（环境科学专业论文）丙烯酰胺降解菌的筛选及降解效果研究.pdf

t h es c r e e n i n go fa c r y l a m i d eb i o d e g r a d a f i n g b a c t e r i u m a n dd e g r a d a t i o ne f f e c ts t u d y a b s t r a c t a c r y l a m i d c ( c 3 h 5 0 n ，f o rs h o r ta m ) i sa w h i t ec r y s t a lc h e m i c a l ，w h i c hi st h ep r o d u c t i o n o fp o l y a c r y l a m i d cm a t e r i a l s p o l y a c r y l a m i d ei sw i d e l ya p p l i e df o rt h ew a t e rt r e a t m e n ta r e a s d u et oi t sw e l lf l o c c u l a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ，i n c l u d i n gt h el a ww a t e rt r e a t m e n t , s e w a g et r e a t m e n t ， i n d u s t r i a lw a t e rt r e a t m e n t ，u r b a ns e w a g et r e a t m e n t ，e t c i nt h eo i li n d u s t r y ，p o l y m e rf l o o d i n g t h r e er e c o v e r yt e c h n i q u eh a se n t e r e dt h ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o ns t a g e p o l y a c r y l a m i d ei s b a s i c a l l yn o n t o x i c ，b u ti t sm o n o m e r s ，a c r y l a m i d e ，p r o d u c e db yh y d r o l y s i si st o x i c s e w a g e s e r i o u s l yp o l l u t e db yh i g hc o n c e n t r a t i o n so fp o l y a c r y l a m i d e ，c a u s e dg r e a th a r mt ot h en a t u r a l e n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h ，e v e nd a m a g e dt h ee c o l o g i c a lb a l a n c e a c r y l a m i d ei sat o x i c a g e n tt o n e r v o u ss y s t e m ，w h i c hd a m a g e st h en e r v o u ss y s t e m ，c a u s e sb o d yw e a k n e s sa n d m o v e m e n td i s o r d e r sa n do t h e rs y m p t o m s t oa v o i dp o l l u t i o no ft h ee n v i r o n m e n t ，i ti sn e s e s s a r y t os e e ka c r y l a m i d em o n o m e rr e m o v a lm e t h o d a e r y l a m i d el i 出d e g r a d a t i o na n dh y d r o l y s i sr a t e i sv e r yl o w b i o l o g i c a ld e g r a d a t i o ni san a t u r a lw a yt oe l i m i n a t ea c r y l a m i d ep o l l u t i o n , w i t hl e s s e n e r g yc o n s u m p t i o n ，l o wc o s e 晰d ef u n c t i o ns c o p e ，l o n gl a s t i n ga n do t h e ra d v a n t a g e s f r o ma na c t i v a t e ds l u d g ei nt h es e c o n d a r ys e d i m e n t a t i o nt a n ko fw a s t e w a t e rt r e a t m e n t p l a n t ，ab a c t e r i a ls t r a i nw i t hh i l g he f f i c i e n c yo fd e g r a d i n ga c r y l a m i d ew a sf o u n d , n a m e da sa 1 8 b a s e do nt h er e s u l to f16 s r d a ns e q u e n c e s ，t h i ss t r a i nw a si d e n t i f i e da sd e l 归at s u r u h a t e n s i s d e l f t i a t s u r u h a t e n s i si san e w l yd i s c o v e r e ds t r a i n , w h i c hh a sa l s ob e e nr e p o r t e da sa d e g r a d a t i o ns t r a i nf o rp h o x i m ，b i f e n t h r i n ，p a e sa n da n i l i n e t h i ss t u d yf o u n dt h i ss t r a i nc a n a l s od e g r a d a t ea c r y l a m i d e b yt h ec o m p a r i s o nb e t w e e ng r o w t hc o n d i t i o n sa n da c r y l a m i d ed e g r a d a t i o n ，t h eo p t i m u m d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n so fd e l f t i a t s u r u h a t e n s i sw e r ed e t e r m i n e d ，w h i c hw e r ea c r y l a m i d e c o n c e n t r a t i o n10 0 0 m g l ，i n o c u l a t e da m o u n ta t2 0 ，t e m p e r a t u r eo f3 0 。ca n dp ho f7 0 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ea c r y l a m i d ec o u l db ec o m p l e t e l yd e g r a d e db yt h es t r a i n w i t h i n4 8 hi nt h ei n o r g a n i cm e d i u m w i t ht h et e m p e r a t u r eb e t w e e n2 0t o4 0 ，p hb e t w e e n 5 0 - 1 0 0 ，a c r y l a m i d ew e r ea l s od e g r a d a t e dw e l l ，w h i c hi m p l i e dt h ee n v i r o n m e n t a lr e q u i r e m e n t s f o ra c r y l a r n i d ed e g r a d a t i o nw a sl o w i nt h es e w a g et r e a t m e n tp l a n t , d o s i n ge x t e r n a ln u t r i t i o ni sak i n do fg o o dm e t h o dt o i m p r o v eb i o d e g r a d a t i o ns p e e di nn o r m a lo p e r a t i o n s oi nt h i sp a p e ra c r y l a m i d ew a sd e g r a d a t e d b yd e l f t i at s u r u h a t e n s i sa d d i n ge x t e r n a ln u t r i t i o n ，w i t ha c r y l a m i d ec o n c e n t r a t i o nl0 0 0 m g l ， i n o c u l a t e da m o u n ta t2 o ，t e m p e r a t u r eo f3 0 。ca n dp ho f7 0 ，w h i c ha d d e de x t r ac a r b o n s o u r c e s ，n i t r o g e ns o u r c e ，m e t a l i o n s 。e x p e r i m e n tr e s u l t sm a d ei t c l e a rt h a ta d d i n gt h ee x t r a n u t r i e n tm e d i u mi nt h ei n o r g a n i cm e d i u ma sm a l t o s e ，n a n 0 3 ，z n 十，t h ed e g r a d a t i o ne f f e c to f 2 4 hw a ss i g n i f i c a n t l yi m p r o v e dc a m p a r i n gw i t hc o n t r o la s9 9 9 8 ，9 8 13 a n d9 5 6 ， r e s p e c t i v e l y a c r y l a m i d ed e g r a d a t i o nd y n a m i c sp r e l i m i n a r ys t u d ys h o w e du n d e rt h eb e s td e g r a d a t i o n c o n d i t i o n ，d e l f t i at s u r u h a t e n s i sd e g r a d a t i o no fa c r y l a m i d ep r o c e s s ，f i t t e dw e l lw i t hf i r s t 。o r d e r k i n e t i cm o d e l ，w i t had e g r a d a t i o nr a t ec o n s t a n t s ( 动o f 0 8 7 5d 叫a n dh a l f - l i v e s ( t l 2 ) o f 0 8d t h i sp a p e ru s e dp h o t o g e n i cb a c t e r i aa n dm i c r o a l g a et ot e s tb i o t o x i c i t yo fa c r y l a m i d e ， c a t a b o l i t e ，f o u n dt h a ta c r y l a m i d ec o u l db ed e g r a d e di m oo t h e rc o m p o u n d sb yd e l f t i a t s u r u h a t e n s i s ，t h et o x i c i t y o ft h e s e c o m p o u n d s w e r el o w e rt h a na c r y l a m i d e ，w h i c h d e m o n s t r a t e dt h es t r a i no fd e l f t i at s u r u h a t e n s i sh a dg o o da p p l i c a t i o np r o s p e c t k e yw o r d s ：a c r y l a m i d e ；b i o d e g r a d a t i o n ；16 s r d n a ；c h a r a c t e r i s t i c s ；l u m i n e s c e n t b a c t e r i a ； m i c r o a l g a e i v 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i i 第一章前言1 1 1 丙烯酰胺的简介1 1 2 环境中丙烯酰胺的来源1 1 3 丙烯酰胺的危害2 1 3 1 生殖毒性2 1 3 2 遗传性毒性2 1 3 3 神经性毒性3 1 3 4 致癌性毒性3 1 4 丙烯酰胺的生物降解4 1 4 1 微生物降解4 1 4 2 生物强化技术5 1 4 3 影响生物降解的因素6 1 4 4 微生物降解的优势7 1 5 生物降解丙烯酰胺的国内外研究进展7 1 6 环境污染物的生物检测8 1 6 1 发光细菌评价生物毒性8 1 6 2 藻类在水质监测中的应用9 1 7 论文的研究内容及实验研究路线1 0 第二章丙烯酰胺高效降解菌的分离、筛选与鉴定1 1 2 1 实验材料1 1 2 1 1 菌株来源1 1 2 1 2 主要仪器及设备11 2 1 3 主要试剂1 1 2 1 4 培养基1 1 2 2 丙烯酰胺降解率的分析方法1 2 2 3 丙烯酰胺降解菌的分离和筛选1 2 2 3 1 降解菌的富集1 2 2 3 2 菌株的分离1 2 2 3 3 菌株的复筛13 2 4 考马斯亮蓝法测定细菌的蛋白质含量1 3 2 4 1 考马斯亮蓝法实验原理1 3 2 4 2 考马斯亮蓝法标准曲线的绘制1 3 2 4 3 细菌细胞可溶性蛋白质的提取和含量的测定1 4 2 5 菌株场发射扫描电镜观察15 2 6 菌株鉴定15 2 7 结果与分析1 6 2 7 1 筛选结果1 6 2 7 2a 18 菌株蛋白质含量18 2 7 3 菌株a 18 场发射扫描电镜19 2 7 4 菌株a 1 8 的鉴定分析与系统发育树1 9 2 8 本章小结2 0 第三章d e l f t i at s u r u h a t e n s i s 降解丙烯酰胺的特性2 1 3 1 实验材料与仪器2 1 3 1 1 主要仪器及设备2 1 3 1 2 主要试剂2 1 3 1 3 培养基2 1 3 2 结果与讨论2 2 3 2 1 空白实验2 2 3 2 2 浓度对菌株d e l f t i at s u r u h a t e n s i s 降解丙烯酰胺的影响2 3 3 2 3 接种量对d e l f i i at s u r u h a t e n s i s 降解丙烯酰胺的影响2 4 3 2 4 温度对菌株d e l 归at s u r u h a t e n s i s 降解丙烯酰胺的影响2 5 3 2 5p h 对菌株d e l i at s u r u h a t e n s i s 降解丙烯酰胺的影响2 6 3 2 6 最佳条件下的降解效率2 7 3 2 7 外来营养物质和微量金属离子的作用2 8 3 3 降解动力学分析31 3 4 本章小结一3 3 第四章生物评价丙烯酰胺降解产物的毒性3 4 4 1 实验材料3 4 4 1 1 材料来源3 4 4 1 2 主要仪器及设备3 4 4 1 3 培养基3 4 4 1 4 丙烯酰胺及其降解产物毒性测试液的制备3 5 4 2 发光细菌测试毒性实验3 5 4 2 1 发光细菌的培养3 5 4 2 2 发光细菌实验方法3 6 4 3 水体毒性分析标准3 6 4 4 藻类实验方法3 6 4 5 结果与讨论3 7 4 5 1 发光细菌生长规律3 7 4 5 2 发光细菌测定丙烯酰胺降解产物的毒性3 8 4 5 3 丙烯酰胺降解产物对小新月菱形藻的4 8 h 毒性抑制效应3 8 4 6 本章小结4 0 第五章结论与展望4 1 5 1 结论4 1 5 2 存在的问题及展望4 2 参考文献4 3 附表。4 7 致谢5 1 攻读硕士期间发表的论文5 2 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书5 3 郑国林丙烯酰胺降解菌的筛选及降解效果研究 1 1 丙烯酰胺的简介 第一章前言 丙烯酰胺( c 3 h s o n ，a e r y l a m i d e ，简称a m ) 是一种不饱和酰胺，沸1 2 5 c ( 3 3 2 5 p a ) ， 熔点8 4 8 5 。c ，密度1 1 2 2 9 c m 3 。能溶于水、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿，不溶于苯及 庚烷中。其单体为无色透明片状结晶，是生产聚丙烯酰胺的原料。 1 2 环境中丙烯酰胺的来源 丙烯酰胺是生产聚丙烯酰胺( p o l y a c r y l a m i d e ，p a m ) 的原料，聚丙烯酰胺的结构中 含有酰胺基，易形成氢键，使其具有良好的水溶性，并兼具絮凝性、增稠性、耐剪切性、 降阻性、分散性等性能【1 ，2 1 。由于其良好的絮凝性能，聚丙烯酰胺最早开始在水处理领域得 到广泛应用，包括原水处理、污水处理、工业水处理、城市生活污水处理等【3 1 ，目前仍然 是国内外水处理领域使用量最大的水处理剂【4 】；作为一种高技术含量、高附加值的重要化 工产品，已广泛应用在石油开采、污水处理、造纸、纺织工业、印染工业、医药工业、建 筑工业、矿冶工业、农业生产等部门和领域并己渗透到人们的日常生活中【5 1 。在国际上各 国的聚丙烯酰胺的应用情况有所不同，美国的聚丙烯酰胺主要用于水处理，在造纸方面应 用所占比例相对较小，而日本的聚丙烯酰胺则主要用于造纸工业，而我国聚丙烯酰胺主要 用在石油的开采。美国丙烯酰胺的消费情况：水处理占6 0 ，造纸占2 5 ，矿山占1 1 ， 其它占4 ；日本聚丙烯酰胺的消费结构为：水处理占3 2 ，造纸占4 5 ，矿山占8 ，石油 占1 2 ，其它占3 ；2 0 0 8 年中国聚丙烯酰胺的消费结构为：水处理占5 6 ，造纸占2 9 ， 石油占l l ，其它占4 t 6 。引。我国是世界上3 次采油工业化程度最高的国家，高分子量p a m 在3 次采油中不仅可以降低成本，而且效果很好，成为首选驱油聚合物【9 d 1 1 。随着油田生产 要求的提高，至u 2 0 1 0 年，我国石油开采行业p a m 需求量为3 0 万吨。聚丙烯酰胺本身基本无 毒，但它在环境中水解成的单体，丙烯酰胺的毒性却很强【1 2 】。大量含有高浓度聚丙烯酰胺 的污水，水解后严重地污染了水体，给自然环境和人类带来了极大的危害，破坏了生态平 衡【1 3 1 4 1 。 2 扬州大学硕士学位论文 1 3 丙烯酰胺的危害 丙烯酰胺是一种神经系统致毒剂，对神经系统有损伤作用，中毒后表现为肌体无力和 运动失调等症状【i5 1 。研究表明，人体可通过消化道、皮肤黏膜、呼吸道等多种途径接触 丙烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。急性毒性试验结果表明，大鼠、小鼠、豚 鼠和兔的丙烯酰胺经口l d s o 为1 5 0 - 1 8 0m g k g ，属中等毒性物质。 人们对丙烯酰胺的毒性认识最早是在职业危害中，工作人员在生产丙烯酰胺、聚丙烯 酰胺、污水处理等过程中都接触到丙烯酰胺，中毒后主要表现为皮肤损害和神经系统损害。 随着人们对丙烯酰胺危害的认识，丙烯酰胺毒理学研究的进展，其致癌性、生殖、遗传等 系统毒性也逐渐被人们所认识【1 6 】。 1 3 1 生殖毒性 丙烯酰胺对人类的生殖毒性目前在医学上还没有发现过病例，但是大量的动物实验结 果发现，丙烯酰胺除引起动物的生殖细胞染色体变异，生殖系统肿瘤，对精子的形成，受 精和对雌性生殖都有影响【1 7 1 。引起动物生殖细胞染色体变异、生殖系统肿瘤、生殖器官和 生精管萎缩、精子数量减少、精子活动度降低和变异率增加，还发现精子的活动强度和曲 线速率下降，致使精子到达子宫腔时间延长【1 8 】。2 0 0 5 年y a n g 等对丙烯酰胺的生殖毒性做了 进一步研究 1 9 1 。实验中用6 0m g ( k g d 1 剂量的丙烯酰胺连续5 d 处理s d 大鼠，在s d 大鼠输 精管内发现组织病理变化：管状内皮增生变厚并形成大量多核巨细胞。s e g a 等用丙烯酰胺 处理雄性小鼠的研究发现：中毒一天后早期小鼠精子细胞中d n a 的释出开始增加，处于中 晚期的精子细胞以及精子的d n a 断裂最为严重【2 们。腹腔注射中高剂量的丙烯酰胺都可以引 起不同分裂期精子细胞内微核的产生和精子细胞微核中着丝粒的出现，丙烯酰胺不会引起 精原细胞的诱变，而对精子细胞到精子的形成过程中具有诱变活性 2 1 - 2 4 】。 1 3 2 遗传性毒性 动物实验中，丙烯酞胺在体内和体外均表现有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和 生殖细胞的基因突变和染色体异常2 5 1 。瑞典食品管理局的报道指出，丙烯酰胺诱导小鼠基 因突变的最低剂量为2 5 5 0 m g k g ，此最低剂量的1 2 0 倍可诱导小鼠的染色体发生异常【2 6 】。 k o y a m a 等【2 7 】用微核实验、彗星实验和t k 基因突变实验研究了丙烯酰胺及其代谢物 环氧丙烯酞胺对人体淋巴t k 6 细胞的基因毒性，结果表明，丙烯酰胺主要引起缺失突变， 以致染色体异常，而丙烯酰胺的代谢产物环氧丙烯酞胺则主要引起点突变，说明二者的对 郑国林丙烯酰胺降解菌的筛选及降解效果研究 基因毒性特征不同。j i a n g 等【2 8 】采用彗星实验和微核试验检测丙烯酰胺对人肝细胞瘤 g 2 ( h e p g 2 ) 细胞中的可能遗传毒性，结果发现丙烯酰胺对h e p g 2 细胞具有遗传毒性，可 能是由于细胞内氧自由基( r o s ) 弓i 起d n a 氧化损伤，导致g s h 含量减少所致。光景芳等 2 9 】采用中国仓鼠肺( c h l ) 细胞培养染色体畸变技术进行实验观察不同梯度丙烯酰胺对哺 乳类动物细胞遗传毒性的影响，结果表明丙烯酰胺致畸作用有剂量反应关系，高浓度诱发 大量非整倍体形成及结构变异，低浓度无诱发c h l 细胞染色体畸变的作用。赵佳，王菊 等 3 0 , 3 1 1 在对动物的实验中也发现丙烯酰胺对动物具有遗传性毒性。 1 3 3 神经性毒性 丙烯酚胺的神经性毒性已经为大多学者所公认，大量的中毒事件也多是围绕其神经毒 性方面，但是丙烯酞胺导致周围神经和中枢神经系统损伤的机制还不十分清楚【3 2 】。研究调 查长期接触丙烯酞胺的职业工人，发现丙烯酰胺中毒后主要表现为手部脱皮、四肢麻木、 乏力、手足多汗、头痛失眠、远端触觉减退等，累及小脑时还会出现步履蹒跚、四肢震颤 觉、深反射减退等，神经传导速度减慢，并发现外周神经损害多表现为通向胞体的长纤维 末端首先受损，逐渐向胞体方向发展，呈“返死现象”【3 3 蚓。 丙烯酰胺是蓄积性神经毒，对中枢及周围神经系统皆有损害。向心走行的中枢纤维的 远端受累与周围神经远端变性并存，l o p a c h i n 称之为中枢神经周围性远端轴索病，经进一 步研究，他认为终板及浦肯野纤维同样受损也是重要作用【3 5 1 。周梅荣等报道了职业工人长 期接触丙烯酚胺，中毒致小脑萎缩的临床病例 3 6 】。褚学斌等报道了职业工人在生产聚丙烯 酰胺的过程不注意防护，丙烯酞胺中毒致视野缺损的案例【3 7 1 。有学者( l e h n i i l 曲的一系列研 究表明，丙烯酰胺的神经毒性是由p u r k i n i e 细胞损伤引起，主要作用点是神经末稍，在亚慢 性染毒的情况下表现出轴突的病理学改变【3 8 - 4 0 l 。 1 3 4 致癌性毒性 丙烯酰胺致癌性研究一直是科学界的研究热点，其研究结果受社会关注的程度最高， 因此而引发的争论也是最多。动物实验，小鼠经口饲喂丙烯酰胺一段时间后，观察到腹膜 间皮瘤发病明显上升，在脑部、脊髓、睾丸及甲状腺癌、雌鼠乳腺癌等都发现肿瘤细胞； 同时认为丙烯酰胺具有一定的多巴胺拮抗作用，该机制可能是导致多种组织细胞异常增 生，从而引发癌症的原因之一；实验发现小鼠不论经口或腹腔内注射，不同组织肿瘤如乳 腺癌、肾上腺癌、子宫癌和阴囊间皮瘤的发生 4 1 , 4 2 。 4 扬州大学硕士学位论文 虽然有足够的数据证明丙烯酰胺是一种验动物致癌物，然而目前还没有足够的数据确 定是否能使人致癌。大部分研究人员认为丙烯酰胺存在对人致癌的危险，但几乎所有证据 都是通过动物实验获得的，在职业接触流行病学方面，由于资料不完全、样本较小和同时 存在接触多种化学物质等因素，还没有直接有效的证据充分证明丙烯酰胺对人体有致癌 性。 1 4 丙烯酰胺的生物降解 随着化学工业的发展和化学品的广泛使用，大量的含有丙烯酰胺的生活污水和工业废 水通过各种途径进入环境，造成了环境的严重污染。环境污染不仅给经济的可持续发展带 来滞后性，而且直接影响到人类健康、稳定的生活。因此，环境问题日益引起了人类的高 度重视。而生物降解是自然环境自行消除有机物污染的最有效途径之一，具有能源消耗少， 成本低，作用范围广，持续时间长等优势。 1 4 1 微生物降解 生物降解：就是通过生物的作用将环境中的大分子污染物分解成小分子化合物的过 程。生物降解一般指微生物的分解作用，有可能是微生物的有氧呼吸，有可能是微生物的 无氧呼吸。m a u s n e t 等曾根据有机污染物生物降解的过程将生物降解分为三种( 或者说是 三个阶段、) ，即： ( 1 ) 初级生物降解：是指有机污染物在生物的作用下，有机物的化学结构发生变化， 其分子的完整性发生改变了，即有机污染物本来的结构发生了部分的变化。 ( 2 ) 环境容许的生物降解：是指经生物降解后的有机污染物的毒性或者某些的特性被 去除了，例如在表面活性剂被生物降解过程中那种使表面活性剂失去起泡性能的降解作 用，或者是聚合物的粘性，或者是在有毒有机污染物降解过程中，有机物的毒性降低或完 转化成无毒化合物。 ( 3 ) 最终生物降解：指有机污染物通过生物降解作用，从有机物向无机物转化，完全 被降解成c 0 2 、水和其它无机物，并转化成为微生物自身的一部分。 1 4 2 生物强化技术 1 4 2 1 生物强化技术简介 生物强化技术：通过向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物来增强生物量，以强化 生物量对某一特定环境或特殊污染物的反应 4 3 , 4 4 】。投入的菌种与底质之间的作用分为直接 作用和共代谢作用。生物强化技术产生于二十世纪7 0 年代中期，8 0 年代以来在水污染治理、 污染土壤的修复及大气污染的治理中得到广泛的研究和应用【4 5 1 。 生物强化技术中投加的菌种可来源于原废水处理系统，也可以是原系统中不存在的外 源微生物或遗传工程菌。投加的菌种需要满足3 个基本条件h 7 】：菌体活性高；在废水处 理系统中能竞争生存，并维持相当数量；可快速降解目标污染物。 1 4 2 2 生物强化技术的作用 ( 1 ) 高效菌直接作用 通过驯化、筛选、诱变、基因重组等技术得到一株以降解目标物质为主要碳源来满足 自身生命活动和代谢所需要的营养物质的微生物，并向污水处理系统中投入一定量的目的 菌种，以达到去除污染物的作用。目前，直接作用所使用的菌株大多是通过质粒育种以及 基因工程得到的【4 8 】。 1 ) 质粒育种：质粒育种是将两种或两种以上的微生物，通过细胞融合技术或结合 技术，使供体菌质粒转移到受体菌体内，使受体菌保留自身功能质粒，同时获得供体 菌的功能质粒。 2 ) 基因工程：基因工程是通过人工技术把需要的供体d n a 提取出来，进行切割、重 组，然后将重组的d n a 导入某一受体细胞中，使重组d n a 在受体细胞中进行复制扩增和表 达，从而获得人们需要的新的基因产物，进而获得新品种。 ( 2 ) 微生物共代谢作用 微生物在有可利用的惟一碳源存在时，对它原来不能利用的物质也能分解代谢的现象 【4 9 1 。对于一些难降解的化合物，微生物不能以其作为碳源和营养物质来满足其生长，但在 其他基质存在的情况下，能够改变这种有害物的物质的化学结构并能使其降解。如在甲烷、 芳香烃、氨、异戊二烯和丙烯为主要基质而生长的一些菌可以产生一种氧合酶，这种酶可 以共代谢三氯乙烯( t c e ) e 4 9 1 。 尽管生物强化在生物修复中的作用在环境微生物学术界的评价褒贬不一，而且大多成 6 扬州大学硕士学位论文 功的实践，都仅仅停留在实验室阶段，但对有毒作用的污染物或难降解的化合物有效微生 物的生物处理系统中，生物强化技术的针对性强，应用灵活，效率高等明显的优势，在难 降解的污水处理中具有很好的应用前景。 1 4 3 影响生物降解的因素 微生物的生命活动必然受到环境因子的影响，一切不良的环境条件都能使其的生长受 到抑制，甚至导致菌体死亡。环境因子如温度、p h 、溶解氧、金属离子、营养物质、及气 候条件等都对微生物降解有机物污染物有着很大的影响。 1 4 3 1 温度 温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命 活动：一方面，在一定范围内随着温度的升高，细胞内酶的活性提高，细菌的速度代谢和 生长速度的加快；另一方面，细胞内核酸、蛋白质等机体重要组成成分对温度比较敏感， 随着温度的进一步升高，可遭受不可逆的破坏，使细胞功能下降，甚至死亡。根据实验研 究，绝大多数微生物的最适生长温度为2 5 3 7 。c 。但也有少数的嗜热菌可以适应在高温下 生长。 1 4 3 2p h 值 环境中的p h 值可影响到微生物酶促反应的速度。如果水体介质中的h + 或o h 。的质量 浓度不在微生物生存的适宜范围内，可能会影响酶活性及降解性能。微生物的生命活动、 物质代谢与p h 密切相关。p h 对微生物的生长的影响是可能会导致微生物的细胞膜和质 膜上的电荷发生变化，影响物质的通透性和吸收转化，来影响其对营养物质的利用，从而 影响微生物的生长速率【5 0 1 。实验表明，大多数细菌在p h 值保持在6 0 - 0 9 0 之间较为适宜， 过高或过低的p n 值都对细菌的生长有明显的影响。细菌经驯化后对酸碱度的适应性可以 进一步提高。 1 4 3 3 营养物质 有机污水中含有的营养成份有可能不能适合满足微生物的生长所需，要靠额外添加的 营养来配合生物对有机污染物的降解，使生物降解效果到达最好。为了能让微生物能完全 的降解有机污染物，添加适当的营养物质非常有必要。特别是在难降解废水生物处理过程 中，投加额外的营养物质是经常采用的一种措施，以提高污泥数量和性能。 郑国林丙烯酰胺降解菌的筛选及降解效果研究 1 4 4 微生物降解的优势 作为对环境有机污染物高效的处理手段，由于其技术上的成熟、无二次污染和其低廉 的运行费用等优点，微生物降解与处理技术得到广泛的关注，在各种难降解污染物的无害 化处理领域发挥着重要的作用。由于微生物特殊的环境适应性、高繁殖速率和变异性，微 生物降解将成为解决丙烯酰胺引起环境污染问题的有效手段【5 l 】。 1 5 生物降解丙烯酰胺的国内外研究进展 对聚丙烯酰胺的生物降解最早由1 9 7 8 年s u z u k i 等研究开始的；在国内，由于聚丙烯酰 胺在油田和水处理的大范围使用以及含聚丙烯酰胺污水的逐年增加，研究者对于含聚丙烯 酰胺污水的处理研究逐渐增多，最早由1 9 9 9 年黄峰等研究了硫酸盐还原菌对聚丙烯酰胺的 降解【5 2 。”j 。表1 1 是目前国内外研究者筛选出的能降解聚丙烯酰胺的微生物种群。 表1 1 已筛选到的聚丙烯酰胺降解菌的典型种群 t a b l e 1 1t y p i c a lp a m d e g r a d i n gb a c t e r i a 降解菌种群研究者 团杆菌和巨胞氮单胞菌 硫酸盐还原菌 腐生菌 黄孢原毛平革菌 复合茵 放线杆菌纲，a 变形菌纲和芽孢杆菌 芽孢杆菌属 脂肪杆菌属，海球菌属，动性球菌属 肠杆菌属 产碱假单胞菌 假单胞菌属菌株 褐栗芽孢杆菌 梭菌属的新种 假单胞菌属，梭状芽孢杆菌属 芽孢杆菌属，梭状芽孢杆菌属，假单胞杆菌属 芽孢杆菌属，节细菌属，黄杆菌属，不动细菌属 k u n i c h i k a n 等【5 5 】 程林波等【5 6 】 黄峰等 韩昌福等【5 7 】 张英筠【5 8 】 佘跃惠等5 9 】 包木太等【删 包木太等【6 l 】 赵敏等【6 2 】 孙晓君等【6 3 】 李蔚等【删 刘永建等【6 5 】 魏利等【鲫 李宜强等【6 7 】 郝春雷等【6 8 】 高玉格等【6 9 1 国内外对聚丙烯酰胺的生物降解有大量的研究，但是普遍认为聚丙烯酰胺不能被生物 完全降解。微生物降解聚丙烯酰胺的同时，聚丙烯酰胺的主链断裂，产生大量的低聚物， 从而可能产生大量的丙烯酰胺单体，根据前述的研究成果，单体丙烯酰胺具有更强的生物 毒性，对环境造成二次污染。因此寻找高效降解丙烯酰胺的微生物非常重要。 扬州大学硕士学位论文 目前，国内外研究丙烯酰胺的聚合物聚丙烯酰胺的生物降解较多，但丙烯酰胺的微生 物降解的相关报道比较少。i g n a t o v 等研究了短杆菌和类产碱假单胞菌两种菌株对丙烯酰 胺的生物降解性能，菌株对丙烯酰胺的降解呈线性关系。李志茹等【7 1 1 筛选出了一株节细菌 属的菌株，该菌株对丙烯酰胺的降解率在6 d 可达至1 j 7 4 。边才苗等【嘲从化工厂的活性污泥 中筛选出了一株不动杆菌属的菌株，6 d 对丙烯酰胺的降解率4 5 0 1 。李署等f 7 3 】对好氧活性 污泥进行驯化，驯化的活性污泥能在2 0 h 内降解9 0 以上的丙烯酰胺，是高效的丙烯酰胺降 解菌群。 但是，总体而言，丙烯酰胺单体的降解菌株较少，活性优异、对降解条件要求较低的 菌株更少。寻找高效、条件要求低的丙烯酰胺降解菌，并对其降解条件进行研究是本次研 究的主要方向。 1 6 环境污染物的生物检测 随着工业社会的发展与进步，有机物污染也越来越严重了，不仅对自然界造成很大的 危害，严重威胁人类生命健康，现在成为世界各国的环境治理难题。传统的化学和生物方 法检测环境中残留污染物的毒性费时费力且费用昂贵。近年来，许多学者提出了适于水体 监测和评价的生物测试方法，其中发光细菌法和藻类成为研究的热点。发光细菌由于反应 快速、灵敏度高、成本低廉等优点，是对水体中污染的毒性进行急性毒性测试的较好方法 而得到广泛关注【7 4 7 6 1 。2 0 世7 0 年代末，国外科学家从海鱼体表分离出了发光细菌，用于检 测水体的生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段【7 7 1 。而藻类与周围环境 形成统一的整体并且互相影响，因其个体微小、生长周期短、对有毒物质反应灵敏、容易 培养等特点，在较短时间内可获得化学物质对藻类世代及种群水平上的影响评价【7 8 】。 1 6 1 发光细菌评价生物毒性 1 611 发光细菌法检测技术的应用现状 随着人们生活水平的提高，由有机物引起的水体污染问题也越来越受到人们的关注。 为了人们的饮用水的安全和健康，提高水产品的质量安全水平，我国政府已经意识到加强 水产品中有机毒物残留监控的重要性。要建立有效的监测体系，就必须有高效的监测手段 和方法，所以针对有机污染残留快速检测方法的研究势在必行。 对于环境有机污染，传统的检测手段难以满足迅速在线分析的要求。以气相色谱、液 相色谱以及气质联用等仪器检出样品中的污染物，具有检测限低、精确度高等优点，但是 郑国林丙烯酰胺降解菌的筛选及降解效果研究 9 存在着操作复杂、检测时间、检测成本较高等问题，也无法对污染物质进行生物危害性评 估【7 9 1 。因此发展新的快速、准确评价各类污染物的毒性的有效方法显得非常迫切。 发光细菌测试使用了具有发光特性的天然微生物，而有毒的污染物会抑制其发光，且 毒性越强，光抑制越明显。这一方法具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠 性。另外，发光细菌本身是没有危害性。所以利用发光细菌的发光强度作为敏感的指标物 来监测环境中的有毒物质，越来越受到各国的重视。 1 6 1 2 发光细菌法在环境生物毒性检测中的应用 野生型发光细菌在接触有毒有害物质时发光会受到抑制，于是早在1 9 7 9 年就有人提出 用它来检测环境水样品的毒性。对于天然存在的发光细菌，其发光现象是一项正常的生理 代谢活动。当毒物存在时，由于荧光酶活性受到抑制或与发光相关代谢途径受阻，发光程 度有所下降甚至完全消失【7 7 】。在1 9 8 1 年，a a b u l i c h 等首先报道了采用明亮发光杆菌 ( p p h o s p h o r e u m ) 菌株进行废水毒性商业化检测的可能性，后来发展为成套的m i c r o t o x 检验 方法【8 0 】。目前，许多国家已将发光细菌方法作为水生态系统