g l 的条件下，c o d 去除率提高近2 0 ，产气量提高近6 0 。 n t a 的添加改变了n i 在污泥中的存在形态，镍的硫化物形态浓度由6 2p g g t s s 降低到 2 9p g g t s s ，而剩余态的浓度则增加了1 8 9 倍。所以n t a 提高了产甲烷菌对微量元素 镍的生物吸取，镍的牛物有效度得到提高。荧光原位杂交( f i s h ) 结果表明：n t a 还 影响着微生物的种群结构，在n t a 添加系统中，利用底物能力强的甲烷八叠球菌的生 长得到促进。f 4 3 0 、辅酶m 含量与污泥的产甲烷活性具有较好的相关性。添加n t a 的 反应器系统中f 4 3 0 与辅酶m 含量分别比未添加系统提高4 5 和2 8 倍。 ( 5 ) 微量元素的牛物吸收与生物亲和力常数a 和牛物转化率b 有关。n t a 促进了产 甲烷菌对微量元素镍的生物吸收，牛物吸收过程不符合自由离子活度模型，微生物对微 量金属元素的吸收并不完全由自由态的金属浓度决定，微量元素螯合物的形成对产甲烷 菌的生物吸收有着重要作用。 关键词：厌氧消化；甲烷；硫化物；镍；牛物可利用性；乙酸；螯合剂；氨三乙酸 a b s t r a e t a b s t r a c t b i o g a sp r o j e c te m p l o y i n ga n a e r o b i cd i g e s t i o na n da i m i n ga tw a s t er e s o u r c eu t i l i z a t i o n i sn o wb e c o m i n gt h em o s te f f e c t i v ea n dp r o m i s i n gt e c h n i q u eu s e df o r t h et r e a t m e n to fu r b a n w a s t e ，i n d u s t r i a lw a s t e w a t e r , p o u l t r ye x c r e t a , a n de x c e s ss l u d g ef r o mw a s t e w a t e rp l a n t t r a c e e l e m e n t sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nm e t h a n ef e r m e n t a t i o na n dl a c ko fe v e nas i n g l ee l e m e n t c o u l dl e a dt ot h ea c t i v i t yd e c r e a s eo fm i c r o o r g a n i s m s t h e r e f o r e ，t h et r e a t m e n te f f i c i e n c ya n d p r o c e s ss t a b l i t yo ft h ea n a e r o b i cr e a c t o rs h o u l db ei n f l u e n c e dg r e a t l y s u l f i d e s ，c a r b o n a t e ，a n d p h o s p h a t ea r ca l w a y sp r e s e n ti n i n d u s t r i a lw a s t e w a t e r , u r b a ns l u d g e ，o rt h e i rt r e a t m e n t p r o c e s s e s b e c a u s et h et r a c em e t a l sc a ne a s i l yp r e c i p i t a t ew i t hs u l f i d e sa n do t h e ra n i o n ，t h e y a l s ow i l ln o te x i s ti na d e q u a t ea m o u n ta n de f f e c t i v eb i o l o g i c a l f o r mi nt h ea c t u a la n a e r o b i c d i g e s t e r s t h em a x i m a ls u b s t r a t ec o n v e r s i o nr a t em a yn o tb ea t t a i n e d f o c u s i n go nn i c k e la s r e s e a r c ho b j e c t ，t h eb i o a v a i l a b i l i t yo ft r a c em e t a l sw a si n c r e a s e db yt h ea d d i t i o no fm e t a li o n c h e l a t o r st ot h ea n a e r o b i cr e a c t o r si nt h i ss t u d y t h en u t r i e n tc o n d i t i o nf o rm e t h a n o g e n sw a s o p t i m i z e da n dm e t h a n ef e r m e n t a t i o nw a se n h a n c e dg r e a t l yt h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) t h ei m p o r t a n c eo ft r a c em e t a ln i c k e li nm e t h a n ef e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e d n i c k e ls h o w e d “h o r m e s i s ”e f f e c to nm e t h a n ef e r m e n t a t i o n t h a tw a s ，n i c k e la tt r a c ed o s a g e c o u l ds t i m u l a t ea n a e r o b i cd i g e s t i o n ，w h i l eh i g hd o s a g em a yc a u s ei n h i b i t i o n m e t h a n e p r o d u c t i o ni n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gn i c k e lc o n c e n t r a t i o ni nd e f i n i t ed o s a g er a n g e t h e p r e s e n c eo fs u l f i d e sm a d eal o to fn i c k e ld o s a g e s n i c k e ls p e c i a t i o ni nr e a c t o r sc h a n g e d b e c a u s eo ft h ec o m p l e x a t i o nb e t w e e nn i c k e la n dc h e l a t o r s t h ef o r m a t i o no fs o l u b l e c o m p l e x e sb e t w e e nn i c k e la n dc h e l a t o r sf a v o r e dt h ed i s s o l u t i o no fn i c k e lf r o mt h e i rs u l f i d e s ， a n dn i c k e lw o u l dn o tb et h el i m i t i n gf a c t o ri nm e t h a n ef e r m e n t a t i o n c r i t r i ca c i d ( c a ) ， n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d ( n t a ) ，a n de t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ( e d t a ) w e r ca l s op r e f e r a b l e s t i m u l a n t sf o ra n a e r o b i cd i g e s t i o n a tas o d i u ma c e t a t ec o n c e n t r a t i o no f7g l ，t e m p e r a t u r eo f 3 5 ，a n dn i 什c o n c e n t r a t i o no f2 0 儿m ，m e t h a n ep r o d u c t i o nw a se n h a n c e d3 4 1 ，4 9 2 ， a n d3 8 6 ，b yt h ea d d i t i o no f10p mc a ，n t a a n de d t a ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e dt os t u d yt h ee f f e c t so fd i f f e r e n t s u b s t r a t e ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n s ， i n i t i a lp ha n da m m o n i an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n so n m e t h a n ef e r m e n t a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn t as t i m u l a t e dm e t h a n ep r o d u c t i o nw h e n a c e t a t e ，p r o p i o n a t e ，b u t y r a t ew a su s e da ss u b s t r a t er e s p e c t i v e l y t h es t i m u l a n te f f e c tw a s r e l a t e dt ot h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a sm o r eh i g h ，t h es t i m u l a n t e f f e c tw a sm o r eo b v i o u s w h e ns o d i u ma c e t a t ec o n c e n t r a t i o nw a s6 ，12g l ，m e t h a n e p r o d u c t i o nw a si n c r e a s e db y3 0 0 、9 5 9 ，r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o ls y s t e m t h ek i n e t i cc o n s t a n tv 眦a n dt h eh a l fs a t u r a t i o nc o n s t a n tk si nm i c h a e l i s m e n t ee q u a t i o n w e r ei m p r o v e df r o m8 4 8m lc h 4 g v s s d 一1a n d2 9 5g n a a c l t o14 7 1m lc h 4 g v s s 。 i i i a b s t r a c t 1 d a n d7 5 7 9n a a e 。l i t h ea p p l i c a t i o no fn t aw a sr e l a t e dt ot h ei n i t i a lp h w h e nt h e i n i t i a lp hw a s5 5 ，6 0 ，n t ad i dn o ts h o wa n ys t i m u l a n te f f e c to nm e t h a n ef e r m e n t a t i o n b u t t h em e t h a n ep r o d u c t i o nw a si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya tp ho v e r6 5 a m m o n i an i t r o g e na t c o n c e n t r a t i o no f0 4g lw a sa d v a n t a g e o u sf o rm e t h a n ef e r m e n t a t i o na n dm e t h a n ep r o d u c t i o n w a se n h a n c e d2 0 a m m o n i an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o na t2 0e e lb e g a nt os h o wi n h i b i t i o n e f f e c to nm e t h a n ef e r m e n t a t i o n t h ei n h i b i t i o ne f f e c tw a sm a i n l yp r e s e n ti nt h el a t t e rp e r i o d o fa n a e r o b i cd i g e s t i o n w h e na m m o n i an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o nw a sa b o v e2 g l ，t h e m e t h a n o g e n i ca c t i v i t yo ft h eb i o m a s sd e c r e a s e dg r e a t l ya n dt h ei n h i b i t i o np r e v a i l e di nt h e e n t i r ea n a e r o b i cd i g e s t i o np r o c e s s a ta m m o n i an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o no f5 g l ，t h e m e t h a n o g e n i ca c t i v i t yo f t h eb i o m a s sd e c r e a s e db y5 0 n i c k e lh a da n t a g o n i s t i ce f f e c to nt h e a m m o n i an i t r o g e nt o x i c i t y t h ei n h i b i t i o ne f f e c tc a u s e db yt h ea m m o n i an i t r o g e nm a yb e a l l e v i a t e do re l i m i n a t e db yt h ea d d i t i o no fn i c k e l t h i si n d i c a t e dt h ea c q u i s i t i o no ft r a c em e t a l w a sv e r yi m p o r t a n tf o rm p bt oi n c r e a s et h e i r t o x i cs u b s t a n c e b u tn t ad i dn o ts h o wa n y n i t r o g e nc o n t a i n i n gw a s t e w a t e r s a b i l i t yf o rr e s i s t a n c et h ed e l e t e r i o u se f f e c to f e f f e c to nm e t h a n ef e r m e n t a t i o no fa m m o n i a ( 3 ) d u r i n gb a t c hm e t h a n ef e r m e n t a t i o no fs u l f a t e - c o n t a i n i n gw a s t e w a t e r s ，t h ee f f e c to f n t ao ns u l f a t er e d u c t i o na n dm e t h a n ep r o d u c t i o nw a ss t u d i e di nd e t a i l s 、e ns u l f a t e c o n c e n t r a t i o nw a sb e l o w5 0 0 0m g l ，m e t h a n e ) ，i e l dw a se n h a n c e db y1 1 9 抖1 a n d s u l f a t er e d u c t i o nw a sd e c r e a s e db y3 3 v 旷7 6 i nt h ep r e s e n c eo f10 0 1 a mn t a t h e b i o a v a i l a b i l i t yo ft r a c em e t a lf o rm e t h a r ep r o d u c t i o nb a c t e r i a ( m p b lw a si n c r e a s e da n dm p b m a yt h e r e f o r eb e c o m em o r er e s i s t a n tt ot h et o x i c i t yp r o d u c e db ys u l f i d e s m p bt h e ns h o u l d p r e d o m i n a t eo v e rs u l f a t er e d u c t i o nb a c t e r i a ( s r b ) i nt h ea n a e r o b i cr e a c t o r s 。讳协e l ls u l f a t e c o n c e n t r a t i o na t t a i n e d5 0 0 0m g l ，m e t h a n ef e r m e n t a t i o nw a si n h i b i t e ds e v e r e l y t h ep r e s e n c e o fn t ad i dn o ti n c r e a s em e t h a n ep r o d u c t i o na n dt h es u l f a t er e d u c t i o nw a sa l s oi n h i b i t e d ( 4 ) i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h eo p e r a t i o ns t a t u sa f t e rt h ea p p l i c a i t i o no fn t at ot h e c o n t i n u o u so p e r a t i o nr e a c t o r s ，t h et r e a t m e n te f f i c i e n c y ，t h et r a c em e t a ln i c k e ls p e c i a t i o n c h a n g e si na n a e r o b i cs l u d g ew i t ht i m e ，a n dt h er e l a t i o nb e t w e e nc o f a c t o r sf 4 3 0 ，c o m c o n c e n t r a t i o na n dm e t h a n o g e n i ca c t i v i t yw e r es t u d i e di nac o n t i n u o u ss t i r r e dr e a c t o r ( c s t r ) t h em e t h a n o g e np o p u l a t i o nc h a n g e sw e r ea l s oa n a l y s e db yu s eo ff l u o r e s c e n c ei ns i t u h y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) t h er e s u l t ss h o w e dc o dr e m o v a le f f i c i e n c yw a se n h a n c e db y2 0 a n d t h em e t h a n ep r o d u c t i o nr a t ew a si n c r e a s e db y6 0 b yt h ea p p l i c a t i o no f10l a mn t a t ot h e i n f l u e n ta ta no r g a n i cl o a dr a t eo f3g l da n di n f l u e n tc o dc o n c e n t r a t i o no f4 5 0 0m e t e n i c k e ls p e c i a t i o nd i s t r i b u t i o ni na n a e r o b i cs l u d g ec h a n g e dw i t hn t aa d d i t i o n t h es u l f i d e f r a c t i o no fn i c k e ld e c r e a s e df r o m6 2t o2 9p g g t s sa n dt h er e s i d u a l f r a c t i o ni n c r e a s e d1 8 9 f o l d s n t ab o o s t e dt h ei n t e r n a l i z a t i o no f n if o rm p b ，h e n c et h eb i o a v a i l a b i l i t yo fn i c k e lw a s g r e a t l yi m p r o v e d f i s h r e s u l t si n d i c a t e dn t ac o u l ds t i m u l a t et h e g r o w t h o f m e t h a n o s a r c i n a c e a ew h i c hu t i l i z es u b s t r a t ef a s t e rt h a nm e t h a n o s a e t a c e a e t h e r ew a sa i v a b s t r a c t p o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nf 4 3 0 ，c o e n z y m em ( c o m ) c o n c e n t r a t i o na n dm e t h a n o g e n i c a c t i v i t yo ft h eb i o m a s s f 4 3 0a n dc o mc o n t e n ti n c r e a s e d4 5a n d2 8f o l d si nt h en t a a m e n d e dr e a c t o r ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o ls y s t e m ( 5 ) t h eu p t a k eo ft r a c em e t a li sr e l a t e dt ot h eb i o a f f i n i t yc o n s t a n taa n db i o c o n v e r s i o n c a p a c i t yc o n s t a n tb n t as t i m u l a t e dt h eu p t a k eo fn i c k e lf o rm p b t h eu p t a k ep r o c e s sd i d n o tc o n f o r mt of r e ei o na c t i v i t ym o d e l ( f i a m ) t h eu p t a k eo ft r a c em e t a lw a sn o ts i m p l y d e t e r m i n e db yt h ef r e ei o nc o n c e n t r a t i o ni nr e a c t o r n ef o r m a t i o no fm e t a lc o m p l e x e sm a y p l a ya l li m p o r t a n tr o l ef o rt h eu p t a k eo f m e t a l sb ym p b k e y w o r d s ：a n a e r o b i cd i g e s t i o n ；m e t h a n e ；s u l f i d e s ；n i c k e l ；b i o a v a i l a b i l i t y ；a c e t a t e ；c h e l a t i n g a g e n t ；n t a v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 嘲丧是日期：驯，夕少 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 日期：m 罗，罗 第。章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 面对世界性的能源危机和严峻的环境形势，我国乃至世界范围都在大力提倡和推广 节能高效的废物综合利用、污染治理等生产项目。开发利用新的可再生能源已势在必行。 以甲烷、乙醇、氢气为代表的生物质能源由于热值高、不产生二次污染一直受到各国重 视。作为一种重要的可再牛能源，以厌氧消化为核心技术、以废弃物资源化为目的沼气 工程已成为处理、利用城市垃圾、工业有机废水、畜禽粪便和污水厂剩余污泥最有效、 前景最广阔的手段之一。在七十年代，我国曾经进行过沼气推广应用，但后来由于运行不 稳定，冬季产气少等原因在许多地区沼气未能得到普遍的利用。甲烷是一种很好的气态 燃料，其热值达3 9 3 0 0 k j m 3 ，l m 3 含6 5 的甲烷的沼气相当于0 6 m 3 的天然气，1 3 7 5 m 3 的城市煤气、0 7 6 k g 原煤、6 4 k w h 电。目前甲烷化厌氧处理工艺已经广泛应用于城市 污水处理厂剩余污泥以及市政固体废弃物的处置。甲烷发酵工艺也普遍应用于高浓度工 业废水的处理，但尚未得到充分应用。据估算，城市污水处理厂采用好氧二级处理工艺， 其污泥厌氧处理所产生的甲烷足够满足污水厂运行所需要的能量i z j 。因此甲烷发酵厌氧 处理技术把污染物去除和能源回收相结合，成本低廉，正成为世界各国争相研究和开发 的热门技术。深入研究甲烷发酵的促进技术、促进机理从而提高产气量及甲烷浓度对于 提高废弃物资源化利用率，大力推广沼气工程具有重要意义。 1 2 产甲烷研究进展 厌氧消化是极为复杂的牛物过程，在参与反应的众多微牛物中，产甲烷菌的优劣 和密度是影响厌氧消化效率和甲烷产量的重要因素，因此对产甲烷菌特征以及影响因子 的研究成为重点。产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧消化转化成甲烷和二氧 化碳的古细菌，它是严格厌氧菌，属于水生古细菌门( e u r y a r c h a e o t a ) 。它们生活在各 种自然环境下，如反刍动物的瘤胃、人类的消化系统、稻田、湖泊或海底沉积物、热油 层和盐池，以及污泥消化和沼气反应器等人为环境中【3 】。产甲烷菌是厌氧消化过程的最 后一个成员，甲烷的生物合成是自然界碳素循环的关键链条。1 9 7 4 年b r y a n tm p 首次提 出了产甲烷菌( m e t h a n o g e n ) 一词，将其与以甲烷为能源的嗜甲烷菌( m e t h a n o t r o p h s ) 区分开来。到目前为止，分离鉴定的产甲烷菌已经有2 0 0 多种。它们分布在3 个纲的5 个目中【4 】o 目前发现的甲烷生物合成过程有3 种途径1 5 j ，如图1 1 所示。第1 种途径以乙酸为 原料，进行裂解生成甲烷，第2 种为以氢气和二氧化碳为原料的甲烷牛物合成，第3 种 江南大学博上学位论文 1 2 1 甲烷的生物合成途径及其形成过程的酶学 a c e 妙上s c 。a 2 h + + 2 e + c 0 2 眦。广 - - - * c 邺二 2 h + + 2 e 一h 2 ( 甲酰基甲基呋喃b ) ( 甲酰基八叠喋呤) c h + - - h s p t ( 次甲基八叠喋呤) p 一h z h z c h ，= h s p t ( 甲基八叠喋呤) p 一。h z h z 一3 叫弋呷斟懵喋呤 m ) + 一h 2 c h 4 图1 1 甲烷生物合成的三种途径 f i g 1 - lt h et h r e er o u t e sf o rm e t h a n ef o r m a t i o n 是以甲基化合物为原料的生物合成。如甲醇、甲基胺、甲基硫等。但无论哪种途径，最 终都形成甲基辅酶m ，甲基辅酶m 在甲基辅酶m 还原酶( m c r ) 的催化下最终形成甲 烷6 1 ( 如图1 2 ) 。其中乙酸为底物的甲烷合成占自然界甲烷合成的6 0 以上，以氢气和 二氧化碳为底物的甲烷合成占3 0 以上。 _ m y l _ a 翻棚叩舶- ( 甲基辅酶m )m 矾h 蚺 h c 声f 翻 帅咏一啄 ( 辅酶b ) c a 哪m ba g o - 舶洲c o _ 每s 瑚 图1 - 2 甲基辅酶还原酶催化的甲烷形成 f i g 1 2m e t h a n ef o r m a t i o nc a t a l y z e db ym e t h y l - c o e n z y m e - r e d u c t a s e ( m c r ) 2 吨r | 羹 唯 卜 第一章绪论 同其他微生物一样，产甲烷菌的一切生命活动都离不开酶，没有酶的存在，其生 命活动就不能进行。微生物对环境中营养物质的吸收，以及在体内的利用都必须有酶的 参与。图1 1 所示的产甲烷代谢途径中包含了两类重要的辅酶1 7 j ：1 ) 作为甲基载体的辅 酶，2 ) 作为电子载体的辅酶。目前还没有人提出普遍适用于各类基质产甲烷过程的电 子传递链的模型。其原因可能是利用不同基质的产甲烷菌的电子传递链是不同的( 电子 供体和电子受体均不同) 。对利用上述几种基质产甲烷途径而言，多数产甲烷途径需要 氢化酶催化电子供体还原电子受体，然后还原态的电子受体将不同氧化态的碳还原成甲 烷。在多数情况下，氧化态的辅酶f 4 2 0 充当电子受体被氢化酶催化还原，还原态的辅酶 f 4 2 0 ( f 4 2 0 h 2 ) 作电子供体，把电子传递给产甲烷过程中需要电子还原的反应。因此，氢化 酶和辅酶f 4 2 0 在产甲烷的电子传递链中起着不可忽视的作用博一j 。产甲烷过程的甲基传 递链中包括了几类作为甲基载体的辅酶i7 j ：辅酶m ( h s c o m ) 、甲基呋喃0 v w r ) 、四氢 甲基喋呤( h 4 m p t ) 。它们存在于所有的产甲烷菌中，在甲基传递链中作为甲基载体，参 与碳代谢的生化反应。迄今为止还未见它们作为产甲烷牛化监测指标的文献报道。但是， 由于它们在产甲烷过程中具有不可取代的地位，因此在建立产甲烷过程的评价方法时不 应该忽略它们。 1 2 2 产甲烷茵研究进展 现代分子牛物学技术的发展给了我们理解产甲烷颗粒污泥种群结构更新的理解和 认识。基于1 6 s r r n a 基因测序，对厌氧污泥进行种群结构分析，正成为决定厌氧反应 器中微生物种群的强有力的工具【i o l 。从1 6 s r - d n a 克隆分析，一些产甲烷菌、共生菌、 硫酸盐还原菌、异养菌以及一些未能识别的种群在厌氧反应器中被发现 1 2 - i s 。1 6 s r r n a 标记的寡核苷酸探针杂交【l 纠引、1 6 s r r n a 基因克隆库分析【1 2 】、p c r s s c a 分析1 6 s r r n a 1 9 】、免疫组织化学分析【2 0 】、极脂脂肪酸分析已经被用来研究沼气反应器中厌氧微 生物的相对丰度和种群动力学1 2 1 j 。 u a s b 反应器中颗粒污泥的种群结构和功能一直是人们研究的热点。一些基木的 问题如：颗粒污泥中有哪些微牛物、它们的空间位置、它们所起的作用与功能等已经渐 渐被认识。通过1 6 s r r n a 标记的荧光原位杂交技术和免疫学技术，颗粒污泥中厌氧微 生物的空间结构已经得到清晰的认识【2 2 。2 8 j 。这些方法所揭示的微生物种群结构通过传统 的方法是不能获得的。其中一个重要的发现就是：在颗粒污泥内部许许多多的微生物形 成一个较好的空间组织结构以实现种间氢转移和底物的传输。例如：一个氧化丙酸型的 互养菌聚集体的周围被嗜氢产甲烷菌所环绕，并且它们的位置十分接近以利于通过种间 氢转移使得丙酸的氧化在热力学上变得可行【2 9 】。而且1 6 sr d n a 克隆分析和后来的f i s h 探针设计使得我们能够观察到颗粒污泥内部一些目前还不能培养的微牛物以及识别它 们的原位功能【2 3 1 。另外一个重要的发现是：即使在稳定运行的反应器中，仍然观察到微 生物种群结构的动力学变化。因此提出了这样一个问题：稳定的反应器操作状态是否意 江雨大宁博上学位沦文 昧着种群结构的稳定【1 2 】。所有的这些发现表明：分子牛物学技术为我们提供了一个快捷 定量种群结构里面微牛物的方法。这些方法在工程学和微牛物学之间架起了一座桥梁 i i o o 由于厌氧微牛物的苛刻的培养特性，它们的分离一直令人困绕，微生物学家已经花 费了大量时间用于分离产甲烷颗粒污泥中的一些功能菌。但是仅仅只有- d , 部分微生物 被分离识别，尽管如此，厌氧微牛物的分离和特性研究仍然吸引着人们进行研究，因为 纯培养物能够提供不依赖于培养的种群分析所不能提供的大量信息。并且，如果把从纯 培养获得的信息结合分子生物学分析，就有可能获得更多更精确的关于它们的丰度、空 间分布、和随着时间而变化的种群的信息【1 0 】。到目前为止，已经有许多的产甲烷菌被分 离研究，新的产甲烷菌还在不断被分离报道。马凯1 3 0 j 等人从北京的厌氧消化反应器中分 离到两株新的产甲烷菌株8 2 1 和4 1 ，利用h 2 和c 0 2 及甲酸为生长底物产甲烷。根据 系统发育及表型特征，8 2 1 ( = d s m l 5 9 9 9 t = c g m c c1 5 0 1 11 ) 属于新种m e t h a n o b a c t e r i u m b e i j i n g e n s es p n o v 。然而基于1 6 sr d n a 克隆分析的研究表明：产甲烷反应器中占优势 的产甲烷菌主要局限于甲烷杆菌( m e t h a n o b a c t e r i u m ) ，甲烷热杆菌 m e t h a n o t h e r m o b a c t e r ( f o r m e r l ym e t h a n o b a c t e r i u m ) ，甲烷短杆菌( m e t h a n o b r e v i b a c t e r ) ，甲烷 八叠球菌( m e t h a n o s a r c i n ) 和甲烷丝状菌( m e t h a n o s a e t a ) ( f o r m e r l ym e t h a n o t h r i x ) 1 3 1 3 2 j 。使用 设计的d n a 探针，通过f i s h 技术，我们可以对这些产甲烷菌的空间分布以及丰度进 行观察【3 3 l 。同时，通过检测辅酶m ，我们还可以快速便捷的了解总的产甲烷菌的丰度【3 4 j 。 嗜冷产甲烷菌目前正达到越来越多的关注和研究。应用嗜冷产甲烷菌可以突破在低 温下进行厌氧牛物处理的瓶颈，大大拓宽厌氧牛物处理的施用领域，减少废水处理的操 作费用。然而到目前为止，仪有很少的嗜冷产甲烷菌被分离出来，直到1 9 9 2 年才有第l 株嗜冷产甲烷菌得以分离培养1 3 引，截至2 0 0 0 年，得以分离培养并命名的产甲烷菌共有 8 3 种【3 6 1 ，而其中嗜冷产甲烷菌仪有2 种【”3 r l 。近5 年内，又有4 种嗜冷产甲烷菌得以 命名1 3 8 4 。这些嗜冷产甲烷菌的名称及基本特征如表1 1 所剩4 2 1 。虽然已命名的嗜冷产 甲烷菌的种类在所有产甲烷菌中所占比例很小，但这并不说明其在自然界中存在的种类 少，而是因为近几十年来才开始关注存在于低温环境中的产甲烷菌，并且利用分离培养 等传统的牛物学方法对作为严格厌氧古菌的产甲烷菌进行研究本身就存在一定困难。如 果能够将分子生物学技术用于筛选含有高效低温产甲烷菌的接种污泥，并能够在低温厌 氧处理整个过程中，全面跟踪和调控反应器内优势产甲烷菌与其他关键菌群的变化关系， 必将为低温厌氧生物处理技术的发展与应用提供更加直接的指导【4 2 1 。因此分离研究嗜冷 产甲烷菌仍然是今后的研究热点。 1 2 3 产甲烷新工艺 近几十年来，厌氧废水处理的地位渐渐变得重要起来，特别是在工业生产领域，用 4 霹 l 留 旺 熏 釜 hv ； hv sg y hv 黾 婆 癸 h 舞 键 求 o q ，童心 乜0 寸f z 枯 缝 。n 譬 冷 堆卦葵酱蒋k；匿檗恃 甾 警旺枯 式 寸 冷涨聪葵黹岬鬻忙、fi啄累k ”80n寸钴睁 d 逭篁 澎 商ogh| 缒_由 o 8 0 n 9 枯旺占ou焉 a _ c 0 t 崎 n n 避斟葵箭臀k|医累k _ 冷 瓣爆葵箭臀k；匿累k o ”_ 撼斟葵酱需k；臣累k 一晨壕辍匿一皿粼锻嫩写羞嫩s弧鲻鉴嫩 墨【哥一芑。 一景壕辍宦一皿粼敏嫩磊若书辞暴iiqddo 慕聪怔暴qu 锚 甾 西n n 高拉斟葵黹忡群忙；啄累k 幕鼙怔器qu n i z n f e c u 。z a n d v o o r tmh1 1 0 2 l 研究了四种取自不同的 厌氧反应器中的颗粒污泥的微量元素的含量并且测定了在添加不同的微量元素后污泥 产甲烷活性的变化。其结果表明：厌氧生物反应器中微量元素常常缺乏，因此研究厌氧 污泥在添加微量元素后其产甲烷活性的变化是一种预测厌氧反应器中微量元素缺乏的 有效方法。 综观国内外的研究，对微量元素促进产甲烷丰要集中在研究微量元素的种类以及投 加组合方面，而实际上在城市有机垃圾以及一些工业废水的牛物处理反应器中，微量元 素的浓度并不低，但在添加微量元素后，产甲烷效应仍然得到大幅度提高，说明微量元 素的存在形态与产甲烷菌的吸收利用存在很大的关系。总的金属浓度并不能作为其