（材料学专业论文）壳聚糖衍生物非病毒基因载体的研究.pdf

中文摘要壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，具有良好的生物相容性，生物降解性，低免疫原性以及无毒性的优点。壳聚糖通过静电作用可以与d n a 形成聚电解质复合物，保护d n a 免受核酸酶的降解，从而促使d n a 顺利的进入细胞，因此壳聚糖作为非病毒基因载体具有广泛的应用前景。本文制备了两种新型的壳聚糖非病毒载体，精氨酸修饰的壳聚糖( a r g c s ) 和n 亚甲基磷酸化壳聚糖( n m p c s ) ，探讨其物理化学性质及其与d n a 之间的相互作用及基因转染行为，对壳聚糖载基因纳米粒子荧光标记条件进行了优化，探讨了精氨酸修饰壳聚糖载基因血管支架体内局部释放基因的可行性，具体内容主要包括以下几个方面：1 、精氨酸修饰的壳聚糖的制备及其与d n a 相互作用的研究。通过红外光谱和核磁共振图谱分析，可以确认精氨酸已经共价连接到壳聚糖上。圆二色谱结果表明d n a 与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍然保持着典型的b 型构象。用透射电镜，原子力显微镜和光子相关光谱检测复合物的表面形态和尺寸大小分布，结果表明，精氨酸修饰的壳聚糖d n a 纳米复合物( n p = 2 ：1 ) 呈现不规则的球形，复合物的直径分布大多在8 0 - - 1 5 0 n m 之间，有利于基因转染。2 、精氨酸修饰的壳聚糖介导的基因转染研究。精氨酸修饰的壳聚糖介导荧光素酶质粒的表达较未修饰的壳聚糖介导的荧光素酶质粒的表达提高了大约1 0 0倍，在整个实验浓度范围内，精氨酸修饰的壳聚糖及其与d n a 的复合物对h e l a细胞的毒性非常小。3 、n 亚甲基磷酸化壳聚糖的制备及其与d n a 相互作用的研究。以红外光谱( f t i r ) 分析表明改性后的壳聚糖的特征基团有显著变化；1 3 cn m r 检测进一步证明了亚甲基磷酸基团的引入。通过复凝聚的方法，制备了纳米尺寸的n m p c s d n a 聚电解质复合物。考察了共聚物与d n a 的相互作用情况，复合物中d n a 的构象变化和复合物的形态和粒径。圆二色谱结果表明d n a 与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍然保持着典型的b 型构象。透射电镜，原子力显微镜检测结果表明，不同n p 下的n 亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖d n a 纳米复合物呈现较规则的球形，且在高电荷比时可形成尺寸较小的纳米尺度颗粒。4 、以人宫颈癌细胞h e l a 为宿主细胞，尝试了以n m p c s 为载体介导含荧光素酶的p g l 3 质粒的体外转染，重点研究了p h 值和n p l t ；对转染效率的影响。实验结果表明，载体可有效将质粒转染h e l a 细胞，获得的最佳转染效率远高于裸d n a 和c s ，与p e i 相当。基于磷酸基团对钙离子有良好的鳌合能力制备了聚合物盐型n m p c s c a 载体，并用于介导基因转染，其转染过程类似于传统的p c a 载体，并认为c a 2 + 离子通道促进了转染过程。5 、壳聚糖载基因纳米粒子荧光标记的优化研究。考察了f i t c 与壳聚糖反应的主要影响因素，观察了荧光标记对纳米粒子表征和转染效率的影响，建立一种快速、稳定并且适宜壳聚糖纳米载体示踪的荧光标记方法。壳聚糖纳米粒子表征和转染效率实验显示最佳的壳聚糖标记条件是反应物壳聚糖与f i t c 的添加比例为2 5 ：l ，在p h 值7 5 室温2 5 反应4 小时。6 、精氨酸修饰壳聚糖载基因支架血管内基因转运的研究。细胞转染实验显示，支架表面细胞及支架邻近细胞大量转染，远离支架细胞未见转染。动物实验结果显示，支架植入部位荧光素酶高表达，同时有2 只动物肝脏标本有微量表达，其他部位未见表达。精氨酸修饰壳聚糖质粒d n a 支架有望成为一种新型有效的血管内基因转运体系。关键词：壳聚糖，精氨酸修饰的壳聚糖，n 亚甲基磷酸化壳聚糖，非病毒载体，基因转染a bs t r a c tc h i t o s a ni san a t u r a l l yo c c u r r i n gc a t i o n i cp o l y s a c c h a r i d ew i t hg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a t i o n ，l o wi m m u n o g e n i c i t ya n dn o n - c y t o t o x i c i t y c h i t o s a ni sc o n s i d e r e dt ob eag o o dc a n d i d a t ef o rn o n v i r a lv e c t o r , s i n c ec a t i o n i c a l l yc h a r g e dc h i t o s a nc a ne f f i c i e n t l yc o n d e n s en e g a t i v e l yc h a r g e dd n at of o r mp o l y e l e c t r o l y t ec o m p l e x e sv i ae l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n ，f a c i l i t a t i n gt h et r a n s p o r to ft h e r a p e u t i cg e n e sa c r o s st h ec e l lm e m b r a n e i nt h i st h e s i s ，t w on o v e ln o n - v i r a lv e c t o r s ，a r g i n i n e m o d i f i e dc h i t o s a n ( a r g c s )a n dn - m e t h y l e n ep h o s p h o m cc h i t o s a n ( n m p c s ) ，w e r ed e v e l o p e d t h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ev e c t o r s ，t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ev e c t o r sa n dp l a s m i dd n aa n dg e n et r a n f e c t i o na c t i v i t i e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h ep a r a m e t e r so fl a b e l i n gc h i t o s a n d n an a n o p a r t i c l e sw i t hf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t ew e r eo p t i m i z e d t h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no fa r g c s d n an a n o p r t i c l e s ( a c d n p s ) c o a t e ds t e n ti ne n d o v a s c u l a rg e n ed e l i v e r yw a ss t u d i e d t h ew o r km a i n l yf o c u so nt h ef o l l o w i n gp a r t s ：1 s y n t h e s i so fa r g - c sa n di n t e r a c t i o n sb e t w e e na r g c sa n dd n a t h ef o r m a t i o no fa r g c sa n dt h ep r o p e r t i e so fa r g c s d n ac o m p l e x e sw e r ei n v e s t i g a t e d f t i ra n d1 cn m rs p e c t r ar e s u l t ss h o w e dt h a ta r g i n i n ew a sc h e m i c a l l yc o u p l e dt oc h i t o s a nt of o r ma r g i n i n e m o d i f i e dc h i t o s a nc o n j u g a t e s c ds p e c t r ai n d i c a t e dt h a tt h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t hc h i t o s a nm e r e l yc a u s e das l i g h tp e r t u r b a t i o no fd n ab o n d sa n dd n as t i l lr e m a i n e db - c o n f o r m a t i o nw i t h i nt h ec o m p l e x e s t e m ，a f ma n dd l sr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ec o m p l e x e sw e r en e a r l ys p h e r e sw i t hm e a nd i a m e t e ra b o u t8 0 - 15 0 n m w h i c hi sv e r ys u i t a b l ef o rg e n ed e l i v e r y 2 g e n et r a n s f e c t i o nm e d i a t e db ya r g c s l u c i f e r a s ee x p r e s s i o nm e d i a t e db ya r g - c sw a sg r e a t l ye n h a n c e dt oa b o u t10 0f o l d sc o m p a r e dw i t ht h el u c i f e r a s ee x p r e s s i o nm e d i a t e db yc h i t o s a n m t ta s s a yi n d i c a t e dt h a ta r g c sw a sas a f en o nv i r a lv e c t o r 3 s y n t h e s i so fn m p c sa n di n t e r a c t i o n sb e t w e e nn m p c sa n dd n a f t i ra n d1 3 cn m rs p e c t r aw e r eu s e dt os t u d yt h es t r u c t u r eo fn m p c s n m p c s d n ac o m p l e x e sw e r eo b t a i n e du s i n gac o m p l e xc o a c e r v a t i o np r o c e s s ，c h a r a c t e r i z e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sr e t a r d a t i o na s s a yf o rt h e i rs t a b i l i t i e s ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) a n dl a s e rs i z ea n a l y s i z e ro b s e r v a t i o nf o rm o r p h o l o g ya n ds i z e ，r e s u l t ss h o w e dt h a ta tc h a r g er a t i o2 ：1o ra b o v e d n ac o u l db ec o m p l e t e l ye n t r a p p e da n ds p h e r i c a lc o m p l e x e sw i t hm e a ns i z eo f8 0 2l0 n mw e r ef o r m e d 4 g e n et r a n s f e c t i o nm e d i a t e db yn i v l p c s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c i e sw e r es t r o n g l yd e p e n d e n to nt h ec h a r g er a t i oa n dp hv a l u eo fc u l t u r em e d i u m ，f o rh e l ac e l l s ，t h eh i g h e s te f f i c i e n c yo b t a i n e da tr a t i oo f4 ：1a n dp h6 2w a sg r e a t l yh i g h e rt h a nt h a tf r o mc s d n ac o m p l e x e so rn a k e dd n aa n da p p r o x i m a t et ot h a tf r o mp e i d n ac o m p l e x e s p o l y m e r i n o r g a n i cs a l tt y p en m p c s c av e c t o rs h o w e ds o m es i m i l a r i t i e sw i t ht r a d i t i o n a lc a - p ，g i v i n gh i g he f f i c i e n c i e sp r o b a b l yo w et op o s i t i v er o l eo fc a 计i o nc h a n n e l 5 o p t i m i z a t i o no ft h ea s s a yf o rl a b e l i n gc h i t o s a n d n an a n o p a r t i c l e sw i t hf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e t oa c h i e v et h ea p p r o p r i a t en a n o p a r t i c l es i z ea n dc e l lt r a n s f e c t i o ne f f i c a c y , t h ef c n ps h o u l db ep r e p a r e dw i t ht h ef i t c - c h i t o s a nl a b e l e db yi n c u b a t i n gt h ef i t ca n dc h i t o s a ni nap h7 5s o l u t i o na t2 5 f o r4h o u r sw i t ht h em o l a rr a t i oo fc h i t o s a nt of i t cb e i n g2 5 ：1 6 s t u d yo na r g - c s d n an a n o p r t i c l e s ( a c d n p s ) c o a t e ds t e n ti ne n d o v a s c u l a rg e n ed e l i v e r y i na10c e l lc u l t u r e ，t h ea c d n p - s t e n t sw i t hp l a s m i dp l r e s e g f pi n d u c e dh j 【g hl e v e lo fg f pe x p r e s s i o ni nc e l l sg r o w no nt h es t e n ts u r f a c ea n da l o n gt h ea d j a c e n ta r e a i na n i m a ls t u d i e s ，l u c i f e r a s ea c t i v i t yw a so b s e r v e do n l yi nt h er e g i o no ft h ea r t e r yi nc o n t a c tw i t ht h ea c d n p - s t e n t s ( h i g he x p r e s s i o n ) b u tn o ti na d j a c e n ta r t e r i a ls e g m e n t so ra tt h ed i s t a lo r g a n s ( 2l i v e rs a m p l e ss h o w e dl o wl u c i f e r a s ea c t i v i t y ) a r g - c s d n an a n o p r t i c l e s ( a c d n p s ) c o a t e ds t e n t sd e m o n s t r a t eg r e a tp o t e n t i a la san o v e la n de f f e c t i v ee n d o v a s c u l a rg e n ed e l i v e r ys y s t e m k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，a r g i n i n e - m o d i f i e dc h i t o s a n ( a r g c s ) ，n m e t h y l e n ep h o s p h o n i cc h i t o s a n ( n m p c s ) ，n o n v i r a lv e c t o r , g e n ed e l i v e r y独创性声明本入声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下迸行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盈大生或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：朱敦而签字日期：沙。8 年1 月t 产日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权苤盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：婪弘乡已签字 j 期：加醴年i 月f u 目刷礁轹蜘1z签字日期：渺矿年月f 日第一章绪论1 1 引言1 1 1 基因治疗的概念第一章绪论人类的疾病，除了急性外伤等特殊情况之外几乎都和基因的变异或突变有不同程度的关系。现在已经知道的遗传性疾病已有5 0 0 0 种以上。其他的后天性疾病，如心脏病、癌症、糖尿病、关节炎、神经系统疾病以及传染病等均在不同程度和基因的异常相关连，因此，采用基因治疗纠正异常的基因来防治疾病是很诱人的，在逻辑学上也是很合理的。基因治疗( g e n et h e r a p y ) 是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术【l 。】。它针对的是疾病的根源一异常的基因本身。目前基因治疗研究已经广泛应用于遗传病、肿瘤和病毒性疾病，并且取得了一定的成功，成为生命科学领域里的一个研究热点卜丌。1 1 2 基因治疗的历史回顾及我国的研究现状19 9 0 年，美国用腺苷酸脱氨酶( a d e n o s i n ed e a m i n a s ed e f i c i e n c y , a d a ) 基因治疗了一位因a d a 基因缺陷导致严重免疫缺损( s e v e r ec o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c gs c i d ) 的4 岁女孩，致使世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮惮j 。经过十几年的发展，基因治疗已取得初步的临床疗效，例如2 0 0 0 年法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使1 1 名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，尽管后来有一名儿童忠了白血病，但这仍是近十年来基因治疗取得的最大成功。目前每年用于基因治疗上的总投资在1 0 亿美元左右，主要集中在美国，其次是欧洲，到2 0 0 1 年底全世界已批准了近6 0 0 个基因治疗临床试验方案，癌症居首位，共3 7 8 个方案，占总数的6 9 ，其次是单基因疾病、心血管病、传染性疾病( 主要是h ) 、基因标记和其他疾病，如图1 1 所示。美国从1 9 9 5 年前后陆续成立了1 0 大基因治疗公司，1 9 9 9 年约有3 0 家基因治疗的专业公司，到2 0 0 0 年达到近1 0 0 家。一旦基因治疗产品被商业化推出，将带动一批基因治疗药物上市，基因治疗将迅速形成巨大的产业p 】。第一章绪论一”“”“”“”“5i啦，恕。! 霪勰i 雾釜囊渤。，我国基因治疗基础研究和临床试验开展得较早，起点也不低，早在七十年代，曼呈院士就对遗传性疾病的防治提出了基因 f 疗的问题，1 9 8 5 年再次撰文指出基因治疗的重要目标是肿瘤。我国是世界上较早丌展基因治疗临床试验的国家，临床试验基本与世界同步，1 9 9 1 年我国首次对b 型血友病进行基因治疗临床试验，这也是我国第一个萆因治疗临床试验方案，之后我国对多种重大疾病展开了基因治疗基础和临床试验，如上海肿瘤医院正在开展恶性脑胶质瘤基础与临床试验研究：军事医学科学院对恶性肿瘤、梗塞性血管病和病理性瘢痕基因治疗进行了大量的基础研究；北京大学医学部利_ | j 抗原肽治疗肝癌进行了大量的基础研究；第二军医大学将d c 细胞疫苗以及肿瘤细胞与抗原递呈细胞融合疫苗基因治疗肿瘤，具有良好的疗效，此外，他们利用细胞因子进行基因治疗也做了大量的基础研究：四j i l 大学利用异种免疫基因治疗荷瘤小鼠具有良好的抗肿瘤新生血管作用：深圳市赛百诺萆因技术有限公司研究开发的重组腺病毒一p 5 3 抗癌注射液治疗多种恶性肿瘤已取得了重大的突破；这些基础研究和临床试验提高了我国基因治疗的整体水平【l ”“j 。2 0 0 4 年1 0 月1 6 口，世界上首个基因治疗药物，由深圳市赛百诺基凶技术有限公司研制开发的抗癌新药一一重组人p 5 3 腺病毒注射液( 商品名“今又生”)在中国问世了，秩得了国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制年口产业化方面已达世界领先水平，在国际竞争中抢占了先机。第一章绪论1 1 3 基因治疗的途径基因治疗常用途径有两种，即体内疗法( i nv i v o ) 和离体疗法( e xv i v o ) 。体内疗法是将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗目的，这是一种简便易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是基因转染率较低。目前研究和应用较多的还是体外疗法，即先在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物，以达到治疗目的【l2 l 。根据基因转移的受体细胞不同，基因治疗又可以分为两种途径：生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。生殖细胞基因治疗( g e r mc e l lg e n et h e r a p y ) ，是将正常基因转移到患者的生殖细胞( 精细胞、卵细胞中早期胚胎) 使其发育成正常个体，显然，这是理想的方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。基因的这种转移一般只能用显微注射，然而效率不高，并且只适用排卵周期短而次数多的动物，这难适用于人类。而在人类实行基因转移到生殖细胞，并世代遗传，又涉及伦理学问题。因此，就人类而言，目前多不考虑生殖细胞的基因治疗途径：体细胞基因治疗( s o m a t i cc e l lg e n et h e r a p y ) ，是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因位点，用正常的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对特定座位基因转移，目前还有很大困难。体细胞基因治疗不必矫正所有的体细胞，因为每个体细胞都具有相同的染色体。有些基因只在一种类型的体细胞中表达，因此，治疗只需集中到这类细胞上。其次，某些疾病，只需少量基因产物即可改善症状，不需全部有关体细胞都充分表达。基因治疗与目前常规治疗方法不同。目前对疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源：异常的基因本身。1 1 4 基因治疗的策略随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展 1 3 】。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致可分为以下几种：1 、基因置换( g e n er e p l a c e m e n t ) ：基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的d n a 完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。2 、基因修复( g e n ec o r r e c t i o n ) ：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列第一章绪论纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。3 、基因修饰( g e n ea u g m e n t a t i o n ) 又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式，如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。4 、基因失活( g e n ei n a c t i v a t i o n ) ：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。如利用反义r n a 、核酸酶等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。5 、免疫调节( i m m u n ea d j u s t m e n t ) ：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素一2导入肿瘤病人体内，提高病人i l 2 的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。6 、其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性，采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损伤力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性g c v 药物，由于只有含h s v - t k 基因的细胞才能将c g v 转化成有毒的药物，因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。总之，基因治疗的策略较多，不同的方法在实践中各具有优缺点。而基因的治疗本身也并不局限于遗传病的治疗，现已扩展到肿瘤、病毒性疾病等。基因治疗可用于疾病的治疗，也可用于疾病的预防。应该指出的是基因治疗并不是万能的，尚不能取代现有的治疗方法，作为一种新的方法也还有一些需进一步完善的地方，在实践是应相互结合，取长补短，以取得较好的治疗效果。1 1 5 基因治疗的步骤基因治疗的步骤包括目的基因的准备、受体细胞的培养、载体的选择、目的基因导入靶细胞以及转导细胞的选择和鉴定等。目的基因的准备：根据基因治疗的不同需要，目的基因可以选择一种人体正常的基因( 如编码低密度脂蛋白受体的基因，治疗家族性高胆固醇血症) ，也可以是人体基因组中根本不存在的一种野生型基因( 如水痘一带状疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶- - t k 的编码基因与药物前体转化的抗肿瘤基因治疗) 。目的基因可以是c d n a ，也可是染色体基因组基因。因绝大部分体细胞不存在选择基因，因此为了解和监测体内转导细胞的位置、寿命和功能，并与体内自身细胞相区别，4第一章绪论除目的基因外，一般还选用一个标记基因( m a r k e rg e n e ) ，或称报道基因( r e p o r t o rg e n e ) 。受体细胞的培养：选择受体细胞作为基因转导的靶细胞也是基因治疗成败的一个关键因素。可供选择的细胞种类很多，但必须具备容易取出，容易培养，容易移植，寿命较长或具有自我更新能力，数量足够等条件。可以是病变发生细胞，也可以是非病变发生细胞。根据疾病的性质，基因治疗的策略，靶细胞常选择淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、甚至是肿瘤细胞。载体的选择：目的基因本身一般不含启动子等调控基因序列，必须将目的基因重组于表达载体的合适位置再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达载体包括非病毒载体和病毒载体两大类，非病毒载体与目的基因重组后所形成的重组表达载体，通过物理的、化学的或融合的方式导入靶细胞内而特异表达。病毒载体与目的基因重组后形成重组表达载体，导入p a 31 7 包装细胞中进行包装以后，即形成具有感染能力的假病毒颗粒( p s e u d o v i r a lp a r t i c l e ) ，这种假病毒颗粒感染靶细胞的同时，也将目的基因导入靶细胞内，以实现目的基因的转移。将目的基因导入靶细胞：可分为物理、化学、融合、非病毒及病毒载体方法四大类。前四种方法基因转移的效率很低，仅在1 0 1 0 之间，病毒载体法的基因转移率则很高，在合适的条件下可达到1 0 0 。目前基因治疗研究中，各种方法都有重要应用，有时几种方法交替应用。细胞的选择和鉴定：由于基因转移技术的限制，目前尚达不到1 0 0 的转导效率，因此有必要将转导细胞和未转导细胞加以区别并鉴定之。常用方法包括标记基因技术，基因缺陷型细胞的转染和选择，基因共转染技术，分子杂交，外源基因表达产物的鉴定等。具体过程如图1 2 所示 1 4 】( 以阳离子非病毒载体为例体现细胞转染的整个过程) 。第一章绪论+p o l y c a t i o n i cv e c t o r s- - - - - - - - 一b a r r i e r st os y s t e m i cd e l i v e r ye x p r e s s e dp r o t e i n图1 - 2 非病毒载d n a 复合物的转基因过程示意图f i g 1 2b i o l o g i c a lb a r r i e r st og e n et h e r a p y , ( 1 ) c o m p l e xf o r m a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n ，( 2 ) t r a n s p o r ti nb l o o dc i r c u l a t i o n ，( 3 ) u p t a k e e n t r yi n t ot h ec e l l ，( 4 ) r e l e a s ef r o me n d o s o m e ，( 5 ) d i s s o c i a t i o nf r o ms y n t h e t i cv e c t o r ，( 6 ) t r a n s i tf x o mc y t o p l a s mt on u c l e u s ，( 7 ) u p t a k e e n t r yi n t on u c l e u sa n d ( 8 ) 廿a n s g e n ee x p r e s s i o n 1 1 6 基因转运递送过程1 1 6 1 转运递送过程的障碍基因递送的确切障碍依赖于所采用的基因治疗策略，转基因可以应用于体内或体外研究，目前体外实验策略的优势在于可以避免许多体内存在的生物学屏障，可通过移除目标组织或体外转染靶向细胞，通过合理地选择和设计以提高宿主细胞被转染比例的过程，最终将所存活的被转染的靶细胞再移植于体内。可是体外基因递送方式中仍存在许多潜在的障碍。主要包含体外转基因表达效率的诸多限制条件，选择中的时间和劳力密集型过程，该过程通常导致显著的组织缺失及体内变性细胞的再引入1 1 5 】。治疗基因作为药物发挥作用首先必需克服两大障碍：( 1 ) 胞外屏障，主要指注射载体后到达靶细胞过程的影响因素，包括细胞吞噬系统，胞外基质、降解酶等；( 2 ) 胞内屏障，主要指细胞膜、内涵体( e n d o s o m e ) 、溶酶体( 1 y s o s o m e ) 及核膜对靶基因进入核内有效表达的影响。1 、细胞外的障碍体内基因递送体系的细胞外障碍是从注射点到靶细胞表面间所遇到的制约性因素。基因纳米粒子进入体内后首先要克服的是细胞外的这些不利于纳米粒子到达靶细胞的系统性因素，如受细胞外核酸酶的降解，体内网状内皮细胞的吞噬6二an第一章绪论清除作用，d n a 与非病毒载体的复合物也可能与血清蛋白相互作用使其在滞留在体内很细的毛细血管 16 1 ，且反复的体内应用还可能会引起抗核酸抗体的产生，激活免疫反应。同时载体基因复合物的稳定性对于延长循环时间是必要的，对特定靶向细胞更是必需的，因为保护性的静电双层在高离子强度的溶液中被减弱，纳米颗粒在离子溶液中可快速聚集。另外，对阳离子非病毒载体而言，带正电的复合物易与细胞外基质、细胞膜表面和血浆蛋白( 都为电负性物质) 发生非特异性反应，且带正电荷的基因纳米粒子可能会非特异地结合在体内的其他非靶细胞上，并被这些细胞非特异性地吞噬。体系的稳定性可通过在阳离子脂质或阳离子聚合物表面形成亲水性的“刷子层”而得到改善，从而降低自身或非自身造成的非特异性反应。2 、细胞内的障碍阳离子脂质体和阳离子聚合物可通过两种途径进人细胞。一种途径是与细胞膜表面的蛋白多糖发生静电介导的反应；另一种途径是在配体一受体结合时发生的以受体介导的内吞作用。这两种方法最终结果都可导致复合物被摄入囊泡，其内涵物部分递送给溶酶体。细胞内障碍存在于基因递送过程中所经历的与细胞膜结合、内涵体释放、向细胞核的转运、进入细胞核和定向摄取等各个方面。( 1 ) 细胞膜由极性头部朝向水相，疏水性非极性尾部相对的磷脂双分子层组成了生物膜的基本骨架，蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双分子中或结合在其表面，就构成了细胞膜的基本结构。经过细胞膜的物质转运有主动运输，被动运输以及胞吞和胞吐作用。10 0 5 0 0 r i m 的基因纳米粒子主要是通过细胞内吞作用进入细胞的，可以是受体介导的也可以是非受体介导的。( 2 ) 内涵体一溶酶体复合物纳米粒子被细胞内吞后形成内涵体，在内涵体的膜上通常伴随着质子泵的活动，使内涵体中p h 值下降，若是受体介导的细胞内吞在酸性环境中将发生受体与配体的分离，受体经过内涵体的循环后又会回到细胞表面。含有内吞物的内涵体可与溶酶体融合，而溶酶体中的各种酸性水解酶可以对内吞物降解，溶酶体上也有许多质子泵，使溶酶体内的氢离子浓度可以高出细胞质近一百倍。( 3 ) 细胞质在细胞质中存在着对复合物扩散阻力以及酶的降解作用，液相的细胞质中包埋着由微丝，微管和中间丝所组成的细胞骨架成分，还溶解有许多生物大分子和一些小的有机或无机分子。若载体d n a 复合物纳米粒子能从内涵体一溶酶体逃逸，就需要经过重重扩散阻力到达核孔附近。同时还需要抵抗细胞质中核酸酶的降解作用，目前的研究尚未清晰说明d n a 在这个过程中是否与载体解离，以及何时解离。若d n a 在进入细胞核之前已与载体解离，则d n a就可能被细胞质中的核酸酶所降解。因此应尽量在载体与d n a 解离前复合物应第一章绪论到达细胞核，以保护d n a 不被细胞质中核酸酶所降解。( 4 ) 核膜核膜是由内外两层平行但不连续的单位膜构成，分内层核膜和外层核膜，两层核膜厚度均为7 5 n m ，都相当于细胞膜的厚度，中间是2 0 - - 一4 0纳米的核周间隙，内外层核膜在某些部位相互融合形成环状开口，成为核孔，核孔上镶嵌着核孔复合体，在真核细胞细胞周期中核膜有规律的解体和重建。在分裂期崩解，在分裂末期又形成。通过核膜的物质运输只能通过核孔，包括主动运输和被动运输。被动运输时核孔复合体作为被动扩散的亲水通道其有效直径是9 1 0 i 蛐即相当于允许相对分子质量在4 0 1 0 3 到6 0 x 1 0 3 以下的蛋白质分子自由通过核孔。但有些小分子由于带有含信号功能的氨基酸序列可以通过主动运输进入细胞核。通过核孔复合体的主动运输有亲核蛋白的核输入如组蛋白，核糖体蛋白以及d n a 和r n a 的合成酶，r n a 分子及r n p 颗粒的核输出等，具有高度的选择性且是双向的。主动运输颗粒比被动运输大，达到2 6 n m 目1 核孔复合体的有效直径的颗粒均可被调节。通过核孔的运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要消耗能量且是双向的。由此可见较大的物质不能通过被动运输通过扩散作用入核，只能通过主动运输进入细胞核。显然易见，基因纳米粒子之所以转染效率较低是因为需要跨越细胞体内重重障碍，抵抗各个阶段核酸酶的降解作用。自然界中的病毒却可将自己的遗传物质高效地运送到靶细胞核，并能整合到细胞基因组中达到稳定的表达，且随着细胞的分裂而复制分裂。此外，体内的一些激素也可以特异地进入细胞核发挥作用。对这些生物体中存在的分子及它们进入细胞核的内在机理的了解，可为提高载基因纳米粒子的转染活性和效率提供一些思路。1 1 6 2 基因转染过程中复合物跨越各道障碍的可能方法和途径在转染过程中复合物能否跨越各道障碍决定了基因纳米粒子能否顺利到达特定靶细胞的细胞核而使得特定的有效或治疗基因得以表达，达到治疗的目的，从基因纳米粒子随血液进入体内到被特定的靶细胞吞噬，首先需要克服的是其与血浆蛋白的相互作用，因为此种相互作用的增强可能会加速其在体内的清除。其次是要抵抗核酸酶的降解，此外还要减少非特异细胞的摄入。这首先要求基因纳米粒子要有适当的粒径和z e t a 电位，粒径的大小与它被网状内皮细胞细胞吞噬清除及在血管中滞留的几率有关。z e t a 电位是指基因纳米粒子表面所带静电荷的多少，一般为正电而使得其可以通过与细胞膜表面负电荷的相互作用黏附在细胞表面，有利于被细胞内吞。z e t a 电位同时还影响纳米粒子与血浆蛋白间的相互作用，通过静电相互作用与细胞表面的结合是一种非特异的结合，如果所带的电荷过大会使纳米粒子与非靶细胞的结合过多，使到达靶细胞的纳米粒子减少，同时增加第一章绪论对细胞的毒。自然界中许多物质是通过受体和配体之间的相互作用与细胞的特异性结合，可以通过在纳米粒子上偶连上与靶细胞表面特异结合的分子。在基因转染研究中对壳聚糖进行半乳糖化修饰，将其与d n a 制成复合物对h e l a 细胞进行转染，正是基于此种相互作用【1 7 】。同时通过z e t a 电位与细胞表面的非特异结合的静电作用，有助于受体配体之间的相互靠近而产生特异结合。因此必定存在一个最适宜的z e t a 电位可使特异的细胞结合最多。以壳聚糖为例，粒径和z e t a 电位的大小与n p 比值及其的分子量、脱乙酰度等有关【1 8 ，1 9 】。聚乙二醇的修饰可以减小纳米粒子与血浆蛋白间的相互作用【z 。( 1 ) 穿过细胞膜有包膜的病毒是通过包膜与细胞膜之间的融合，将病毒的内容物释放入细胞，而没有包膜的病毒主要是通过受体介导的细胞内吞作用。体内还有多种受体和非受体介导的细胞内吞作用首先都始于受体和配体间的特异结合或者是非特异地黏附在细胞表面。因此为了实现高效而特异的靶向运输，可以在纳米粒子上偶连上各种特异的配体。在肝癌细胞，卵巢癌细胞的表面有较多的叶酸受体，可在纳米粒子上用叶酸作为配体【2 1 1 。在白血病细胞的表面有较多的铁传递蛋白的受体，可在靶细胞是白血病细胞的纳米粒子上偶连上铁传递蛋白【2 2 】。另外还有在t 细胞的表面有较多的c d 3 分子【2 3 1 ，在许多上皮细胞癌的细胞表面有许多表皮生长因子的受体【2 4 1 。同时可以用长的烷基链修饰壳聚糖增加它对细胞膜的扰动作用，有利于复合物粒子进入细胞。( 2 ) 内涵体一溶酶体逃逸当载基因纳米粒子进入细胞后形成内涵体，由于内涵体膜上有质子泵活动使其p h 下降，然后内涵体与溶酶体融合，p h 值进一步降低，同时还得抵抗溶酶体中酸性核酸酶的降解作用。多肽在酸性环境中会发生构象变化，构象变化后的多肽可以使溶酶体的膜破裂 2 5 ，2 6 | 。这些小分子多肽的偶联可能会有利于载基因纳米粒子从内涵体溶酶体中逃避。另一种关于内涵体逃避是通过质子海绵作用实现的，即进入溶酶体的基因载体上有仲胺和叔胺基团，在质子泵活动使得p h 值下降的过程中，这些基团有缓冲作用，可以结合游离的氢离子，使p h 值下降延缓，从而使溶酶体中的酸性核酸酶失去活性。由于这种缓冲作用的存在，质子泵持续活动，氢离子进入溶酶体的数量不断增加，在电荷的作用下也有大量的氯离子进入溶酶体中，最终会由于渗透性膨胀，使溶酶体膜破裂。其他的一些学者认为长的疏水性碳链的修饰可以破坏溶酶体的膜结构。一些药物的使用也可以使基因纳米粒子免受核酸酶的降解，如氯喹是可以穿过溶酶体膜的碱性药物，可以中和氢离子，使溶酶体中的p h 值不下降，从而使酸性的水解酶不能发挥作用，保护基因纳米粒子免受核酸酶的降解 27 1 。( 3 ) 沿细胞质的扩散以及抵抗细胞质核酸酶的降解先前的诸多研究表明将质粒d n a 注射入细胞核中报告基因的表达要比将质粒d n a 注射入细胞质中表9第一章绪论达量高1 0 0 1 0 0 0 倍【2 8 ，2 9 1 ，过去对这个现象的解释是由于核膜的作用，近期研究认为是细胞质中核酸酶的降解