（环境科学专业论文）利用活性污泥生物合成聚羟基丁酸酯的研究.pdf

a b s t r a c t p o l y d h y d r o x y b u t y r a t e ( p h b ) i sa ni n t r a c e l l u l a rs t o r a g es u b s t a n c ep r o d u c e db ya l a r g ev a r i e t yo fb a c t e r i a i th a sa t t r a c t e di n t e r e s t 勰b i o d e g r a d a b l ep l a s t i c sn o to n l y b e c a u s eo fi t sc o m p a t i b l em a t e r i a lp r o p e r t i e sl i k es y n t h e t i ct h e r m o p l a s t i c sb u ta l s o b e c a u s eo fi tc o u l db es y n t h e s i z e df r o mr e n e w a b l er e s o u r c e t h em i c r o o r g a n i s m si n a c t i v a t e ds l u d g ew e r ea b l et oa c c u m u l a t ep h bi nt h ef o r mo fi n t r a c e l l u l a rs t o r a g e p o l y m e r s t h ep r o d u c t i o no fp h bf r o mr e s i d u a ls l u d g e ，t h e r e f o r e ，i san e ww a yf o r p h bs y n t h e s i s ，w h i c ha l s od e v e l o p san o v e lp a t h w a yf o rt h er e c l a m a t i o no fr e s i d u a l s l u d g e as e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o rw a sc o n d u c t e db ya e r o b i cd y n a m i cf e e d i n gw i t h a c e t a t ea sc a r b o ns o u r c et od o m e s t i c a t ea c t i v a t e ds l u d g et oe n r i c hp h b a c c u m u l a t i n g m i c r o o r g a n i s m s a n dt h ea c e t a t er e m o v a l ，p h ba c c u m u l a t i o na n dt h ea c t i v a t e d s l u d g eg r o w t hi nat y p i c a lc y c l ew a s a l s os t u d i e d a f t e rb e i n gd o m e s t i c a t e d ，t h eu n b a l a n c e dg r o w t ho fa c t i v a t e ds l u d g ea n dt h e p h ba c c u m u l a t i o nw a sr e s e a r c h e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf e e d i n gb yh i g ha c e t a t e d o s a g eo f9 31 5 m gc l ，t h ea c t i v a t e ds l u d g eg r e wu n d e ru n b a l a n c i n gc o n d i t i o n t h e i n c r e a s eo fa c t i v a t e ds l u d g eb i o m a s si sm a n l yd u et ot h ea c c u m u l a t i o no fp h b d u r i n gf e a s tp e r i o d ，9 4 a c e t a t ew a sr e m o v e d ，i nw h i c haf r a c t i o no f5 3 4 o f a c e t a t ew a st r a n s f o r m e dt op h b t h ea p p a r e n ti n c r e a s eo fa c t i v a t e ds l u d g ew a s 8 8 0 m g l ，i nw h i c ht h ei n c r e a s eo f p h bc o n t e n ti s8 3 6 m g l t oi m p r o v et h ep h bc o n t e n ti na c t i v a t e ds l u d g ea n dt of i n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o nf o rp h bs y n t h e s i z a t i o n t h r e ec r i t i c a lf a c t o r s ：d i s s o l v e do x y g e n , c a r b o n c o n c e n t r a t i o n ，a n dm t r o g e nd e f i c i e n c yw a se v a l u a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t o ) t h e r a t eo fs u b s t r a t eu p t a k e a sw e l la st h ec o n t e n to fp h bi n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f d i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o n , b u th i g hd os u p p l yr a t er e s u l t e di nd e c r e a s e dp h b y i e l d s f o rt h em o s te f f i c i e n tc o n v e r s i o no fa c e t a t et op h b ，am o d e r a t ed i s s o l v e d o x y g e ns u p p l ya p p e a r st ob ea p p r o p r i a t e a tam o d e r a t ed i s s o l v e do x y g e ns u p p l yr a t e o f8 0 l h ( k l a8 9 31 h ) ，am u c hh i g h e rc o n v e r s i o no f0 7 6w a sr e a c h e w i t ht h e i n i t i a la c e t a t ei n c r e a s i n g ，t h em a x i m u mp h bp r o d u c t i o ni n c r e a s e dc o r r e s p o n d i n g l y f e e d i n gb y ah i g h d o s a g e a c e t a t eo f 8 0 0 m g c l ，w i t h af m ( f o o dt o m i c r o o r g a n i s m s ) o f2 5m gcl q m gcl ，p h bp r o d u c t i o nr e a c h e di t sm a x i m u m v a l u eo f1 0 7 0 m g la t8h w h e nf mr a t i oa b o v e2 5m gcl _ m gcl 一，p h b c o n t e n td i d n ti n c r e a s ea n y m o r e ，b e c a u s eo ft h el o n gt i m eo fs t o r a g er e a c t i o n ( e x c e s s8 n h o u r ) s u b je c t e dt on it r o g e n l i m i t i n gc o n d i t i o n s ，t h eg r o w t ho fa c t i v a t e ds l u d g ei s m a n l yd u et ot h es t o r a g eo fp h b ，y e tt h er e s i d u a lc e l lb i o m a s sd i d n ti n c r e a s e u n d e r t h en i t r o g e n - l i m i t i n gc o n d i t i o n ，t h em a x i m u mv a l u eo fp h bs t o r a g ew a s15 9 8 m g l ， 6 5 2 o fa c t i v a t e ds l u d g e k e yw o r d s ：a c t i v a t e d s l u d g e ，b i o s y n t h e s i sp o l y - p - h y d r o x y b u t y r i ca c i d , r e s o u r c e so fa c t i v a t e ds l u d g e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：德古尖象 签字日期： 2007 年月1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授 权墨鲞盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：德古尖震 一名：翅 签字日期：2 0 0 7 年月f 日 签字日期： l 6 月日 第一章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 人类通常是以材料的使用作为文明的一个重要里程碑。高分子材料的科技进 步给人类带来了巨大的物质文明，但是高分子化合物的不可降解性使得大量废弃 的高分子材料成为城市垃圾的主要来源之一。近年来，“白色污染”已成为一个家 喻户晓的热门话题，也是一个令人困扰、受到社会群起而攻之的问题。“白色污 染”一词最早来自对残留在农田壤中的地膜对农田和生态环境造成危害的比 喻。现在“白色污染”则泛指由废弃的塑料、泡沫等造成的污染f l 】。目前，全球 以石油为原料合成塑料的产量已达一亿吨以上，其中美国和欧洲各三千万吨，日 本约一千二百万吨，中国约三百万吨。然而，塑料制品的大量使用、回收率和塑 料垃圾处理率极低是形成白色污染的主要原因。据统计，全球每年产生的塑料垃 圾高达五千万吨，尤其是垃圾袋、餐具、食品包装和工业包装等一次性塑料废弃 物污染农田、旅游胜地和海岸港口，严重影响了生态环境，破坏了生态结构。另 外，农用地膜在田地中残留和累积也是造成“白色污染”的原因之一【2 】，例如：大 量使用农用地膜使耕地中不可分解的地膜残片积累，破坏土壤结构，影响农作物 的正常生长发育，造成农作物的显著减产。塑料废弃物填埋在地下，长期不会分 解，占地又多；焚烧处理时会释放有害气体，造成二次污染；再次回收利用难度 大，成本高。所以治理这种“白色污染”势在必行，自降解塑料问世以来受到人们 极大的关注。它将有望成为解决白色污染的根本途径。故此：许多国家已经致力 于可降解塑料特别是生物可降解塑料的研究开发。探索用可生物降解的制品替换 石油化学塑料的可能性【3 卅，使用可生物降解塑料不仅可以消除对环境的污染， 另一重大意义还在于它为塑料工业开辟了新的原料资源。石油和天然气将随着日 益使用而最终枯蝎，而农副产品、微生物资源则是取之不尽的再生资源。因此， 生物可降解塑料的研究开发无论从环境保护角度还是从资源开发角度来看，都具 有重大意义。 ， 可生物降解塑料是指那些在生物环境下，通常是在酶的作用下能被分解的塑 料。可生物降解指活的微生物如：细菌和真菌对营养底物的分解与吸收。这一过 程是在微生物分解的酶的催化作用下完成的，催化效率的高低依赖于环境因素， 诸如：温度、p h 、氧气和微生物的种类，以及高分子物的分子量，微生物仅能 利用代谢小分子物质，通过将硫键打开的方式可得到更多可代谢的物质，分子量 在5 0 0 - - 2 0 0 0 之间的有机物可促进微生物的生长【7 1 。降解塑料根据合成途径或降 第一章文献综述 解机理有以下几类：淀粉基生物塑料、光降解塑料、光一生物双解塑料和其他生 物降解塑料。淀粉基生物塑料由于价格和以及产品性能方面的原因导致其应用受 到很大限制：光解塑料和光一生物双解塑料这两类产品的优点是开始降解的时间 可控制，但完全降解的时间较长，最终产物是否会造成二次污染尚未得到确认【8 】； 其他生物降解塑料中有：天然高分子型生物可降解塑料，合成高分子型生物可降 解塑料，微生物合成型生物可降解塑料。 。 天然高分子型生物可降解塑料是利用生物可降解的天然高分子，如植物来源 的生物物质和动物来源的甲壳质等为基材制造的塑料 9 】。植物来源包括细胞壁组 成的纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、多糖类及碳氢化合物，动物来源就是虾、 螃蟹等甲壳动物【lo 】，其中以利用纤维素来生产可降解塑料的研究居多，但因纤维 素存在物理性能上的不足，由其单独制成的薄膜的耐水性、强度均达不到要求， 需通过与其它高分子如由甲壳质制得的脱乙酰基多糖等共混改性。如日本以纤维 素和脱乙酰基壳多糖进行复合，制得生物可降解塑料。目前s a l m o r a l t l l 】等正在研 究利用豆类产品来合成可降解塑料。 合成高分子型生物可降解塑料是指利用化学方法合成的生物可降解塑料。这 类产品具有比较大的灵活性，可通过研究合成与天然高分子生物可降解塑料结构 相似的塑料或合成具有有敏感降解官能团的塑料。通常合成主链上含有c - n 、 c o 等杂链的高分子比主链上只是c c 结构的高分子易于生物降解。聚乳酸就 是其中一种研究较多、性能较好的生物降解性塑料。它是通过乳酸化二聚物的化 学聚合或乳酸的直接聚合得到的聚合物。其制品在生活用品、医疗用品上得到了 广泛的应用。其降解产物是二氧化碳和水，不会造成二次污染。此外，聚乳酸还 具有优良的生物相容性，其降解产物能参与人体代谢，已被美国食品医药管理局 ( f d a ) 批准，可用作医用手术缝合线、注射用胶囊、微球及埋植剂等【1 2 1 。 微生物合成型生物可降解塑料是指微生物可把某些有机物作为食物来源，通 过发酵作用合成高分子。这类高分子主要有微生物聚酯和微生物多糖，具有生物 可降解性，可用于制造不污染环境的生物可降解塑料。近年来研究较多的就是这 种完全可生物降解的聚羟基脂肪酸酯( p i - i a s ) 的研究。 1 2 聚羟基脂肪酸酯 聚羟基脂肪酸酯是许多原核微生物在不平衡生长条件下合成的细胞内能量 和碳源储藏性物质。它作为“来自微生物技术的第一种塑料”，完全以可再生的 自然资源为原料，由微生物发酵法合成，不仅具有类似于化学合成塑料的理化性 质，能纺丝、压膜、注塑等，而且同时具有化学合成塑料所不具备的生物可降解 2 性( 彻底分解成二氧化碳和水) 和生物相容性。其分子通式可表达如下 oi 廿c p 其中x = 1 ，2 或3 ，n 为单体数目r 代表侧链，多为c l c 1 3 正烷基，也可以 是支链的不饱和的或带取代基的烃基。当f l ，r 为甲基时，为聚口羟基丁 酸酯( p o l y - 3 - h y d r o x y b u 咖t e ，p h b ) 是p h a s 中最常见且最重要的一种。根据 单体中碳原子的数目可咀将p h a s 分为：短链p h a s ( s h o r t - c h a i u - l e - n g t h p i l a s ，s c i p h a s ，单体为含3 - , 5 个碳原子的羟基脂肪酸) 和中链p h a s ( m e d i u m - c h a i n l e n g t h p h a s ，m c l p h a s ，单体为舍“1 4 个碳原子的羟基脂肪酸) 。目前发 现的p h a s 除p h b 为均聚物外，其它几乎均为共聚物。其中研究较为透彻的是 3 羟基丁酸( 3 h b ) 与3 羟基戊酸( 3 h v 的共聚物p h b v ( p o l y 一3 h y d r o x y b u t y r a t e - c o 一3 - h y d r o x y v a l e r a t e ) 。英国帝国化学公司( 蛔p e r i 旬c h e m i c a li n d u s t r y ) 已在8 0 年代实现了商品名为b i o p o l 的中等规模的工业化生产，b i o p o l 是一系列h v 含 量由0 3 0 的p h b v 共聚物。羟基丁酸与中链羟基烷酸的共聚物的研宄已成为 继p i - i b 和p u b v 后聚羟基鞋烷酸酯研宄中的热点m “】。 多种礅生物在一定条件下能积雾p h a s 作为碳源和能源，由于p h a s 具有地 溶解性和高分子量它在胞内的积累不会引起细胞渗透压的增加。因而，它是一 类理想的胞内储存物比糖原、多聚磷酸或脂肪酸更加普遍地存在于微生物中。 p h a s 以离敦的嗜苏丹的颗粒形式储存在于细胞中，这种颗粒可以在电子显微镜 下观察到，见图1 l 龟 图l1 扫描电子显微镜下微生物细胞内的p h a s 颗粒 、lm 0 第一章文献综述 1 2 1 聚羟基脂肪酸酯的性质 聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 是由生物发酵合成的热塑性聚酯，它不同于以蚕 丝和纤维素为代表的很多天然高分子，因其不熔化而不能象合成塑料那样熔化加 工成型。但p h a s 可以用合成塑料相同的方法进行加工成薄膜、容器、丝等，因 此在结构、性能上类似于化学合成的聚乙醇酸、聚乳酸、聚s 已内酯等脂肪族 聚酯。目前发现的p h a s 所有的单元都只是以r 型手性中心的形式存在，具有左 旋的口螺旋结构，从聚合物化学的角度说，就是所有这些聚合物都是全同立构 的。其中聚羟基丁酸酯( p h b ) ，是最广为人知的p h a s 聚酯系列的一种。早 在1 9 2 5 年法国巴斯德研究所的m l e m o i g n e 就在在巨大芽抱杆菌b a c i l l a s m e g a t h e r i u m 细胞中发现聚羟基丁酸酯( p h b ) 颗榭7 1 ，之后人们逐渐认识到 p h b 是一种广泛存在于微生物细胞中并作为其营养和能量储存物质与细胞代谢 的天然产物，p h b 具有多种优良的生物和理化性能：对人体无毒、完全的生物 降解性、可为人体吸收且与人体血液、组织相容，它还具有光学活性，是结晶性 聚酯，晶胞参数a = 0 5 7 6 n m ，b = 1 3 2 0 r i m ，c = 0 5 9 6 n m ( 轴向周期) ，没有对称中心， 使其表现出压电性【l5 1 。由于分子结构是等规立构，p h b 表现出高度结晶，其结 晶度达8 0 ，熔点18 0 0o c ，t 。约1 0 0 c ，从熔融态缓慢冷却可得很大的球晶。它 的某些物理性质与聚丙烯p p 很相似，它与聚丙烯的性质对比如表1 1 所示。 表1 1p p 与p h b 的性质对比 从表1 1 中可看出，p h b 比聚丙烯更硬和脆，断裂伸长p h b 为6 - - 8 ，聚丙 烯为4 0 0 。抗有机溶剂性也较聚丙烯差，但却有聚丙烯所不具备的优良的抗紫 外辐射性【1 6 1 。但抵抗溶解的能力却比聚丙烯差。然而，两者的主要差别在于p h b 4 第章文献综述 可生物降解，而p p 不能通过生物途径降解。在自然环境中，例如活性污泥、土 壤或海洋里、存在大量可分解p h b 的微生物，这些微生物可在菌体外分泌出p h b 的胞外降解酶：如a l c a l i g e n e sf a e c a l i st 1 可在菌体外分泌出同时水解水溶性的 3 羟基丁酸低聚物和非水溶性的p h b 的脂酶。p h b 经酶解后最终代谢为二氧化 碳和能量【1 7 】。p h b 在不同环境下降解速率有所不同，具体见表1 2 。 表1 2p h b 在不同自然环境中的生物降解性 p h a s 的降解速率与自然环境中的温度、p h 值均有关【l 引。另一方面，降解 速率与p h a s 的分子量大小，聚集态结构有关【1 9 1 ，因为聚集态表面结构影响微生 物在其表面的沉积和繁殖，从而也影响其生物降解速率。 聚羟基丁酸( p h b ) 是p h a s 中存在最广，发现最早且研究最透彻的一种， 据报道 2 0 】：i c i 公司采用天然土壤中微生物通过发酵过程生产，并把技术专利转 让给了孟山都公司。同时，m a s s a c h s e t t s 技术学院开始采用工程菌生产p h a s ， 并于1 9 9 2 年诞生了m e t a b o l i x 公司。m e t a b o l i x 公司于2 0 0 1 年从孟山都收购技术 专利并与自有成果进行了融合，于2 0 0 4 年与( a d m ) 公司签约，使p h a s 塑料推 向大规模工业化，计划建设5 万吨发酵装置以生产这种聚合物，定于2 0 0 8 年中 期建成。然而，以纯菌种发酵生产的成本过高，使之无法于普通塑料竞争市场。 如何开发廉价发酵生产工艺和提高p h a s 的产量成了研究的热点，为降低p h a s 的发酵生产成本，目前国内外也有一些研究者在研究利用污水处理厂的剩余污泥 制备p h a s 。 1 2 2 聚羟基脂肪酸酯的应用 聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 作为一种生物塑料具有多种用途：因为它不仅具有一 般合成塑料的理化性质，而且还具有它们所没有的生物相容性、生物降解性、水 解性、光学活性、压电性等： 聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 具有生物降解性，它能够以常用的热塑性塑料加工设 备制成各种制品，如可以熔融纺丝，吹膜和挤出片材。可制成各种一次性塑料用 第一章文献综述 品如购物袋、工业包装材料、妇女卫生用品和一次性尿布等，丢弃后不会造成环 境污染。如日本有公司用“b i o p o l ”生产单丝，用于制作标准养殖网，并在兵库县 水产试验场进行实用性试验，初步结果可被海水中微生物分解成c 0 2 和h 2 0 ， 可解决过去采用尼龙或维尼纶制的养殖网在海水中漂浮污染不降解的问题。 聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 具有良好的生物相容性，可在医学领域得到广泛应 用。聚羟基脂肪酸醋可用作可吸收手术缝线及药物缓释体系的载体。以聚羟基脂 肪酸酯作药物基材控制盐酸四环素的释放，可以治疗周期性牙病。含蕙酿结构的 抗癌药a c l a r u b i c i nh y d r o c h l o r i d e ( a c r h c l ) $ t 成p h b 微胶囊后，释放速率大大 降低【2 1 1 。聚羟基脂肪酸酯还可用作动物或人体组织的移植物。将其做成某些组织 的支架植入人体，当新的组织长出后，聚羟基脂肪酸酯逐渐降解，降解产物可被 人体吸收，不会产生过敏反应。聚羟基脂肪酸酯经过简单水解，还可与葡萄糖一 样在临床上进行口服和注射。如制成骨骼愈合支架，它的压电效应可以促进骨骼 生长和愈合。因为骨骼新组织生长压迫支架，这种压力可使聚羟基脂肪酸酯产生 电流，骨骼受到电流刺激而加速生长，很快愈合，支架不必再次手术取出，在一 定时间后可溶于体内。 聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 经一定时间的水解酯链可被分散切断，水解速度因聚 酯分子量的不同而有很大差异。分子量越大水解速度越慢。因此，聚酯的水解速 度可通过分子量来调整。利用这种生物降解性和水解性，用p h a s 膜将药物包起 来投放，成为可使药物长期缓慢放出的缓释系统。作为缓释体系的载体也可用于 农牧业，作为长效除荞剂、抗真菌剂、杀虫剂或肥料的缓释载体，特别是给大规 模农牧业带来极大方便【2 2 】。 以聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 为材料，可制成医用手术缝合线，伤口表面处理， 人造血管，药品的延缓荆等不会使人体不适，经，射线灭菌后，聚羟基脂肪酸酯 可制成无味、无菌的外科手套涂粉。在外科手术中，聚羟基脂肪酸酯还可与硬脂 酸钙、乳酸钙等一起作为缝线涂覆物，干燥和潮湿情况下均有良好效果。可以预 见，当生产成本降低之后聚羟基脂肪酸酯的应用范围将逐渐扩大。 1 3 聚羟基脂肪酸酯的生物合成与途径 1 3 1 合成聚羟基脂肪酸酯的微生物 能产生聚羟基脂肪酸酯的微生物分布极广，包括光能和化能、自养和异养菌 计6 5 个属中的许多种。其中最主要的有：产碱杆菌属( a l c a l i g e n e s ) 、假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、甲基营养菌( m e t h y l o t r o p h s ) 、固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 和红螺菌属 6 第一章文献综述 ( r h o d o s p i r i l l u m ) 等，见表1 - 3 2 3 。 表1 3 能够积累p h b 的主要微生物 表l 一3 中的微生物将分别利用不同的碳源产生不同的聚羟基脂肪酸酯。 1 3 2 合成聚羟基脂肪酸酯的碳源 糖类、脂肪醇、脂肪酸、碳氢化合物甚至二氧化碳和氢气的混合气体都可作 为碳源。见表1 4 【2 4 , 2 5 , 5 3 ：为不同菌种利用不同碳源产生不同聚羟基链烷酸酯的 部分结果。 表1 - 4 微生物利用不同碳源产生各种聚羟基脂肪酸酯 7 第一章文献综述 续表1 4 由表1 - 4 可知：真养产碱杆菌似1 e u t r o p h u s ) 在一定条件下积累p h b 可达细胞 干重的9 0 以上。 固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 和红螺菌属( r h o d o s p i r i l l u m ) 和ec o l i 重组菌都能利用 葡萄糖作碳源合成p h b 分别达细胞干重的7 0 4 和3 1 0 ，7 6 o 。 m e t h y l o c y s t i s p a r v a so b b p 利用甲烷作为碳源合成p h b 达细胞干重的7 0 。 r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s 和t h i o c y s t i sv i o l a c e a 都能利用乙酸作为碳源合成p h b 分别达细胞干重的6 9 9 和8 3 。a l c a l i g e n e sl a t u s 变异株和e r w i n i as p 重组菌 利用蔗糖作为碳源合成p h b 达细胞干重的7 0 左右。 此外；利用甲醇作碳源产生p h b 的最好结果的经鉴定为p r o t o m o n a s e x t o r q u n s 的甲基营养菌【2 6 1 。h y p h o m i c r o b i u mz a v a r z i n i i 利用甲醇作为碳源只能合 成大概4 肛5 9 的p h b 。 属于r r n a 同源组i 的大多数假单胞菌能利用烷烃作碳源合成聚羟基链烷酸 酯 2 7 1 。例如食油假单胞菌( p o l e o v o r a n s ) f l 皂利用辛烷合成聚羟基辛酸，也能分别利 用中等链长的单一烷醇或烷酸作唯一碳源产生不同链长烷酸的二元或三元共聚 物：还能利用烯烃1 作碳源产生含不饱和羟基酸为单体链节的聚合物以及利用 5 6 或7 甲基辛酸作辅助基质产生含支链的3 羟基链烷酸聚合物【2 8 1 。其它一些 菌如铜绿假单胞菌( p a e r u g i n o s a ) 还能利用葡萄糖酸合成中等链长羚基链烷酸聚 合物【2 9 1 ，d o i 实验室从土壤中分离的p s e u d o m o n a ss p 6 1 3 能以葡萄糖等糖类及 8 第一章文献综述 脂肪酸为碳源合成含c 4 - , c 1 2 偶数碳原子单体链节的脂肪酸醋共聚物【3 0 】。 p r e o s i n o v a n s 在限n 的恒化培养条件下以辛酸为底物合成含3 羟基丁酸3 羟基己 酸3 羟基辛酸3 羟基癸酸( 1 ：1 5 ：7 5 ：9 ) 的共聚物【2 引。 固氮菌产p h b 的早年研究以a b e ，e n n c m i 为代表，而近年来对利用糖蜜等 非纯净碳源产生聚羟基链烷酸酯的研究主要是棕色固氮菌a v i n e l a n d i i 。 深红红螺菌( r r u b a r u m ) 利用4 戊酸作碳源时生成的聚羟基链烷酸酯中 h b ，h v 和3 羟基- 4 戊烯酸的克分子百分数分别为l l ，5 9 和3 0 t 3 1 】，还发现：在分 类上属于红球( r h o d o c o c c u s ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 和棒杆菌属( c o r y h e b a c t e r i u m ) 中的一些菌能利用葡萄糖或其它单一碳源产生含h v 和h b 的聚羟基链烷酸酯 2 9 1 o 微生物利用不同碳源产生各种聚羟基脂肪酸酯，这正是微生物代谢多样性的 一种表现。它们合成的途径也有差异。 1 3 3 不同微生物合成聚羟基脂肪酸酯的合成途径不同 在微生物中最受关注的真养产碱杆菌，由于它的p h a s 聚合酶只接受3 5 个 碳原子数的单体，对于6 个碳原子以上的单体则不接受。因此，真养产碱杆菌产 生短链p h a s 3 2 , 3 3 1 。如：合成p h b 的途径分三步反应完成，首先所利用的碳源在 细胞内通过各种途径转化为乙酰辅酶a ，再由3 酮基硫酯酶催化两个乙酰c o a 的c c 结合，生成乙酰乙酰辅酶a ，然后是由依赖n a d p h ( 还原型烟酰胺腺嘌 吟二核苷酸磷酸) 的乙酰乙酰还原酶催化立体选择性的反应，从乙酰乙酰辅酶a 产生d ( ) 3 羟基丁酰辅酶a ：三是由p h b 聚合酶将各个d ( ) 3 羟基丁酰辅酶 a 部分通过酯键连接成聚酯 3 4 - 3 6 。 深红红螺菌合成p h b 的途径为五步反应：即依赖于n a d h 的还原酶将乙酰 乙酰辅酶a 还原为l ( + ) 3 羟基丁酰辅酶a ，再由两个立体特异性的烯酸辅酶a 水合酶将其经过丁烯酰辅酶a 转变成d ( ) 3 羟基丁酰辅酶a 3 4 】。 1 3 4 不同碳源合成聚羟基脂肪酸酯的途径不同 l e m o s 等【37 】深入研究了挥发性脂肪酸v f a ( 乙酸、丙酸、丁酸、戊酸) 作 为碳源生成p h a s 机理，及其对合成聚合物产量和组成的影响。对于用丙酸驯化 的活性污泥( 充满能够合成p h a s 的菌群) 乙酸、丙酸或其混合物进料均得到 共聚物p ( h b h v ) ；对于用乙酸驯化的活性污泥，乙酸和丁酸得到均聚物p h b ， 丙酸、戊酸或乙酸和丙酸的混合物得到三聚物p ( h b h v h m v ) 。用乙酸驯 化的活性污泥合成p h a s ，以乙酸作为碳源时的聚合物产量高，为0 5 8 c m m o lh a 9 第一章文献综述 c m m o l s t 3 8 ls 表示基质) ，其次是丁酸( 0 4 5 c m m o i l i a c m m o ls ) 、戊酸 ( 0 3 8 c m m o lh a c m m o ls ) 和丙酸( 0 3 7 c m m o lh a c m m o ls ) 。对于后两者， 由于生成乙酰辅酶a 时要脱羧，所以聚合物产量低。最高比聚合物贮存率是乙 酸( 0 4 7 c m m o lh a c m m o lx h ) ( x 表示微生物) ，其次是丙酸( 0 1 0 4 c m m o l h a c m m o lx h ) ，而丁酸和戊酸的聚合物产率则很低。分别为0 0 7 1 和0 0 8 c m m o l h a c m m o lx h 。用乙酸驯化的活性污泥，比用丙酸驯化的活性污泥能更有 效的贮存p h a s 。并且贮存量主要由进料基质决定，其次是选择得到的微生物种 类。他们通过实验结果推测了由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸生成p h a s 各单体的可 能途径，见图1 2 37 1 。其中由丙酰辅酶a 生成乙酰辅酶a 有多种途径，如：2 甲 基柠檬酸循环，丙烯酰辅酶a 途径，以及甲基丙二酰辅酶a 途径等。这与d i o n i s i 等【3 9 】的推测有些不同，他们认为丙酰生成p i - i v 中，由丙酸生成乙酰辅酶a 是限 速步骤，并且生成的乙酰辅酶a 完全用于h v 而不用于h b 生成。 乙酸 上 乙酰铺酶a 羟基甲基戊酸 t l _ 羟基甲基戊酰铺酶a 丁酸羟基丁酰铺酶a羟基戊酰铺酶a l 上1 l 羟基丁酰羟基戊酸 图1 2 乙酸丙酸丁酸戊酸生成聚合物可能途径 ( 1 2 表示一个或两个单元) 目前对不同途径了解的程度还很不一样。例如：在从脂肪酸合成p h a s 的过 程中如何从q 氧化中间物l ( + ) 3 羟脂酸辅酶a 转变成p h a s 的d ( ) 型前体就需 要进一步探索。因此，由挥发性脂肪酸合成p h a s 的机理有待进一步研究。但是 现有的研究足以证明：不同的碳源合成聚羟基脂肪酸的途径各异。 1 3 5 聚羟基脂肪酸酯生物合成的研究现状 目前由于生产p h a s 的费用很高，很多学者在降低其生长费用的方面已做了 许多研究，例如： 1 0 第一章文献综述 为提高p h a s 的生产效率而改变发酵阶段，分离和培养以廉价碳源为底物生 产p h a s 的菌株，通过克隆许多微生物的p h a s 合成基因已培养出多种重组菌株。 l e e 等人m 】利用不同混合培养基研究了多种ec o l i 重组菌，ec o l i 中菌株 x l b l u e 在实验室中，投加2 0 9 葡萄糖l 时能累积0 3 6 9 9 g 葡萄糖，即7 9p h v l 。 s h i r a i 等人【4 l 】利用光合菌r h o d o b a c t e rs p h e r o i d s 以分批投加的葡萄糖为唯一 碳源，结果p h a s 的产率为6 9 p h v l 。 s h i m i z u 等人【4 2 】利用在营养物缺乏条件下细菌可以累积p h a s 的能力，将 p h a s 的产量提高到0 7 0 p h a s g 细胞质。 日本东京大学的h s a t o h ，t m i n o 和t m a t s u o 等报道了一系列有关利用生活污 水来合成聚羟基链烷酸酯的研究成果 4 3 - 4 。7 1 。他们发现聚羟基脂肪酸酯在生活污水 中扮演重要角色，是微生物积累多磷酸盐和糖原的代谢中间物，因此可利用生活 污水来合成聚羟基脂肪酸酯。在厌氧需氧活性污泥培养液中聚羟基脂肪酸酯总量 可达3 0 ，而引入新的微嗜气需氧培养液中聚羟基脂肪酸酯的总量可达6 0 以 上。 a z o t o b a c t e rc h r o o c o c c u mh 2 3 在人工合成的含n h 4 + 的培养基上以1 的葡萄 糖、果糖淀粉等作为碳源时可积累占细胞干重7 0 的p h b ，而在同样的培养基 上以来自橄榄油工厂a l p e c h i n 为碳源时可积累占细胞干重5 0 的p h b l 4 引。 c h u a 等人【4 9 】提出了一种新的合成p h a s 的方法，即p h a s 作为传统活性污 泥法副产物的合成方法，通过控制污水中的c o d ：n 比，可使得污水处理系统中 的细菌对聚合物进行累积并储存于细胞内。对微生物的正常生长来说，n 是很重 要的营养元素，但却不利于微生物对p h a s 的累积。因此，在污水处理系统运行 时，细胞的增长量和聚合物的合成速率两方面都必须考虑。 l p h o l o w a c h 等研究了液态有机工业废水向聚羟基脂肪酸酯转化的可能性 【5 0 】。从生产丙烯酸酯工厂的活性污泥中分离出包括b a c i l l u s ，p s e u d o m o n a s ，a l c a 1 i g e n e s 的多种菌很适宜在蒸馏甲基异丁烯产生的主要含甲基2 羟基异丁烯的废 水中生长，积累聚羟基脂肪酸酯，其费用与利用葡萄糖生产聚羟基脂肪酸酯的相 近。 有报道说p s e u d o m o n a s ps e u d o f l a v a 菌能利用普通木头中半纤维素馏分的水 解产物作为碳源和能量来源合成聚羟基链烷酸酯 5 1 1 ，这种水解产物的主要成分是 葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。在分批培养中如果水解产物的浓度超过3 0 ( v v ) ， 菌种停止生长。当分别以葡萄糖、木糖和阿拉伯糖为单一碳源时，p p s e u d o f l a v a 所积累的p h b 占菌体干重分别为2 2 ，2 2 ，1 7 ( w t w t ) ，p h b 重均分子量分别 为1 ，1 0 0 0 0 0 ，l ，1 0 0 0 0 0 和6 4 0 0 0 0 。 我国的文欣等人则对利用某些廉价原料合成p h b 进行了研究1 5 ：, 5 3 ) 。以甜菜糖 第一章文献综述 蜜或高果糖浆来培养a l c a l i g e n e se u t r o p h u sh 1 6 ，采用补料分批培养技术，经培 养基优化实验发现，菌体干重分别可达2 0 9 l 和2 6 9 l ，p h b 产量分别可达7 6 9 l 和1 3 9 l 。 国内外对微生物聚酯的生物合成的研究主要集中在以下几个方面：一方面： 选育优产菌种分别利用不同的单一碳源积累p h a s ，尤其是能合成共聚物p h a s 的菌种，对于某些特定菌种，研究不同培养条件对其产p h a s 的影响以提高产量。 二方面：利用不同的底物合成带不同官能团的p h a s ；三方面：利用某些生产废 料或廉价原料作为碳源来生产p h a s 以降低成本。 1 4 废水概述 众所周知，随着城市化的进程，工业废水、生活污水为代表的有机废水已经 成为地球环境的一大主要污染源。据统计，我国每年的污水排放己达5 1 l x l 0 4 亿吨。为保护城市环境和生态平衡，对污水进行适当处理十分必要。在当前污水 处理技术领域中，活性污泥法是应用最为广泛的技术之一，已成为城市污水和有 机性工业废水的主体处理技术。 1 4 1 废水处理方法 废水处理按处理过程：一级处理、二级处理、三级处理。 一级处理是去除可沉降的悬浮物质、悬浮油类和酸碱等物质。 二级处理是去除可降解的溶解性和初级处理没有去除的悬浮、胶体有机物质。 三级处理是去除难降解的有机物质和溶解性的无机物质。 活性污泥法和其他生物处理法都属于二级处理。废水生物处理是通过微生物 的新陈代谢作用，将废水中有机物质的一部分转化为微生物的细胞物质，另一部 分转化为比较稳定的化学物质( 无机物或简单有机物) 的方法。废水的生物处理是 生物群体生命活动的结果，生物污泥是微生物群体的表现形式，所谓生物污泥， 就是微生物群、动物群和吸附的有机物质、无机物质的总称，这些微生物中，有 原生动物、细菌、藻类等，绝大部分生物污泥都是十分复杂的微生物群体【5 4 】。这 些微生物在自然界中的地位和所需食物及生理学的特性是各不相同的，因此，采 用生物法就有可能从污水中去除各种各样的有机物，包括有毒物质及某些矿物 质。虽然各种微生物之间的关系十分复杂，然而作为整体却有自己的规律，有机 物的去除正是基于这种规律。 1 2 第一章文献综述 1 4 2 活性污泥处理废水 ( 1 ) 活性污泥 对含有有机污染物的污水连续进行曝气，能够增值大量的好氧微生物，所增 值的好氧微生物与水中的固体物质形成微小绒粒，沉积如泥状。如将这种污泥收 集并投加到新鲜污水中将继续增值微生物并使其吸收有机污染物的速度大大提 高，这一过程形成了一种充满微生物的污泥即为活性污泥 5 5 1 。 ( 2 ) 活性污泥的性质 活性污泥是以好氧菌为主体所形成的绒粒，混杂着废水中的有机及无机性的 悬浮物质和胶体物质，表面上附着种种不同的原生动物和后生动物，是一种很复 杂的体系。各种活性污泥由于水质、介质条件以及工艺的不同，具有差别甚大的 生物相。但根据许多研究者对多种活性污泥成分分析的结果，活性污泥具有较接 近的化学组成，通式可写作：c 5 h 7 n 0 2 。目前还很难精确计算活性细胞的数量， 由于微生物是固相，就常用混合液的悬浮固体( 即m l s s ) 中挥发固体( 即v s s ) 的 重量就假定近似的等于活性细胞数量，但在工程往往还是用悬浮固体重量。两者 不同之处是悬浮固体中有一部分无机物质，因此挥发固体接